Το κιρκάδιο ρολόι ρυθμίζει τη ρυθμική έκφραση της ερυθροποιητίνης στον νεφρό του ποντικού

Για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Lina K. Sciesielsk et al

Το Cistanche tubulosa αποτρέπει τη νεφρική νόσο, κάντε κλικ εδώ για να το λάβετεπροϊόντα και Κιστάνι

Η δημιουργία κιρκάδιων ρυθμών είναι αυτόνομη από κυψέλες και βασίζεται σε έναν βρόχο ανάδρασης μεταγραφής/μετάφρασης που ελέγχεται από μια οικογένεια ενεργοποιητών παραγόντων μεταγραφής κιρκάδιου ρολογιού, συμπεριλαμβανομένων των CLOCK, BMAL1 και καταστολέων όπως οι CRY1 και CRY2. Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να εξετάσει τόσο τον μοριακό μηχανισμό όσο και την αιμοποιητική επίπτωση της κιρκαδικής έκφρασης της ερυθροποιητίνης. Μεταλλαγμένα ποντίκια με ομόζυγη διαγραφή των κρυπτοχρωμάτων 1 και 2 των γονιδίων του κιρκάδιου ρολογιού του πυρήνα (Cry-null) χρησιμοποιήθηκαν για να διαλευκανθεί η κιρκαδική ρύθμιση της ερυθροποιητίνης. Τα ποντίκια ελέγχου άγριου τύπου εμφάνισαν σημαντική διαφοράνεφρόΈκφραση mRNA της ερυθροποιητίνης μεταξύ των κιρκάδιων χρόνων 06 και 18. Παράλληλα, ένας σημαντικά υψηλότερος αριθμός κυττάρων που παράγουν ερυθροποιητίνη στονεφρό(byRNAscope ) και σημαντικά υψηλότερα επίπεδα κυκλοφορούσας πρωτεΐνης ερυθροποιητίνης (με ELISA) ανιχνεύθηκαν κιρκάδιος χρόνος 18. Τέτοιες αλλαγές καταργήθηκαν σε ποντίκια Cry-null και ήταν ανεξάρτητες από την τάση οξυγόνου, τον κορεσμό οξυγόνου ή την έκφραση του επαγόμενου από την υποξία παράγοντα 2 άλφα, υποδεικνύοντας ότι η κιρκαδική έκφραση της ερυθροποιητίνης ρυθμίζεται μεταγραφικά από τα CRY1 και CRY2. Οι αναλύσεις γονιδίου αναφοράς έδειξαν ότι το ετεροδιμερές CLOCK/BMAL1 ενεργοποιεί ένα στοιχείο E-box στον προαγωγέα 5' ερυθροποιητίνης. Ο in situ υβριδισμός με RNAscope επιβεβαίωσε την παρουσία του Bmal1 σε κύτταρα που παράγουν ερυθροποιητίνηνεφρό. Σε ποντίκια Cry-null, βρέθηκε σημαντικά μειωμένος αριθμός δικτυοερυθροκυττάρων, ενώ ο αριθμός των ερυθροκυττάρων και ο αιματοκρίτης παρέμειναν αμετάβλητοι. Έτσι, κιρκαδική ρύθμιση ερυθροποιητίνης στο νορμοξικό ενήλικο ποντικόνεφρόελέγχεται μεταγραφικά από τους κύριους κιρκαδικούς ενεργοποιητές CLOCK/BMAL1 και τους καταστολείς CRY1/CRY2. Αυτό το εύρημα μπορεί να έχει συνέπειες γιαφυσιολογία των νεφρώνκαι ασθένεια, εργαστηριακή διάγνωση και θεραπεία αναιμίας.

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ:χρονοβιολογία; κιρκάδιος ρυθμός? ρολόι; κρυπτοχρωμα? ερυθροποιητίνη; αιμοποίηση; παράγοντας που προκαλείται από υποξία

Μεταφραστική δήλωση Τα μοριακά ρολόγια σχεδόν σε όλους τους τύπους κυττάρων οδηγούν τη μεταγραφή γονιδίων σε συνεργασία με ειδικούς για ιστούς παράγοντες. Μέχρι στιγμής, οι κιρκάδιοι ταλαντωτικοί μηχανισμοί στονεφρόδεν έχουν συνδεθεί με τη βιολογία της ερυθροποιητίνης (Epo). Εδώ, έχει διευκρινιστεί ότι η κιρκαδική έκφραση Epo ρυθμίζεται από πρωτεΐνες κύριου ρολογιού (κρυπτόχρωμα 1 και 2, Clock και Bmal1). Δεδομένου ότι η ΕΡΟ δρα σαφώς εντός του πολύπλοκου ρυθμιστικού δικτύου της ερυθροποίησης, η βέλτιστη χρήση της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης EPO σε ασθενείς μενεφρόΗ ανεπάρκεια μπορεί να περιλαμβάνει την εφαρμογή του μόλις πριν από το φυσιολογικό κιρκάδιο μέγιστο περίπου τα μεσάνυχτα.

Οι κιρκάδιοι ρυθμοί στη νεφρολογία είναι σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητοι αλλά πολύ σχετικοί επειδή η διατάραξή τους από εργασία με βάρδιες, επιλογές τρόπου ζωής και γήρανση σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο διαφόρων ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων των καρδιαγγειακών διαταραχών.^1–4Ζωικά μοντέλα διαταραγμένων κιρκάδιων ρολογιών παρέχουν τις πρώτες ενδείξεις για την αρνητική επίδραση της κιρκαδικής απορρύθμισης στο αιμοποιητικό σύστημα (π.χ. από αυξημένο αριθμό γηρασμένων ερυθροκυττάρων).^5,6

