Θεραπευτική επίδραση της Cistanoside A στον μεταβολισμό των οστών ποντικών με ωοθηκεκτομή

1. Εισαγωγή

Η οστεοπόρωση, ένας συστηματικός σκελετικός «σιωπηλός δολοφόνος», έχει γίνει ένας σημαντικός κίνδυνος για την υγεία που ταλαιπωρεί πάνω από 2000 εκατομμύρια ανθρώπους παγκοσμίως τα τελευταία χρόνια. Χαρακτηρίζεται από χαμηλή πυκνότητα οστικής μάζας (BMD) και μικροαρχιτεκτονική επιδείνωση, η οποία προέρχεται από υπερβολική οστική απορρόφηση έναντι του σχηματισμού οστού και, τέλος, οδηγεί σε οστεοπορωτικό κάταγμα. Σήμερα, ο εντοπισμός παραγόντων που εμποδίζουν την οστεοκλαστική διαφοροποίηση και απορρόφηση είναι η κοινή και επιτυχημένη στρατηγική για την ανάπτυξη θεραπευτικών φαρμάκων για την οστεοπόρωση, και υπάρχουν πράγματι πολλοί συνθετικοί παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της βαλερικής οιστραδιόλης και της αλενδρονικής νατρίου, που θα μπορούσανπρόληψη και θεραπεία της οστεοπόρωσης. Ωστόσο, τα φάρμακα για τις ασθένειες απέχουν πολύ από το να είναι ιδανικά. Ορισμένα από αυτά τα φάρμακα θα μπορούσαν να αυξήσουν τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του ενδομητρίου και του μαστού και επίσης έχουν κάποιο βαθμό ανεπιθύμητων ενεργειών, όπως υπερασβεστιαιμία, υπερασβεστιουρία κ.λπ., που περιορίζουν τις κλινικές τους εφαρμογές. Ως εκ τούτου, για περισσότερο από μια χιλιετία, τα παραδοσιακά κινέζικα φάρμακα (TCM), ειδικά τα βρώσιμα TCM με απομονωμένες βιοδραστικές ενώσεις και κλάσματα, χρησιμοποιούνται εκτενώς με ασφάλεια και αποτελεσματικότητα στις ασιατικές χώρες για την πρόληψη και τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών, συμπεριλαμβανομένης της οστεοπόρωσης.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΚΑΙ ΤΗΝ ΠΡΟΛΗΨΗ ΤΗΣ ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΣΗΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Η οστεοπόρωση χαρακτηρίζεται ως ενισχυμένη οστική απορρόφηση λόγω αυξημένης οστεοκλαστογένεσης και αυτή η διαδικασία περιλαμβάνει τη δέσμευση αιμοποιητικών μονοκυττάρων σε πρόδρομους οστεοκλάστες, οι οποίοι συντήκονται για να σχηματίσουν πολυπύρηνους οστεοκλάστες που στοχεύουν τις θέσεις των οστών που υποβάλλονται σε αναδιαμόρφωση [4]. Ο ενεργοποιητής υποδοχέα για τον συνδέτη πυρηνικού παράγοντα-κΒ (RANKL), ένας βασικός παράγοντας που εκκρίνεται από τους οστεοβλάστες, διεγείρει τη διαφοροποίηση των μονοκυττάρων σε οστεοκλάστες [8,9]. Η αλληλεπίδραση του RANKL με τον υποδοχέα του RANK οδηγεί σε έναν καταρράκτη ενδοκυτταρικών γεγονότων, συμπεριλαμβανομένων των NF-κB, PI3K/Akt και εξαρτώμενης από ασβέστιο/καλμοδουλίνη κινάσης, στρατολογώντας τον παράγοντα που σχετίζεται με τον υποδοχέα TNF πρωτεΐνης σήματος προσαρμογής (TRAF6). Ως αποτέλεσμα, πολλά γονίδια δεικτών που σχετίζονται με οστεοκλάστες, συμπεριλαμβανομένων των TRAP, καθεψίνης Κ και DPD, ρυθμίζονται προς τα πάνω και η διαδικασία της οστικής απορρόφησης επιταχύνεται.

Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες χαρακτηρίζονται από τμήματα κινναμωμικού οξέος και υδροξυλοφαινυλαιθυλίου που συνδέονται με μια -γλυκοπυρανόζη (απιόζη, γαλακτόζη, ραμνόζη, ξυλόζη, κ.λπ.) μέσω ενός γλυκοσιδικού δεσμού, τα οποία είναι ευρέως κατανεμημένα σε φαρμακευτικά φυτά [10]. Το Cistanoside A (Cis A) είναι ενεργόφαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιοστο Cistanche deserticola YC Ma. Σύμφωνα με το αρχείο της κινεζικής φαρμακοποιίας, το C. deserticola χρησιμοποιήθηκε παραδοσιακά για τη θεραπεία της ανεπάρκειας του νεφρού-yin, της μυϊκής αδυναμίας, της οσφυϊκής αδυναμίας κ.λπ., και οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες είναι τα κύρια βιοενεργά συστατικά αυτού του βοτάνου [11]. Με βάση τη θεωρία του «νεφρού» του TCM, ο νεφρός θα μπορούσε να διέπει το οστικό σύστημα, πράγμα που σημαίνει ότι η ανάπτυξη και οι λειτουργίες των οστών εξαρτώνται από τη νεφρική ουσία και αυτή η ουσία των νεφρών μπορεί να μετατραπεί σε μυελό των οστών για να θρέψει τα οστά. προάγουν την ανάπτυξη και επιδιόρθωση του σκελετού και ενισχύουν τον σκελετό [12]. Καθώς το C. deserticola θα μπορούσε να ενισχύσει το νεφρό, υποθέσαμε ότι το Cis A θα μπορούσε να αποτρέψει και να θεραπεύσει την οστεοπόρωση. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να επικυρώσει τις δυνατότητες τουCis A στην πρόληψη της οστεοπόρωσηςχρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ποντικών με ωοθηκεκτομή και προσδιορίστηκαν δείκτες σχηματισμού οστού και απορρόφησης, καθώς και οι σχετικοί πιθανοί μηχανισμοί για την εκτίμηση της αντιοστεοπορωτικής βιοδραστικότητας αυτού του παράγοντα.

2. Αποτελέσματα και Συζήτηση

2.1. Αποτελέσματα

2.1.1. Επιδράσεις του Cis A στη δοκιμή κάμψης οστών τριών σημείων

Για να αναλύσουμε εάν η θεραπεία με Cis A κάνει το οστό πιο δυνατό, υποβάλαμε τα μηριαία οστά στη δοκιμή κάμψης τριών σημείων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, το μέγιστο φορτίο που εφαρμόστηκε όταν σπάσουν τα οστά ήταν 21,5% και 22.0% υψηλότερο στα ζώα που έλαβαν θεραπεία με 20 mg/kg και 80 mg/ kg Cis A, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα ζώα στην ομάδα με ωοθηκεκτομή (OVX) (p < 0.05). Εν τω μεταξύ, η θεραπεία με Cis A ενίσχυσε επίσης την ακαμψία των οστών. όλα τα ποντίκια που έλαβαν Cis A παρουσίασαν σημαντικά αυξημένη ακαμψία με δεδομένα 121.{27}} ± 12,1 (p < 0,05), 124,1 ± 16,2 (p < 0,05) και 127,7 ± 9,6 (p < 0,01), αντίστοιχα σε σύγκριση με 102,2 ± 10,7 των ποντικών OVX. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η αυξημένη οστική αντοχή στα ποντίκια OVX που έλαβαν Cis A οφειλόταν σε αυξημένη ποσότητα οστού και σε βελτίωση της ποιότητας των οστών.

2.1.2. Επιδράσεις του Cis A στη μικροαρχιτεκτονική των οστών

Η τρισδιάστατη μικροαρχιτεκτονική των δοκιδωτών οστών ποντικών που μετρήθηκε με μικρο-CT (Εικόνα 2 και Πίνακας 1) δείχνει διαισθητικά ότι τα ποντίκια στην ομάδα OVX παρουσίασαν μια αξιοσημείωτη μείωση της δοκιδωτής περιοχής και του αριθμού των δοκίδων σε σύγκριση με την εικονική ομάδα, υποδεικνύοντας ότι η ωοθηκεκτομή θα μπορούσε να προκαλέσει μια αξιοσημείωτη μείωση στην πυκνότητα της οστικής μάζας (BMD, −46%), στην περιεκτικότητα σε ανόργανα άλατα των οστών (BMC, −66%), στην περιεκτικότητα σε ανόργανα άλατα ιστού (TMC, −85%), στο κλάσμα οστικού όγκου (BVF, −82%), δοκιδωτός αριθμός (Tb. N, −76%) και αύξηση του διαχωρισμού των δοκιδωτών (Tb. Sp, +80%) χωρίς καμία τροποποίηση στη συνολική πυκνότητα ιστού (TMD) και στο πάχος του δοκιδωτού (Tb. Th) μετά την λειτουργία 12 εβδομάδων. Ωστόσο, τα ποντίκια OVX που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Cis A είχαν ως αποτέλεσμα δοσοεξαρτώμενα αυξημένη BMD (+43%~57%), BMC (+65%~73%), TMC (+83%~ 90%), BVF (+80%~88%), μεγαλύτερη μείωση της Tb. Sp (−79%~88%) και περαιτέρω ενισχυμένη Tb. N (+73%~82%) σε σύγκριση με την ομάδα OVX. Η TMD φαινόταν να μην επηρεάζεται από την ωοθηκεκτομή αλλά αυξήθηκε σημαντικά από τη θεραπεία με βαλερική οιστραδιόλη (EV).

