Η Διαφορά των Χημικών Συστατικών και των Βιολογικών Δραστηριοτήτων των Ακατέργαστων Προϊόντων Φέτες και του Προϊόντος Επεξεργασμένου με Ατμό Οίνου από το Cistanche Deserticola

1. Εισαγωγή

Cistanche deserticolaείναι ένα κοινό παραδοσιακό κινέζικο φάρμακο και χρησιμοποιείται γενικά ως τονωτικό στην Κίνα και την Ιαπωνία εδώ και πολλά χρόνια, κοινώς γνωστό ως «τζίνσενγκ της ερήμου».Cistanche deserticolaκαταγράφηκε για πρώτη φορά ως κορυφαίος βαθμός στο "Shennong's Herbal Classic of Materia Medica (Shen Nong Ben Cao Jing)" περίπου το 100 π.Χ. και χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών όπως νεφρική ανεπάρκεια, ανικανότητα, γυναικεία υπογονιμότητα, νοσηρή λευκόρροια, άφθονη μετρορραγία (λευκά) , αίσθηση κρύου στην οσφύ και τα γόνατα και χρόνια δυσκοιλιότητα στους ηλικιωμένους [1]. Μέχρι στιγμής, έχουν απομονωθεί αρκετά κύρια συστατικά, όπως πολυσακχαρίτες [2, 3], φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (PhGs) [1, 4], ιριδοειδή [1] και συνδέτες [1, 5]. Ανάμεσα τους,PhGs και πολυσακχαρίτεςείναι τα κύρια βιολογικά ενεργά συστατικά σεCistanche deserticola[6–9]. Τα σύγχρονα φαρμακολογικά πειράματα το έχουν αποδείξειCistanchedeserticolaμπορεί να ενισχύσει την παραγωγή τεστοστερόνης και να προστατεύσει το σπέρμα, να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και να ενισχύσει την κυτταρική επιβίωση, επιδεικνύοντας αξιόλογες δραστηριότητες για τη σεξουαλική ισχύ, βελτιώνοντας τη μνήμη, την αντιγήρανση, τη σάρωση των ελεύθερων ριζών και τη νευροπροστασία [10-13].

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΠΑΡΑΔΟΣΙΑΚΑ ΚΙΝΕΖΙΚΑ ΒΟΤΑΝΑ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Για να μειωθεί η τοξικότητα και/ή να ενισχυθούν τα αποτελέσματα, τα περισσότερα από τα παραδοσιακά κινέζικα βότανα θα πρέπει να υποβάλλονται σε επεξεργασία πριν από τη συνταγή. τα παραδοσιακά στάδια της διαδικασίας περιλαμβάνουν τον καθαρισμό, τη διαδικασία νερού (άλεσμα σε νερό, στον ατμό και ψήσιμο) και την ελεύθερη διαδικασία (θέρμανση με κρασί, ξύδι, αλάτι ή μέλι) [14]. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας, τα χημικά συστατικά μπορεί να αλλάξουν: τα σχετικά περιεχόμενα ορισμένων συστατικών μπορεί να αλλάξουν ή να σχηματιστούν νέα συστατικά [15]. Η διαδικασία του Cistanche deserticola έχει μακρά ιστορία και το Cistanche deserticola θα πρέπει να υποβάλλεται σε επεξεργασία με μούλιασμα σε κρασί από ρύζι και στον ατμό, όπως περιγράφεται στην Chinese Pharmacopeia (έκδοση 2015) [16]. Το SPW έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζει τις επιδράσεις τους στους μεσημβρινούς των νεφρών σύμφωνα με τη θεωρία της παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής (TCM) [17]. Το WSCD τεκμηριώνεται για πρώτη φορά στο "Lei Gongs Treatise on Preparation and Boiling of Materia Medica (Lei Gong Pao Zhi Lun)" στη Βόρεια και Νότια Δυναστεία της Κίνας. Το WSCD χρησιμοποιείται καλύτερα για τη θεραπεία ανεπάρκειας των νεφρών και την προστασία του σπέρματος όπως καταγράφεται στο "Taiping Shenghui Fang" στη Δυναστεία Σονγκ της Κίνας. Ωστόσο, μέχρι στιγμής δεν έχουν γίνει συγκριτικές μελέτες για τα χημικά συστατικά μεταξύ RCD και WSCD.

