Ο μηχανισμός της cistanche deserticola που προάγει την εντερική λειτουργία

Γιουάν Γκάο, Τσουάντζιε Ζονγκ, Φεν Λιου, Λέι Φανγκ, Ρούνλαν Κάι, Γιου Σι, Σι Τσεν, Γιουν Τσι

Αφηρημένος

ΦαινυλαιθανοειδέςΓλυκοσίδες(PhGs), μια κατηγορία πολυφαινολικών ενώσεων, θεωρούνται ένα από τα σημαντικότερα βιοδραστικά συστατικά τουΣιστάντσεερημικόλαY.C. Ma (CD), του οποίου το εκχύλισμα χρησιμοποιείται από το στόμα στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική. Αν και προηγούμενες φαρμακολογικές μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα PHGs ασκούν πολλές δραστηριότητες, τα προφίλ εντερικής μεταφοράς τους δεν έχουν αποσαφηνιστεί. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την εντερική διαπερατότητα ενός εκχυλίσματος πλούσιου σε PhG (PRE) απόΣιστάντσεΈρημοςως ολοκληρωμένο σύστημα στο μοντέλο μονοστιβάδας κυττάρων Caco-2 χρησιμοποιώντας ένα σύστημα βιοανάλυσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το PRE μεταφέρεται κυρίως μέσω ανεπαρκώς απορροφημένης παθητικής διάχυσης προς τα κάτω σε μια κλίση συγκέντρωσης χωρίς εκροή, η οποία παρέχει τη φαρμακοκινητική βάση για την κλινική εφαρμογή των PhGs σεΣιστάντσε Λιποταξία. Προσδιορίσαμε επίσης την εντερική διαπερατότητα τριών μεγάλωνΠ.Γ.Σ.[acteoside (AC), ισοακτεοσίδη (IS) και εχινοσίδη (EC)]από την HLPC. Επιπλέον, αναπτύξαμε μια νέα μέθοδο ανίχνευσης φθορισμού HPLC για τον ακριβή προσδιορισμό της ποσότητας ροής ac και IS. Όπως αναμενόταν, τα χαρακτηριστικά μεταφοράς των τριώνΠ.Γ.Σ.είναι σύμφωνες με εκείνες των PRE, υποδεικνύοντας ότι το παρόν σύστημα βιολογικού προσδιορισμού είναι κατάλληλο και αξιόπιστο για την αξιολόγηση των χαρακτηριστικών μεταφοράς των ομάδων δραστικών συστατικών (AIG) στο PRE. Επιπλέον, αυτό το σύστημα μπορεί επίσης να είναι κατάλληλο για άλλα φυτικά εκχυλίσματα δεδομένης της κατάλληλης βιοδραστικότητας.

Επαφή:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Το Cistanche deserticola έχει πολλές επιπτώσεις, κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Εισαγωγή

Η κυτταρική σειρά Caco-2, η οποία προήλθε από αδενοκαρκινώματα του ανθρώπινου παχέος εντέρου, παρουσιάζει εντεροκύτταρα χαρακτηριστικά. Υπό κανονικές συνθήκες, τα κύτταρα Caco-2 διαφοροποιούνται αυθόρμητα από τα ώριμα κύτταρα και σχηματίζουν άθικτες μονοστιβάδες [1]. Τα γειτονικά κύτταρα προσκολλώνται μέσω στενών συνδέσεων που σχηματίζονται στην κορυφαία πλευρά της μονοστιβάδας, οι οποίες μπορούν να διακρίνουν τα παθητικά και ενεργά μεταφερόμενα φάρμακα κατά μήκος του επιθηλιακού στρώματος [2]. Λόγω της μορφολογικής και βιοχημικής ομοιότητας με τα φυσιολογικά εντεροκύτταρα, οι μονοστιβάδες κυττάρων Caco-2 χρησιμεύουν ως ένα καλά αποδεκτό in vitro μοντέλο για τη μελέτη του δυναμικού εντερικής απορρόφησης και των χαρακτηριστικών μεταφοράς των φαρμάκων [3, 4].