2.1.3. Επιδράσεις του Cis A τόσο στον Σχηματισμό Οστών όσο και στους Δείκτες Απορρόφησης

Οι επιδράσεις του Cis A στους δείκτες οστικής απορρόφησης, συμπεριλαμβανομένων των TRAP, DPD, του δείκτη σχηματισμού οστού καθεψίνης Κ ALP και της πρωτεΐνης Gla των οστών (BGP), φαίνονται στο Σχήμα 3. Μετά από 12 εβδομάδες επέμβασης ωοθηκεκτομής, οι δραστηριότητες των TRAP, DPD και η καθεψίνη Κ στην ομάδα OVX αυξήθηκαν σημαντικά, ιδιαίτερα η DPD, η οποία αυξήθηκε κατά σχεδόν 55,6%. Η TRAP και η καθεψίνη Κ ενισχύθηκαν κατά 43,5% και 38,1%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με την εικονική ομάδα. Το Cis A, χορηγούμενο από το στόμα για 12 εβδομάδες, έδειξε αξιοσημείωτη δυνατότητα στην πρόληψη όλων των προαναφερθέντων δεικτών οστικής απορρόφησης, ιδιαίτερα της υψηλής δόσης (80 mg/kg) που παρουσιάζει σημαντική επίδραση στην καταστολή των δραστηριοτήτων της DPD κατά 45.0%, TRAP κατά 49.0% και καθεψίνη Κ κατά 44.0%, αντίστοιχα (p < {0.01), σε σύγκριση με το Ομάδα OVX (Εικόνα 3). Αν και μια αυξητική τάση των δραστηριοτήτων ALP και BGP καταδείχθηκε στην ομάδα OVX, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές αλλαγές. Ωστόσο, μια σημαντική βελτίωση στη δραστηριότητα ALP παρατηρήθηκε σε ομάδες που έλαβαν χαμηλή και υψηλή Cis A-θεραπεία σε σύγκριση με την εικονική ομάδα (p < 0,01).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΛΗΨΗ ΤΗΣ ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΣΗΣ ΑΣΘΕΝΗΣΗΣ 75% ECH 30% ACT 12%

2.1.4. Επιδράσεις του Cis A στα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης του TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG και RANKL

Η ανάλυση Western blot αποκάλυψε ότι σε σύγκριση με την εικονική ομάδα, τα επίπεδα πρωτεΐνης των TRAF6, NF-κB και RANKL στην ομάδα OVX ήταν σημαντικά αυξημένα (p < 0.05), ενώ η OPG, Τα PI3K και Akt μειώθηκαν σημαντικά (Εικόνα 4). Το Cis A (20 mg/kg ή 80 mg/kg) μείωσε σημαντικά την έκφραση TRAF6 (p < 0,05), ακολουθούμενη από μείωση της έκφρασης RANKL και αύξηση της OPG, πράγμα που σημαίνει ότι η αναλογία OPG/RANKL ρυθμίστηκε προς τα πάνω. Κατά συνέπεια, οι καταρράκτες σηματοδότησης του NF-κB ρυθμίστηκαν προς τα κάτω και το PI3K/Akt ρυθμίστηκε προς τα πάνω από την επεξεργασία Cis A (ρ < 0,05).