Όσον αφορά την ερυθροποίηση, όχι μόνο οι κυτταρικές επιδράσεις αλλά και η ρυθμικότητα του κύριου ρυθμιστή της, της ερυθροποιητίνης (Epo), έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον επειδή οι αθλητές έχουν κατηγορηθεί επανειλημμένα για ντόπινγκ αίματος με ανασυνδυασμένο ανθρώπινο Epo (who) λόγω διαφορών που εξαρτώνται από την ώρα της ημέρας. κυκλοφορούντες συγκεντρώσεις Epo και αιματολογικές παράμετροι.7,8 Ημερήσιες διακυμάνσεις στα επίπεδα Epo (S-Epo) στον ανθρώπινο ορό περιγράφηκαν για πρώτη φορά το 1981 σε ασθενείς με χρόνια αναπνευστική νόσο των εργαζομένων στον άνθρακα,⁹και στη συνέχεια σε υγιή άτομα.^10,11Μέχρι σήμερα, αρκετές αναφορές δείχνουν υψηλά επίπεδα S-Epo τη νύχτα (8 μ.μ. έως 4 π.μ.) και χαμηλά επίπεδα S-Epo νωρίς το πρωί (4 π.μ. έως 8 π.μ.). Η φάση και το πλάτος των ταλαντώσεων S-Epo, εάν υπάρχουν καθόλου, είναι μεταβλητά μεταξύ των ανθρώπινων ατόμων.^9,10,12,13Κατά μέσο όρο, τα επίπεδα S-Epo άλλαξαν περίπου 1.5-πλάσια σε σχέση με το ελάχιστο.^14–22Αυτός ο ημερήσιος ρυθμός αποδείχθηκε ότι δεν επηρεάζεται από τη γήρανση, την προπόνηση,16 ή την έκθεση σε υψόμετρο.17 Αντίθετα, η ημερήσια ταλάντωση της S-Epo καταργείται σε ασθενείς με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια που επιπλέκεται από ημερήσια υποξαιμία, σε μυέλωμα με νεφρική ανεπάρκεια. , και στη μυελοδυσπλασία.^15,21,23

Το 2009, περιγράψαμε την κιρκαδική έκφραση mRNA του Epo στον νεφρό ποντικού σε μια ανάλυση μεγάλης κλίμακας των προαγωγών γονιδίων ελεγχόμενων από το ρολόι, αλλά δεν μπορέσαμε να αναγνωρίσουμε είτε ένα ξεχωριστό γενετικό στοιχείο στο γονίδιο EPO είτε έναν παράγοντα μετενεργοποίησης που είναι υπεύθυνος για την κιρκαδική ταλάντωση. 24 Πιο πρόσφατα, ένα μοντέλο αιμορραγικού σοκ σε αρουραίους πρότεινε, σύμφωνα με παράλληλα πρότυπα έκφρασης, ότι τα γονίδια ρολογιού (Bmal1 και Per2) εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκκρισης EPO κατά τη διάρκεια της υποξίας/ισχαιμίας.²⁵

Η δημιουργία κιρκάδιων ρυθμών είναι αυτόνομη ως προς το κύτταρο και βασίζεται σε έναν βρόχο ανατροφοδότησης μεταγραφής-μετάφρασης που ελέγχεται από μια οικογένεια παραγόντων μεταγραφής του κιρκάδιου ρολογιού, συμπεριλαμβανομένων των CLOCK, BMAL1, PER1, PER2, CRY1 και CRY2.26 Το ετεροδιμερές CLOCK/BMAL1 ενεργοποιεί το ετεροδιμερές των γονιδίων του κιρκάδιου ρολογιού PER1/2 και CRY1/2 μέσω δέσμευσης σε στοιχεία κουτιού Ε στους προαγωγείς τους. Οι πρωτεΐνες PER και CRY, ωστόσο, παρέχουν αρνητική ανάδραση αναστέλλοντας τη δραστηριότητα CLOCK/BMAL1, μειώνοντας έτσι τη δική τους έκφραση. Τα καθαρά αποτελέσματα οδηγούν σε μοτίβα ταλάντωσης της έκφρασης του κιρκάδιου γονιδίου και ρυθμικές αλλαγές στην κυτταρική και φυσιολογία οργάνων.²⁷

Για την κατανόηση των επιπτώσεων του βιολογικού ρολογιού, έχουν μελετηθεί μέχρι στιγμής διάφοροι τύποι μεταλλαγμένων ποντικών με διαταραγμένους ή καταργημένους παράγοντες μεταγραφής ενός πυρήνα. ποντίκια (Cry-null), τα οποία δεν έχουν την ικανότητα να εκφράζουν ενδογενείς κιρκαδικούς ρυθμούς.^26,30Τα συνδυασμένα in vivo και in vitro δεδομένα δείχνουν ότι το Cry1/2 ρυθμίζει την κιρκαδική έκφραση της Epo μέσω της επαγόμενης από το CLOCK/BMAL1-μεταγραφής στον νορμοξικό νεφρό.

ΜΕΘΟΔΟΙ

Πειράματα σε ζώα

Ομόζυγα ζώα Cry1–/– /Cry2–/– (Cry-null; αρσενικό και θηλυκό; με βάση το C57BL/6J)31 και άγριου τύπου (WT) μάρτυρες εκτράφηκαν (For-schungseinrichtungen für Experimentelle Medizin Charité) και ανατράφηκαν για 5 έως 7 μήνες. Τα ποντίκια WT προήλθαν από την αναπαραγωγή της αποικίας Cry-null.

Ο γονότυπος Cry-null επιβεβαιώθηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Συμπληρωματικός Πίνακας S1). Για να παρασυρθούν, τα ποντίκια στεγάστηκαν σε ομάδες και είχαν τροφή και νερό κατά βούληση σε 12-ώρα:12-ώρα κύκλο φωτός/σκότους για 14 ημέρες. Την ημέρα 2 μετά την απελευθέρωση σε σταθερό σκοτάδι, τα ζώα θυσιάστηκαν σε κιρκαδικό χρόνο (CT) 06 ή 18 (n ¼ 13-15 για κάθε ομάδα και χρονικό σημείο). Οι ιστοί (ήπαρ και νεφρός) λήφθηκαν γρήγορα και καταψύχθηκαν γρήγορα σε υγρό άζωτο. Μια υποομάδα αρσενικών και θηλυκών ζώων WT και Cry-null αναλύθηκαν λεπτομερώς για σωματικό βάρος και διαφορικό αιμογράφημα.

Για ανάλυση αερίων αίματος, τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν (φεντανύλη, {{0}}.075 mg/kg, μιδαζολάμη, 1,5 mg/kg και μεδετομιδίνη, 0,75 mg/kg), τραχειοτομή, διασωληνωμένη και αερισμός (παλιρροιακή όγκος, 9 ml/kg, ρυθμός αναπνοής, 160 min- 1, θετική τελική εκπνευστική πίεση, 2 cm H2O), όπως περιγράφεται.32 Ένας καθετήρας πολυαιθυλενίου εισήχθη χειρουργικά στην αριστερή καρωτίδα. Μετά από 5 λεπτά σταθεροποίησης, το πείραμα τερματίστηκε μέσω ταχείας αφαίμαξης μέσω του καρωτιδικού καθετήρα, αναλύθηκαν τα αέρια αίματος (ABL-800, Ραδιομετρητής, ελεγχόμενη θερμοκρασία) και οι νεφροί αποκόπηκαν για αναλύσεις post hoc.