Σε αντίθεση με τις χημικές ουσίες, τα φυτικά εκχυλίσματα (PE) είναι μείγματα των οποίων η βιολογική δραστηριότητα και τα ενεργά συστατικά συχνά δεν αναγνωρίζονται καλά [5]. Επιπλέον, οι εντερικές ιδιότητες μεταφοράς της ΠΕ, σε αντίθεση με τις ιδιότητες των συστατικών της, συνδέονται στενά με την κλινική χρήση. Οι μετρήσεις ροής για ένα δείγμα δοκιμής σε μια μονοστιβάδα κυττάρων Caco-2 συνήθως περιλαμβάνουν χημικές μεθόδους, όπως HPLC, LC /MS κ.λπ. Αν και αυτές οι μέθοδοι είναι ισχυρά εργαλεία, είναι πολύπλοκες, χρονοβόρες, ακριβές και περιστασιακά απαιτούν εξελιγμένο εξοπλισμό. Το πιο σημαντικό είναι ότι ούτε μία ούτε μία ούτε μια μειοψηφική συνιστώσα μπορούν να αντικατοπτρίζουν τη μόνιμη εγκατάσταση στο σύνολό της. Ως εκ τούτου, πρέπει να θεσπιστεί μια νέα προσέγγιση ανεξάρτητη από τον προσδιορισμό των συστατικών για τον προσδιορισμό και την αξιολόγηση των χαρακτηριστικών μεταφοράς των PE.

ΣιστάντσεερημικόλαΤο Y.C. Ma (CD), ένα ολοπαρασιτικό φυτό, είναι ένα κοινό παραδοσιακό κινεζικό φάρμακο που χρησιμοποιείται κυρίως για τη θεραπεία της νεφρικής ανεπάρκειας, της αδυναμίας του σώματος και της δυσκοιλιότητας και αυτές οι χρήσεις έχουν καταγραφεί επίσημα στην Κινεζική Φαρμακοποιία [6]. Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (PhGs), συμπεριλαμβανομένης της εχινοκοσίδης (EC), της ακτινοσίδης (AC), της ισοακτεοσίδης (IS) κ.λπ., είναι μια κατηγορία πολυφαινολικών ενώσεων [7]. Θεωρούνται ένα από τα σημαντικότερα βιοδραστικά συστατικά τουΣιστάντσεείδος [8]. Φαρμακολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η βιοδραστικότητα τηςΠ.Γ.Σ.είναι ποικίλη και περιλαμβάνει αντιοξειδωτικά [9], αντι-κόπωση [10], ηπατοπροστατευτικά [11], ανοσορρυθμιστικά [12], αντιφλεγμονώδη [7, 13] και νευροπροστατευτικά αποτελέσματα [14]. Ωστόσο, τα χαρακτηριστικά εντερικής μεταφοράς τουΠ.Γ.Σ.δεν έχουν διερευνηθεί. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την εντερική διαπερατότητα ενός πλούσιου σε PhG εκχυλίσματος (PRE) από CD ως ολοκληρωμένο σύστημα και τη διαπερατότητα τριών κύριων PhGs (AC, IS και EC) σε διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το PRE μεταφέρεται κυρίως μέσω ανεπαρκώς απορροφημένης παθητικής διάχυσης προς τα κάτω σε μια κλίση συγκέντρωσης χωρίς εκροή, η οποία παρέχει τη φαρμακοκινητική βάση για την κλινική εφαρμογή των PhGs σε CD.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά

Η ανθρώπινη εντερική κυτταρική σειρά Caco-2 ελήφθη από την Αμερικανική Συλλογή Καλλιέργειας Τύπου (ATCC, Rockville, MD, ΗΠΑ). Ac, IS και EC (>98%) αγοράστηκαν από την Must Biotechnology Co. (Τσενγκντού, Κίνα). Το τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) του Dulbecco, ο ορός εμβρυϊκών βοοειδών (FBS) και τα μη απαραίτητα αμινοξέα (NEAA) παρήχθησαν από την Gibco BRL (Grand Island, NY, ΗΠΑ). Οι πλάκες TranswellTM 6-well (περιοχή ανάπτυξης μεμβράνης εισαγωγής 4,67 cm2 ) ελήφθησαν από την Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, ΗΠΑ). Το κολλαγόνο ουράς αρουραίου ελήφθη από το Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ΗΠΑ). Όλα τα αντιδραστήρια και οι χημικές ουσίες για την ανάλυση HPLC ήταν αναλυτικής ποιότητας.