2.2. Συζήτηση

Δεδομένων των περιορισμών των τρεχουσών θεραπευτικών επιλογών για τη νόσο της οστεοπόρωσης, υπάρχει ανάγκη για εναλλακτικές λύσεις από τρόφιμα ή φυσικά βρώσιμα φαρμακευτικά φυτά. Ως μέρος της συνεχιζόμενης προσπάθειάς μας να ανακαλύψουμε αποτελεσματικούς αντιοστεοπορωτικούς παράγοντες από το TCM, βρήκαμε μια σειρά από εκχυλίσματα, κλάσματα και ενώσεις που έχουν την επίδραση των αντιοστεοπορωτικών ιδιοτήτων [13,14]. Το Cistanche deserticola είναι ένα σημαντικό κλασικό TCM, το οποίο βρέθηκε ότι διαθέτει ευνοϊκό προφίλ ασφάλειας [15] και ευρείες ιατρικές λειτουργίες για τη θεραπεία της νεφρικής ανεπάρκειας κ.λπ. [16]. Σύμφωνα με τη θεωρία του TCM, TCM που έχουν την επίδραση της αναζωογόνησης του νεφρού ήταν συνήθωςχρησιμοποιείται για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης; Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες είναι τα κύρια βιοενεργά συστατικά αυτού του βοτάνου, υπονοώντας έτσι ότιφαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδεςπου περιέχεται στο C. deserticola μπορεί να έχει αντιοστεοπορωτική ιδιότητα. Έχει αποδειχθεί ότι το εκχύλισμα C. deserticola θα μπορούσε να αναστείλει σημαντικά τη μείωση της BMD και να αποτρέψει την επιδείνωση της μικροαρχιτεκτονικής της δοκιδωτής που προκαλείται από το OVX [17]. Στο πείραμα in vitro, αύξησε επίσης σημαντικά την ALP, τη μορφογενετική πρωτεΐνη των οστών-2 και το mRNA της οστεοποντίνης, καθώς και την ανοργανοποίηση των οστών καλλιεργημένων οστεοβλαστών [18]. Η εχινακοσίδη, ένα κύριο βιοδραστικό συστατικό του C. deserticola που καταγράφηκε επίσημα στην κινεζική φαρμακοποιία [11], εμφάνισε αντιοστεοπορωτική δράση με υψηλή δόση 30~270 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα [19] και περαιτέρω in vitro αποτελέσματα έδειξαν ότι θα μπορούσε να προάγει την αναγέννηση των οστών αυξάνοντας την αναλογία OPG/RANKL στα κύτταρα MC3T3-Ε1 Υποκλώνου 14 [20]. Το Cis A ήταν ένας από τους γλυκοσίδες φαινυλαιθανόλης που απομονώθηκαν από το C. deserticola και αρκετές αναφορές αποκάλυψαν ότι αυτή η ένωση είχε αντιοξειδωτική δράση [21] και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες [22,23]. Μια πρόσφατα δημοσιευμένη εργασία ανακάλυψε ότι το Cis A εμφάνισε προστατευτικές δραστηριότητες τόσο για το CCl4 όσο και για την επαγόμενη από το αλκοόλ ηπατοτοξικότητα σε ποντίκια, και επίσης έδειξε προστατευτική ιδιότητα στη βλάβη που προκαλείται από αιθανόλη σε πρωτογενή καλλιεργημένα ηπατοκύτταρα ποντικού in vitro [24]. Στην παρούσα μελέτη μας, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το Cis A είχε αντιοστεοπορωτική δράση σε χαμηλή δόση (20~80 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) χρησιμοποιώντας μοντέλο ποντικών με ωοθηκεκτομή και αυτή η βιοδραστικότητα ασκήθηκε με μείωση του επιπέδου του TRAF6, καταστέλλοντας η έκφραση του RANKL και του NF-κB και η διέγερση των OPG, PI3K και Akt, που σημαίνει ότι το θεραπευτικό αποτέλεσμα του Cis A σε ποντίκια OVX ήταν μέσω του μηχανισμού της αδρανοποίησης του NF-kappaB με τη μεσολάβηση του TRAF6- και της ενεργοποίησης PI3K/Akt.

Είναι ευρέως γνωστό ότι η ωοθηκεκτομή μπορεί να προκαλέσει οστεοπόρωση με εμφανή μείωση της BMD, της εμβιομηχανικής αντοχής, της ποιότητας των οστών και της μικροαρχιτεκτονικής του δοκιδωτού οστού και οι παραπάνω αλλαγές οφείλονται εν μέρει στην ανεπάρκεια οιστρογόνων [25]. Τώρα, στο παρόν πείραμα in vivo, η μελέτη μας καταδεικνύει ότι η οστεοπόρωση που προκαλείται από ωοθηκεκτομή είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση της εμβιομηχανικής αντοχής και των δομικών παραμέτρων της δοκιδωτής, συμπεριλαμβανομένων των BMD, BMC, TMC και Tb. Ν και αυξάνοντας το Tb. Sp; και η θεραπεία του Cis A βελτίωσε σημαντικά τις μηχανικές ιδιότητες των οστών, συμπεριλαμβανομένου του μέγιστου φορτίου και ακαμψίας, ενίσχυσε την BMD και βελτίωσε τις περισσότερες δομικές παραμέτρους της μικροαρχιτεκτονικής της δοκιδωτής οστού σε σύγκριση με τα ποντίκια της ομάδας OVX, υποδεικνύοντας ότι το Cis A ήταν αποτελεσματικό στη βελτίωση της ποιότητας των οστών και δοκιδωτή μικροαρχιτεκτονική σε ποντίκια OVX.