Όλες οι διαδικασίες εγκρίθηκαν από την Τοπική Επιτροπή Περιποίησης Ζώων (T0307/08, G0100/17 με προσθήκη από τον Ιανουάριο του 2021) και πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές και τους κανονισμούς της γερμανικής νομοθεσίας για την προστασία των ζώων.

Παρασκευή RNA και ποσοτική ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

Ολικό RNA εκχυλίστηκε όπως περιγράφηκε.33 Ένα σύνολο 1000 ng ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με αντίστροφη μεταγραφάση SuperScript III (Thermo Fisher; Νο. 18080085) και τυχαία εξαμερή (Thermo Fisher; Νο. SO142), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι ποσοτικές αλυσιδωτές αντιδράσεις πολυμεράσης διεξήχθησαν σε έναν κυκλοποιητή StepOnePlus (Life Technologies) με εκκινητές που εκτείνονται σε εσώνια ή προσδιορισμούς TaqMan (Συμπληρωματικός Πίνακας S2). Ο απόλυτος ποσοτικός προσδιορισμός mRNA επιτεύχθηκε με σύγκριση με μια τυπική καμπύλη από σειριακές αραιώσεις του προτύπου αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης.

Ανίχνευση έκφρασης Epo mRNA στο νεφρό με τεχνική RNAscope

Η ανάλυση RNAscope πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή (ACD, τεχνική σημείωση 320536). Οι εγκάρσιες κρυοτομές του μέσου νεφρού 10-mm χρωματίστηκαν με έναν ανιχνευτή C1 έναντι DapB (αρνητικός έλεγχος, ACD, Νο. 310043) ή Epo (ACD, Νο. 315501). Τα βήματα υβριδισμού με χρήση του ενισχυτή 4-6 και η ανίχνευση των κόκκινων σημάτων παραλείφθηκαν. Δύο ανεξάρτητοι, τυφλοί ερευνητές μέτρησαν τα θετικά Epo κύτταρα σε αρχική μεγέθυνση 200, σε 3 έως 8 κρυοτομές ανά ζώο σε ένα σύστημα απεικόνισης Axioplan 2 (Zeiss).

Πραγματοποιήθηκαν αντιπροσωπευτικές εικόνες ποσοτικού προσδιορισμού Epo και διπλή φθορίζουσα χρώση χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίου ανίχνευσης φθορισμού RNAscope Multiplex V2 (ACD; Νο. 323110), σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Οι εγκάρσιες παρα τομές του μέσου νεφρού 1,5-mm χρωματίστηκαν με έναν ανιχνευτή C1 έναντι του Bmal1 (ACD; Νο. 438741) και έναν ανιχνευτή C2 έναντι του Epo (ACD; Νο. 315501-C2). Το Opaleye 520 (Akoya BioSciences; Νο. FP1487001KT) χρησιμοποιήθηκε με τον ανιχνευτή C1 και η βαφή opal 650 (Akoya BioSciences; Νο. FP1496001KT) χρησιμοποιήθηκε με τον ανιχνευτή C2. Στην αρχική μεγέθυνση - 400, τα θετικά Epo κύτταρα απεικονίστηκαν για εντοπισμό Bmal1 σε ένα σύστημα απεικόνισης Eclipse Ti2 (Nikon). Η 40,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη χρησιμοποιήθηκε ως αντιχρώση.

Συγκεντρώσεις EPO στον ορό

Τα δείγματα αίματος αφέθηκαν να πήξουν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου πριν φυγοκεντρηθούν για 20 λεπτά σε 2000 - g. Ο ορός αφαιρέθηκε και καταψύχθηκε αμέσως στους -80 C έως ότου εκτελεστεί η συνδεδεμένη με ένζυμο ανοσοπροσροφητική δοκιμασία για Epo (Quantikine; R&D Systems; Αρ. MEP006) με μη αραιωμένα δείγματα. Η απορρόφηση διαβάστηκε με έναν αναγνώστη απορρόφησης μικροπλάκας iMARK (Bio-Rad) στα 450 nm, με διόρθωση μήκους κύματος στα 570 nm και μια τυπική καμπύλη προσαρμογής παραμέτρων 4-, όπως περιγράφηκε προηγουμένως.³³

Αριθμός αιμοσφαιρίων

Ο συνολικός και ο διαφοροποιημένος αριθμός κυττάρων από το αντιπηκτικό αίμα με EDTA μετρήθηκαν από το Synlab. κτηνίατρος Βερολίνου με αυτοματοποιημένο μετρητή κυττάρων ADVIA2120i (Siemens) για αίμα ποντικού.

Αναλύσεις γονιδίων αναφοράς

Κύτταρα ανθρώπινου εμβρυϊκού νεφρού 293 (DSMZ; Νο. ACC305; αριθμοί αναλήψεων 3–10, αρνητικό μυκόπλασμα) αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco/Ham F12 (Biochrom; Νο. FG4815) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (Merck; F7524). Η μορφομετατροπή των κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε 12-πλάκες φρεατίου που περιείχαν 1.{10}} κύτταρα/φρεάτιο. Κάθε φρεάτιο επιμολύνθηκε με 333 ng πλασμιδικού DNA (1 από τα 10 εκ των οποίων ήταν κατασκεύασμα βανίλιας) και 1 ml αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Fugene 6 (Promega, Νο. E2691) όπως περιγράφεται.34 Όλα τα κατασκευάσματα που χρησιμοποιήθηκαν παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Τα κύτταρα λύθηκαν 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση με ρυθμιστικό διάλυμα Παθητικής Λύσης (Promega, Νο. Ε1941). Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε με τα κιτ Beetle-Juice και Renilla-Juice (και τα δύο pjk GmbH· Νο. 102511/102531, αντίστοιχα), σε φωτόμετρο Lumat LB9501. Κάθε πείραμα διεξήχθη σε τεχνικά αντίγραφα και χρησιμοποιήθηκαν μέσες τιμές για τους υπολογισμούς.