Σύγχρονες φαρμακολογικές έρευνες έχουν δείξει ότι το WSCD θα μπορούσε να τονώσει το νεφρό για να εξασφαλίσει την ουσία διεγείροντας τον άξονα υποθάλαμος-υπόφυση-γονάδα σε διάφορους βαθμούς και χρησιμοποιείται για τη θεραπεία ανεπάρκειας στο νεφρό, όπως ανεπάρκεια νεφρού-yang [18]. Ωστόσο, μέχρι τώρα, οι διαφορές στις βιολογικές δραστηριότητες μεταξύ RCD και WSCD δεν έχουν ερευνηθεί. Πρόσφατα, για να διευκολυνθεί η πειραματική έρευνα, το μοντέλο ζώου με ανεπάρκεια νεφρού-yang έχει αντιγραφεί με ένεση σε αρουραίους με υψηλή δόση υδροκορτιζόνης, στην οποία οι αρουραίοι θα εμφανίσουν συμπτώματα που μοιάζουν πολύ με αυτά που περιγράφονται στην ανεπάρκεια νεφρού-yang του TCM [19, 20] . Οι αρουραίοι με ανεπάρκεια νεφρού-yang έχουν πάντα κάποια συμπτώματα όπως απώλεια βάρους, μείωση κατανάλωσης τροφής, αδυναμία, αυξημένη πρόσληψη νερού και μειωμένη δραστηριότητα. Με βάση αυτό το ζωικό μοντέλο, ανιχνεύθηκαν οι διαφορές στα θρεπτικά αποτελέσματα των νεφρών μεταξύ RCD και WSCD και μάλιστα αποκάλυψαν την επιστημονική ουσία της παραδοσιακής κινεζικής διαδικασίας.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Υλικά και Χημικά

Οι πρότυπες ουσίες όπως π.χακτεοσίδης, ισοακτεοσίδης, εχινακοσίδης, κιστανοσίδης Α και 2- ακετυλολακτεοσίδηςαγοράστηκαν από τη Shanghai Yuanye Biotechnology Co. Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Το Cistanoside F, το cistanoside C, το osmanthuside B και το tubuloside B αγοράστηκαν από την Chengdu Pfeide Biotechnology Co. Ltd (Chengdu, Κίνα) Η καθαρότητα όλων των προτύπων δεν ήταν μικρότερη από 98%. Η μεθανόλη και ακετονιτρίλιο ποιότητας HPLC αγοράστηκαν από την Aladdin Chemistry Inc. (Σαγκάη, Κίνα). Το απιονισμένο νερό ελήφθη χρησιμοποιώντας ένα MilliQ50 SP Reagent Water System (Bedford, MA, USA) για την παρασκευή δειγμάτων και κινητών διαλυμάτων. Όλοι οι άλλοι οργανικοί διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν αναλυτικής ποιότητας και αγοράστηκαν από την Shanghai Chemical Co. Ltd (Σαγκάη, Κίνα).

2.2. Συλλογή δειγμάτων

Όλα τα ακατέργαστα Cistanche deserticola (7 παρτίδες δειγμάτων) συλλέχθηκαν από το Ιατρικό Πανεπιστήμιο Inner Mongolia από τις επαρχίες της Εσωτερικής Μογγολίας και της Ningxia. Όλα ταυτοποιήθηκαν ως cistanche deserticola YC Ma από τον Xiaoqin Wang, τον καθηγητή του Τμήματος Φαρμακογνωσίας στο Ιατρικό Πανεπιστήμιο της Εσωτερικής Μογγολίας. Ένα δείγμα κουπονιού κατατέθηκε στη Φαρμακευτική Σχολή του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Εσωτερικής Μογγολίας. μετά τη συλλογή, οι ταξιανθίες του Cistanche deserticola αφαιρέθηκαν, οι μίσχοι κόπηκαν σε φέτες και ξηράνθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου με αέρα και στη συνέχεια οι φέτες χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες σε κάθε παρτίδα: η μία είναι RCD και η άλλη χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή του WSCD. .

Τα WSCD παρασκευάστηκαν στο εργαστήριο σύμφωνα με την κινεζική φαρμακοποιία (έκδοση 2015) [16], που σημαίνει ότι τα κομμένα RCD εμποτίστηκαν σε κρασί από ρύζι με ένα κλειστό δοχείο για 6 ώρες μέχρι να μαλακώσουν, μαγειρεύτηκαν στον ατμό σε λουτρό νερού για επιπλέον 12 ώρες μέχρι η επιφάνεια γίνεται μαύρη και στεγνώνει σε θερμοκρασία δωματίου με αέρα.

2.3. Ανάλυση κύριου στοιχείου (PCA)

Η ανάλυση κύριου συστατικού (PCA) είναι μια πολύπλοκη τεχνική που χρησιμοποιείται ευρέως για τη μείωση των διαστάσεων των πολυμεταβλητών προβλημάτων. Μειώνει τη διάσταση του αρχικού συνόλου δεδομένων εξηγώντας τη συσχέτιση μεταξύ ενός μεγάλου αριθμού μεταβλητών με όρους μικρότερου αριθμού υποκείμενων παραγόντων χωρίς σημαντική απώλεια πληροφοριών. Σε αυτήν τη μελέτη, οι διαφορές μεταξύ RCD και WSCD πραγματοποιήθηκαν από μη εποπτευόμενη PCA χρησιμοποιώντας το λογισμικό SIMCA 13.0 με βάση τις σχετικές περιοχές κορυφής στη χρωματογραφία HPLC. Με τη βοήθεια του PCA, βρέθηκαν οι κύριες επιρροές των χημικών στην ταξινόμηση μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων.

