Μεταγραφικό και Λιπιδομικό Προφίλ Ανθρώπινων Μεσεγχυματικών Βλαστοκυττάρων με Μειωμένη Γήρανση και Αυξημένη Ικανότητα Διαφοροποίησης Τριγραμμής κατά τη Φαρμακευτική Θεραπεία

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ

Τα ανθρώπινα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα (hMSCs) είναι κύτταρα πολλαπλών δυνατοτήτων που χρησιμοποιούνται ευρέως στην κυτταρική θεραπεία. Ωστόσο, η συχνά εμφανιζόμενη γήρανση και μείωση των δυνατοτήτων διαφοροποίησης περιόρισε τις ευρείες εφαρμογές του MSC. Αρκετές στρατηγικές όπως η επεξεργασία μικρών μορίων έχουν μελετηθεί ευρέως και έχουν χρησιμοποιηθεί για τη βελτίωση των χαρακτηριστικών του στελέχους παρακάμπτοντας τη γήρανση, αλλά οι ακριβείς μηχανισμοί για τη μείωση της γήρανσης δεν έχουν μελετηθεί πλήρως. Σε αυτή τη μελέτη, τα hMSCs υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ραπαμυκίνη, ολτιπράζη, μετφορμίνη και βιταμίνη C για τον ενδεικνυόμενο χρόνο και αυτά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αξιολόγηση γήρανσης και διαφοροποίηση τριών γενεών. Επιπλέον, τα σύνολα δεδομένων μεταγραφικής και λιπιδομικής των hMSCs μετά από φαρμακευτική αγωγή αναλύθηκαν για την ερμηνεία των βιολογικών οδών που είναι υπεύθυνες για τα αποτελέσματα κατά της γήρανσης. Αν και τέσσερα φάρμακα παρουσίασαν σημαντικές δραστηριότητες στην προώθηση της οστεογονικής διαφοροποίησης των MSC, η μετφορμίνη είναι το βέλτιστο φάρμακο για την προώθηση της διαφοροποίησης τριών γενεών. Οι όροι GO έδειξαν ότι οι αντιγηραντικές επιδράσεις των φαρμάκων σχετίζονταν κυρίως με τις διεργασίες κυτταρικής γήρανσης, μιτωτικής και μείωσης. Η βιοσύνθεση των φωσφατιδυλοχολινών (PC) και της φωσφατιδυλαιθανολαμίνης (PE) ανεστάλη, ενώ η μετατροπή της παραγωγής φωσφατιδυλινοσιτολών (PIs) και κορεσμένων λιπαρών οξέων (SFA)/μονοακόρεστων λιπαρών οξέων (MUFA) ενεργοποιήθηκε. Τα ελεύθερα μεσαίου λιπαρά οξέα (FFA) αυξήθηκαν σε hMSC με διαφορετικούς φαινότυπους αντιγήρανσης. Ως εκ τούτου, δημιουργήσαμε μια ολοκληρωμένη μέθοδο για την αξιολόγηση της φαρμακευτικής παρέμβασης με βάση τα αποτελέσματα της μεταγραφικής και λιπιδομικής. Η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη διαφορετικών βιολογικών φαινοτύπων κατά τη φαρμακευτική παρέμβαση σε MSC που θα επεκτείνει την κλινική εφαρμογή των hMSC.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η γήρανση, μια διαδικασία που εξαρτάται από το χρόνο, θα προκαλέσει φυσιολογική δυσλειτουργία. Η γήρανση είναι ο πρωταρχικός παράγοντας κινδύνου για πολλές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου, των νευροεκφυλιστικών ασθενειών και του διαβήτη. Η εξάντληση των βλαστοκυττάρων και η κυτταρική γήρανση είναι ένα από τα χαρακτηριστικά που καθορίζουν τον φυσιολογικό φαινότυπο κατά τη γήρανση [1]. Τα ανθρώπινα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα (hMSCs) είναι κύτταρα πολλαπλών δυνατοτήτων που παρουσιάζονται στον μυελό των οστών, στον λιπώδη ιστό, στον πλακούντα, στον ομφάλιο λώρο, στους μυς και σε πολλούς άλλους ιστούς [2-6]. Κάτω από ειδικό για τη γενεαλογικό μέσο, ​​τα hMSCs μπορούν να υποστούν διαφοροποίηση σε λιποκύτταρα, οστεοβλάστες και χονδροκύτταρα καθώς και σε άλλες κυτταρικές σειρές in vitro. Ως εκ τούτου, τα hMSC παίζουν σημαντικό ρόλο στην αναγεννητική ιατρική και την κυτταρική θεραπεία. Ωστόσο, η κλινική χρήση του MSC περιορίζεται από τη γήρανση κατά τη διάρκεια της μεγαλύτερης καλλιέργειας in vitro. Η γήρανση των hMSC συνήθως σχετιζόταν με την αλλαγή του μήκους των τελομερών, της κυτταρικής πυκνότητας, του δυναμικού πολλαπλασιασμού, της δυνατότητας διαφοροποίησης της γενεαλογίας, της επιγενετικής, της μιτοχονδριακής λειτουργίας και του εκκριτώματος [7]. Ως εκ τούτου, η υπέρβαση της γήρανσης των MSC απαιτεί πιο εις βάθος μελέτες για τη διερεύνηση των στρατηγικών για την αναστολή της γήρανσης του hMSC. Η μετφορμίνη (TAME) είναι το πρώτο φάρμακο που εγκρίθηκε σε κλινική δοκιμή για την καθυστέρηση της γήρανσης [8] και είναι επίσης εγκεκριμένο από την FDA φάρμακο πρώτης γραμμής για τη θεραπεία του σακχαρώδη διαβήτη τύπου ε 2 [9].κιστανάκιΗ αγωνιώδης οδός Nrf2 θεωρείται ο υποκείμενος μηχανισμός για τη μετφορμίνη που μεσολαβεί στην επιμήκυνση της διάρκειας ζωής [10]. Το Oltipraz, ένας αντισχιστοσωμικός παράγοντας, χρησιμοποιήθηκε επίσης για την αναστολή της εξέλιξης του καρκίνου μέσω της οδού NRF2 σε ένα μοντέλο τρωκτικών[11, 12]. Αναφέρθηκε επίσης ότι η oltipraz επέδειξε αντιγηραντική δράση καταστέλλοντας την αντιοξειδωτική οδό NRF2 [13]. Επιπλέον, η ραπαμυκίνη (Sirolimus) χρησιμοποιήθηκε για την επικάλυψη στεφανιαίων στεντ, την πρόληψη της απόρριψης μοσχεύματος οργάνων και τη θεραπεία της λεμφαγγειολειομυωμάτωσης [14]. Αναφέρθηκε ότι η ραπαμυκίνη θα μπορούσε να αναστείλει την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων και των Β κυττάρων μέσω της αναστολής του mTOR [15], κάτι που επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από την επιδείνωση της ανεπάρκειας των βλαστοκυττάρων [16]. Η βιταμίνη C είναι ένα πολύ γνωστό αναγωγικό και έχει αναφερθεί ότι ανακουφίζει τη γήρανση στο μοντέλο βλαστοκυττάρων με σύνδρομο Werner[17]. Ωστόσο, το αν μοιράζονταν παρόμοια μονοπάτια για να ασκήσουν τον ρόλο τους στην αντιγήρανση και τους συγκεκριμένους μηχανισμούς για την καταστολή της κυτταρικής γήρανσης στους ανθρώπους παραμένει ασαφές. Επιπλέον, το μεταγράφημα και το λιπίδιο για αυτά τα MSC που αντιμετωπίστηκαν με τα τέσσερα φάρμακα δεν διερευνήθηκαν πλήρως, γεγονός που μας ώθησε να πραγματοποιήσουμε τα παρακάτω πειράματα για να αντιμετωπίσουμε αυτά τα σημαντικά ερωτήματα.

