Οι ολικοί γλυκοζίτες του Cistanche Deserticola προάγουν την αποκατάσταση της νευρολογικής λειτουργίας προκαλώντας νευροαγγειακή αναγέννηση μέσω της οδού Nrf- 2/Keap-1 σε αρουραίους MCAO/R

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Fujiang Wang, Ruiyan Li, Pengfei Tu, Jianping Chen, Kewu Zeng και Yong Jiang

Ιστορικό:Η παραδοσιακή κινεζική ιατρική Cistanche deserticola έχει αναφερθεί ότι ισχύει για καρδιαγγειακά και εγκεφαλοαγγειακά νοσήματα. Ωστόσο, τα ενεργά συστατικά του για την προστασία του ισχαιμικού εγκεφαλικού δεν είναι ξεκάθαρα. Στόχος μας ήταν να εξερευνήσουμε τα ενεργά συστατικά τουC. deserticolaκατά του ισχαιμικού εγκεφαλικού επεισοδίου καθώς και των πιθανών μηχανισμών του.Μέθοδοι:Ερευνήσαμε τις προστατευτικές επιδράσεις του εγκεφάλου εκχυλισμάτων απόC. deserticola, ολικούς γλυκοσίδες (TGs), πολυσακχαρίτες (PSs) και ολιγοσακχαρίτες (OSs) σε μοντέλο αρουραίου απόφραξης-επαναιμάτωσης μέσης εγκεφαλικής αρτηρίας (MCAO/R). 2, 3, 5-Χρώση με χλωριούχο τριφαινυλτετραζόλιο (TTC) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση του όγκου του εγκεφαλικού εμφράγματος και η δοκιμασία μπλε Evans υιοθετήθηκε για την αξιολόγηση της διαπερατότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (BBB). Στη συνέχεια, οι εκφράσεις CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO{-1, claudin-5, occludin, Keap-1 και Nrf{{ 12}} αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας στύπωμα western ή ανοσοφθορισμό και οι δραστηριότητες MDA, SOD, CAT και GSH-Px αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ.Αποτελέσματα:Η θεραπεία με TGs μείωσε σημαντικά τις βαθμολογίες νευρολογικού ελλείμματος και τους όγκους εμφράγματος, προώθησε την αγγειογένεση και τη νευρική αναδιαμόρφωση και διατήρησε αποτελεσματικά την ακεραιότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλου. Επιπλέον, τα TG μείωσαν σημαντικά τα επίπεδα MDA και αύξησαν τις αντιοξειδωτικές δραστηριότητες (SOD, CAT και GSH-Px) στον εγκέφαλο. Εν τω μεταξύ, τα TG μείωσαν σημαντικά την έκφραση Keap-1 και διευκόλυναν την πυρηνική μετατόπιση Nrf-2. Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκαν προστατευτικές επιδράσεις για ομάδες PS και OS.Συμπέρασμα:Τα TG είναι τα κύρια ενεργά συστατικά τουC. deserticolaέναντι εγκεφαλικής βλάβης που προκαλείται από MCAO/R και η προστασία γίνεται κυρίως μέσω της οδού Nrf-2/Keap-1.

Λέξεις-κλειδιά: Cistanche deserticola, εγκεφαλική βλάβη, ολικοί γλυκοσίδες, πολυσακχαρίτες, ολιγοσακχαρίτες, μονοπάτι Nrf-2/Keap- 1

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Τα εγκεφαλικά θεωρούνται ως κύρια αιτία θανάτου και αναπηρίας στον κόσμο (Donnan et al., 2008). Σχεδόν το 87 τοις εκατό όλων των περιπτώσεων εγκεφαλικού προκαλούνται από ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο (Ovbiagele και Nguyen-Huynh, 2011). Επί του παρόντος, ο πιο αποτελεσματικός παράγοντας και το μόνο εγκεκριμένο από την FDA φάρμακο που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία του ισχαιμικού εγκεφαλικού είναι ο ανασυνδυασμένος ενεργοποιητής πλασμινογόνου ιστού. Ωστόσο, ένας μεγάλος αριθμός ασθενών με εγκεφαλικό αποτυγχάνει να ανταποκριθεί σε αυτό το φάρμακο, λόγω του στενού θεραπευτικού του χρόνου και του σοβαρού κινδύνου αιμορραγικών επιπλοκών (Lee et al., 2012· Schellinger and Kohrmann, 2014). Μια σημαντική πρόκληση της θρομβολυτικής θεραπείας είναι ο τραυματισμός ισχαιμίας/επαναιμάτωσης (I/R), που θεωρείται η κύρια αιτία εγκεφαλικής βλάβης και καταστροφής της λειτουργίας. Η επαναιμάτωση μετά από εγκεφαλική ισχαιμία αυξάνει τον κίνδυνο εγκεφαλικής αιμορραγίας ενώ οδηγεί σε νευροαγγειακή βλάβη και παράγει υπερβολικά αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) που βλάπτουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (Alluri et al., 2015). Αρκετές μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι η διαταραχή του BBB είναι μια κύρια αιτία της παθογένεσης του ισχαιμικού εγκεφαλικού επεισοδίου (Cao et al., 2016b).

Το BBB αποτελείται κυρίως από ενδοθηλιακά κύτταρα, περικύτταρα, αστροκύτταρα, νευρώνες και βασικές μεμβράνες. Τα βασικά συστατικά του BBB είναι εγκεφαλικά μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα που ενώνονται με σφιχτές συνδέσεις, περιορίζοντας έτσι τα εξωγενή μόρια στον εγκέφαλο. Οι παθολογικές αλλοιώσεις των σφιχτών συνδέσμων—ιδιαίτερα της occludin, claudin-5 και zonula occludens-1 (ZO-1)— επηρεάζουν σημαντικά τη λειτουργία BBB κατά τη διάρκεια ενός ισχαιμικού εγκεφαλικού, ιδιαίτερα τη διαπερατότητα του φραγμού (Liu et al., 2014· Hu et al., 2018· Liu et al., 2019). Κατά τις περιόδους I/R, το υπερβολικό ROS είναι ένας από τους κύριους παράγοντες που οδηγούν στην άμεση βλάβη των νευρώνων του εγκεφάλου (Ding et al., 2014). Η υπερπαραγωγή ROS οδηγεί σε υποβάθμιση ορισμένων συνδέσμων και διαταραχή της BBB, η οποία οδηγεί σε εξωγενή μόρια που εισέρχονται στον εγκέφαλο μέσω του BBB, οδηγώντας σε επιδείνωση της εγκεφαλικής βλάβης (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). Ως εκ τούτου, η προστασία του BBB από αντιοξειδωτικά έχει θεωρηθεί ως ένας πιθανός τρόπος για την πρόληψη τραυματισμού επαναιμάτωσης.