2.4. Η προετοιμασία των δειγμάτων

2.4.1. Προετοιμασία εκχυλίσματος για ζώα

Τα RCD και WSCD επιλέχθηκαν από τα δείγματα που συλλέχθηκαν και παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στην Ενότητα 2.2.

Το RCD ξηράνθηκε στον αέρα και κομμένο σε φέτες κονιοποιήθηκε με έναν κονιοποιητή (FW135, Tianjin Taisite Instrument Co., Ltd.), ζύγιζε με ακρίβεια 1,0 kg και εμποτίστηκε σε 50% αιθανόλη για 30 λεπτά και οι αναλογίες του φυτού Η/αιθανόλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν 1/10 (β/β). Και στη συνέχεια, εκχυλίστηκε υπό αναρροή δύο φορές για 1 ώρα κάθε φορά. Τα δύο εκχυλίσματα συνδυάστηκαν και διηθήθηκαν και η αιθανόλη ανακτήθηκε υπό μειωμένη πίεση στους 60°C. Το συνολικό ακατέργαστο εκχύλισμα PhGs ξηράνθηκε υπό κενό στους 60°C και καθαρίστηκε με μακροπορώδη ρητίνη. Τέλος, ελήφθη το εκχύλισμα PhG του RCD και ζυγίστηκε με ακρίβεια.

Το εκχύλισμα PhG του WSCD ελήφθη ακολουθώντας την ίδια διαδικασία παραπάνω.

Τα ιζήματα από την εκχύλιση των PhG ξηράνθηκαν στον αέρα και αφυπνίστηκαν δύο φορές για 1,5 ώρα κάθε φορά με 20 φορές νερό. Τα δύο εκχυλίσματα συνδυάστηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στις 4000 rpm για 10 λεπτά, και το υπερκείμενο συμπυκνώθηκε και καταβυθίστηκε με 95% αιθανόλη. μετά τη φυγοκέντρηση, το ίζημα ξηράνθηκε σε κενό στους 60∘ C. Τέλος, τοεκχύλισμα πολυσακχαρίτηελήφθη RCD και ζυγίστηκε με ακρίβεια.

Το εκχύλισμα πολυσακχαρίτη του WSCD ελήφθη ακολουθώντας την ίδια διαδικασία παραπάνω.

Τα εκχυλίσματα PhGs και πολυσακχαριτών των RCD και WSCD αναμειγνύονται εναιωρήματα σε νερό, αντίστοιχα, όταν οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε αγωγή από το στόμα.

2.4.2. Προετοιμασία δείγματος για τον προσδιορισμό των PhGs

Τα εκχυλίσματα PhGs στην Ενότητα 2.4.1 ζυγίστηκαν με ακρίβεια στα 0,15 g και εκχυλίστηκαν με υπερήχους με 50mL υδατικού διαλύματος μεθανόλης 50% για 40 λεπτά. Μετά την ψύξη, η απώλεια βάρους αναπληρώθηκε με 50% μεθανόλη. Όλα τα δείγματα και οι διαλύτες διηθήθηκαν μέσω μεμβράνης 0,45 μm πριν από την ανάλυση. Η περιεκτικότητα τεσσάρων PhGs σε RCD και WSCD προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας HPLC και τα συνολικά PhG προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας φασματοφωτομετρία UV.

2.4.3. Παρασκευή δείγματος για τον προσδιορισμό του πολυσακχαρίτη

Τα εκχυλίσματα πολυσακχαριτών στην Ενότητα 2.4.1 ζυγίστηκαν με ακρίβεια ως 0.10 g και εκχυλίστηκαν με υπερήχους με 50 mL ζεστό νερό για 40 λεπτά. μετά την ψύξη, η απώλεια βάρους αναπληρώθηκε με νερό. Όλα τα δείγματα και οι διαλύτες διηθήθηκαν μέσω μεμβράνης 0,45 μm πριν από την ανάλυση.