Το Cistanche μπορεί να αντιγηρανθεί

Σε αυτή τη μελέτη, η μετφορμίνη, η ολτιπράζη, η ραπαμυκίνη και η βιταμίνη C χρησιμοποιήθηκαν για τη θεραπεία των hMSC του μυελού των οστών (BM-hMSCs). Πρώτον, οι φαινότυποι διαφοροποίησης των hMSCs μετά τη θεραπεία χαρακτηρίστηκαν για να απεικονίσουν τις αντιγηραντικές τους δυνατότητες. Πραγματοποιήθηκε μεταγραφοτομική και λιπιδομική ανάλυση στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με φάρμακο. Στη συνέχεια, διεξήχθη ανάλυση GO με βάση το σύνολο δεδομένων μεταγραφικής για να αγκυρώσει τα συμβάντα σηματοδότησης που είναι υπεύθυνα για τη γήρανση και τις δραστηριότητες αντιγήρανσης. Διεξήχθη μεταβολικό προφίλ και ανάλυση μονοπατιού που απεικονίζει μια διακύμανση της παραγωγής λιπιδίων κατά τη διάρκεια της φαρμακευτικής αγωγής. Συνολικά, έχουμε δημιουργήσει ένα συνολικό σύστημα αξιολόγησης της φαρμακευτικής παρέμβασης για τη γήρανση των hMSC. Το σύστημα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη διαφορετικών βιολογικών φαινοτύπων κατά την παρέμβαση φαρμάκου σε MSC που θα επεκτείνει την κλινική εφαρμογή των hMSC.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Το BM-hMSC υποβάλλεται σε γήρανση μετά από μεγάλο χρονικό διάστημα καλλιέργειας in vitro