Στατιστική ανάλυση

In all animals, the circadian gene expression was analyzed; 2 animals were excluded as they showed outlier values (>1.5-διπλώστε το μεσοτεταρτημόριο) σε 4 από τα 6 γονίδια που εκφράζονται κιρκαδικά. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας IBM SPSS Statistics 27 και παρουσιάζονται ως μεμονωμένες κουκκίδες με τη διάμεσο ή ως ράβδοι με τη μέση τιμή και το SD. Πραγματοποιήθηκε δοκιμή Mann-Whitney U ή Kruskal-Wallis με Bonferroni ως post hoc δοκιμή.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Αφαίρεση της κιρκαδικής έκφρασης Epo σε ποντικούς Cry-null

Για να αποσαφηνιστεί ο μοριακός μηχανισμός της κιρκαδικής ρύθμισης της Epo, αναλύσαμε την έκφραση mRNA και πρωτεΐνης Epo σε μεταλλαγμένα ποντίκια WT και Cry-null. Στον νεφρό WT, τα κανονικά γονίδια ρολογιού έδειξαν έκφραση εξαρτώμενη από την ώρα της ημέρας, ενώ αυτή καταργήθηκε στα ποντίκια Cry-null, όπως αναμενόταν (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Προηγουμένως αναφέραμε κιρκάδια ταλάντωση της έκφρασης του Epo mRNA σε 24 ώρες για νεφρούς ποντικού WT ενηλίκων.24 Εστιάζοντας τώρα στις ελάχιστες και μέγιστες τιμές, παρατηρήσαμε μια σημαντική, w{7}}πλάσια διαφορά μεταξύ CT06 (περίοδος ύπνου ποντικού, αναμενόμενη ελάχιστη ) και CT18 (φάση δραστηριότητας, αναμενόμενο μέγιστο, Εικόνα 1α). Στους νεφρούς των ποντικών Cry-null, ωστόσο, δεν ανιχνεύθηκε σημαντική διαφορά στην έκφραση του mRNA του νεφρού Epo. Σημειωτέον, σε ποντίκια Cry-null, οι απόλυτες ποσότητες επιπέδων μεταγραφής νεφρικής Epo και τις δύο φορές ήταν μεταξύ των διάμεσων επιπέδων WT Epo mRNA στο CT06 και στο CT18 (Εικόνα 1a). Το mRNA EPO στα αντίστοιχα ήπατα ήταν κάτω από το όριο ανίχνευσης (τα δεδομένα δεν φαίνονται).

Ημερήσιες αλλαγές στις συγκεντρώσεις της Epo στον ορό

Για να εκτιμήσουμε τη μετάφραση της κιρκαδικής έκφρασης mRNA Epo σε κυκλοφορούσα πρωτεΐνη Epo, αναλύσαμε δείγματα ορού με ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία. Δείγματα αίματος ελήφθησαν πριν από τα δείγματα οργάνων. Το Epo του ορού αύξησε το w2.{2}} φορές μεταξύ CT06 και CT18 σε ποντίκια WT, αλλά αυτή η διαφορά καταργήθηκε στα ποντίκια Cry-null (Εικόνα 1β). Συγκεκριμένα, οι μέσες συγκεντρώσεις S-Epo που λήφθηκαν κατά μέσο όρο με την πάροδο του χρόνου (CT06 και CT18) ήταν παρόμοιες σε ποντίκια WT και Cry-null (22 mU/ml [εύρος, 3–59 mU/ml] έναντι 21 mU/ml [εύρος, 7 –50 mU/ml]).

Έκφραση κιρκάδιου Epo σε σχέση με παραμέτρους αερίων αρτηριακού αίματος και παλμική οξυμετρία

Για να διερευνηθεί εάν πιθανές ημερήσιες αλλαγές στα επίπεδα οξυγόνου στο αίμα και στους ιστούς θα μπορούσαν να προκαλέσουν κιρκάδια ταλάντωση της έκφρασης της Epo, ελήφθησαν δείγματα αρτηριακού αίματος και πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις αερίων αίματος σε αναισθητοποιημένα, τραχειοτομημένα και μηχανικά αεριζόμενα ποντίκια Cry-null και WT σε CT06 ή CT18. που αντιστοιχούν στα χαμηλότερα και υψηλότερα κιρκαδικά επίπεδα mRNA του Epo, αντίστοιχα (Εικόνα 1α). Δεν εντοπίσαμε σημαντικές διαφορές στο αρτηριακό pH, στη μερική πίεση του CO2 ή στη μερική πίεση του O2 ούτε στην τυπική περίσσεια βάσης ή τις συγκεντρώσεις γαλακτικού (Εικόνα 2a–e) μεταξύ ποντικών CT06 και CT18 ή WT και Cry-null. Τα επίπεδα κορεσμού οξυγόνου, που μετρήθηκαν με παλμική οξυμετρία, επίσης δεν έδειξαν διαφορές (Εικόνα 2στ). Η γονιδιακή έκφραση του κύριου ρυθμιστή ΕΡΟ που επάγεται από την υποξία παράγοντα (HIF) 2a δεν διέφερε μεταξύ CT06 και CT18, είτε σε ποντίκια WT είτε σε ποντίκια Cry-null (Εικόνα 3). Έτσι, υπό κανονικές συνθήκες, η κιρκαδική ρύθμιση της Epo δεν προκαλείται από αλλαγές στην τάση του οξυγόνου.

Κιρκάδιος διακόπτης ενεργοποίησης-απενεργοποίησης της έκφρασης Epo σε κύτταρα που παράγουν νεφρική Epo