Προετοιμασία του PRE από την ερημική cistanche

Το αποξηραμένο στον αέρα υλικό CD κονιοποιήθηκε και εξήχθη με διήθηση με 70% αιθανόλη. Το πλούσιο σε PhG κλάσμα παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10] και εξήχθη με κορεσμένη με νερό n-βουτυλική αλκοόλη. Το υγρό του εκχυλίσματος συμπυκνώθηκε και αποξηράνθηκε υπό μειωμένη πίεση. Η φασματοφωτομετρία μακροπορικής ρητίνης-UV [15] μέτρησε περιεκτικότητα σε PhG 78,4%. Το τελικό δείγμα αντιπροσώπευε απόδοση 1,75% της πρώτης ύλης σε ξηρό βάρος. Το ληφθέν δείγμα αποθηκεύτηκε στους −20°C μέχρι την περαιτέρω χρήση.

Προσδιορισμός εναλλασσόμενου ρεύματος, IS και EC με HPLC

Ένα σύστημα Shimadzu HPLC εξοπλισμένο με το λογισμικό λύσης LC χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο του περιεχομένου των AC, IS και EC στο PRE. Χρησιμοποιήθηκε μια στήλη Αντίστροφης φάσης Intersil C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) και διατηρήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου. Οι κινητές φάσεις ήταν ακετονιτρίλιο και νερό που περιείχαν 0,1% φωσφορικό οξύ (v/v) με έκλουση κλίσης (Πίνακας 1) με ρυθμό ροής 1,0 ml/min. Ο ανιχνευτής φασματοφωτόμετρου UV ρυθμίστηκε στα 334 nm. Για να προσδιορίσουμε με ακρίβεια τη ροή του AC και του IS, αναπτύξαμε μια νέα μέθοδο ανίχνευσης φθορισμού HPLC (HPLC-FLD). Μετά από δομική ανάλυση και σάρωση μήκους κύματος φθορισμού (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται), λάβαμε τις βέλτιστες συνθήκες ανίχνευσης φθορισμού για εναλλασσόμενο ρεύμα (π.χ.: 338 nm, Em: 448 nm) και IS (Ex: 320 nm, Em: 434 nm)

Η αναλυτική μέθοδος HPLC επικυρώθηκε χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα χαρακτηριστικά επιδόσεων: σταθερότητα, γραμμικότητα, ευαισθησία, ακρίβεια (ενδοημερήσια και ενδοημερήσια μεταβλητότητα) και ακρίβεια. Οι αναλυτέες ουσίες στο ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς αποθηκεύτηκαν στους 25°C στο σκοτάδι για 24 ώρες και μετρήθηκε η σταθερότητά τους. Οι αναλυτέες ουσίες ήταν ιδιαίτερα σταθερές παρουσία βιταμίνης C (0,4%) επειδή οι τιμές της σχετικής τυπικής απόκλισης (RSD) στις περιοχές αιχμής ήταν< 3.5%.="" the="" linear="" regression="" equation,="" correlation="" coefficient,="" range="" of="" linearity,="" lod,="" and="" loq="" for="" ac,="" is,="" and="" ec="" are="" shown="" in="" table="" 2.="" the="" lods="" (18–30="" nm)="" and="" loqs="" (60–100="" nm)="" values="" illustrate="" that="" the="" hplc-fld="" and="" hplc-uv="" methods="" are="" highly="" sensitive.="" the="" rsd="" values="" that="" express="" the="" precision="" of="" the="" method="" were="" all="">< 2%="" for="" intra-="" and="" inter-day="" variability,="" indicating="" good="" precision.="" for="" recovery="" evaluation,="" ac,="" is,="" and="" ec="" was="" added="" to="" the="" transport="" buffer="" to="" yield="" three="" (high,="" medium,="" and="" low)="" concentration="" levels.="" the="" recovery="" values="" of="" the="" method="" for="" the="" analytes="" are="" summarized="" in="" table="" 3.="" the="" average="" recoveries="" ranged="" from="" 90.0%="" to="" 96.4%,="" indicating="" good="" accuracy.="" in="" conclusion,="" the="" established="" hplc="" methods="" are="" satisfactory="" with="" respect="" to="" linearity,="" sensitivity,="" precision,="" and="" accuracy="" for="" the="" quantification="" of="" ac,="" is,="" and="" ec="" in="" transport="">