Τα BM-hMSCs είναι πολυδύναμα βλαστοκύτταρα με κοινά χαρακτηριστικά αυτοανανέωσης και διαφοροποίησης σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Ωστόσο, με την αύξηση της διέλευσης in vitro, τα κύτταρα υπόκεινται σταδιακά σε γήρανση και θα χάσουν το μεγαλύτερο μέρος των δυνατοτήτων διαφοροποίησής τους. Η κατάσταση των BM-hMSCs αναλύθηκε σε διαφορετικά περάσματα (Ρ2, Ρ8, Ρ13) και η κατάσταση του κυττάρου έγινε χειρότερη, αποδεικνύεται από την επιβράδυνση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, την αύξηση του θανάτου και την επιμήκυνση της μορφολογίας (Εικόνα 1Α). Επιπλέον, δοκιμάστηκαν επίσης οι ικανότητες διαφοροποίησης τριών γενεών των P8 BM-hMSCs. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, σε σύγκριση με τις προηγούμενες μελέτες μας [18], οι ικανότητες διαφοροποίησης του P8 BM-έχει μειωθεί, αλλά μπορεί ακόμα να διαφοροποιηθεί σε οστεοβλάστες, λιποκύτταρα και χονδροκύτταρα υπό επαγωγικό μέσο.cistanche ΑυστραλίαΣύμφωνα με το in vitro μοντέλο γήρανσης των MSC όπως αναφέρθηκε [18], αντιμετωπίσαμε περαιτέρω τα BM-hMSCs με τέσσερα υποψήφια φάρμακα με στόχο την παρέμβαση στη γήρανση in vitro. Όπως φαίνεται στο Σχήμα iC, τα κύτταρα απλώθηκαν σε μια πλάκα 24-πηγαδιού με πυκνότητα 60 τοις εκατό και φάρμακα προστέθηκαν στα κύτταρα μετά από 48 ώρες. Το υπερκείμενο των κυττάρων συλλέγεται κάθε τρεις ημέρες επτά φορές. Την 21η ημέρα μετά το φάρμακο

(Συμπληρωματικό Σχήμα 1Α). Το Oltipraz, η ραπαμυκίνη και η βιταμίνη C μπορούν να βελτιώσουν αποτελεσματικά το δυναμικό διαφοροποίησης που ήταν ευθέως ανάλογο με τον ανταγωνισμό της γήρανσης (Συμπληρωματικό Σχήμα 1Β). Είναι ενδιαφέρον ότι μόνο το oltipraz έδειξε θετική επίδραση στο μέσο διαφοροποίησης των λιποκυττάρων (Συμπληρωματικό Σχήμα 1C,1D).οφέλη από το cistanche,Συνοψίζοντας, το oltipraz είναι το καλύτερο φάρμακο για τη βελτίωση των ικανοτήτων διαφοροποίησης τριών γενεών, η ραπαμυκίνη και η βιταμίνη C θα μπορούσαν να βελτιώσουν αποτελεσματικά το δυναμικό οστεογονικής και χονδρογονικής διαφοροποίησης, ενώ η μετφορμίνη εμφανίζει μόνο περιορισμένη θετική επίδραση στην οστεογονική διαφοροποίηση.