Εκτός από τη διάσπαση του BBB, το I/R μπορεί να οδηγήσει σε νευροαγγειακή βλάβη και νευρωνικό θάνατο (Jung et al., 2010). Κατά τη διάρκεια ενός εγκεφαλικού, αυξημένος θάνατος νευρωνικών κυττάρων μπορεί να προκύψει από οξειδωτικό στρες (Chi et al., 2018) και πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι το ROS επιδεινώνει τη σοβαρότητα του εγκεφαλικού και τη νευρολογική βλάβη (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et al., 2006). Αν και οι κλινικές δοκιμές δεν έχουν ικανοποιητικά αποτελέσματα, η νευροπροστασία εξακολουθεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για τη θεραπεία του οξέος ισχαιμικού εγκεφαλικού επεισοδίου (Moretti et al., 2015). Έτσι, η εύρεση αποτελεσματικών φαρμάκων νευροπροστασίας για τη θεραπεία των εγκεφαλικών είναι ένα όφελος για τους ασθενείς με εγκεφαλικό επεισόδιο.

Η παραδοσιακή κινεζική ιατρική (TCM) λαμβάνει μέτρα για να παρέμβει ενάντια στην εσωτερική ανισορροπία του σώματος (Gaire, 2018). Λόγω της πολύπλοκης παθογένεσης των ισχαιμικών εγκεφαλικών επεισοδίων, η πολυπαραγοντική επίδραση της TCM και των ενεργών συστατικών της διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στη θεραπεία των εγκεφαλικών επεισοδίων. Το Cistanche deserticola YC Ma, ευρέως διαδεδομένο σε άνυδρες ή ημίξηρες περιοχές σε όλη τη Μογγολία και τη Βορειοδυτική Κίνα, είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο βότανο TCM για τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών όπως η λήθη και η κατάθλιψη για περισσότερα από 1,000 χρόνια στην Κίνα . Μοντέρνοφαρμακολογικές μελέτες έδειξαν ότι τα ακατέργαστα εκχυλίσματα απόC. deserticolaέδειξε πολλαπλές φαρμακολογικές δραστηριότητες, όπως η ενίσχυση της λειτουργίας μάθησης και μνήμης, νευροπροστασία, ενίσχυση της ανοσίας, αντιοξειδωτικά, αντιγηραντικά και αντικόπωση (Ko and Leung, 2007; Wang et al., 2012; Li et al., 2015). Η χημική ανάλυση του C. deserticola έδειξε ότι τα κύρια συστατικά του περιλαμβάνουν φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες, ιριδοειδή γλυκοσίδες, πολυσακχαρίτες και ολιγοσακχαρίτες (Jiang and Tu, 2009). Ωστόσο, τα ενεργά συστατικά του C. deserticola για την προστασία του εγκεφάλου δεν είναι πολύ σαφή.Η νευροπροστατευτική ιδιότητα του C. deserticola υποδηλώνει τις θεραπευτικές του δυνατότητες σε γνωστικές ασθένειες όπως το εγκεφαλικό επεισόδιο και η κατάθλιψη, καθώς και η νόσος Alzheimer (Wang et al., 2017). Ωστόσο, η έρευνα για τον αντίκτυπο τουC. deserticolaστα εγκεφαλικά επεισόδια, συμπεριλαμβανομένων των ενεργών συστατικών και των μηχανισμών δράσης του, είναι πολύ περιορισμένη. Στην τρέχουσα εργασία, διερευνήσαμε την προστατευτική επίδραση τριών εκχυλισμάτων από το C. deserticola, των ολικών γλυκοσιδών (TGs, φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων και άλλων γλυκοσιδίων), πολυσακχαριτών (PSs) και ολιγοσακχαριτών (OSs) σε εγκεφαλικές βλάβες I/R. Τα ευρήματά μας μπορεί να συμβάλουν στην ακριβή κλινική εφαρμογή τουC. deserticolaκαι παρέχουν έναν υποψήφιο παράγοντα για θεραπεία ισχαιμικού εγκεφαλικού επεισοδίου.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Χημικά και Αντιδραστήρια

Οι μίσχοι του Cistanche deserticola αγοράστηκαν από το Alasan, Εσωτερική Μογγολία, και αναγνωρίστηκαν από έναν από τους συγγραφείς (P.-F. Tu). Τα TG, τα PS και τα OS παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο που αναφέρθηκε προηγουμένως (Gao et al., 2015). Η ποσοτική ανάλυση των TG πραγματοποιήθηκε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Li et al, 2019) και το χρωματογράφημά της φαίνεται στο σχήμα 1. Τα κύρια συστατικά των TGs είναι η εχινακοσίδη, η τουμπουλοσίδη Α, η ακτεοσίδη, η ισο- ακτεοσίδη, και 2'-ακετυλακτεοσίδιο. το περιεχόμενό τους είναι 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g και 12,045 mg/g, αντίστοιχα. Τα περιεχόμενα των PS και των OS είναι 69,42 τοις εκατό και 65,24 τοις εκατό, αντίστοιχα, όπως προσδιορίζεται με HPLC και την ανάλυση φαινόλης-θειικού οξέος, αντίστοιχα (Zhang A. et al., 2018; Shi et al, 2019).

Οι τυπικές αναφορές εχινακοσίδης (Α0282), τουμπουλοσίδης Α (Α0942), ακτεοσίδης (Α0280), ισο-ακτεοσίδης (Α0281) και 2'-ακετυλακτεοσίδης (Α0943) αγοράστηκαν από την Chengdu Must Biotechnology (Sichuan, Κίνα). Η καθαρότητα όλων των προτύπων είναι μεγαλύτερη από 98 τοις εκατό. Τα κιτ Nissl Stain H&E αγοράστηκαν από την Boster (Wuhan, Κίνα). Το Edaravone (T0407-1) αγοράστηκε από την Target Mol (Σαγκάη, Κίνα). Αγοράστηκαν Κουνέλι κατά των αρουραίων MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) και CD31 κατά ποντικιού (ab24590) από την Abcam Inc (Cambridge, MA, ΗΠΑ). Rabbit anti-rat Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) και Occludin (BS72035) αγοράστηκαν από την Bioworld Technology (Nanjing, Κίνα). Η Cell Signaling Technology Inc. (Βοστώνη, MA, Η.Π.Α.) ήταν η πηγή της συναψίνης αντι-ποντικιού κουνελιού-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T). Το GAPDH (HRP-60004) αγοράστηκε από την Proteintech Group, Inc. (Σικάγο, ΗΠΑ). Τα δευτερεύοντα αντισώματα παρασχέθηκαν από την Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Πεκίνο, Κίνα). Το Hoechst 33258 ελήφθη από την Beyotime (Jiangsu, Κίνα).