Για να μελετηθεί εάν η κιρκαδική έκφραση mRNA της Epo προκαλείται από την ενεργοποίηση πρόσθετων κυττάρων που παράγουν νεφρική Epo (REPCs) ή μόνο με την αύξηση της έκφρασης Epo ανά κύτταρο, χρησιμοποιήθηκε υβριδισμός RNAscope in situ σε εγκάρσιες τομές μεσαίου νεφρού (παράδειγμα στο Συμπληρωματικό Σχήμα S2). Στα ποντίκια WT, ο αριθμός των REPC αυξήθηκε σημαντικά μεταξύ CT06 (διάμεσος, 5; εύρος, 0–25) και CT18 (διάμεσος, 22, εύρος, 5–82, 4.{{ 11}}διπλό· P ¼ 0,010). Αντίθετα, οι νεφροί Cry-null εμφάνισαν παρόμοιο αριθμό REPC στο CT06 (διάμεσος, 18, εύρος, 2-33) και CT18 (διάμεσος, 15, εύρος, 4-87, μη σημαντικός, Εικόνα 1γ). Θεωρήσαμε ότι τα ποντίκια Cry-null εμφανίζουν περιορισμό ανάπτυξης λόγω της μειωμένης σηματοδότησης του αυξητικού παράγοντα 1 (IGF1) που μοιάζει με ινσουλίνη, ο οποίος οδηγεί σε μια συνεχώς αυξανόμενη διαφορά στο σωματικό βάρος και το μέγεθος οργάνων μεταξύ των ποντικών Cry-null και WT.30 Όπως χρησιμοποιήσαμε σχετικά νεαρά ζώα, το απόλυτο βάρος των νεφρών των ποντικών Cry-null ήταν μόνο ελαφρώς χαμηλότερο από ό,τι στα ποντίκια WT (–12 τοις εκατό στα ποντίκια Cry-null), αλλά η σχετική αναλογία νεφρού προς βάρος σώματος δεν διέφερε (Συμπληρωματικό Σχήμα S3) . Έτσι, η κιρκαδική αύξηση στην έκφραση του mRNA της Epo φαίνεται να ρυθμίζεται από την εναλλαγή πρόσθετων REPC.

Ενεργοποίηση του ελάχιστου προαγωγέα EPO από το CLOCK/BMAL1

Για να ταυτοποιηθούν οι ρυθμιστικές αλληλουχίες που είναι υπεύθυνες για την κιρκαδική έκφραση της Epo (Εικόνα 4a), πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης σε κύτταρα ανθρώπινου εμβρυϊκού νεφρού 293. Η κυτταρική σειρά ανθρώπινου εμβρυϊκού νεφρού 293 επιλέχθηκε όχι για την νεφρική της προέλευση αλλά για την έλλειψη ενδογενούς κιρκάδιου ρολογιού. Έτσι, το διεγερτικό αποτέλεσμα του CLOCK/BMAL1 θα μπορούσε να δοκιμαστεί σε ένα χαμηλό, μη ταλαντούμενο υπόβαθρο CLOCK/BMAL1. Η υπερέκφραση του CLOCK/BMAL1 διεγείρει σημαντικά τη δραστηριότητα του ελάχιστου ανθρώπινου προαγωγέα ΕΡΟ (Εικόνα 4b, Ι έναντι II). Εάν το μοτίβο του E-box (–36 έως –31 bp σε σχέση με τη θέση έναρξης της μεταγραφής) είναι μεταλλαγμένο,35 αυτό το αποτέλεσμα αμβλύνεται (Εικόνα 4β, III).

Για να μελετήσουμε εάν η παρατηρούμενη κιρκαδική ρύθμιση ήταν εξαρτώμενη από τον κυτταρικό τύπο, εξετάσαμε αρκετές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν ΕΡΟ για ενδογενή δραστηριότητα ρολογιού παρακολουθώντας τις ταλαντώσεις ενός ανταποκριτή λουσιφεράσης που προκαλείται από τον υποκινητή Bmal1. Εκείνα με ενδογενή ρυθμό περιελάμβαναν κύτταρα HEP3B που προέρχονται από ανθρώπινα ηπώματα, κύτταρα KELLY που προέρχονται από ανθρώπινο νευροβλάστωμα και νεφρικά κύτταρα ποντικού PDGFRbþ (πρώην κυτταρική σειρά ποντικού που εκφράζει EPO FAIK1-10).36,37 Μεταξύ των 3 κυτταρικών σειρών, μόνο Τα κύτταρα KELLY εμφάνισαν ταλαντώσεις λουσιφεράσης που οδηγούνται από προαγωγέα ΕΡΟ (Συμπληρωματικό Σχήμα S4A). Αν και τα κύτταρα PDGFRbþ εμφάνισαν έναν ισχυρό κιρκάδιο ρυθμό δραστηριότητας προαγωγέα Bmal1, δεν ανιχνεύσαμε ταλαντώσεις που προκαλούνται από τον προαγωγέα ΕΡΟ, υποδηλώνοντας χαμηλότερο εύρος του κατασκευάσματος αναφοράς που καθοδηγείται από τον υποκινητή ΕΡΟ (Συμπληρωματικό Σχήμα S4B).

Εντοπισμός Bmal1 και Epo στους νεφρούς ποντικών Cry-null έναντι WT

Για να διευκρινιστεί περαιτέρω (i) η κιρκαδική ρύθμιση της παραγωγής Epo των νεφρών με τη στρατολόγηση κυττάρων που παράγουν νεφρική Epo και (ii) τον συνεντοπισμό της έκφρασης Bmal1 και Epo, πραγματοποιήσαμε υβριδισμό RNAscope in situ. Το Epo και το Bmal1 συνεντοπίστηκαν και η μικροσκοπία σε χαμηλή μεγέθυνση αντιπροσωπεύει διαφορές στη στρατολόγηση των REPC (Εικόνα 5), όπως ποσοτικοποιείται στο Σχήμα 1γ.

Αιματολογικά ευρήματα στην ανεπάρκεια Cry1/Cry2 Για να εκτιμηθούν (i) οι αιμοποιητικές επιδράσεις της έλλειψης κιρκαδικής έκφρασης Epo και (ii) πιθανές άλλες αιματολογικές ανωμαλίες σε ποντικούς χωρίς λειτουργικό ρολόι, αναλύθηκαν οι μετρήσεις των αιμοσφαιρίων. Οι διαφορές ώρας της ημέρας της έκφρασης mRNA της Epo και της συγκέντρωσης S-Epo δεν αντικατοπτρίστηκαν από σημαντικές διαφορές στον αριθμό των περιφερειακών δικτυοερυθροκυττάρων στο CT06 έναντι του CT18 σε ποντικούς WT. Οι μετρήσεις δικτυοερυθροκυττάρων, ωστόσο, ήταν σημαντικά χαμηλότερες τόσο στο CT06 όσο και στο CT18 στα ζώα Cry-null σε σύγκριση με τα ποντίκια WT (Εικόνα 6a). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στους αριθμούς των ερυθροκυττάρων ή στις τιμές του αιματοκρίτη σε ποντίκια WT έναντι Cry-null. Και οι δύο παράμετροι, ωστόσο, δεν διέφεραν μεταξύ CT06 και CT18 και στα δύο στελέχη (Εικόνα 6b και c) και δεν αντιστοιχούσαν στον χαμηλότερο αριθμό περιφερειακών δικτυοερυθροκυττάρων σε ποντικούς Cry-null (Εικόνα 6a). Για να ελεγχθεί εάν οι διατροφικές ανεπάρκειες (π.χ. σίδηρος και φυλλικό οξύ) λόγω της μειωμένης σηματοδότησης IGF1 εμπλέκονται στην ασυμφωνία των μειωμένων δικτυοερυθροκυττάρων, αλλά οι φυσιολογικοί αριθμοί ερυθροκυττάρων σε ποντίκια Cry-null, το μέγεθος και το σχήμα των ερυθρών αιμοσφαιρίων αναλύθηκαν αλλά δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ ποντικών Cry-null και WT (Συμπληρωματικό Σχήμα S5).