Μεταγραφικό προφίλ των BM-hMSCs που έλαβαν θεραπεία με φάρμακα Δεδομένου ότι και τα τέσσερα φάρμακα θα μπορούσαν να εξουδετερώσουν τη γήρανση των BM-hMSCs με διαφορετική αποτελεσματικότητα, στη συνέχεια προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε τους υποκείμενους μηχανισμούς για τη διακριτή τους δράση διερευνώντας το μεταγραφικό προφίλ των BM-hMSCs κατά τη θεραπεία με φάρμακα . Υπολογίσαμε την αναδίπλωση της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ κάθε ζεύγους φαρμάκου-μάρτυρα αντίστοιχα. Για κάθε ζεύγος φαρμάκου-μάρτυρα, επιλέχθηκαν τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (DEGs) με αναδίπλωση πάνω από 2, τα οποία περιέχουν τόσο γονίδια προς τα πάνω όσο και προς τα κάτω ρύθμισης (Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Πήραμε 1758 γονίδια συνολικά μετά από ανάλυση όλων των DEG από τα φάρμακα που έλαβαν θεραπεία BM-hMSCs (Εικόνα 3Α). Για να διερευνήσουμε τις λειτουργίες των DEG, προσδιορίζουμε τους όρους εμπλουτισμένης γονιδιακής οντολογίας (GO) ("p<0.01) based="" on="" each="" drug's="" degs="" [19](supplementary="" table="" 2).="" these="" enriched="" go="" terms="" represent="" the="" functions="" influenced="" by="" the="" drugs.="" furthermore,="" we="" plot="" the="" venn="" diagram="" to="" study="" the="" similarity="" and="" specificity="" of="" the="" enriched="" go="" terms.="" as="" shown="" in="" figure="" 3b,="" although="" each="" drug="" has="" its="" unique="" regulated="" go="" terms,="" the="" drugs="" also="" share="" a="" common="" go="" which="" suggests="" that="" there="" are="" common="" functions="" influenced="" by="" all="" four="" drugs.="" these="" common="" go="" terms="" may="" associate="" with="" the="" effects="" of="" the="" drug="" on="" senescence="" alleviation="" and="" trilineage="" differentiation="">

Δώδεκα κοινοί όροι GO μοιράζονταν τέσσερα φάρμακα (Εικόνα 3Β, 3Δ), εκ των οποίων εμπλουτίστηκαν κυρίως στην αρνητική ρύθμιση της κινητικότητας των κυττάρων (Εικόνα 3Ε), στη θετική ρύθμιση της οργάνωσης της δομής της ακτομυοσίνης, στη ρύθμιση της κυτταρικής διαδικασίας και στην οργάνωση κυτταρικών συστατικών, στην οργάνωση του κυτταροσκελετού , καταβολική διαδικασία μακρομορίου, ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, καταβολική διαδικασία πρωτεϊνών και μικρή μεταγωγή σήματος με τη μεσολάβηση GTPase (Εικόνα 3C, 3E). Αυτές οι λειτουργίες σχετίζονται στενά με τη μοίρα των κυττάρων, ιδιαίτερα με τους φαινοτύπους που σχετίζονται με τη γήρανση.

Μετά από ανάλυση των κοινών όρων GO μεταξύ μετφορμίνης και ολτιπράζης, διαπιστώσαμε ότι μοιράζονται την ίδια λειτουργία με τους αγωνιστές NRF2. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3ΣΤ, η λειτουργία του κυτταρικού κύκλου, η καταβολική διαδικασία των μακρομορίων και η οργάνωση του πυρηνικού φακέλου ρυθμίστηκαν προς τα πάνω. Επιπλέον, η λειτουργία για την κίνηση των συστατικών, τη μετανάστευση/προσκόλληση κυττάρων και την απόκριση στη βιταμίνη Ε/οργανική κυκλική ένωση/λιπίδιο μειώθηκε (Εικόνα 3G). Αυτά τα αποτελέσματα συνολικά έδειξαν ότι η μετφορμίνη και η ολτιπράζη μπορεί να επηρεάσουν τις ικανότητες διαφοροποίησης των κυττάρων, τη μοίρα των κυττάρων και τον κυτταρικό μεταβολισμό. Δεδομένου ότι το oltipraz είναι το καλύτερο φάρμακο για τη βελτίωση των ικανοτήτων διαφοροποίησης τριών γενεών, προσπαθήσαμε περαιτέρω να εντοπίσουμε τις συγκεκριμένες οδούς που τροποποιήθηκαν από το oltipraz. Είναι ενδιαφέρον ότι οι εμπλουτισμένοι όροι 85 GO σχετίζονταν κυρίως με την κυτταρική γήρανση, τον κυτταρικό κύκλο, τη διαδικασία μιτωτικής και μείωσης, την κυτταρική απόκριση σε φάρμακα, βιταμίνη, cAMP, ερέθισμα βλάβης DNA, θρεπτικό και οσμωτικό στρες (Συμπληρωματικό Σχήμα 2A,2B). Λιπιδομικό προφίλ BM-hMSC που έλαβαν φαρμακευτική αγωγή Για να διερευνηθεί η παγκόσμια διακύμανση των λιπιδίων όσον αφορά την οστεογονική διαφοροποίηση των BM-hMSCs κατά τη φαρμακευτική θεραπεία, διεξήχθη η ανάλυση προφίλ λιπιδομικής με βάση το LC-MS. Συνολικά 139 είδη λιπιδίων ταυτοποιήθηκαν στο κυτταρικό λιπίδιο. συμπεριλαμβανομένων λυσοφωσφατιδυλαιθανολαμινών (LPE), 21 PEs, 4 PE-Os, 4 φωσφατιδυλινοσιτόλες (PI), 5 φωσφατιδυλοσερίνες (PS), 8 Κεραμίδια (Cer), 4 Cerys, 11 σφιγγομυελίνες (SM), 6 τριακυλογλυκερίδια (DG), TG) και 20 ελεύθερα λιπαρά οξέα (FFA) (Εικόνα 4Α-4Μ). Σύμφωνα με το υλικό ομαδοποίησης, τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με oltipraz παρουσίασαν τις μεγαλύτερες παραλλαγές λιπιδίων, κάτι που συμφωνούσε με την καλύτερη επίδρασή τους στην ανακούφιση της γήρανσης των κυττάρων και στη βελτίωση της διαφοροποίησης τριών γενεών. Αναλυτικά, τα LPC των μονοφωσφατιδυλογλυκερολών αυξήθηκαν στην ομάδα θεραπείας με oltipraz σε σύγκριση με τον έλεγχο, ενώ τα αντίστοιχα PC και PE ρυθμίστηκαν προς τα κάτω (Εικόνα 4B,4D,4E). Τα επίπεδα των PI και των SFA είναι επίσης αυξημένα ενώ τα επίπεδα των Ceres και MUFA μειώθηκαν (Εικόνα 4F, 4L, 4H, 4M). Αυτά τα αποτελέσματα