2.5. Χρωματογραφική Κατάσταση HPLC και Προσδιορισμός των τεσσάρων PhGs

Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε σύστημα HPLC UltiMate 3000 (Thermo Fisher Scientific, ΗΠΑ), εξοπλισμένο με αντλία διπλής κλίσης, διαμέρισμα στήλης και ανιχνευτή DAD . Τα δεδομένα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας ένα σύστημα δεδομένων χρωματογραφίας ChromeLeon. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε Agilent Zorbax SB-C18 (250mm×4,6 mm, 5 μm) με προστατευτική στήλη C18 (4,6 mm×12,5 mm, 5 μm). Η κινητή φάση αποτελούνταν από ακετονιτρίλιο (Α) και 0.1% διάλυμα φωσφορικού οξέος (Β) με ταχύτητα ροής 1 mL/min. Η βαθμιδωτή έκλουση είναι η εξής: αρχική 0–13 λεπτά, γραμμική αλλαγή από AB (5:95, v/v) σε AB (15:85, v/v). 13–25 λεπτά, γραμμική αλλαγή σε AB (20:80, v/v). 25–43 λεπτά, γραμμική αλλαγή σε AB (25:75, v/v). Το μήκος κύματος του ανιχνευτή παρακολουθήθηκε στα 330 nm. Η θερμοκρασία της στήλης ορίστηκε στους 30∘ C και ο όγκος του δείγματος που εγχύθηκε ήταν 10 μL [21]. Το αποθεματικό διάλυμα που περιέχει τέσσερα πρότυπα αναφοράς παρασκευάστηκε με διάλυση των προτύπων αναφοράς σε 50% μεθανόλη σε τελική συγκέντρωση 0,20 mg/mL για 2-ακετυλακτεοσίδη, 0,20 mg/mL για ακτεοσίδη, 0,05 mg/mL για οσμανθουσίδη Β, και 0,10 mg/mL για ισοακτεοσίδη. Το διάλυμα στη συνέχεια αραιώθηκε σε πέντε διαφορετικές συγκεντρώσεις με τρία αντίγραφα για να δημιουργηθούν καμπύλες βαθμονόμησης. Το περιεχόμενο του δείγματος εκφράστηκε σε g/kg ακατέργαστου βάρους.

2.6. Προσδιορισμός Ολικών PhGs

Τα συνολικά PhG προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο φασματοφωτομετρίας UV στο μήκος κύματος 330nm σε φασματοφωτόμετρο UV1000 (Shanghai Tianmei Scientific Instrument Co., Ltd.). Το αποθεματικό διάλυμα παρασκευάστηκε με διάλυση προτύπων εχινακοσίδης σε μεθανόλη 50%. σε τελική συγκέντρωση 0,10 mg/mL και στη συνέχεια αραιώθηκε σε πέντε διαφορετικές συγκεντρώσεις με τρία αντίγραφα για τη δημιουργία καμπυλών βαθμονόμησης.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Προσδιορισμός Πολυσακχαριτών

Ο προσδιορισμός τουπολυσακχαρίτεςδιεξήχθη χρησιμοποιώντας τη μέθοδο φαινόλης-θειικού οξέος. 1 mL του διαλύματος του δείγματος τοποθετήθηκε σε δοκιμαστικό σωλήνα 20 mL με γυάλινο πώμα και 1 mL διαλύματος φαινόλης 6% και 5 mL πυκνού θειικού οξέος προστέθηκαν και ανακινήθηκαν για 5 λεπτά. Το μίγμα μεταφέρθηκε σε λουτρό ζέοντος νερού για 10 λεπτά και ψύχθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για ανίχνευση υπεριώδους. Η απορρόφηση υπεριώδους ακτινοβολίας παρακολουθήθηκε στα 480 nm σε φασματοφωτόμετρο UV1000. Το πρότυπο αναφοράς της άνυδρης D-γλυκόζης ζυγίστηκε με ακρίβεια και διαλύθηκε σε απεσταγμένο νερό σε τελική συγκέντρωση 0,10 mg/mL. Στη συνέχεια το διάλυμα αραιώθηκε σε πέντε διαφορετικές συγκεντρώσεις με τρία αντίγραφα για να δημιουργηθούν καμπύλες βαθμονόμησης.

2.8. Πειράματα σε ζώα

2.8.1. Ζώα και Στέγαση

Αρσενικοί αρουραίοι SD με σεξουαλική ωριμότητα (180-200 g) αγοράστηκαν από την Xinglong (Πεκίνο) Experimental Animal Farm (ηλικία: 6 εβδομάδων) και η άδεια εργαστηριακού ζώου ήταν SCXK (Jing):2016-0003. Όλες οι διαδικασίες σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Έρευνας Ζώων του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Εσωτερικής Μογγολίας και πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας σχετικά με τις αρχές της φροντίδας των ζώων (2004). Όλα τα ζώα διατηρήθηκαν σε σύστημα φραγμού με ρυθμιζόμενη θερμοκρασία 21–23∘ C και σχετική υγρασία 40–65% και σε κύκλο σκότους/φωτός 12 ωρών. Στους αρουραίους δόθηκε κατά βούληση τροφή και νερό και εγκλιματίστηκαν στο παραπάνω περιβάλλον για μια εβδομάδα.