Των ζώων

Οι αρουραίοι Sprague-Dawley (αρσενικοί, βάρους 250-300 g) ελήφθησαν από το Vital River Laboratory Animal Technology (Πεκίνο, Κίνα) και στεγάστηκαν σε ένα κλιματιζόμενο δωμάτιο που διατηρήθηκε σε κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών. Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ARRIVE για την έρευνα σε ζώα (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010) και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Κέντρου Επιστημών Υγείας του Πανεπιστημίου του Πεκίνου (LA2019123).

Πειραματικά Πρωτόκολλα Ζώων

Οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε MCAO/R, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Wang et al., 2018). Εν συντομία, η αριστερή κοινή καρωτιδική αρτηρία (CCA), η εξωτερική καρωτίδα (ECA) και η εσωτερική καρωτίδα (ICA) εκτέθηκαν και ένα ράμμα με μονόινα νήματα 3-0 εισήχθη από το ECA στο ICA μέχρι να φτάσει στη μέση εγκεφαλική αρτηρία (MCA). Μετά από 1,5 ώρα απόφραξης MCA, προσομοιώθηκε η επαναιμάτωση αφαιρώντας το νήμα. Κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης, η θερμοκρασία του σώματος όλων των αρουραίων διατηρήθηκε στους 37,0 βαθμούς.

Χορήγηση φαρμάκου

Οι αρουραίοι χωρίστηκαν τυχαία σε έξι ομάδες χρησιμοποιώντας την έκδοση λογισμικού SPSS 22.0 όπως περιγράφεται (Jiang et al., 2014): κανονική ομάδα (NOR); ομάδα μοντέλων (MOD); ομάδα edaravone (θετικό φάρμακο, 6 mL/kg, EDI); Ομάδα TGs (280 mg/kg, TGs); Ομάδα PSs (280 mg/kg, PSs) και ομάδα OSs (280 mg/kg, OSs). Τα TGs, PS και OSs χορηγήθηκαν μία φορά την ημέρα μετά από MCAO/R για 14 ημέρες. Οι ομάδες NOR και MOD υποβλήθηκαν σε αγωγή με φυσιολογικό ορό. Οι αριθμοί των ζώων φαίνονται στον Πίνακα 1.

Μέτρηση βάρους και τροποποιημένες βαθμολογίες νευρολογικού ελλείμματος (mNSS)

Το σωματικό βάρος παρακολουθήθηκε τη 14η ημέρα χρησιμοποιώντας μια ψηφιακή ζυγαριά ADVENTURE™ (OHAUS, New Jersey, ΗΠΑ). Το mNSS αξιολογήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τον FJ Wang (Wang et al., 2018), με μικρές αναθεωρήσεις.

2, 3, 5-Χρώση με χλωριούχο τριφαινυλτετραζόλιο (TTC)

Ο όγκος του εμφράγματος μετρήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Wang et al., 2015). Εν συντομία, οι εγκέφαλοι τεμαχίστηκαν σε επτά στεφανιαία τετράγωνα σε ίση απόσταση (2 mm). Αυτές οι τομές χρωματίστηκαν με 2 τοις εκατό TTC (Coolaber, Πεκίνο, Κίνα) στους 37 βαθμούς για 15 λεπτά. Όγκος εμφράγματος ( ποσοστό )=(ομόπλευρος όγκος ισχαιμικού ημισφαιρίου −όγκος ετερόπλευρου ισχαιμικού ημισφαιρίου)/όγκος ετερόπλευρου ισχαιμικού ημισφαιρίου × 100.

Nissl και H&E Staining

Οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν βαθιά και ολόκληρος ο εγκέφαλος αφαιρέθηκε γρήγορα από το κρανίο και στερεώθηκε χρησιμοποιώντας 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη και ενσωματώθηκε σε κερί παραφίνης και τεμαχίστηκε σε φέτες πάχους 7 μm. Οι τομές χρωματίστηκαν με Nissl και H&E. Σε αυτή τη μελέτη, έξι τυχαία πεδία 200 × 200 μm καταγράφηκαν σε κάθε δείγμα ιστού με μικροσκόπιο φωτός. Ο αριθμός των σωμάτων της Nissl μετρήθηκε με την έκδοση λογισμικού IPP 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, ΗΠΑ).

Evans Blue Assay

Οι αρουραίοι έλαβαν ένεση με 2 τοις εκατό EB (Coolaber Science & Technology Co., LTD) μετά από MCAO/R. Δύο ώρες αργότερα, οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν και ολόκληρος ο εγκέφαλος αφαιρέθηκε γρήγορα και ομογενοποιήθηκε σε ακετόνη. Τα υπερκείμενα αναλύθηκαν στα 620 nm με συσκευή ανάγνωσης απορρόφησης 800 TS (BioTek, ΗΠΑ).

Μέτρηση των Δραστηριοτήτων της Καταλάσης (CAT), της Δισμουτάσης του Υπεροξειδίου (SOD), της Μηλονοδιαλδεΰδης (MDA) και της Υπεροξειδάσης της Γλουταθειόνης (GSH-Px)

Όλα τα δείγματα ορού φυγοκεντρήθηκαν στις 4,000 × rpm για 15 λεπτά στους 4 βαθμούς και στη συνέχεια αναλύθηκαν για να ανιχνευθούν οι δραστηριότητες των MDA, CAT, SOD και GSH-Px ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, Κίνα).

Ανάλυση Western Blotting

Οι ιστοί εγκεφάλου (100 mg) που συλλέχθηκαν από κάθε αρουραίο ομογενοποιήθηκαν και λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA και στη συνέχεια αναλύθηκαν για να ανιχνευθεί η συγκέντρωση πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας κιτ BCA (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.). Οι ολικές πρωτεΐνες του ιστού φορτώθηκαν σε πηκτές SDS-PAGE 10 τοις εκατό και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη αποκλείστηκε χρησιμοποιώντας 5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα, στη συνέχεια επωάστηκε όλη τη νύχτα με πρωτογενή αντισώματα στους 4 βαθμούς. Η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε με ένα δευτερεύον αντίσωμα. Η ανάλυση κηλίδας Western αναλύθηκε χρησιμοποιώντας σύστημα ψηφιακής απεικόνισης Kodak (5200 Multi, Tanon, China).