Ανάλυση μονοπατιού με βάση τη λιπιδομική και μεταγραφική σε hMSCs που έχουν υποστεί αγωγή με φάρμακα

Για την περαιτέρω διερεύνηση των υποκείμενων μηχανισμών για τη βελτίωση της διαφοροποίησης τριών γενεών με το oltipraz, πραγματοποιήθηκε ανάλυση μονοπατιού με βάση τα λιπιδομικά και μεταγραφικά σύνολα δεδομένων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, η CDP-Διακυλογλυκερολική Συνθάση 1 (CDS1) ήταν το μόνο ένζυμο που ρυθμίστηκε προς τα πάνω σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με oltipraz, γεγονός που μπορεί να είναι ο λόγος για την αύξηση των PI και τη μείωση των PC. Ωστόσο, η προς τα κάτω ρυθμισμένη ακυλοτρανσφεράση της λεκιθίνης χοληστερόλης (LCAT) και η αμετάβλητη ακυλοτρανσφεράση λυσοφωσφατιδυλοχολίνης3 (LPCAT3) ήταν ασυνεπείς με τα αυξημένα LPC, υποδηλώνοντας ότι τα υπερβολικά παραγόμενα LPC ενδέχεται να μην συντίθενται από PCs/Pes (Εικόνα 5Α). Είναι ενδιαφέρον ότι μπορεί να παρατηρηθεί μια προφανής μετατροπή μεταξύ SFA και MUFA (Εικόνα 5Β). Η αύξηση των κορεσμένων λιπαρών οξέων (SFA) και η μείωση των MUFAs μπορεί να προκύψουν από την προς τα κάτω ρυθμισμένη δεσατουράση στεαροϋλ-CoA (SCD). Αυτή η διάταξη τείνει να αποκαλύπτει τον μηχανισμό για τη μειωμένη δραστηριότητα της λιπογένεσης μετά τη θεραπεία με oltipraz. Αν και η θεραπεία με oltipraz θα μπορούσε να μειώσει την παραγωγή Ceres, οι μετατροπές που μεσολάβησαν από το Cars δεν άλλαξαν σημαντικά (Εικόνα 5Γ).

Παγκόσμια προφίλ λιπιδικών ειδών σε υπερκείμενο hMSCs κατά τη θεραπεία με φάρμακα