2.8.2. Δοσολογία και Δειγματοληψία

Οι αρουραίοι μεταφέρθηκαν σε μεμονωμένα μεταβολικά κλουβιά και χωρίστηκαν τυχαία σε 6 ομάδες (?=10 σε κάθε ομάδα). Τους δόθηκε μια ενδομυϊκή ένεση 15 mg/kg ηλεκτρικού νατρίου υδροκορτιζόνης (που αγοράστηκε από την Tianjin Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd., Tianjin, Κίνα) για 2 εβδομάδες εκτός από την ομάδα 1 που εγχύθηκε με ίσο όγκο φυσιολογικού ορού. Την 14η ημέρα, το σωματικό βάρος, η κατανάλωση τροφής, η πρόσληψη νερού, ο όγκος ούρων και η αυθόρμητη δραστηριότητα μέσα σε 5 λεπτά συλλέχθηκαν για να βεβαιωθείτε ότι το μοντέλο ανεπάρκειας νεφρού yang έγινε με επιτυχία. Από την 15η ημέρα, 6 ομάδες υποβλήθηκαν σε θεραπεία ως εξής: η ομάδα 1 και η ομάδα 2 (ομάδα μοντέλου, Μ) υποβλήθηκαν σε αγωγή με ίσο όγκο απεσταγμένου νερού, η ομάδα 3 (εκχύλισμα PhGs της ομάδας RCD, PR) υποβλήθηκε σε θεραπεία με {{12 }}.42 g/kg PhGs εκχύλισμα RCD, το οποίο ήταν ίσο με περίπου 1,8 g/kg του ακατέργαστου Cistanche deserticola και οι άλλες ομάδες ήταν οι ίδιες, η ομάδα 4 (PhGs εκχύλισμα της ομάδας WSCD, PW) έλαβε μια δόση { {17}}.49 g/kg PhGs εκχύλισμα WSCD, ομάδα 5 (εκχύλισμα πολυσακχαρίτη της ομάδας RCD, SR) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με {{20}}.18 g/kg το εκχύλισμα πολυσακχαρίτη του RCD, και η ομάδα 6 ήταν (εκχύλισμα πολυσακχαρίτη της ομάδας WSCD, SW) υποβλήθηκαν σε αγωγή με δόση 0,22 g/kg το εκχύλισμα πολυσακχαρίτη του WSCD. Όλοι οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε αγωγή με γαστρική έγχυση ανά ημέρα. Μετά από θεραπεία ενός μήνα, οι αρουραίοι αρνήθηκαν την τροφή για 12 ώρες πριν από τη συλλογή αίματος. Την επόμενη μέρα, όλοι οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν και θυσιάστηκαν. Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, οι αρουραίοι ζυγίζονταν μία φορά την εβδομάδα για προσαρμογή της δοσολογίας και ζυγίζονταν ξανά πριν από τη θυσία. Δείγματα αίματος συλλέχθηκαν στο σωληνάριο Eppendorf με διάλυμα EDTA-2Na 10%. Ο ορός διαχωρίστηκε μέσω φυγοκέντρησης στις 2000 rpm για 15 λεπτά και αποθηκεύτηκε σε -80 βαθμό για περαιτέρω χρήση. Επιπλέον, αφαιρέθηκαν νεφρά, όρχεις, επιδιδυμίδα, προστάτης και σπερματοδόχος κύστη και ζυγίστηκαν γρήγορα. Μετά τη ζύγιση, οι όρχεις καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο για τον προσδιορισμό των SOD και MDA.

2.9. Ανάλυση ορμονικών και αντιοξειδωτικών επιδράσεων

Τα επίπεδα τεστοστερόνης (Τ) και οιστραδιόλης (Ε2) προσδιορίστηκαν στο Κέντρο Επιθεώρησης Ποιότητας Qingdao Kechuang με ραδιοανοσία και χρωματομετρική μέθοδο. Οι κατεψυγμένοι όρχεις ζυγίστηκαν και αναμίχθηκαν με 20 φορές ψυχρό φυσιολογικό ορό (Β/Β). Το ομογενοποίημα των όρχεων που ελήφθη με ομογενοποίηση ιστού στο λουτρό πάγου φυγοκεντρήθηκε για να ληφθεί το υπερκείμενο. Τα περιεχόμενα SOD και MDA του όρχεως προσδιορίστηκαν με κιτ SOD και MDA ακολουθώντας τις οδηγίες.

2.10. Στατιστική ανάλυση

Η σημασία των διαφορών μεταξύ των ομάδων συγκρίθηκε μέσω μιας δοκιμής ANOVA μονής κατεύθυνσης που ακολουθήθηκε από τη δοκιμή του Schefe με όριο σημαντικότητας 0.05 χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS 25.0. Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως η μέση ± τυπική απόκλιση (SD) (n=3).