Εκτός από τη συνολική BMD, η δοκιμή κάμψης τριών σημείων και η μέτρηση της μικροαρχιτεκτονικής του δοκιδωτού οστού θα μπορούσαν να διαγνώσουν άμεσα την οστεοπόρωση, οι δείκτες σχηματισμού οστού, συμπεριλαμβανομένων των ALP και BGP, και ο δείκτης οστικής απορρόφησης, συμπεριλαμβανομένων των TRAP, DPD και καθεψίνης Κ, χρησιμοποιήθηκε επίσης για αποσαφηνίσει τους σχετικούς αντιοστεοπορωτικούς μηχανισμούς του Cis A. Στη μελέτη μας, η δραστηριότητα της ALP στα ποντίκια της ομάδας OVX έδειξε μια μη σημαντική αυξητική τάση, η οποία έδειξε αυξημένο ρυθμό οστικής ανανέωσης [26,27] στην μετεμμηνοπαυσιακή οστεοπόρωση. η υψηλή (80 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) και η χαμηλή (20 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) δόση των θεραπειών Cis A έδειξαν σημαντική ενίσχυση της δραστηριότητας ALP σε σύγκριση με την ψευδή ομάδα, ενώ η δραστηριότητα BGP δεν φαινόταν να επηρεάζεται από την ωοθηκεκτομή σε όλες τις ομάδες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία. Η TRAP, η DPD και η καθεψίνη Κ αυξήθηκαν σημαντικά στην ομάδα OVX και η χορήγηση Cis A μείωσε σημαντικά και τους τρεις δείκτες οστικής απορρόφησης. Τα παραπάνω δεδομένα υποδηλώνουν ότι το Cis A διέθετε πιθανή αντιοστεοπορωτική δράση και αυτό το αποτέλεσμα ασκήθηκε από τη ρύθμιση του μεταβολισμού των οστών, συμπεριλαμβανομένης τόσο της καταστολής της οστικής απορρόφησης όσο και της αύξησης του σχηματισμού οστού.

Ο συντονισμός μεταξύ οστεοβλάστης και οστεοκλαστής είναι ένας κρίσιμος παράγοντας για τη διατήρηση της σκελετικής ακεραιότητας. Οι οστεοκλάστες, που εκφράζουν την TRAP, προσκολλώνται στην επιφάνεια του οστού μέσω του σχηματισμού σφραγιστικών ζωνών δεσμευμένων στην ακτίνη, εντός των οποίων απελευθερώνονται πρωτεολυτικά ένζυμα, όπως η καθεψίνη Κ, οδηγώντας στο σχηματισμό κοιλοτήτων απορρόφησης. Η ρύθμιση της οστεοκλαστογένεσης από ανώριμα κύτταρα της οστεοβλαστικής γενεαλογίας μεσολαβείται από RANKL και OPG [28]. Το OPG είναι ένας υποδοχέας δόλωμα που αναστέλλει την ενεργοποίηση του RANKL της οστεοκλαστογένεσης, μειώνοντας έτσι την οστική απορρόφηση. Το RANKL, το οποίο παρέχει ένα σημαντικό σήμα στους προγονικούς οστεοκλάστες, είναι ένα μόριο δεσμευμένο στη μεμβράνη της οικογένειας προσδέματος παράγοντα νέκρωσης όγκου που προάγει το σχηματισμό οστεοκλαστών. Η αναλογία έκφρασης OPG/RANKL πιστεύεται ότι είναι μια βασική παράμετρος της οστεοκλαστογονικής δραστηριότητας και οι καταρράκτες σηματοδότησης που ενεργοποιούνται από το RANKL περιλαμβάνουν τις οδούς NF-κB και PI3K [29]. Η σημασία της οδού NF-κB για την οστεοκλαστογένεση αποδεικνύεται από το γεγονός ότι η διαγραφή του NF-κB σε ποντίκια είχε ως αποτέλεσμα την απουσία ώριμων οστεοκλαστών [30]. Το TRAF6 αποδείχθηκε ως ένας πολλά υποσχόμενος στόχος για νέα αντιοστεοπορωτικά φάρμακα. Ποντίκια με ανεπάρκεια TRAF{11} που εμφάνιζαν ελαττωματική οστεοκλαστογένεση και σοβαρή οστεοπέτρωση κατέδειξαν έτσι τη σημασία του TRAF6 στον μεταβολισμό των οστών. Τα αναδυόμενα στοιχεία δείχνουν μια κρίσιμη ρυθμιστική λειτουργία για το TRAF6 σε καταρράκτες σηματοδότησης που διαμεσολαβούνται από RANKL/RANK [4,31]. Τα δεδομένα της τρέχουσας μελέτης έδειξαν ότι η θεραπεία με Cis A στα ποντίκια OVX είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης TRAF6, μειωμένο RANKL και αυξημένες εκφράσεις OPG εμποδίζοντας έτσι την ενεργοποίηση RANKL του κατάντη NF-κB και ενεργοποίηση των οδών σήματος PI3K/Akt. υποδηλώνοντας ότι το Cis A αναστέλλει τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών μέσω της αδρανοποίησης του NF-kappaB που διαμεσολαβείται από το TRAF{{20} και της ενεργοποίησης PI3K/Akt και αυξάνει την αναλογία OPG/RANKL, αναστέλλοντας στη συνέχεια την οστεοκλαστογένεση και προάγοντας τον σχηματισμό οστού.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FORΑΝΤΙΟΣΤΕΟΠΟΡΩΤΙΚΗ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑPHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Υλικά και Μέθοδοι