Επιπλέον, οι λιπιδομικές αλλοιώσεις στο μέσο χαρακτηρίστηκαν προκειμένου να διερευνηθεί διεξοδικά η επίδραση των φαρμάκων στα hMSC. Όπως φαίνεται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 3, η ανάλυση ομαδοποίησης έδειξε ότι τα λιπίδια ταξινομήθηκαν σε δύο ομάδες, π.χ. η πλειονότητα των FFAs και άλλων λιπιδίων (μη FFAs).cistanche χοληστερόληΌπως φαίνεται στο Σχήμα 6, σε τέσσερις ομάδες, τα FFA εμφάνισαν εμφανείς αλλαγές σε διαφορετικές περιόδους θεραπείας. Αντίθετα, τα μη FFA παρουσίασαν ελαφρές διακυμάνσεις σε τέσσερις ομάδες (Εικόνα 6Α-6Δ). Τα FFA ήταν σημαντικά αυξημένα σε πρώιμα στάδια σε όλες τις ομάδες (Εικόνα 6Ε-6Η).παρενέργειες cistanche deserticolaΕπιπλέον, τα FFAs σε κύτταρα που προκλήθηκαν από τη θεραπεία με μετφορμίνη (Εικόνα 6Ε), ολτιπράζη και βιταμίνη C αυξήθηκαν γρήγορα από το 2ο χρονικό σημείο στο 3ο χρονικό σημείο. Ωστόσο, στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ραπαμυκίνη, τα FFA αυξήθηκαν από τη λίστα στο 2ο χρονικό σημείο (Εικόνα 6F-6H). Είναι ενδιαφέρον ότι τα FFA σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μετφορμίνη παρουσίασαν μεγαλύτερη μείωση από ό,τι στις άλλες τρεις ομάδες (Εικόνα 6Ε). Στη συνέχεια, ελαφρές αυξήσεις των FFAs μπορούσαν να παρατηρηθούν στην ομάδα θεραπείας με oltipraz και βιταμίνη C ενώ από το 4ο έως το 5ο χρονικό σημείο, τα FFA εμφάνισαν ελαφρά μείωση στην ομάδα θεραπείας με μετφορμίνη (Εικόνα 6Ε, 6F, 6Η).

Σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ραπαμυκίνη, τα επίπεδα των FFAs διατηρήθηκαν βασικά από το 3ο έως το 5ο χρονικό σημείο. Συγκεκριμένα, όπως φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 3 και στον Συμπληρωματικό Πίνακα 4, τα μοτίβα μεταβολής των FFA θα μπορούσαν να ταξινομηθούν περαιτέρω σε 8 συστάδες. Εκεί, το σύμπλεγμα 6 που αποτελείται κυρίως από SFAs έδειξε την ίδια διάταξη με εκείνα που εμφανίζονται στην ομάδα oltipraz και βιταμίνη C, ενώ η ομάδα I ήταν βασικά η ίδια με την ομάδα ραπαμυκίνης. Γενικά, τα μεσαία FFA σε όλες τις ομάδες εκτός από τη μετφορμίνη αυξήθηκαν συνολικά μαζί με την πρόκληση, υποδηλώνοντας τη συσχέτιση μεταξύ των FFA στο εσωτερικό πολιτισμικό περιβάλλον και τη γήρανση των κυττάρων. Τα κύτταρα που επάγονται από τη μετφορμίνη και τη βιταμίνη C συνεισέφεραν παρόμοια επίδραση στα SFA στο εσωτερικό περιβάλλον σε σύγκριση με την επαγωγή της ραπαμυκίνης (Εικόνα 6A,6D,6E,6H).

Η γενική στρατηγική για τη μελέτη των αντιγηραντικών επιδράσεων των φαρμάκων στα hMSC

Για να συνοψίσουμε, όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, για να χαρακτηριστούν οι αντιγηραντικές επιδράσεις τεσσάρων φαρμάκων σε hMSCs, διεξήχθη μια συστηματική μελέτη βασισμένη στο εργαστήριο που αποτελείται από χαρακτηρισμό φαινοτύπου, μεταγραφική, κυτταρική λιπιδομική και μέση λιπιδομική ανάλυση. Το Oltipraz ανακούφισε τη γήρανση και βελτίωσε την αποτελεσματικότητα της διαφοροποίησης των τριών γενεών προάγοντας την παραγωγή PI, αναστέλλοντας τη βιοσύνθεση των PC/PE και εμποδίζοντας τη μετατροπή από SFA σε MUFA. Οι όροι GO επεξηγούν επίσης τον φαινότυπο που σχετίζεται με την κυτταρική γήρανση, τη διαδικασία μιτωτικής και μείωσης, την κυτταρική απόκριση στο ερέθισμα βλάβης του DNA, τα επίπεδα ιόντων αμμωνίου και οξυγόνου. Είναι ενδιαφέρον ότι η οδός NRF2 ρυθμίστηκε τόσο από την ολτιπράζη όσο και από τη μετφορμίνη για την προώθηση της διαφοροποίησης των κυττάρων σε διαφορετικούς βαθμούς. Εν τω μεταξύ, η διάταξη λιπιδομικής μέσου κατέδειξε τους κρίσιμους ρόλους των FFAs μέσου στη διαφοροποίηση των MSC σε πολλαπλούς κυτταρικούς τύπους. Ως εκ τούτου, η πολυδιάστατη στρατηγική παρέχει πολλαπλές προοπτικές για την ερμηνεία των διαφορετικών επιπτώσεων της παρέμβασης φαρμάκου στη γήρανση των hMSC. Αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη διαφορετικών βιολογικών φαινοτύπων κατά τη φαρμακευτική παρέμβαση σε MSC που θα επεκτείνει την κλινική εφαρμογή των hMSC.