Αξιοσημείωτα, ο διάμεσος αριθμός αιμοπεταλίων στα ποντίκια Cry-null έτεινε να είναι υψηλότερος από ό,τι στα ποντίκια WT, αλλά ο αριθμός των αιμοπεταλίων δεν ήταν σημαντικά διαφορετικός μεταξύ CT06 και CT18 και στα δύο στελέχη (Εικόνα 6δ). Αντίθετα, οι αριθμοί λευκών αιμοσφαιρίων (WBC) διέφεραν σημαντικά μεταξύ CT06 και CT18 σε WT αλλά όχι σε ποντίκια Cry-null. Ο διάμεσος αριθμός WBC στα ποντίκια Cry-null ήταν εξίσου υψηλός, όπως στα ποντίκια WT στο CT06 (Εικόνα 6e).

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Εδώ, αποδεικνύουμε ότι η κιρκαδική έκφραση Epo ρυθμίζεται σε μεταγραφικό επίπεδο. Η ανάλυση των συγκεντρώσεων Epo mRNA και S-Epo σε αρρυθμικά ποντίκια με έλλειψη Cry1 και Cry2 ανακατεύθυνε την αναζήτησή μας για το "ρολόι του Epo" στους μεταγραφικούς παράγοντες στόχους CLOCK και BMAL1, οι οποίοι καταστέλλονται από CRY1 και CRY2.26 Ablation of Cry1/Cry2 στην απώλεια της ρυθμικής καταστολής του CLOCK/BMAL1, με αποτέλεσμα σταθερά επίπεδα μεταγραφής Epo που ήταν μεταξύ των διάμεσων επιπέδων σε CT06 και CT18 σε ποντίκια WT (Εικόνα 1α). Ο in situ υβριδισμός με RNAscope υποδεικνύει ότι η κιρκάδια ταλάντωση επιτυγχάνεται με την ενεργοποίηση της έκφρασης Epo mRNA σε ενδιάμεσα κύτταρα (Εικόνα 1c) και ο in situ υβριδισμός με RNAscope αποκάλυψε επίσης την έκφραση του Bmal1 σε REPCs (Εικόνα 5).

Πιο σημαντικό, τα σημαντικά υψηλότερα επίπεδα S-Epo στο CT18 επιβεβαιώνουν ότι η κιρκαδική, μεταγραφική ρύθμιση Epo μεταφράζεται σε κιρκαδικές ταλαντώσεις της κυκλοφορούσας πρωτεΐνης Epo υπό νορμοξικές συνθήκες (Εικόνα 1β). Το πραγματικό μέγιστο των επιπέδων S-Epo αναμένεται λίγο αργότερα από το CT18 επειδή η de novo σύνθεση της πρωτεΐνης EPO απαιτεί w80 έως 120 λεπτά,38 και οι κιρκάδιοι χρόνοι επιλέχθηκαν με βάση τα μέγιστα επίπεδα mRNA Epo. 24 Βρήκαμε ότι η κιρκαδική ρύθμιση της EPO πιθανώς προκαλείται από μεταγραφική ενεργοποίηση ενός μοτίβου E-box στον προαγωγέα 5' EPO από το CLOCK/BMAL1 (Εικόνα 4 και Συμπληρωματικό Σχήμα S4), το οποίο είναι σύμφωνο με την περιγραφόμενη θετική συσχέτιση μεταξύ της πρωτεΐνης BMAL1 και Επίπεδα S-Epo σε μοντέλο οξείας αιμορραγίας αρουραίου.²⁵

Υπάρχουν στοιχεία για αμφίδρομη ρύθμιση μεταξύ των οδών CLOCK/BMAL1 και HIF μέσω της άμεσης αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης.^39,40Η ανοδική ρύθμιση του HIF2a, του κύριου ενεργοποιητή του προαγωγέα EPO,41,42 οδήγησε σε αλλοιωμένα επίπεδα έκφρασης γονιδίων ρολογιού σε κύτταρα ανθρώπινου ηπατώματος.43 Επιπλέον, το BMAL1 διμερίζεται με πρωτεΐνες HIF1a και HIF2a.^44,45,και ο έλεγχος του κιρκάδιου ρολογιού της δραστηριότητας του HIF ρυθμίζονται με έναν ειδικό για τον ιστό τρόπο.39 Σε ποντίκια, που εκτέθηκαν σε οξεία υποξία (4 ώρες στο 6 τοις εκατό έναντι 21 τοις εκατό O2), το mRNA EPO αυξήθηκε υπερβολικά αλλά δεν παρουσίαζε πλέον κιρκαδικές διαφορές .46 Έτσι, οι νορμοξικές συνθήκες είναι πιθανώς οι πιο κατάλληλες για την ανατομή του μοριακού μηχανισμού της κιρκαδικής ρύθμισης της Epo. Σε τρωκτικά, ωστόσο, έχουν αναφερθεί ημερήσιες αλλαγές στα επίπεδα οξυγόνου στο αίμα και στους ιστούς.39,47 Σε αρουραίους, υπάρχει χαμηλό εύρος ρυθμικών ημερήσιων αλλαγών στην οξυγόνωση των νεφρών της τάξης του zD3%, με κορύφωση στο σκοτάδι (¼ δραστηριότητα τρωκτικών) .47 Τέτοιες διαφορές δεν μπορούσαν να ανιχνευθούν στα πειράματά μας, στα οποία μόνο αναισθητοποιημένα, τραχειοτομή και μηχανικά αεριζόμενα ποντίκια μπορούσαν να μελετηθούν για ρυθμιστικούς λόγους στα ζώα. Ωστόσο, η ανάλυση του αρτηριακού pH, της μερικής πίεσης του CO2 και της μερικής πίεσης του O2, της περίσσειας τυπικής βάσης ή του γαλακτικού καθώς και του κορεσμού οξυγόνου δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ ποντικών WT και Cry-null και στις δύο CT (Εικόνα 2). Επιπλέον, τα επίπεδα μεταγραφής Hif2a στο νεφρό ήταν επίσης παρόμοια σε όλες τις καταστάσεις (Εικόνα 3). Έτσι, υπό κανονικές συνθήκες, η κιρκαδική ρύθμιση της Epo φαίνεται να είναι ανεξάρτητη από τις ημερήσιες αλλαγές στην τάση του οξυγόνου. Ωστόσο, το ερώτημα σε ποιο βαθμό το μεγάλο υψόμετρο ή η υποξία (χαμηλό pO2) επηρεάζει την κιρκαδική ταλάντωση της παραγωγής Epo αξίζει περαιτέρω προσοχή. Τα επίπεδα της ανθρώπινης S-Epo είναι γενικά υψηλότερα σε μεγάλο υψόμετρο, ενώ η φάση και το πλάτος είναι αμετάβλητα,17,22 και σε υγιείς εθελοντές που εκτίθενται σε νορμοβαρική υποξία, οι συγκεντρώσεις S-Epo παρουσιάζουν έντονη ταλάντωση.⁴⁸