3.1. Φυτικά Υλικά, Παρασκευή και Προσδιορισμός

Στελέχη Cistanche deserticolaΤο YC Ma, που ταυτοποιήθηκε από τον καθηγητή Xue-yan Fu του Τμήματος Φαρμακευτικής του Ιατρικού Πανεπιστημίου Ningxia, συλλέχθηκαν στις 2 Σεπτεμβρίου 015 στην κομητεία Yongning, στην επαρχία Ningxia, στην Κίνα. Ένα δείγμα κουπονιού (#20150901) διατηρήθηκε στο ερμπάριο του τμήματος φαρμακείου. Συνολικά 30,0kg ξηρανθέντων στον αέρα μίσχων C. deserticola εκχυλίστηκαν με αναρροή με 70% αιθανόλη (180 L, 3 χ 2 ώρες) 3 φορές. Τα διηθήματα συνδυάστηκαν και υποβλήθηκαν σε στήλη μακροπορώδους ρητίνης (ΑΒ{-8) με σύστημα διαλυτών σταδιακής βαθμίδωσης αυξανόμενης αιθανόλης σε νερό (0%, 20% και 60%, το καθένα 60 L) για να δώσουν τρία κλάσματα, στη συνέχεια Το 60% του κλάσματος καθαρίστηκε περαιτέρω με Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech Co., Uppsala, Σουηδία) και ημιπαρασκευαστική υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (Agilent 1100, Agilent Technologies, Waldbronn, Γερμανία) για να ληφθεί ανοιχτό κίτρινο κιστανοσίδη Α 4,5 g (Cis Α, η απόδοση ήταν 0,015%). Η δομή διευκρινίστηκε κυρίως με αναλύσεις δεδομένων NMR (Bruker Avance, 400 MHz, Γερμανία) και φασμάτων MS (Agilent 6540, Agilent Technologies), οι οποίες ήταν συνεπείς με τα αναφερόμενα δεδομένα [19]. Η καθαρότητά του προσδιορίστηκε με τη μέθοδο κανονικοποίησης της περιοχής HPLC (Εικόνα 5). Σε πειράματα σε ζώα, με βάση το προκαταρκτικό μας πείραμα, η δόση του Cis A ήταν 20–80 mg/kg/ημέρα.

3.2. Χημικά και Διαλύτες

Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα: κιτ εκχύλισης ολικής πρωτεΐνης και κιτ κβαντοποίησης πρωτεΐνης BCA (Ken Gen Biotech. Co. Ltd, Nanjing, Κίνα), πρωτογενή αντισώματα TRAF6, NF-κB, PI3K, Akt, RANKL, OPG, -ακτίνη και τουμπουλίνη ( Τεχνολογία κυτταρικής σηματοδότησης, Beverly, MA, ΗΠΑ), δευτερογενή αντισώματα συζευγμένης με υπεροξειδάση χρένου, αντι-κουνελιού IgG κατσίκας (ZSGB-BIO, Πεκίνο, Κίνα), βαλερική οιστραδιόλη (1 mg, Delpharm Lille SAS, Παρίσι, Γαλλία), οστό Gla -Κιτ ELISA διασυνδέει πρωτεΐνες και δεοξυπυριδινολίνη (Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, Κίνα) και το κιτ ELISA καθεψίνης K (Biovision, Mountain View, CA, USA). Όλα τα άλλα χημικά και βιοχημικά μέσα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αντιδραστήρια αναλυτικής ποιότητας AR.