Ανάλυση ανοσοφθορισμού

Πραγματοποιήθηκε χρώση ανοσοφθορισμού για CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, ocludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 και Keap-1. Τα πρωτογενή αντισώματα κατά Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO{-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 και Keap-1 αραιώθηκαν σε 1:200 και 1:100, αντίστοιχα. Το δευτερεύον αντίσωμα Alexa Flur 488 ποντικού κατά κουνελιού IgG και ροδαμίνης (TRITC) κατσίκας αντι-κουνελιού IgG αραιώθηκαν και τα δύο σε 1:200. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με Hoechst 33258. Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, USA). Η έκφραση πρωτεΐνης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό IPP έκδοση 6.0.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα περιγράφηκαν ως μέσος όρος ± SD. Το λογισμικό SPSS έκδοση 22.0 πραγματοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση. Χρησιμοποιήθηκε μονόδρομη ANOVA κατά τη σύγκριση διαφορετικών ομάδων. P < 0.05="" θεωρήθηκε="" η="" στατιστική="">

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Οι TGs αυξάνουν το σωματικό βάρος και μειώνουν τις βλάβες στον εγκέφαλο σε αρουραίους MCAO/R

Μετά από 14 ημέρες θεραπείας με TGs, PSs, Oss και EDI, αξιολογήθηκαν τα σωματικά βάρη, τα νευρολογικά ελλείμματα και οι όγκοι εμφράγματος των I/R αρουραίων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα σωματικά βάρη στην ομάδα MOD μειώθηκαν σημαντικά, ενώ τα μειωμένα βάρη στις ομάδες TG, PS και EDI αυξήθηκαν (Εικόνα 2Α). Οι βαθμολογίες νευρολογικού ελλείμματος μειώθηκαν σημαντικά από το EDI και το TG (Εικόνα 2Β). Οι φέτες του εγκεφάλου στους αρουραίους της ομάδας NOR ήταν βαθύ κόκκινο και δεν υπήρχαν έμφραγμα, ενώ οι αρουραίοι της ομάδας MOD εμφάνισαν μεγάλο ομόπλευρο εγκεφαλικό έμφραγμα. Μετά τη θεραπεία με TGs, οι όγκοι του εμφράγματος μειώθηκαν σημαντικά (Εικόνες 2C, D). Η θεραπεία PS και OSs δεν έδειξε εμφανή επίδραση στους παραπάνω δείκτες. Τα παραπάνω δεδομένα έδειξαν ότι τα TGs μπορούσαν να ανακουφίσουν σημαντικά την εγκεφαλική βλάβη που προκαλείται από I/R, αλλά τα PS και OS δεν μπορούσαν.

Οι TGs Βελτιώνουν την Ιστοπαθολογική Βλάβη σε αρουραίους MCAO/R

Για να προσδιοριστούν ορισμένες από τις επιδράσεις της θεραπείας με TGs, PSs και OSs στις ιστοπαθολογικές βλάβες, έγινε χρώση H&E για να αποκαλυφθούν παθολογικές βλάβες. Οι ιστομορφολογικές δομές των εγκεφάλων στην ομάδα NOR τακτοποιήθηκαν τακτικά. Οι αλλαγές μορφολογίας στις ομάδες TGs ήταν μικρότερες από αυτές στην ομάδα MOD. Ωστόσο, οι ομάδες θεραπείας με PS και OSs δεν έδειξαν σημαντική βελτίωση των αλλαγών της μορφολογίας (Εικόνα 3).

Τα TG εξασθενούν τον νευρωνικό τραυματισμό μετά από αρουραίους που προκαλούνται από I/R

Η χρώση Nissl έδειξε τις ιστοπαθολογικές αλλαγές των νευρώνων στον ημισφαίριο της ισχαιμικής περιοχής. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, οι φυσιολογικοί νευρώνες είχαν καθαρό πυρήνα και ανέπαφη δομή. Στην ομάδα MOD, οι νευρώνες είχαν διευρυμένους μεσοκυττάριους χώρους. Τα σώματα του nissl εξαφανίστηκαν, συρρικνώθηκαν και βάφτηκαν βαθιά. Ωστόσο, αυτές οι αλλαγές σπάνια παρατηρήθηκαν στις ομάδες EDI, TGs και PSs. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα TGs και τα PSs θα μπορούσαν να μετριάσουν σημαντικά την ισχαιμία/επαγόμενη από επαναιμάτωση νευρωνική βλάβη.

Τα TG εξασθενούν τη διαταραχή του BBB μετά από αρουραίους που έλαβαν I/R

Η δοκιμασία μπλε Evans είναι μια κλασική μέθοδος για την έρευνα της αλλαγής της διαπερατότητας BBB. Τα αποτελέσματα του πειράματος έδειξαν ότι αυξημένο μπλε του Evans παρατηρήθηκε στην ομάδα MOD, ενώ υπήρχε σημαντικά μειωμένο μπλε του Evans στους αρουραίους TG και στους επίμυες που έλαβαν θεραπεία με EDI. Επιπλέον, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων θεραπείας PS και OSs (Εικόνα 5). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα TGs θα μπορούσαν να μετριάσουν σημαντικά τη διαταραχή του BBB.

Τα TG προάγουν την αγγειογένεση σε αρουραίους που έχουν τραυματιστεί με Ε/Κ

Πιο πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η αγγειογένεση παίζει κρίσιμο ρόλο στη νευρολογική λειτουργική αποκατάσταση και την προγνωστική έκβαση μετά από οξύ ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο (Yuen et al., 2015). Για την αξιολόγηση των επιδράσεων των TGs, PSs και OSs στην αγγειογένεση, χρησιμοποιήθηκαν τα CD31 και a-SMA για τον ποσοτικό προσδιορισμό των τριχοειδών αριθμών. Η χρώση με ανοσοφθορισμό έδειξε ότι η ομάδα MOD προκάλεσε μια αξιοσημείωτη μείωση στις εκφράσεις του CD31 (Εικόνες 6Α, Β) και a-SMA (Εικόνες 6C, D) στο ημισχαιμικές περιοχές των αρουραίων I/R, σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς αρουραίους . Αυτό το αποτέλεσμα απέδειξε ότι το I/R θα μπορούσε να προκαλέσει αγγειακή βλάβη στον ημισφαίριο του φλοιού των ισχαιμικών ημισφαιρίων. Ωστόσο, η θεραπεία TGs και EDI αύξησε αξιοσημείωτα την πυκνότητα των τριχοειδών, την αγγειογένεση και την αρτηριογένεση, όπως υποδεικνύεται από τις αυξημένες εκφράσεις των CD31 και a-SMA. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα TGs θα μπορούσαν να προάγουν την αγγειογένεση στον ισχαιμικό ημισφαίριο αρουραίων I/R, αλλά τα PS και OS δεν μπορούσαν.