3. Αποτελέσματα

3.1. Η Ανάλυση των Αλλαγών των PhGs μετά το SPW με χρήση PCA

Για να συγκριθούν οι αλλαγές PhGs μετά το SPW, επιλέχθηκαν 9 χρωματογραφικές κορυφές ως χαρακτηριστικές κορυφές και ταυτοποιήθηκαν. Οι δομές τους φαίνονται στο Σχήμα 1, οι σχετικές περιοχές κορυφής των οποίων υπολογίστηκαν για ποσοτική έκφραση. Το χρωματογράφημα HPLC φαίνεται στο Σχήμα 2, το οποίο δείχνει ότι το σχετικό περιεχόμενο των κύριων PhGs άλλαξε κατά τη διάρκεια του SPW. Η ανάλυση PCA στις σχετικές περιοχές κορυφής των 9 συστατικών λήφθηκε για τη διάκριση διαφορετικών δειγμάτων. Το RCD και το WSCD ήταν μακριά το ένα από το άλλο στην γραφική παράσταση των βαθμολογιών (Εικόνα 3(α)), το οποίο έδειξε ότι τα δείγματα ταξινομήθηκαν σε δύο ομάδες. Έτσι πιστεύεται ότι το περιεχόμενο των χημικών συστατικών ήταν διαφορετικό. Για να βρεθούν περαιτέρω οι πιθανοί χημικοί δείκτες για τη διάκριση, πραγματοποιήθηκε μια εκτεταμένη στατιστική ανάλυση για τη δημιουργία της γραφικής παράστασης φόρτωσης Bi (Εικόνα 3(β)). Οι κορυφές 2, 3, 4, 6 και 7 θα μειωθούν μετά το SPW ενώ οι κορυφές 5, 8 και 9 θα αυξηθούν, και όλα ήταν τα πιο σημαντικά στοιχεία για τη διάκριση των RCD και WSCD. τα σχετικά περιεχόμενα της κορυφής 1 δεν ποικίλλουν πολύ μετά το SPW.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.2. Τα περιεχόμενα των ολικών πολυσακχαριτών και των PhGs άλλαξαν μετά το SPW

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3(β), 8 συστατικά (5, 8 και 9 αυξήθηκαν και 2, 3, 4, 6 και 7 μειώθηκαν) είχαν αλλάξει σημαντικά και είχαν σημαντικό αντίκτυπο στη ομαδοποίηση του δείγματος. Μεταξύ αυτών, η ισοακτεοσίδη και η Οσμανθουσίδη Β είχαν αυξηθεί περισσότερο ενώ 2? -η ακετυλολακτεοσίδη και η ακτεοσίδη μειώθηκαν περισσότερο. Λοιπόν, τα περιεχόμενα του ισοακτεοσιδίου, Osmanthuside B, 2; -ακετυλολακτεοζίτης και ακτεοσίδης προσδιορίστηκαν με HPLC. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, η κορυφή 4 ήταν ακτεοσίδη, η κορυφή 5 ήταν ισοακτεοσίδη, η κορυφή 7 ήταν 2? -ακετυλολακτεοσίδη, και η κορυφή 8 ήταν οσμανθουσίδη Β. Τα συνολικά PhGs σε RCD και WSCD προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο UV και οι ολικοί πολυσακχαρίτες πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο φαινόλης-θειικού οξέος, τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 1, ισοακτεοσίδη, Οσμανθουσίδη Β ,ολικούς πολυσακχαρίτες και PhGsστο WSCD είχε αυξηθεί σημαντικά σε σύγκριση με το RCD. 2; -η ακετυλολακτεοσίδη και η ακτεοσίδη είχαν μειωθεί σημαντικά.

3.3. Κατασκευάστηκε το μοντέλο ανεπάρκειας νεφρού-γιανγκ που προκαλείται από υδροκορτιζόνη

Σε σύγκριση με την κανονική ομάδα, μετά από 2 εβδομάδες ενδομυϊκής ένεσης 15 mg/kg ηλεκτρικού νατρίου υδροκορτιζόνης, το σωματικό βάρος, η κατανάλωση τροφής και η αυθόρμητη δραστηριότητα μειώθηκαν σημαντικά (P<0.05) and the water intake and urine volume were increased; the results were shown in Table 2. The T and E2 levels in the serum of the model group were lower than normal group as shown in Figure 4. From the above, the kidney-yang deficiency model was successfully made.

3.4. Η επίδραση των εκχυλισμάτων στο μέσο βάρος και τον δείκτη των σπλάχνων.