Προσδιορισμός του PRE με σύστημα βιοδοκιμασίας

Η βιοδοκιμασία (συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα) βασίστηκε στη δοκιμασία FRAP (αναγωγική/αντιοξειδωτική ισχύς σιδήρου) που περιγράψαμε προηγουμένως [16] και επικυρώθηκε από την άποψη της γραμμικότητας και της ακρίβειας (ενδοημερήσια και ενδοημερήσια μεταβλητότητα). Η γραμμικότητα της μεθόδου βιοπροσδιορισμού προσδιορίστηκε με βάση τις καμπύλες βαθμονόμησης. Το εύρος συγκέντρωσης γραμμικότητας ήταν 0,0625 − 40 μg/ml (y = 0,0258x+0,0968, R2 = 0,996). Η ακρίβεια της καθιερωμένης μεθόδου βιοπροσδιορισμού προσδιορίστηκε ως προς την ενδοημερήσια και ενδοημερήσια μεταβλητότητα για την ανάλυση του PRE (10,0 μg/ml). Η ενδοημερήσια επαναληψιμότητα της μεθόδου προσδιορίστηκε με βάση πέντε διαδοχικούς προσδιορισμούς την ίδια ημέρα. Η ενδοημερήσια επαναληψιμότητα μετρήθηκε με βάση πέντε διαδοχικούς προσδιορισμούς σε τρεις διαφορετικές ημέρες. Οι τιμές RSD για την ακρίβεια της μεθόδου ήταν 1,014% και 4,72% για την ενδοημερήσια και ενδοημερήσια μεταβλητότητα, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας καλή ακρίβεια. Έτσι, η καθιερωμένη μέθοδος βιοδοκιμασίας είναι ικανοποιητική όσον αφορά τη γραμμικότητα, την ακρίβεια και την ακρίβεια για τον ποσοτικό προσδιορισμό του PRE στο ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς.

Κυτταροκαλλιέργεια

Τα caco-2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 °C και 95% σχετική υγρασία σε μια ατμόσφαιρα που περιείχε 5% CO2 και θρεπτικό μέσο αποτελούμενο από DMEM, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-γλουταμίνη, πενικιλίνη (100 U/ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg/ml). Το μέσο άλλαζε κάθε δεύτερη μέρα κατά τη διάρκεια της κυτταρικής ανάπτυξης και διαφοροποίησης. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλαστικές φιάλες 75-cm2 και συλλέχθηκαν κάθε 3-5 ημέρες με 0,05% EDTA-θρυψίνη. Για τα πειράματα μεταφοράς, τα κύτταρα σπέρνονταν σε πυκνότητα 1×105 κυττάρων/cm2 σε ένθετα Transwell επικαλυμμένα με κολλαγόνο. Περίπου 21 ημέρες μετά τη σπορά, οι μονοστιβάδες χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα μεταφοράς. Η ακεραιότητά τους προσδιορίστηκε μετρώντας τη δια-επιθηλιακή ηλεκτρική αντίσταση (TEER) σε όλες τις μονοστιβάδες με ένα EVOM εξοπλισμένο με ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., USA). Οι τιμές TEER της μονοστοιβάδας κυττάρων Caco-2 έπρεπε να υπερβαίνουν τα 500 O∙cm2.

Πειράματα στον τομέα των μεταφορών

Η μονοστιβάδα πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (ρυθμιστικό διάλυμα P που περιείχε 10 mM HEPES, 1 mM πυροσταφυλικού νατρίου, 10 mM γλυκόζης, 3 mM CaCl2 και 145 mM NaCl, pH 7,4) και στη συνέχεια προ-επωάστηκε για 20 λεπτά στους 37°C. Μετά την αφαίρεση του ρυθμιστικού διαλύματος μεταφοράς, προστέθηκε φρέσκο ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς που περιείχε δείγματα δοκιμής στον κορυφαίο θάλαμο (AP) (1,5 ml) σε κατευθυντικές μελέτες AP σε βασεόπλευρες (BL) ή στον θάλαμο BL (2,5 ml) σε κατευθυντικές μελέτες BL έως AP. Για τις δοκιμασίες AC, IS και EC με χρήση HPLC, αφαιρέθηκε ένα κλάσμα (300 μl) από κάθε θάλαμο δέκτη σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα (30, 60, 90 και 120 λεπτά). Ο θάλαμος λήψης αναπληρώθηκε με τον ίδιο όγκο φρέσκου προθερμασμένου (37°C) ρυθμιστικού διαλύματος μεταφοράς μετά από κάθε δειγματοληψία. Τα δείγματα που συλλέχθηκαν αποθηκεύτηκαν στους −20°C για περαιτέρω χρήση. Για τον προσδιορισμό του PRE με τη χρήση βιοδοκιμασίας, ελήφθησαν μόνο τα δείγματα στα 120 λεπτά. Λόγω της αστάθειας των PRE, AC, IS και EC, προστέθηκε 0,4% (w/v) βιταμίνη C για τη σταθεροποίηση των δειγμάτων προκειμένου να προσδιοριστεί το περιεχόμενο AC, IS και EC με HPLC και τα δείγματα για τη βιοανάδραση PRE ελέγχθηκαν αμέσως μετά τη δειγματοληψία. Υπολογίστηκε η τιμή του συντελεστή φαινομενικής διαπερατότητας (Papp ή 'Papp) κάθε δείγματος.