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Η νέα νόσος του κοροναϊού 2019 (COVID-19) έχει εξελιχθεί σε παγκόσμια έκτακτη ανάγκη για τη δημόσια υγεία. Επί του παρόντος, δεν υπήρχαν ειδικά φάρμακα για την προστασία των ασθενών από ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις. Αναφέρθηκε ότι η εφαρμογή MSC σε σοβαρές περιπτώσεις COVID-19 βελτιώνει την έκβαση των ασθενών ρυθμίζοντας τη φλεγμονώδη απόκριση του σώματος και προάγοντας την επισκευή και την αναγέννηση του πνευμονικού ιστού [20]. Ωστόσο, η συχνά αναδυόμενη γήρανση των hMSCs κατά τη διάρκεια της μακροχρόνιας καλλιέργειας in vitro παρεμπόδισε την κλινική εφαρμογή των hMSCs. Σε αυτή τη μελέτη, καθιερώνουμε ένα in vitro σύστημα διαλογής φαρμάκων που βασίζεται στον φαινότυπο γήρανσης των BM-hMSCs [21]. Πολλές μελέτες διεξήγαγαν έρευνα παρέμβασης σχετικά με τη γήρανση για hMSCs με βάση τον χειρισμό των TFs [22-27] και την εφαρμογή διαφορετικών φαρμάκων [10. 13,17,28,29].Ωστόσο, είμαστε οι πρώτοι που αξιολογήσαμε διεξοδικά την αντιγηραντική επίδραση διαφορετικών φαρμάκων στα BM-hMSCs από την άποψη της δραστικότητας και της αποτελεσματικότητας της διαφοροποίησης της SA{15}. Η ραπαμυκίνη, η ολτιπράζη, η μετφορμίνη και η βιταμίνη C είναι τα τέσσερα παραδοσιακά φάρμακα που χρησιμοποιήθηκαν αρχικά για την παρέμβαση της γήρανσης των hMSC. Αν και και τα τέσσερα φάρμακα εξουδετερώνουν τη γήρανση του BM-MSC, τα ακριβή αποτελέσματα και ο υποκείμενος μηχανισμός των τεσσάρων φαρμάκων στην προώθηση της κυτταρικής διαφοροποίησης ήταν διαφορετικά. Το πιο σημαντικό, καθιερώνουμε επίσης ένα συνολικό σύστημα αξιολόγησης της φαρμακευτικής παρέμβασης με ολοκληρωμένη ανάλυση μεταγραφικών και λιπιδομικών προφίλ σε υπερκείμενα και λύματα κυττάρων. Αναλυτικά, τα μεταγραφικά δεδομένα αναλύθηκαν πλήρως σε συνδυασμό με τον φαινότυπο των βλαστοκυττάρων μετά τη φαρμακευτική θεραπεία για να διερευνηθεί η αλλοιωμένη οδός και οι υποκείμενοι μηχανισμοί που επηρεάζονται από τη φαρμακευτική θεραπεία. Επιπλέον, το πρότυπο αλλαγής λιπιδίων των κυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικά φάρμακα σε διαφορετικά χρονικά σημεία προσδιορίστηκε με LC-MS. Επιπλέον, μέσω της ενσωμάτωσης των δεδομένων της μεταγραφομικής και της μεταβονομικής λιπιδίων, αναλύθηκαν και συνοψίστηκαν οι ειδικές για το φάρμακο μεταβολικές οδοί και οι σχετιζόμενες με το φάρμακο αλλαγές λιπιδίων.