Όλοι οι αρουραίοι και τα σπλάχνα τους ζυγίστηκαν και στη συνέχεια υπολογίστηκε ο μέσος δείκτης σπλάχνων. Σε σύγκριση με την ομάδα Ν, η ομάδα Μ είχε μειώσει σημαντικά τα βάρη των σπλάχνων του νεφρού, της σπερματικής κύστης, της επιδιδυμίδας και του όρχεως, γεγονός που έδειξε επίσης ότι το μοντέλο ανεπάρκειας νεφρού-yang που προκαλείται από υδροκορτιζόνη πραγματοποιήθηκε με επιτυχία. Σε σύγκριση με την ομάδα Μ, όλο το παρατηρούμενο βάρος των σπλάχνων είχε αυξηθεί στις ομάδες PW και SR, η ομάδα PR είχε αυξημένο βάρος όρχεως, επιδιδυμίδας, σπερματοδόχου κύστης και προστάτη αδένα και η ομάδα SW είχε αυξημένο βάρος νεφρού, όρχεως, επιδιδυμίδας και σπερματικό κυστίδιο. Σε σύγκριση με τις ομάδες PR, η ομάδα PW ήταν καλύτερη στους νεφρούς, τη σπερματική κύστη και τον προστάτη αδένα. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων SR και SW στο βάρος του όρχεως, της επιδιδυμίδας, της σπερματικής κύστης και του προστάτη. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 3.

Σε σύγκριση με την ομάδα Ν, οι δείκτες των σπλάχνων του νεφρού, των όρχεων, της επιδιδυμίδας και της σπερματικής κύστης μειώθηκαν στην ομάδα Μ. Σε σύγκριση με την ομάδα M, η ομάδα PW και SR είχε αυξήσει τον δείκτη του νεφρού, των όρχεων, του προστάτη και της σπερματικής κύστης, οι ομάδες PR είχαν αυξήσει τον δείκτη του όρχεως, του προστάτη αδένα και της σπερματικής κύστης και η ομάδα SW είχε αυξήσει τον δείκτη του νεφρού, των όρχεων και της σπερματικής κύστης. Σε σύγκριση με τις ομάδες PR, η ομάδα PW ήταν καλύτερη στους νεφρούς, τη σπερματική κύστη και τον προστάτη αδένα. Οι ομάδες SW και SR είχαν παρόμοιο δείκτη νεφρού, όρχεως, σπερματοδόχου κύστης και επιδιδυμίδας. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 4.

3.5. Η επίδραση του εκχυλίσματος στο επίπεδο της ορμόνης (Τ και Ε2)

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, σε σύγκριση με την ομάδα Μ, τα επίπεδα Τ και Ε2 σε όλες τις ομάδες θεραπείας (ομάδα PW, PR, SW και SR) είχαν αυξηθεί σημαντικά (P<0.05). However, the PW group was better than the PR group in the level T and E2. The SR and SW groups had no significant difference.

3.6. Η επίδραση των εκχυλισμάτων στην αντιοξειδωτική δράση

Το SOD είναι ένα σημαντικό αντιοξειδωτικό ένζυμο. Το MDA είναι το προϊόν της υπεροξείδωσης των λιπιδίων που είναι ο δείκτης που αντικατοπτρίζει τον βαθμό της οξειδωτικής βλάβης. Τα περιεχόμενα SOD και MDA επηρεάζουν την έκταση της οξειδωτικής και αντιοξειδωτικής ικανότητας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, Σε σύγκριση με την ομάδα Μ, η αντιοξειδωτική δράση σε όλες τις ομάδες θεραπείας (PW, PR, SW και SR) είχε ενισχυθεί. Η ομάδα SW είχε τη μεγαλύτερη αντιοξειδωτική δράση.

4. Συζήτηση

Πριν από την κλινική εφαρμογή, τα ακατέργαστα υλικά θα πρέπει να υποβάλλονται σε παραδοσιακές κινεζικές τεχνικές επεξεργασίας. Ο ατμός είναι μια από τις παραδοσιακές προσεγγίσεις επεξεργασίας για ορισμένα κινέζικα φαρμακευτικά βότανα, η οποία δίνει ένα μαύρο χρώμα που παράγεται από την αντίδραση Maillard [22], αυξάνοντας τις ποσότητες ορισμένων βιοδραστικών συστατικών [23] και τις φαρμακολογικές δραστηριότητες. Το WSCD ως ένα από τα προϊόντα της διαδικασίας είναι καλύτερο όσον αφορά τα θρεπτικά νεφρά σε σύγκριση με το RCD όπως τεκμηριώνεται στην έκδοση του 2015 της Κινεζικής Φαρμακοποιίας. Σε αυτή τη μελέτη, τα αποτελέσματα της PCA έδειξαν ότι το SPW είχε αλλάξει το χημικό προφίλ του RCD. Επιπλέον, 8 συστατικά στα PhGs είχαν αλλάξει σημαντικά. Τα συνολικά PhG, οι ολικοί πολυσακχαρίτες, ο ισοακτεοσίδης και ο Οσμανθουσίδης Β είχαν αυξηθεί περισσότερο, ενώ 2? -η ακετυλακτεοσίδη και η ακτεοσίδη μειώθηκαν μετά το SPW. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το SPW θα μπορούσε να αλλάξει τα χημικά συστατικά του RCD. Τα περιεχόμενα των PhG με 1,3,4- τρι-υποκατεστημένα τμήματα γλυκοπυρανοσυλίου (όπως ακτεοσίδη, 2α-ακετυλολακτεοσίδη και κιστανοσίδη C) μειώθηκαν στο WSCD, ωστόσο, οι συγκεντρώσεις των ισομερών τους με 1,3,{13 }} το τρι-υποκατεστημένο τμήμα γλυκοπυρανοσυλίου (όπως ισοακτεοσίδη και επιτραπέζια πλευρά Β) αυξήθηκε, γεγονός που έδειξε ότι ο μετασχηματισμός των χημικών συστατικών μπορεί να συμβεί κατά τη διάρκεια του SPW και η αντίδραση υδρόλυσης θα είναι ένας από τους λόγους. Οι προτεινόμενες οδοί μετασχηματισμού φαίνονται στο Σχήμα 6. Η αύξηση των πολυσακχαριτών μετά το SPW έχει επίσης αναφερθεί στο ginseng [24].