Ανάλυση δεδομένων

Οι τιμές Papp στις κατευθύνσεις AP BL ή BLAP των AC, IS και EC υπολογίστηκαν με βάση την ακόλουθη εξίσωση: Papp = (4Q/4t)/(A C0), όπου Papp είναι ο φαινομενικός συντελεστής διαπερατότητας (cm/s) που προσδιορίζεται με HPLC. (4Q/4t) είναι ο ρυθμός εμφάνισης της υπό δοκιμή σύνθεσης (AC, IS ή EC) στην πλευρά του δέκτη (μmol/s)· A είναι η επιφάνεια του ενθέματος (cm2 ). C0 είναι η αρχική συγκέντρωση της εξεταζόμενης ουσίας στην πλευρά του δότη (μmol/ml). Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε η μονάδα μάζας "μg" αντί του "μmol" όταν υπολογίστηκαν οι τιμές 'Papp. Τα δεδομένα εκφράζονται ως τα μέσα ± SD.

Αποτελέσματα

Σύνθεση των acteoside, ισοακτεοσίδης και εχινοκοσίδης σε PRE από την κιστάντσε στερηνικόλα

Επειδή το AC, το IS και το EC θεωρούνται τα κύρια βιοδραστικά PHG των ειδών Cistanche [8], αναλύσαμε το περιεχόμενό τους στο PRE μέσω HPLC-UV. Το αντιπροσωπευτικό χρωματογράφημα παρουσιάζεται στο σχήμα 1. Η ταυτοποίηση αυτών των συστατικών βασίστηκε στη σύγκριση των χρόνων κατακράτησης και του φάσματος UV με εκείνους των αυθεντικών προτύπων σε μήκος κύματος 334 nm. Η περιεκτικότητα των AC, IS και EC σε PRE ήταν 26,60%, 1,84% και 32,83%, αντίστοιχα. Έτσι, αυτές οι τρεις ενώσεις αντιπροσωπεύουν το 61,27% του PRE. Επιπλέον, τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η περιεκτικότητα σε PhG σε PRE είναι 78,4%. Ως εκ τούτου, το AC, το IS και το EC αντιπροσωπεύουν περίπου το 80% των PHG στις ΕΠΑ.

Συνολικές αντιοξειδωτικές ικανότητες των PRE, AC, IS και EC

Έχουν αναφερθεί μελέτες για την αντιοξειδωτική δράση των PhGs από CD [9], και το AC, το IS και το EC αντιπροσωπεύει περίπου το 80% των PhGs στο PRE. Έτσι, οι συνολικές αντιοξειδωτικές ικανότητες των PRE, AC, IS και EC δοκιμάστηκαν και εκφράζονται χρησιμοποιώντας τις τιμές FRAP (× 10-6 mmol). Όπως φαίνεται στο σχήμα 2, όταν η τιμή FRAP ήταν 8 × 10–6 mmol, οι τελικές συγκεντρώσεις ΤΩΝ PRE, AC, IS και EC ήταν 6,20 μg/ml, 3,14 μg/ml, 22,92 μg/ml και 4,89 μg/ml, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι η συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα αυτών των τεσσάρων δειγμάτων κατατάχθηκε ως εξής: AC > EC > PRE > IS. Η βιοδραστικότητα του PRE αποδίδεται στις ομάδες δραστικών συστατικών του (AIG). Για περίπου το 60% των PRE, AC και EC παρουσίασαν ισχυρότερη συνολική αντιοξειδωτική δράση από το PRE και το IS. Επειδή το IS (1,84%) αποτελεί ένα πολύ μικρό κλάσμα του PRE, άλλα συστατικά, όπως το ασθενώς αντιοξειδωτικό IS, είναι επίσης σαφώς ενεργά στο PRE. Παραδόξως, η συνολική αντιοξειδωτική δράση διέφερε σχεδόν 7 φορές μεταξύ του AC και του ισομερούς IS του, υποδεικνύοντας όχι μόνο τον αριθμό των φαινολικών ομάδων υδροξυλίου [9] αλλά και τη θέση των φαινολικών ομάδων υδροξυλίου στο μόριο που επηρέασαν το αντιοξειδωτικό αποτέλεσμα.