Η ρύθμιση του κιρκάδιου Epo είναι πιθανώς πιο σημαντική για την κλινική νεφρολογία και αιματολογία, αλλά και για εργαστηριακά διαγνωστικά, όπως η εξέταση αίματος για ντόπινγκ με παράγοντες που διεγείρουν την ερυθροποίηση. Για την αξιολόγηση των συγκεντρώσεων της κυκλοφορούσας Epo στις αναλύσεις ντόπινγκ, πρέπει να ληφθούν υπόψη η ώρα της ημέρας (εξωτερική ώρα) κατά τη συλλογή του αίματος και ο χρονότυπος του ατόμου (εσωτερικός χρόνος).49,50

Στην ερυθροποίηση, οι μονάδες σχηματισμού ριπών – το ερυθροειδή είναι τα πρώτα ειδικά για τη γενεαλογία κύτταρα, ακολουθούμενα από μονάδες σχηματισμού αποικιών – ερυθροειδή, τα οποία παρουσιάζουν άφθονη έκφραση του υποδοχέα Epo. Μετά από 2 ημέρες σε καλλιέργεια με Epo, οι μονάδες σχηματισμού αποικιών ποντικού – ερυθροειδής παράγουν αποικίες ερυθροβλαστών. Μόλις επιτευχθεί το στάδιο των ορθοχρωματικών ερυθροβλαστών μετά από 7 ημέρες, τα κύτταρα εξωθούν τους πυρήνες τους για να γίνουν δικτυοερυθροκύτταρα που δεν έχουν έκφραση υποδοχέα Epo. πιθανώς δεν προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ CT06 και CT18 σε ποντίκια WT (Εικόνα 6a–c). Σημειωτέον, οι συνολικοί αριθμοί δικτυοερυθροκυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότεροι στα ποντίκια WT από ό,τι στα ποντίκια Cry-null (Εικόνα 6α), γεγονός που υποδηλώνει ότι η διαφοροποίηση σε δικτυοερυθρά κύτταρα είναι μειωμένη σε ποντίκια Cry-null. Προηγούμενα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα πρώιμα ερυθροειδή προγονικά κύτταρα παρουσιάζουν επίσης κιρκάδιο σχέδιο σύνθεσης DNA. Η in vivo χορήγηση του rhEpo ενισχύει τους κιρκάδιους ρυθμούς των αριθμών αποικιών ερυθροειδών.52 Χαμηλότεροι αριθμοί δικτυοερυθροκυττάρων, παρά τις σχετικά υψηλές συνολικές συγκεντρώσεις S-Epo στα ποντίκια Cry-null, θα μπορούσαν να προκύψουν από την κατάργηση της σύνθεσης του κιρκάδιου DNA στο επίπεδο των ερυθροειδών προγόνων. Τέτοιος αστερισμός υψηλής S-Epo και μειωμένη ερυθροποίηση έχει παρατηρηθεί σε ποντίκια με γενετική αφαίρεση παραγωγής μελατονίνης επίφυσης (ποντίκια C3H/HeN που στερούνται περιορισμένης ταχύτητας N-ακετυλο τρανσφεράση),53 που υποστηρίζουν εγγενείς κιρκαδικές δραστηριότητες στο ερυθροειδές προγονικό κύτταρο επίπεδο.

Συγκεκριμένα, τα ποντίκια Cry-null εμφανίζουν περίπου 80 τοις εκατό μείωση στα επίπεδα IGF1, οδηγώντας σε μειωμένη σηματοδότηση IGF1 και 30 τοις εκατό μείωση του σωματικού βάρους και του μεγέθους οργάνων σε σύγκριση με το WT, μια επίδραση που επιδεινώνεται κατά τη διάρκεια της ζωής. τα πειράματα ήταν σχετικά μικρά (μέση ηλικία,^21–29 εβδομάδων), εμφάνισαν μια μέτρια επίδραση στο συνολικό βάρος του σώματος και στο απόλυτο βάρος των νεφρών στα ποντίκια Cry-null, αλλά η αναλογία νεφρού προς βάρος σώματος ήταν φυσιολογική (Συμπληρωματικό Σχήμα S3). Το τελευταίο γεγονός μπορεί να σχετίζεται με την ικανότητα σύνθεσης πρωτεΐνης Epo (Εικόνα 1β).