3.3. Πειράματα σε ζώα

Εξήντα θηλυκά ποντίκια στελέχους Kunming, ηλικίας 8 εβδομάδων με σωματικό βάρος 26.0 ± 1,62 g, αγοράστηκαν από το Ιατρικό Πανεπιστήμιο Ningxia και 10 ποντίκια κρατήθηκαν σε ένα κλουβί με τυπική εργαστηριακή δίαιτα και νερό της βρύσης υπό συνθήκες ελεγχόμενου αέρα (24.0 ± 0,5 ◦C, 45%–50% υγρασία και 12 ώρες/12 ώρες κύκλοι φωτισμού φωτός-σκότους). Αφού εγκλιματίστηκαν για 1 εβδομάδα, η χειρουργική επέμβαση έγινε υπό άσηπτη κατάσταση και όλα τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με ένυδρη χλωράλη (100 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκή). τα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε χειρουργική έκθεση χωρίς αφαίρεση των ωοθηκών ήταν η εικονική ομάδα (n=10). οι άλλες υποβλήθηκαν σε αμφοτερόπλευρη ωοθηκεκτομή ως ομάδες OVX (n=50). Τα παραπάνω πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τον οδηγό για τη φροντίδα και τη χρήση πειραματόζωων και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Βιοηθικής του Ιατρικού Πανεπιστημίου Ningxia.

Μετά από μια άλλη περίοδο ανάρρωσης {{0}}εβδομάδων, τα παραπάνω 50 ποντίκια OVX χωρίστηκαν τυχαία και εξίσου σε 5 ομάδες: έλαβαν από του στόματος βαλερική οιστραδιόλη (1 mg/kg/ημέρα) ως θετικό έλεγχο (EV). με 20, 40 και 80 mg/kg/ημέρα Cis A ως ομάδες χαμηλής, μέτριας και υψηλής δόσης, αντίστοιχα. με το όχημα (0,5% Καρβοξυμεθυλοκυτταρίνη()-Na) ως ομάδα μοντέλου (OVX). Σε όλα τα ποντίκια χορηγήθηκε από το στόμα ίσος όγκος 1 mL/100 g σωματικού βάρους φορέα, EV ή Cis A, που ξεκίνησε τη δεύτερη εβδομάδα μετά την επέμβαση και διήρκεσε για 12 εβδομάδες. Το σωματικό βάρος μετρήθηκε δύο φορές την εβδομάδα, με τη δόση να προσαρμόζεται ανάλογα. Μετά την τελευταία από του στόματος χορήγηση, δείγματα αίματος αφαιρέθηκαν από τη μηριαία αρτηρία αναισθητοποιημένων ποντικών, αφέθηκαν να πήξουν και φυγοκεντρήθηκαν στα 3000 × g για 10 λεπτά για να δώσουν ορό. έγινε ανατομή του δεξιού μηρού και της κνήμης. Όλα τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -80 ◦C για περαιτέρω αξιολόγηση της μικροαρχιτεκτονικής των οστών και των βιοχημικών παραμέτρων ορού που σχετίζονται με την οστεοπόρωση.

3.4. Δοκιμή κάμψης τριών σημείων

Η εμβιομηχανική ιδιότητα του δεξιού μηριαίου οστού του ποντικιού προσδιορίστηκε με χρήση διάταξης κάμψης τριών σημείων. Η ράβδος κάμψης έχει ένα στήριγμα σε σχήμα V για τη στερέωση των περιφερικών και των εγγύς άκρων του μηριαίου οστού κατά τη διάρκεια της δοκιμής. Το μηριαίο οστό τοποθετήθηκε οριζόντια με την πρόσθια πλευρά προς τα πάνω και το φορτίο εφαρμόστηκε προς τα κάτω στο κέντρο του μέσου μηριαίου οστού. Η απόσταση μεταξύ των στηρίξεων ήταν 8 mm. Τα οστά φορτώθηκαν με σταθερό ρυθμό μετατόπισης 0,02 mm/s μέχρι την αστοχία χρησιμοποιώντας μια μηχανή δοκιμών BOSE (3220) (Bose Corporation, Endura TEC Systems Group, Minnetonka, MN, ΗΠΑ). Οι καμπύλες φορτίου-μετατόπισης λήφθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό των δομικών και υλικών ιδιοτήτων, συμπεριλαμβανομένου του μέγιστου φορτίου, του μέγιστου φορτίου, του συντελεστή ελαστικότητας, της αντοχής σε κάμψη κ.λπ.