Τα TG Αυξάνουν την Έκφραση των Πρωτεϊνών Σφιχτής Σύνδεσης σε Αρουραίους που έχουν τραυματιστεί με Ε/Κ

Η διαταραχή του BBB μπορεί να αυξήσει την περιεκτικότητα σε νερό του εγκεφάλου και το πρήξιμο των ιστών, οδηγώντας σε εγκεφαλική βλάβη. Οι πρωτεΐνες σφιχτής σύνδεσης είναι σημαντικά δομικά συστατικά του BBB (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). Για να ελεγχθεί εάν η θεραπεία με TG, PS και OSs μετά το εγκεφαλικό επεισόδιο μπορεί να επηρεάσει την ακεραιότητα του BBB, οι εκφράσεις των ZO-1, claudin-5 και ocludin πραγματοποιήθηκαν με ανάλυση ανοσοφθορισμού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι εκφράσεις του claudin-5, του ocludin και του ZO-1 ήταν εμφανώς μειωμένες στην ομάδα MOD. Ωστόσο, αυξήθηκαν σημαντικά μετά από 14 ημέρες χορήγησης TGs. Οι ομάδες PS και OSs δεν έδειξαν σημαντικές αλλαγές σε αυτές τις πρωτεϊνικές εκφράσεις (Εικόνα 7). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι τα TGs μπορούν να ρυθμίσουν τις εκφράσεις της πρωτεΐνης σφιχτής σύνδεσης και πιθανώς να διατηρήσουν την ακεραιότητα BBB μετά από τραυματισμό I/R. Τα TG αυξάνουν την κάλυψη περικυττάρων στα τριχοειδή αγγεία σε τραυματισμένους αρουραίους I/R Η κάλυψη περικυττάρων στα τριχοειδή αγγεία διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της ακεραιότητας του BBB (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Έτσι, δοκιμάσαμε εάν η κάλυψη των περικυττάρων θα μπορούσε να αυξηθεί με θεραπεία TG, PS και OS. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης έντασης ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι τόσο οι εκφράσεις PDGFRb όσο και CD31 μειώθηκαν δραματικά στην ομάδα MOD. Η χορήγηση TG στους αρουραίους I/R ανέκτησε σημαντικά ή ακόμη και αύξησε τις εντάσεις έκφρασης των PDGFRb και CD31, αλλά δεν παρατηρήθηκε διαφορά στις ομάδες θεραπείας με PSs και OSs (Εικόνα 8). Έτσι, η θεραπεία των TGs θα μπορούσε να αυξήσει σημαντικά την κάλυψη των περικυττάρων. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαίωσαν περαιτέρω ότι τα TG μπορούν να διατηρήσουν την ακεραιότητα του BBB μετά το I/R.

Οι TGs προωθούν τη νευρωνική αναδιαμόρφωση σε αρουραίους που έχουν τραυματιστεί με φλέβα

Σύμφωνα με πολυάριθμες μελέτες, η νευρογένεση μετά από ένα εγκεφαλικό μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη λειτουργική αποκατάσταση (Grefkes and Ward, 2014; Zhang et al., 2019). Η συναπτοφυσίνη (SYN), οι πρωτεΐνες μετασυναπτικής πυκνότητας 95 (PSD-95) και η πρωτεΐνη 2 που σχετίζεται με μικροσωληνίσκους (MAP-2) χρησιμοποιήθηκαν ως δείκτες για την εξέταση της πλαστικότητας των νευρώνων στον ισχαιμικό ημισφαίριο του φλοιού. Για να αξιολογηθούν οι επιδράσεις της θεραπείας με TGs, PSs και OSs στη νευρογένεση σε αρουραίους που έχουν τραυματιστεί με I/R, διεξήχθη ο ανοσοφθορισμός και το western blot για εκφράσεις SYN, PSD95 και MAP-2. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 9 και 10, τα επίπεδα έκφρασης SYN, PSD95 και MAP{12}} σε αρουραίους I/R μετά από 14 ημέρες επαναιμάτωσης μειώθηκαν σε σύγκριση με τους αρουραίους NOR, ενώ η θεραπεία TGs και PSs θα μπορούσε να αυξηθεί σημαντικά- ρυθμίζουν τα επίπεδα έκφρασής τους. Η ομάδα OSs δεν είχε σημαντική αλλαγή σε σύγκριση με την ομάδα MOD. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η θεραπεία TGs και PSs ήταν σε θέση να προωθήσει δραματικά τη νευρική αναδιαμόρφωση μετά από τραυματισμό I/R.

Εκφράσεις TGs Alter Nrf-2 και Keap-1 σε I/R τραυματισμένους αρουραίους

Το οξειδωτικό στρες είναι ένας κύριος παθογόνος μηχανισμός στον τραυματισμό I/R (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Οι μελέτες επαλήθευσαν ότι ο Nrf-2 είναι ο κύριος ρυθμιστής των αντιοξειδωτικών αποκρίσεων (Thompson et al., 2015). Για να διερευνήσουμε τις οξειδωτικές αποκρίσεις που προκαλούνται από Nrf-2 και Keap{-1 μετά από τραυματισμό I/R, αξιολογήσαμε την κυτταροπλασματική έκφραση καθώς και την πυρηνική μετατόπιση του Keap-1. Εν τω μεταξύ, η έκφραση του Nrf-2 σε ιστούς εγκεφάλου αρουραίου τραυματισμένου I/R προσδιορίστηκε επίσης (Εικόνες 10 και 11). Σύμφωνα με την ανάλυση ανοσοφθορισμού, το Nrf-2 βρέθηκε να εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα στην ομάδα NOR. Στην ομάδα TGs, η έκφραση του Nrf-2 στον κυτταροπλασματικό εντοπισμό ρυθμίστηκε προς τα κάτω, αλλά ρυθμίστηκε προς τα πάνω στον πυρήνα και παρατηρήθηκε επίσης μειωμένη έκφραση Keap-1. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η προστασία του εγκεφάλου των TGs θα μπορούσε να συσχετιστεί με τη διαμόρφωση του Nrf-2 και του Keap-1