Ωστόσο, η ανάλυση του μεγέθους ή του σχήματος των ερυθρών αιμοσφαιρίων (MCV, MCH και MCHC, Συμπληρωματικό Σχήμα S5) δεν υπέδειξε διατροφικές ανεπάρκειες (π.χ. σίδηρο και φυλλικό οξύ) ως εξήγηση για την ασυμφωνία μεταξύ του μειωμένου αριθμού δικτυοερυθροκυττάρων και του φυσιολογικού αριθμού ερυθροκυττάρων στο Cry- μηδενικά ποντίκια (Εικόνα 6α και β). Συγκεκριμένα, η σηματοδότηση Epo και IGF1 συγχρονίζουν τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων κατά τη διάρκεια της ερυθροποίησης μέσω αλληλεπίδρασης με το μεταγραφικό σύμπλεγμα GATA-1/φίλος του GATA-1.54 Σε αυτή τη διαδικασία, το Epo ενεργοποιεί την κυτταρική οδό AKT και ως εκ τούτου αυξάνει τη συγγένεια του GATA-1, του κύριου μεταγραφικού ρυθμιστή της ερυθροποίησης, με τον συμπαράγοντα φίλο του GATA-1. Αυτός ο μηχανισμός αναστέλλεται, ωστόσο, εάν καταργηθεί η σηματοδότηση IGF1.54 Έτσι, μια θετική επίδραση της σχετικά υψηλότερης Epo σε ποντίκια Cry-null στη διαφοροποίηση των ερυθρών αιμοσφαιρίων μπορεί να αντισταθμίσει τη μειωμένη δραστηριότητα IGF1 στα σχετικά νεαρά ποντίκια Cry-null που μελετήθηκαν εδώ.

Η γενική επίπτωση της πλήρους κιρκαδικής αρρυθμίας στην αιμοποίηση διευκρινίζεται περαιτέρω από την ανάλυσή μας των αριθμών των αιμοπεταλίων και των λευκών αιμοσφαιρίων. Προηγούμενα αποτελέσματα από ποντίκια που εκφράζουν μια κυρίαρχη-αρνητική μορφή του Ρολογιού (ClockD19/D19) έδειξαν ότι η διαταραχή της έκφρασης της θρομβοποιητίνης (του κύριου ρυθμιστή της μεγακαρυοποίησης) και του υποδοχέα της Mpl έχει ως αποτέλεσμα αυξημένο αριθμό ώριμων μεγακαρυοκυττάρων μυελού και κυκλοφορούντων αριθμών αιμοπεταλίων. 55 Η περιγραφείσα σημαντική κιρκάδια ταλάντωση των αριθμών αιμοπεταλίων με στο μέγιστο σε χρόνο zeitgeber (ZT) 20 σε ποντίκια WT καθώς και υψηλότερους αριθμούς αιμοπεταλίων σε ZT08 σε ποντίκια ClockD19/D19,55 με αποτέλεσμα την έλλειψη κιρκαδικής ταλάντωσης των αριθμών αιμοπεταλίων, δεν μπόρεσε να επιβεβαιωθεί στο μοντέλο ποντικιού μας (Εικόνα 6δ). Ένα άλλο σημαντικό εύρημα είναι η απώλεια των διαφορών ώρας της ημέρας των κυκλοφορούντων WBC σε ποντίκια Cry-null σε αντίθεση με τα ποντίκια WT (Εικόνα 6e), η οποία είναι σύμφωνη με την αναφερόμενη δραστηριότητα του CLOCK/BMAL1 στην παραγωγή ώριμων λευκών αιμοσφαιρίων.^56,57

Για την ερμηνεία των δεδομένων μας, πρέπει να ληφθούν υπόψη οι διαφορές στις δραστηριότητες ημέρας-νύχτας σε ποντίκια και ανθρώπους: Ο χρόνος CT06 στους ανθρώπους αντιστοιχεί περίπου στα μεσάνυχτα (φάση ύπνου), ενώ ο χρόνος CT18 αντιστοιχεί περίπου στο μεσημέρι (φάση δραστηριότητας). Το αντίθετο ισχύει για τα νυκτόβια ποντίκια, αλλά και οι δύο οργανισμοί εμφανίζουν το ίδιο κιρκαδικό πρότυπο έκφρασης Epo (χαμηλό σε CT/ZT06, υψηλό σε CT/ZT18). Αυτό δείχνει ότι πρόσθετοι μηχανισμοί (π.χ. μεταβολικοί παράγοντες) θα μπορούσαν να τροποποιήσουν τους ρυθμούς της έκφρασης της Epo και στους δύο οργανισμούς. Ο συγχρονισμός μεταξύ των επιπέδων κορυφής της Epo και της έκφρασης του υποδοχέα Epo σε πρώιμους ερυθροειδείς προγόνους (μονάδες σχηματισμού ριπών-ερυθροειδείς και ακόμη και μονάδες σχηματισμού αποικιών- ερυθροειδή κύτταρα)⁵² υποδηλώνει ότι οι ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με rhEpo (π.χ. σε νεφρική αναιμία τελικού σταδίου ή αιματολογικές διαταραχές) θα ωφεληθούν από τη μίμηση της φυσιολογικής κιρκαδικής φυσιολογίας εφαρμόζοντας υπογλυκαιμία κατά τη διάρκεια της νύχτας. Δεν έχουν ακόμη αναφερθεί αιμοποιητικές διαταραχές σε ανθρώπους με μεταλλάξεις απώλειας λειτουργιών CRY1 (Online Mendelian Inheritance in Man *601933) ή CRY2 (Online Mendelian Inheritance in Man *603732). Κλινικές αναφορές συσχετίζουν παραλλαγές CRY1 κυρίως με διαταραχές ελλειμματικής προσοχής/υπερκινητικότητας, που συχνά συνοδεύονται από αϋπνία, άγχος, κατάθλιψη ή διαταραχή καθυστερημένης φάσης ύπνου.^58,59Αυτό αξίζει περαιτέρω διερεύνηση γιατί τέτοιες ασθένειες μπορεί να επιδεινωθούν από αναιμία ή αιμοποιητικές διαταραχές.

Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη παρέχει τις πρώτες ενδείξεις ότι η κιρκαδική έκφραση της EPO στον κανονικό νεφρό ποντικού ενηλίκου ρυθμίζεται σε μεταγραφικό επίπεδο από την ενεργοποίηση με τη μεσολάβηση CLOCK/BMAL1- ενός στοιχείου E-box στον προαγωγέα 5'EPO. Καθώς η ΕΡΟ δρα διακριτικά μέσα στο πολύπλοκο ρυθμιστικό δίκτυο της ερυθροποίησης, η βέλτιστη χρήση του repo σε ασθενείς με νεφρική ανεπάρκεια μπορεί να περιλαμβάνει την εφαρμογή του ακριβώς πριν από το φυσιολογικό κιρκάδιο μέγιστο κατά τη διάρκεια της νύχτας.