Το Oltipraz είναι το καλύτερο φάρμακο για τη βελτίωση των ικανοτήτων διαφοροποίησης των BM-hMSCs μεταξύ τεσσάρων φαρμάκων. Οι DEG που επηρεάστηκαν από τη θεραπεία με oltipraz εμπλουτίστηκαν κυρίως σε κυτταρική γήρανση, κυτταρικό κύκλο και κυτταρική απόκριση σε φάρμακα, cAMP και ούτω καθεξής. Αυτές οι αλλαγές διαδραματίζουν κρίσιμους ρόλους στην κυτταρική γήρανση Ωστόσο, η ολτιπράζη και η μετφορμίνη, οι αναστολείς της οδού Nrf2, επηρέασαν τις κοινές ρυθμιστικές οδούς [30], οι οποίες εμπλουτίζουν κυρίως τις ικανότητες διαφοροποίησης των κυττάρων, τη μοίρα των κυττάρων και τον μεταβολισμό των κυττάρων. Ως αναστολέας της οδού mTOR, η ραπαμυκίνη θα μπορούσε να αποτρέψει την κυτταρική γήρανση [31, 32]Συνεπώς, βρήκαμε επίσης ότι η ραπαμυκίνη παίζει τον καλύτερο ρόλο στην προώθηση της οστεογονικής διαφοροποίησης, η οποία κυρίως μέσω της ρύθμισης του μονοπατιού μεταβολικής διαδικασίας που περιέχει φωσφορικά, της οργάνωσης κυτταρικών συστατικών. κυτταρική επικοινωνία, μεταγωγή σήματος, βιοσυνθετική διαδικασία μακρομορίων, μεταβολική διαδικασία κυτταρικής πρωτεΐνης και ανάπτυξη σκελετικού συστήματος. Η βιταμίνη C είναι ένα πολύ γνωστό αναγωγικό και παίζει τον καλύτερο ρόλο στην προώθηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με τα άλλα τρία φάρμακα, αλλά δεν υπήρξε σημαντική επίδραση στη βελτίωση των ικανοτήτων διαφοροποίησης τριών γενεών του MSC. Αυτοί οι φαινότυποι μπορεί να προκληθούν από την απόκριση σε κυτοκίνη/λιπιδικό/οξειδωτικό στρες και από θετική ρύθμιση της καταλυτικής δραστηριότητας (Συμπληρωματικό Σχήμα 4).

Τα λιπίδια έχει αποδειχθεί ότι παίζουν αναντικατάστατους ρόλους στη διαφοροποίηση των βλαστοκυττάρων [33]. Βρήκαμε προηγουμένως ότι οι αυξήσεις των μεμβρανικών γλυκεροφωσφολιπιδίων συμπεριλαμβανομένων των PC και των PE, χαρακτηριστικό της γήρανσης, παρατηρήθηκαν παγκοσμίως στα ηλικιωμένα MSCs[18]. Στην τρέχουσα μελέτη, οι μειώσεις σε PC και PEs παρατηρήθηκαν στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με oltipraz τα οποία απέδωσαν καλύτερα στην καθυστέρηση της γήρανσης των MSCs Τα PC και τα PE είναι τα λιπίδια με την υψηλότερη αφθονία στην κατασκευή ευκαρυωτικών μεμβρανών 34]. Τα αυξημένα επίπεδα PC και PE στους ορούς έχουν αποδειχθεί σε ηλικιωμένους σε σύγκριση με νεότερα άτομα [34]. Είναι ενδιαφέρον ότι τα PI ήταν τα μειοψηφικά GPL που μειώθηκαν στα ηλικιωμένα MSC στις προηγούμενες παρατηρήσεις μας. Σε αυτή τη μελέτη, τα PI ήταν δραματικά αυξημένα σε όλα τα επαγόμενα κύτταρα. Μηχανικά, η ανάλυση οδού πρότεινε ότι οι αυξήσεις στα PI μπορεί να σχετίζονται με την ενεργοποιημένη CDS1. Η CDS1 κινάση έχει αποδειχθεί ότι συμμετέχει στη ρύθμιση της σηματοδότησης ROS και επηρεάζει περαιτέρω την έκφραση των γονιδίων που λειτουργούσαν στην οξειδωτική αντίσταση [35]. Μια άλλη σημαντικά μπλοκαρισμένη μεταβολική ροή είναι η μετατροπή από SFA σε MUFA με τη μεσολάβηση SCD. Ως βιοβαρόμετρο λιπογένεσης, το ενεργοποιημένο SFA/MUFA έχει παρατηρηθεί σε μια παρτίδα ασθενειών όπως ο καρκίνος και η μη αλκοολική λιπώδης νόσος του ήπατος (NAFLD)[36,37] Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρούνται επίσης σε ηλικιωμένα ποντίκια, γεγονός που αντανακλά τον ανώμαλο μεταβολισμό του λιπίδια στο ήπαρ κατά τη διάρκεια της γήρανσης [38]. Συνολικά, η στρατηγική μας μπορεί να χρησιμοποιηθεί στον έλεγχο φαρμάκων κατά της γήρανσης και στην εξερεύνηση μοριακού μηχανισμού μετά από φαρμακευτική αγωγή σε βλαστοκύτταρα και καρκίνο. Συνδυάζοντας τη στρατηγική με το σύστημα αξιολόγησης, μπορούμε να πραγματοποιήσουμε παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο με βάση την κατάσταση που σχετίζεται με τη γήρανση των βλαστοκυττάρων για να ανακαλύψουμε νέα φάρμακα που θα χρησιμοποιηθούν σε θεραπείες με βλαστοκύτταρα.

Αυτό το άρθρο προέρχεται από το www.aging-us.com