Οι TG μετριάζουν το οξειδωτικό στρες του εγκεφαλικού ιστού σε αρουραίους που έχουν τραυματιστεί με φλέβα

Για να επιβεβαιωθούν οι αντιοξειδωτικές επιδράσεις των TGs, αξιολογήθηκαν οι δραστηριότητες των SOD, CAT, GSH-Px και MDA σε αρουραίους που έχουν τραυματιστεί με I/R. Στο Σχήμα 12, η ​​περιεκτικότητα σε MDA αυξήθηκε σημαντικά στην ομάδα MOD και ταυτόχρονα, οι δραστηριότητες των SOD, CAT και GSH-Px μειώθηκαν, σε σύγκριση με τους κανονικούς αρουραίους. Αντίθετα, η θεραπεία με TGs οδήγησε σε σημαντική μείωση της περιεκτικότητας σε MDA και αύξηση των δραστηριοτήτων των SOD, CAT και GSH-Px. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν περαιτέρω την αντιοξειδωτική δράση των TGs.

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Πολλές μελέτες προτείνουν ότι το TCMC. deserticolaέχει εκτεταμένες βιολογικές δραστηριότητες, π.χ. ενίσχυση της ικανότητας μάθησης, της μνήμης και της ανοσίας (Dong et al., 2007; Jiang and Tu, 2009; Wang et al., 2017; Xia et al., 2018). Ωστόσο, τα ενεργά συστατικά του C. deserticola για νευροπροστασία παραμένουν ασαφή. Η τρέχουσα εργασία στοχεύει να ελέγξει τα ενεργά στοιχεία απόC. deserticolaκατά του ισχαιμικού εγκεφαλικού επεισοδίου στο μοντέλο MCAO/R. Τρία εκχυλίσματα από C. deserticola (TGs, PSs και OSs) χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των επιπτώσεών τους σε αρουραίους MCAO/R, καθώς και πιθανούς μηχανισμούς.

Το εγκεφαλικό είναι μια κοινή οξεία εγκεφαλοαγγειακή νόσος. Επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν ότι το εγκεφαλικό είναι πιο συχνό στους άνδρες παρά στις γυναίκες (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik and Bushnell, 2017). Έτσι, στο πείραμά μας, αρσενικοί αρουραίοι υιοθετήθηκαν για τις δοκιμές. Τα αποτελέσματά μας απέδειξαν ότι η επαγωγή I/R επιτάχυνε το οξειδωτικό στρες και τον όγκο του εμφράγματος, σπάζοντας το BBB και οδηγώντας σε νευρική και εγκεφαλοαγγειακή βλάβη. Μετά τον έλεγχο, τα TGs βρέθηκαν να μειώνουν τον όγκο του εμφράγματος και προάγουν τη νευρική αναδιαμόρφωση και την αγγειογένεση. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι τα TG διατηρούν την ακεραιότητα του BBB μετά από τραυματισμό I/R. Αντίθετα, τα PS και τα OS δεν προσφέρουν σημαντική ανακούφιση στον τραυματισμό I/R. Έτσι, τα TGs θεωρούνται το κύριο ενεργό κλάσμα τουC. deserticolaγια νευροπροστασία, ενδεχομένως μέσω της προώθησης της νευρικής αναδιαμόρφωσης, της αγγειογένεσης και της ακεραιότητας του BBB μέσω της ενεργοποίησης της οδού Nrf- 2/Keap-1.

Τα αυξανόμενα στοιχεία υποδεικνύουν ότι η δημιουργία αποτελεσματικής παράπλευρης κυκλοφορίας είναι σημαντικά σημαντική για την αποφυγή του σχηματισμού εμφράγματος και ισχαιμικού ισχαιμικού εγκεφαλικού επεισοδίου και αποτελεί κρίσιμη θεραπεία σε πρώιμο στάδιο του ισχαιμικού εγκεφαλικού επεισοδίου (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). Ο πολλαπλασιασμός των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων και των λείων μυϊκών κυττάρων μετά από ισχαιμικό έμφραγμα καθορίζει την εγκαθίδρυση παράπλευρης κυκλοφορίας. Ωστόσο, τα μοντέλα ισχαιμίας έχουν ένα κοινό φαινόμενο - δηλαδή, το οξειδωτικό στρες υπήρχε ευρέως στο μικροαγγειακό σύστημα του εγκεφάλου. Τα δεδομένα της μελέτης έχουν δείξει ότι ένας μεγάλος αριθμός αντιοξειδωτικών μπορεί να διαταράξει τη λειτουργία του BBB και τις ιδιότητες της αγγειογένεσης (Mentor and Fisher, 2017). Το CD31 και το a-SMA είναι οι δείκτες των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων καθώς και των λείων μυϊκών κυττάρων, αντίστοιχα (Saboor et al., 2016). Για τη διερεύνηση της επίδρασης στον προαναφερθέντα κυτταρικό πολλαπλασιασμό των εκχυλισμάτων απόC. deserticola, εξετάσαμε τις εκφράσεις του CD31 και του a-SMA στο ομογενοποιημένο εγκεφαλικό ισχαιμικό μισοφέγγαρο. Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι τα TG ενίσχυσαν εντυπωσιακά τις εκφράσεις των CD31 και a-SMA. Ωστόσο, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές για τις ομάδες PS και OS. Επομένως, συμπεράνουμε ότι τα TGs μπορεί να μειώσουν την εγκεφαλική βλάβη προάγοντας την αγγειογένεση μέσω της αύξησης των εκφράσεων των CD31 και a-SMA, ενώ τα PS και τα OS δεν παρείχαν τέτοια προστασία από εγκεφαλική βλάβη. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν περαιτέρω ότι μόνο τα TG θα μπορούσαν να αποτρέψουν την εγκεφαλική βλάβη I/R.