3.5. Ανάλυση μικροϋπολογιστικής τομογραφίας

Τα δεξιά μηριαία οστά όλων των ποντικών καθαρίστηκαν από προσκολλημένους μαλακούς ιστούς και η μικροαρχιτεκτονική του δοκιδωτού οστού του παραπάνω δεξιού περιφερικού μηριαίου μεταφυσικού προσδιορίστηκε με σαρωτή μικρο-CT (eXplore Locus SP, GE Healthcare, London, ON, Καναδάς) με η ισοτροπική ανάλυση ορίστηκε στα 8 μm και στις τρεις χωρικές διαστάσεις. Η περιοχή ενδιαφέροντος (ROI) επιλέχθηκε χρησιμοποιώντας τις ίδιες συντεταγμένες στην πλάκα ανάπτυξης του μηριαίου οστού. Οι μορφομετρικές παράμετροι των οστών, συμπεριλαμβανομένης της BMD, της περιεκτικότητας σε ορυκτά οστών (BMC), της περιεκτικότητας σε μεταλλικά στοιχεία ιστού (TMC), της πυκνότητας των ιστών (TMD), του κλάσματος όγκου οστού (BVF), του διαχωρισμού των δοκίδων (Tb. Sp), του αριθμού δοκιδωτών (Tb. N ) και το δοκιδωτό πάχος (Tb. Th), αξιολογήθηκαν μέσω ανάλυσης του ROI χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης οστού ΑΒΑ.

3.6. Ανάλυση Βιοχημικών Παραμέτρων

Η δραστικότητα της αλκαλικής φωσφατάσης ορού (ALP) μετρήθηκε σε έναν αυτόματο αναλυτή (Ciba-Corning 550 Diagnostics, Corp., Oberlin, ΟΗ, ΗΠΑ)). Τα επίπεδα DPD, BGP και καθεψίνης Κ ορού προσδιορίστηκαν με αντίστοιχα κιτ αντιδραστηρίων και η ανθεκτική σε τρυγικό οξύ όξινη φωσφατάση (TRAP) αναλύθηκε σύμφωνα με τη σχετική βιβλιογραφία [32].

3.7. Ανάλυση Western Blot

Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης των TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG και RANKL σε διαφορετικές ομάδες ανιχνεύθηκαν με ανάλυση Western blot. Εν συντομία, η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από τη δεξιά κνήμη ποντικών χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 0,5 mM φαινυλμεθυλσουλφονυλοφθορίδιο, πρωτεάση και αναστολείς φωσφατάσης. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στους 12,000× g για να ληφθούν τα υπερκείμενα για περαιτέρω ανάλυση. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης των προϊόντων λύσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ποσοτικό προσδιορισμό δικινχονικού οξέος. Πρωτεΐνες (50-100 μg) διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας 10% SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου και επωάστηκαν με μονοκλωνικά πρωτογενή αντισώματα που στοχεύουν τα TRAF6, NF-κB RANKL, PI3K, Akt, OPG και -ακτίνη (1:500). Η ίδια μεμβράνη απογυμνώθηκε και ανιχνεύθηκε ξανά, με σήματα χημειοφωταύγειας που ανιχνεύθηκαν από το λογισμικό Image Lab. -η ακτίνη ή η τουμπουλίνη χρησίμευε ως εσωτερικός έλεγχος.

3.8. Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα που ελήφθησαν από πειράματα σε ζώα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης με τη δοκιμή Dennett από το SPSS (Έκδοση 22.0, IBM SPSS Statistics, IBM Corp., Armonk, Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ ) λογισμικό· μια τιμή p < 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική και όλα τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν ως η μέση τιμή ± SD.

4. Συμπεράσματα

Συνοπτικά, Cis A,ενεργούς φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδεςπου απομονώθηκε από το C. deserticola, εμφάνισε σημαντική αντιοστεοπορωτική δράση σε ποντίκια OVX και ο μοριακός μηχανισμός μπορεί να σχετίζεται με την αδρανοποίηση του NF-kappaB που προκαλείται από το TRAF6- και την ενεργοποίηση PI3K/Akt, επομένως πιθανότατα ένας πολλά υποσχόμενος παράγοντας για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης ασθένεια.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FORΑΝΤΙΟΣΤΕΟΠΟΡΩΤΙΚΗ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑPHGS75% ECH 30% ACT 12%