Το Cistanche deserticola έχει τεκμηριωθεί ότι τονώνει τα νεφρά και αναστρέφει τη μείωση των επιπέδων τεστοστερόνης και έχει αντιοξειδωτική δράση και αντιφλεγμονώδη δράση [25], και τα PhGs και οι πολυσακχαρίτες ήταν τα δύο κύρια βιολογικά ενεργά συστατικά του Cistanche deserticola. Ως PhGs, η ισοακτεοσίδη και η οσμανθουσίδη Β είχαν αντιοξειδωτικά και αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα [26, 27]. Έτσι, μελετήθηκε η σύγκριση των φαρμακολογικών επιδράσεων στο επίπεδο τεστοστερόνης και της αντιοξειδωτικής δράσης των RCD και WSCD. Στο μοντέλο της ανεπάρκειας νεφρού-yang που προκαλείται από υδροκορτιζόνη, το ενδοκρινικό σύστημα διαταράχθηκε και το επίπεδο των ορμονών του φύλου μειώθηκε σημαντικά στο αίμα. Σε αυτή τη μελέτη, τα αποτελέσματα της ανάλυσης ορμονών φύλου έδειξαν ότι τόσο το RCD όσο και το WSCD θα μπορούσαν να αυξήσουν σημαντικά τα επίπεδα Τ και Ε2 και τα δύοPhGs και πολυσακχαρίτεςέδειξε βελτίωση των ορμονών του φύλου. Το WSCD ήταν καλύτερο από το RCD, ειδικά σε ομάδες εκχυλίσματος PhGs. Τα αποτελέσματα των δεικτών σπλάχνων έδειξαν ότι τόσο τα PhGs όσο και οι πολυσακχαρίτες μπορούν να βελτιώσουν τα βάρη των σπλάχνων και τους δείκτες βάρους τους. Στις ομάδες εκχυλίσματος PhGs, το WSCD είναι καλύτερο από το RCD στην αύξηση των βαρών και των δεικτών των νεφρών και των σπερματικών κυστιδίων. Επιπλέον, το Cistanche deserticola έχει σημαντική αντιοξειδωτική δράση, ειδικά στις ομάδες εκχυλίσματος πολυσακχαριτών με WSCD. Όπως συζητήθηκε παραπάνω, τόσο το RCD όσο και το WSCD θα μπορούσαν να βελτιώσουν το σύνδρομο ανεπάρκειας νεφρού-yang. Ωστόσο, το WSCD είναι καλύτερο από το RCD στην αύξηση του επιπέδου Τ, Ε2, των βαρών και των δεικτών της επιδιδυμίδας και των όρχεων. Τα αποτελέσματα της μελέτης φαρμακολογικών επιδράσεων έδειξαν ότι το SPW είχε αλλάξει τα χημικά συστατικά των PhGs και αύξησε την περιεκτικότητα σε πολυσακχαρίτες, που με τη σειρά του αύξησε το επίπεδο της σεξουαλικής ορμόνης και ενίσχυσε την αντιοξειδωτική δράση.

5. Συμπέρασμα

Η μελέτη αποσκοπούσε στην ανακάλυψη της αλλαγής των PhGs, των ολικών πολυσακχαριτών και της φαρμακολογικής επίδρασης σε RCD και WSCD στον αρουραίο με ανεπάρκεια νεφρού-yang, ειδικά σε επίπεδο ορμονών και αντιοξειδωτική δράση. Αυτή η μελέτη έδειξε ότι η διαδικασία των παραδοσιακών κινεζικών βοτάνων μπορεί να αλλάξει τα χημικά συστατικά τους και να επηρεάσει τη βιοδραστηριότητά τους. Υποστηρίζεται επίσης ότι τα ωμά προϊόντα και τα μεταποιημένα προϊόντα διαφέρουνntlyστην κλινική.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%