Επικύρωση των μονοστιβίων Caco-2

Για την επικύρωση του συστήματος μονοστιβάδας κυττάρων Caco-2, οι τιμές Papp της προπρανολόλης (ένας καλά μεταφερόμενος δείκτης) και του κίτρινου Lucifer (ένας ελάχιστα μεταφερόμενος δείκτης) από το AP στο BL κατά μήκος των μονοστιβλήτων Caco-2 προσδιορίστηκαν ως 1,51 × 10-5 cm/s και 2,8 × 10-7 cm/s, αντίστοιχα, και αυτές οι τιμές συμφώνησαν με εκείνες που δημοσιεύθηκαν σε προηγούμενες αναφορές [17, 18]. Η δοκιμασία δραστικότητας αλκαλικής φωσφατάσης επιβεβαίωσε επίσης ότι οι μονοστιβάδες των κυττάρων Caco-2 ήταν ποιοτικά συγκρίσιμες με το επιθήλιο του λεπτού εντέρου [19]

Η διαπερατότητα του Acteoside, του Ισοακτηεοσίδη και του Echinacoside

Γενικά, οι τιμές Papp των καλά απορροφημένων φαρμάκων ήταν υψηλές (> 1,0 × 10–5 cm/s), ενώ οι τιμές των φαρμάκων που απορροφήθηκαν ελάχιστα ήταν χαμηλές (< 1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3].="" as="" shown="" in="" table="" 4,="" the="" papp="" values="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" nearly="" on="" the="" order="" of="" 10–7="" cm/s,="" indicating="" that="" these="" compounds="" were="" poorly="" permeable.="" furthermore,="" efflux="" or="" active="" transport="" were="" not="" observed="" because="" the="" ratios="" of="" papp="" bl="" to="" ap="" papp="" ap="" to="" bl="" for="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" between="" 0.90="" ~="" 1.55,="" and="" the="" criterion="" of="" net="" efflux="" proposed="" by="" the="" fda="" guidance="" is="" a="" ratio="" less="" than="" 2="" [20].="" based="" on="" the="" kinetic="" curves="" presented="" in="" fig.="" 3,="" the="" bidirectional="" transport="" percentages="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" at="" 200="" μm="" increased="" linearly="" with="" time.="" the="" transport="" rate="" (tr)="" values="" of="" the="" three="" compounds="" increased="" linearly="" in="" both="" directions="" between="" approximately="" 100="" and="" 300="" μm="" (fig.="" 4).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" main="" transport="" mechanism="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" is="" also="" passive="">

Η διαπερατότητα του PRE

Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα του PRE οφείλεται τουλάχιστον στο 61,27% του AIG από pre. Έτσι, αξιολογήσαμε την TR του PRE με βάση την καμπύλη συγκέντρωσης-επίδρασης της συνολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας και υπολογίσαμε τις τιμές «Papp» προκειμένου να αντικατοπτρίζουν τα χαρακτηριστικά μεταφοράς του PRE. Οι «τιμές Papp του PRE για ap! BL και BL! Το AP ήταν (2,16 ± 0,26) × 10-7 cm/s και (3,13 ± 0,29) × 10-7 cm/s, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι αυτή η ένωση ήταν ελάχιστα διαπερατή. Επιπλέον, η εκροή ή η ενεργός μεταφορά δεν ήταν εμφανής επειδή η αναλογία «Papp BL προς AP / «Papp AP» προς BL για το PRE ήταν 1,45 [20]. Επιπλέον, το αμφίδρομο TR του PRE αυξήθηκε γραμμικά μεταξύ περίπου 300 και 900 μg/ml (Εικ. 5). Η έλλειψη κατευθυντικής προτίμησης των αποτελεσμάτων υποδηλώνει ότι η παθητική διάχυση είναι ο κύριος μηχανισμός μεταφοράς του PRE.