Το ισχαιμικό εγκεφαλικό μπορεί να θεωρηθεί ως το αποτέλεσμα εγκεφαλικής ισχαιμίας που προκαλείται από βλάβη της νευρωνικής πλαστικότητας ή αναδιαμόρφωση των περιοχών του εγκεφάλου. Η πλειοψηφία των ασθενών με εγκεφαλικό υποφέρει από νευρολογικά ελλείμματα. Η ενεργοποίηση της νευρογένεσης είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για τους ασθενείς με εγκεφαλικό για να βελτιώσουν τις νευρολογικές τους λειτουργίες (Cramer and Chopp, 2000). Η νευρογένεση συμμετέχει άμεσα στην αποκατάσταση της νευρολογικής λειτουργίας μετά από τραυματισμό του εγκεφάλου I/R (Zhang et al., 2019). Προηγούμενη έρευνα δείχνει ότι τα TG μπορούν να βελτιώσουν το ποσοστό επιβίωσης των πυραμιδικών κυττάρων του ιππόκαμπου και να προκαλέσουν νευρογένεση (Lian et al., 2017). Το οξειδωτικό στρες προκαλεί την απώλεια νευρώνων κατά τη διάρκεια πολλών ασθενειών, όπως το Πάρκινσον, το εγκεφαλικό κ.λπ. (Duan and Si, 2019; Singh et al., 2019). Το Nrf-2 μεταγράφει πολλά γονίδια που σχετίζονται με τη νευροπροστασία στην περιοχή προαγωγέα τους, κυρίως συμπεριλαμβανομένων των λιγασών SOD, MDA, CAT και g γλουταμυλοκυστεϊνης, κ.λπ. (Satoh et al., 2006). Οι πρωτεΐνες SYN, PSD-95 και MAP-2, οι οποίες σχετίζονται στενά με τον συναπτικό σχηματισμό και τη νευροδιαβίβαση, μπορούν να θεωρηθούν ως δείκτες της ερευνητικής νευρωνικής πλαστικότητας στην περιοχή του ισχαιμικού μισού χεριού. Μετά από μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία με TGs θα μπορούσε να αυξήσει σημαντικά τις εκφράσεις των PSD95, SYN και MAP-2, υποδεικνύοντας ότι η εγκεφαλική προστασία των TGs συσχετίστηκε με την ενισχυμένη νευρωνική πλαστικότητα κατά τη διάρκεια του I/R. Ωστόσο, είναι κρίμα που δεν υπάρχει εμφανής διαφορά για τα PS καθώς και για τις ομάδες OS. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα TGs θα μπορούσαν να ενισχύσουν τη νευροπλαστικότητα μετά από εγκεφαλική βλάβη I/R.Η έρευνα απεικόνισης σε ασθενείς με εγκεφαλικό έδειξε ότι η δυσλειτουργία BBB μπορεί να θεωρηθεί ως ένα εντυπωσιακό χαρακτηριστικό του περιισχαιμικού εγκεφάλου (Bang et al., 2007). Τα TJs, τα οποία αποτελούνται από κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες, διαμεμβρανικές πρωτεΐνες και μόρια προσκόλλησης σύνδεσης μεταξύ τριχοειδών ενδοθηλιακών κυττάρων, είναι πολύ σημαντικά για τη διατήρηση της ακεραιότητας του BBB (Ye et al., 2019). Μεταξύ αυτών, η ZO-1, η claudin-5 και η οκλουδίνη είναι οι πιο σημαντικές πρωτεΐνες στα TJ. Τα αυξανόμενα στοιχεία δείχνουν ότι η αυξημένη διαπερατότητα του BBB που προκαλείται από ισχαιμία γενικά συσχετίζεται με τις μεταβολές του ZO-1, του claudin-5 και του occludin (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al., 2017· Liu et al., 2018). Σε αυτήν την εργασία, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι παρόλο που οι TGs μπορούσαν να αυξήσουν σημαντικά τις εκφράσεις των πρωτεϊνών ZO{-1, claudin{-5 και οκλουδίνης σε εγκεφαλικούς ιστούς που προκαλούνται από MCAO, ούτε τα PSs ούτε τα OSs το έκαναν. Το BBB αποτελείται από εγκεφαλικά ενδοθηλιακά κύτταρα και συνδέεται στενά με περικύτταρα (Nyul-Toth et al., 2016). Τα περικύτταρα είναι ζωτικής σημασίας για την ακεραιότητα του BBB (Bell et al., 2010). Το ισχαιμικό εγκεφαλικό πυροδοτεί τον θάνατο των περικυττάρων και την αποκόλληση από τα ενδοθηλιακά κύτταρα του εγκεφάλου στην οξεία φάση, αποσταθεροποιώντας έτσι τη μικροαγγείωση και μεταβάλλοντας τις ιδιότητες του BBB (Zechariah et al., 2013). Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι τα TG θα μπορούσαν να αυξήσουν την κάλυψη των περικυττάρων στα τριχοειδή αγγεία και να αυξήσουν τα επίπεδα έκφρασης των ZO-1, claudin-5 και ocludin. Αυτά τα φαινόμενα απέδειξαν ότι τα TGs μπορούσαν να προστατεύσουν αποτελεσματικά την ακεραιότητα του BBB μετά από εγκεφαλική βλάβη I/R. Συνοπτικά, τα TGs μπορούν να μετριάσουν την εγκεφαλική βλάβη με πολλούς τρόπους, όπως η προώθηση της αγγειογένεσης, η βελτίωση της πλαστικότητας των νευρώνων και η διατήρηση της ακεραιότητας του BBB.

Στη συνέχεια ερευνήσαμε το μονοπάτι σηματοδότησης για να εξερευνήσουμε τον μηχανισμό που βρίσκεται κάτω από την προστασία του εγκεφάλου των TG. Η διαδικασία του τραυματισμού I/R είναι πολυπαραγοντική, και έτσι πολλοί μηχανισμοί εμπλέκονται στην παθογένεση. Το οξειδωτικό στρες είναι ένας θεμελιώδης παράγοντας κινδύνου που συμβάλλει σε εγκεφαλικές βλάβες που προκαλούνται από I/R (Suda et al., 2013), όπως η βλάβη της δομής BBB, η αγγειακή ενδοθηλιακή δυσλειτουργία και η επιδείνωση της ισχαιμικής νευρωνικής βλάβης (Xiong et al., 2015; Caglayan et al., 2019· Priestley et al., 2019). Έτσι, το οξειδωτικό στρες έχει γίνει ένας ελκυστικός θεραπευτικός στόχος σε εγκεφαλική βλάβη που προκαλείται από I/R. Τα ένζυμα φάσης 2, τα οποία διαμεσολαβούνται από τον πυρηνικό παράγοντα Ε2-σχετιζόμενος παράγοντας-2 (Nrf-2), έχουν θεωρηθεί ως σημαντικό μέσο με το οποίο οι νευρώνες προστατεύονται από το οξειδωτικό στρες (Suzuki και Yamamoto, 2015; Ya et al., 2018). Τα αυξανόμενα στοιχεία δείχνουν ότι η ενεργοποίηση του Nrf-2 κατά τη διάρκεια του I/R είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για νευροπροστασία (Ding et al., 2015· Zhang R. et al., 2017). Το Nrf-2, ως σημαντικός ρυθμιστής της ενδογενούς αντιοξειδωτικής άμυνας, μεσολαβεί στο επίπεδο της αίμης οξυγενάσης 1 (HO{17}}) και άλλων αντιοξειδωτικών ενζύμων, όπως το NAD(P)H οξειδορεδουκτάση της κινόνης 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH και MDA (Siow et al., 2007; Ding et al., 2014). Επιπλέον, το Nrf-2 παίζει σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στην αγγειογένεση. Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι το Nrf-2 μπορεί να ενισχυθεί σημαντικά και να ενεργοποιηθεί στη διαδικασία της αγγειακής ανάπτυξης (Wei et al., 2013).

Όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Jiang and Tu, 2009), τα TG περιέχουν πολλές βιοδραστικές ενώσεις, για παράδειγμα, εχινακοσίδη, τουμπουλοσίδη Α, ακτεοσίδη, ισο-ακτεοσίδη και 2'-ακετυλακτεοσίδη, και μερικά από αυτά έδειξαν νευροπροστατευτικές λειτουργίες μετά από εγκεφαλική Ι/Ρ τραυματισμό (Peng et al., 2016). Η εχινακοσίδη έχει πολλές φαρμακολογικές επιδράσεις, όπως αντιοξείδωση, αντιγήρανση, νευροπροστασία, αντιφλεγμονή, προαγωγή του γαλακτώματος, ηπατοπροστασία, προαγωγή του σχηματισμού οστών και αντικαρκινικές δραστηριότητες (Yu et al., 2016; Li et al., 2018· Zhang Y. et al., 2018· Ji et al., 2019· Xu et al., 2019). Πρόσφατα, η εχινακοσίδη έχει αναγνωριστεί ως ισχυρό αντιοξειδωτικό στο κεντρικό νευρικό σύστημα (Lu et al., 2016). Η εχινακοσίδη μπορεί να μειώσει την περιεκτικότητα σε MDA και να βελτιώσει τις δραστηριότητες των SOD και GSH Px σε ισχαιμική εγκεφαλική βλάβη και η μοριακή ανάλυση σύνδεσης έδειξε ότι η εχινακοσίδη μπορεί να συνδεθεί με το Keap-1, οδηγώντας στην πυρηνική μετατόπιση Nrf-2 (Li et al., 2018). Η μελέτη του Xia έδειξε ότι η ακτεοσίδη θα μπορούσε να μειώσει τον όγκο του εμφράγματος και την περιεκτικότητα σε νερό του εγκεφάλου για να βελτιώσει τα νευρολογικά ελλείμματα σε αρουραίους MCAO/R μέσω του μετριασμού του οξειδωτικού στρες (Xia et al., 2018). Άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι η ισο-ακτεοσίδη θα μπορούσε να αυξήσει τις δραστηριότητες των κυτταρικών αντιοξειδωτικών ενζύμων, SOD και CAT σε κύτταρα V79-4 που έχουν υποστεί επεξεργασία με H2O (Chae et al., 2005). Με βάση τις παραπάνω αναφορές των δραστικών ενώσεων που περιέχονται στα TG, είναι δυνατό να συμπεράνουμε ότι τα TG θα μπορούσαν να προστατεύσουν από το ισχαιμικό εγκεφαλικό μέσω των οδών αντιοξείδωσης.

Ο Li ανέφερε τις νευροπροστατευτικές επιδράσεις των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών (PhGs) στην απόπτωση που προκαλείται από H2O2- στα κύτταρα PC12 μέσω της οδού Nrf2/ARE (Li et al., 2018). Αυτά τα PhG καταστέλλονται σημαντικά με την ενεργοποίηση της πυρηνικής μετατόπισης του Nrf2 και τις αυξανόμενες εκφράσεις των HO-1, NQO1, καταλυτικής υπομονάδας λιγάσης γλουταμικού-κυστεΐνης (GCLC) και υπομονάδας τροποποίησης λιγάσης γλουταμικού-κυστεΐνης (GCLM) (Li et al. Gong et al., 2019). Επομένως, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η οδός Nrf-2/ARE διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στις προστατευτικές επιδράσεις με τη μεσολάβηση PhGs στα νευρωνικά κύτταρα. Ομοίως, σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι τα TGs θα μπορούσαν να μειώσουν το επίπεδο του MDA και να αυξήσουν τα επίπεδα SOD, CAT και GSH-Px στους αρουραίους I/R. Εν τω μεταξύ, τα TG θα μπορούσαν να ρυθμίσουν προς τα πάνω την έκφραση Nrf2 στον πυρήνα, να μειώσουν την αντίστοιχη έκφραση στο κυτταρόπλασμα και να μειώσουν σημαντικά την έκφραση Keap-1. Επομένως, η οδός Nrf-2/Keap-1 μπορεί να εμπλέκεται σε νευροπροστατευτικά αποτελέσματα που προκαλούνται από TG. Περαιτέρω επικύρωση αυτής της οδού θα πραγματοποιηθεί in vitro κυτταρική καλλιέργεια με μοντέλα τραυματισμών στέρησης οξυγόνου-γλυκόζης/επαναοξυγόνωσης στο μέλλον. Εξάλλου,C. deserticolaΤα εκχυλίσματα χορηγήθηκαν στη μελέτη μας για 14 ημέρες συνεχώς. Εφόσον η νευρογένεση ενηλίκων θα επηρεάσει την ερμηνεία των νευροπροστατευτικών επιδράσεων κατά τη διάρκεια 14 ημερών επαναιμάτωσης, η νευρογένεση δεν μπορεί να αποκλειστεί στον τρέχοντα σχεδιασμό πειράματός μας για τη διερεύνηση της νευροπροστατευτικής επίδρασης των CT. Αυτός είναι ο περιορισμός της έρευνάς μας.

Συμπερασματικά, είναι τα TG απόC. deserticolaπου μπορεί να ενισχύσει την αγγειογένεση και τη νευρογένεση, καθώς και να διατηρήσει την ακεραιότητα του BBB σε αρουραίους τραυματισμού I/R, αλλά όχι στα PS και OS. Τα εφέ θα μπορούσαν να διαμεσολαβηθούν από την ενεργοποίηση της διαδρομής Nrf-2/Keap-1.