Συζήτηση

Σε σύγκριση με τα εξαιρετικά καθαρισμένα φαρμακευτικά προϊόντα, η ΠΕ είναι γενικά ένα μείγμα που αποτελείται από εκατοντάδες συστατικά με πολύ διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες. Ως εκ τούτου, η ΠΕ ασκεί συστηματική, πολυχτροκεντρική και πολυκαναλική συνεργιστική δράση λόγω του σύνθετου AIG [21], η οποία εμποδίζει την ανάλυση των χαρακτηριστικών μεταφοράς της ΠΕ. Για να αξιολογηθούν οι ιδιότητες μεταφοράς της ΠΕ πιο επιστημονικά, ορισμένοι ερευνητές έχουν εντοπίσει πολλαπλά συστατικά, αντί για ένα μόνο συστατικό, στο PE [22–24]. Ωστόσο, ένας περιορισμένος αριθμός συστατικών δεν μπορεί να αντικατοπτρίζει τη μόνιμη εγκατάσταση στο σύνολό της. Ωστόσο, ο προσδιορισμός όλων των συστατικών στο PE είναι αδύνατος. Επιπλέον, εάν διάφορα συστατικά των ιδιωτικών επενδυτικών κεφαλαίων εμφανίζουν εντελώς διαφορετικά χαρακτηριστικά μεταφοράς, τα ολιστικά χαρακτηριστικά μεταφοράς των ιδιωτικών επενδυτικών κεφαλαίων θα είναι δύσκολο να προσδιοριστούν.

Στη δεκαετία του 1990, χρησιμοποιήθηκαν συστήματα βιοδοκιμασίας για την αξιολόγηση της TR αντιμικροβιακών παραγόντων [25]. Μέχρι το 2005, ο Eguchi και οι συνάδελφοί του [26] είχαν αξιολογήσει την αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος καρότου χρησιμοποιώντας μέσα BL από διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2. η προσέγγιση αυτή είναι καταλληλότερη για να αντικατοπτρίζει in vivo καταστάσεις.

Με βάση μια προηγούμενη αναφορά της δραστηριότητας των PhGs [9] και τα αποτελέσματά μας (Εικ. 2), το TR του AIG στο PRE μπορεί να αξιολογηθεί προσδιορίζοντας τη συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα του μέσου στο θάλαμο του δέκτη. Μετά τα πειράματα μεταφοράς, διαπιστώσαμε ότι το TR του PRE ήταν παρόμοιο και προς τις δύο κατευθύνσεις και αυτή η μεταφορά ήταν ακόρεστη και απορροφήθηκε ελάχιστα («Papp»< 1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3],="" and="" it="" did="" not="" indicate="" efflux,="" suggesting="" that="" passive="" diffusion="" down="" a="" concentration="" gradient="" is="" the="" main="" transport="" mechanism="" of="" pre="" (fig.="" 5).="" furthermore,="" the="" transport="" characteristics="" of="" pre="" are="" consistent="" with="" those="" of="" ac,="" is,="" and="" ec,="" the="" effective="" components="" that="" display="" anti-oxidative="" activity="" in="" pre="" (fig.="" 4="" and="" table="" 4).="" this="" result="" was="" expected="" and="" indicated="" that="" the="" present="" bioassay="" system="" is="" appropriate="" and="" reliable="" for="" the="" evaluation="" of="" the="" transport="" characteristics="" of="" aig="" in="" pre="" in="" differentiated="" caco-2="">

Σε αντίθεση με την κανονική τιμή Papp, η οποία χρησιμοποιείται συνήθως για να αντικατοπτρίζει τη μεταφορά μιας μόνο ένωσης, η τιμή Papp που λαμβάνεται από την TR με βάση την καμπύλη συγκέντρωσης-επίδρασης μπορεί όχι μόνο να αντικατοπτρίζει τα συστατικά που διεισδύουν σε μονοστιβάδες με άθικτη δομή, αλλά και να περιλαμβάνει άλλους παράγοντες που σχετίζονται με τη δραστικότητα-στόχο, όπως οι μεταβολίτες των συστατικών, χημικά αποικοδομημένα προϊόντα, και ακόμη και μερικές κυτοκίνες που εκκρίνονται από τα κύτταρα Caco-2 ως απάντηση στη διέγερση που μπορεί να επηρεάσει τη βιοδραστικότητα-στόχο. Έτσι, ο πολυπαραγοντικός παράγοντας που προαναφέρθηκε, και όχι μόνο τα μεταφερόμενα άθικτα συστατικά, καθορίζει την τιμή «Papp». Επομένως, «το Papp μπορεί να συσχετιστεί πιο έντονα μέσα σε καταστάσεις Vivo από την κανονική τιμή Papp [26]. Σε αυτή τη μελέτη, διευκρινίσαμε την παθητικά διάχυτη και ανεπαρκώς απορροφούμενη φύση του PRE με βάση την «τιμή Papp» του, και αυτή η φύση μπορεί να σχετίζεται με την υψηλή δοσολογία και τη μακρά περίοδο κλινικής θεραπείας του CD [27]. Παρ 'όλα αυτά, αυτά τα ευρήματα θα παρέχουν πιο συστηματική καθοδήγηση για τους κλινικούς ιατρούς στην εφαρμογή του CD όταν έχουν εντοπιστεί μόνο τα χαρακτηριστικά μεταφοράς των περισσότερων AIG σε CD, όχι μόνο των PhGs.

Ωστόσο, το επιλεγμένο στοιχείο βιοδραστικότητας πρέπει να είναι επαρκώς ευαίσθητο ώστε να ανιχνεύεται στο μέσο του θαλάμου δέκτη, γεγονός που αποτελεί πρόκληση για τη δημιουργία ενός συστήματος βιοαντιπροσωπίας για την αξιολόγηση των χαρακτηριστικών μεταφοράς του PE. Επιπλέον, η βιοδραστικότητα θα πρέπει επίσης να εξαρτάται από όσο το δυνατόν περισσότερα συστατικά. Στη μελέτη μας, η συνολική δοκιμασία αντι-οξειδωτικής ικανότητας ήταν πιο κατάλληλη από αρκετές άλλες μεθόδους (S1 Εικ.). Αλλά ακόμα κι έτσι, η δοκιμή μας μπορεί να ανιχνεύσει μόνο το TR του PRE σε 120 λεπτά.

Συλλογικά, η παρούσα μελέτη καθιέρωσε ένα νέο σύστημα βιοανάλυσης για την αξιολόγηση της εντερικής διαπερατότητας του PRE σε διαφοροποιημένα κύτταρα Caco-2. Τα ληφθέντα αποτελέσματα έδειξαν ότι μια ανεπαρκώς απορροφημένη παθητική διάχυση κάτω από μια κλίση συγκέντρωσης χωρίς εκροή είναι ο κύριος μηχανισμός μεταφοράς του PRE (Σχήμα 5), ο οποίος παρέχει τη φαρμακοκινητική βάση για την κλινική εφαρμογή των PhGs σε CD. Η χρήση ενός νέου συστήματος βιοδοκιμασιών για την αξιολόγηση του TR και, ως εκ τούτου, τον υπολογισμό των τιμών «Papp» για την εκτίμηση της ιδιότητας εντερικής μεταφοράς του AIG σε PEs είναι σαφώς εφικτή. Αυτή η προσέγγιση μπορεί επίσης να είναι κατάλληλη για άλλες PE δεδομένης της κατάλληλης βιοδραστικότητας

Υποστηρικτικές Πληροφορίες

Σ1 Σχ. Επιδράσεις του PRE στο (Α) ανιόν υπεροξειδίου, (Β) ρίζα υδροξυλίου, (C) προϊόν υπεροξείδωσης λιπιδίων και (D) ρίζα DPPH. Οι διαδικασίες ανάλυσης πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές [1, 2] χωρίς τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος μεταφοράς. Οι τιμές IC50 (50% συγκέντρωση αναστολής) και SC50 (50% συγκέντρωση καθαρισμού) υπολογίστηκαν με βάση τις τυπικές καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης. (DOCX)

Συνεισφορές συγγραφέων

Συνέλαβε και σχεδίασε τα πειράματα: YG XC YQ. Εκτελέστηκαν τα πειράματα: YG CZ FL LF RC YS. Ανέλυσε τα δεδομένα: CZ YG YQ. Συνεισφερόμενα αντιδραστήρια/υλικά/εργαλεία ανάλυσης: RC. Γράφει το άρθρο: YG YQ

Τμήμα Ερευνητικού Κέντρου Φαρμακολογίας και Τοξικολογίας, Ινστιτούτο Ανάπτυξης Φαρμακευτικών Φυτών, Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών & Ιατρικό Κολλέγιο Peking Union, Πεκίνο, P.R. Κίνα,

Πανεπιστήμιο Κινεζικής Ιατρικής Heilongjiang, Χαρμπίν, Heilongjiang, P.R. Κίνα