Ο κεντρικός ρόλος του μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα- (TGF-) στην ανάπτυξη της νεφρικής ίνωσης
Mar 26, 2022
Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
ΜΕΡΟΣ Ⅰ: Ο ρόλος της ανθρώπινης πρωτοπαθούς νεφρικής ινοβλάστης σε TGF- 1-Συσκευές μίμησης ίνωσης με μεσολάβηση
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee & et al.
1. Εισαγωγή
Νεφρική ίνωση, η τελική κοινή οδός αναρίθμητων προοδευτικών νεφρικών παθήσεων, χαρακτηρίζεται από αύξηση της παραγωγής πρωτεΐνης εξωκυτταρικής μήτρας (ECM), μείωση της αποικοδόμησης της μήτρας, δυσλειτουργία της αλληλεπίδρασης κυττάρου-μήτρας, μετασχηματισμό μόνιμων κυττάρων και διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων.Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-Το (TGF- ) είναι ένα πολυλειτουργικό διμερές πεπτίδιο που ρυθμίζει βιολογικές διεργασίες όπως ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, η διαφοροποίηση και οι ανοσολογικές αποκρίσεις [1]. Μεταξύ των πολυάριθμων ινωδογόνων παραγόντων, ο TGF- (Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-) παίζει κεντρικό ρόλο και έχει αντιφλεγμονώδη δράση. TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)-τα ποντίκια με έλλειψη πεθαίνουν από μαζική φλεγμονή. Διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)προστατεύονται ουσιαστικά από την ανάπτυξη νεφρικής ινωτικής παθολογίας, κυρίως μέσω της αντιφλεγμονώδους δράσης του [2]. Οι κερδοσκοπικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες του TGF-(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)είναι δίκοπα μαχαίρια σχετικά με τη θεραπευτική εφαρμογή του TGF-(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)αναχαίτηση. Έχουν γίνει αξιοσημείωτες προσπάθειες για την παρεμπόδιση του TGF-(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)δράση για την παρεμπόδιση της εξέλιξης τουνεφρώνίνωση[3]. Αν και πολλές προσεγγίσεις έχουν χρησιμοποιηθεί για την καταπολέμησηνεφρώνίνωση, ένα πειραματικό μοντέλο για την αξιολόγηση των διαθέσιμων φαρμάκων δεν είναι ιδανικό.
cistanche βότανο πρόληψηνεφρικές παθήσεις
Γενικά, οι μελέτες σε ζώα διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στις προκλινικές δοκιμές για την πρόβλεψη της φαρμακοκινητικής και της αποτελεσματικότητας των φαρμάκων. Ωστόσο, υπάρχουν διάφορες διαφορές μεταξύ ζώων και ανθρώπων, γεγονός που μας ωθεί να αμφισβητήσουμε την ακρίβεια των δοκιμών αποτελεσματικότητας και ασφάλειας φαρμάκων με βάση τα ζώα. Η νεφρική λειτουργία των ζώων είναι υπερδιπλάσια από αυτή των ανθρώπινων νεφρών. Ως εκ τούτου, τα φάρμακα μεταβολίζονται πιο γρήγορα στα ζώα από ό,τι στον άνθρωπο, καθιστώντας δύσκολη την αποσαφήνιση των αποτελεσμάτων των δοκιμών τοξικότητας φαρμάκων χρησιμοποιώντας μελέτες σε ζώα. Επιπλέον, τα αποτελέσματα πειραμάτων σε ζώα δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την πρόβλεψη των αντιδράσεων των φαρμάκων στους ανθρώπους, καθώς τα ζώα έχουν διαφορετικές φυσιολογικές λειτουργίες. με βάση τα ζώανεφρική ίνωσητα μοντέλα έχουν δυσκολίες στην αναπαραγωγή του ανθρώπουνεφρική ίνωση; Ως εκ τούτου, η έρευνα βρίσκεται σε εξέλιξη για να ξεπεραστούν τα τρέχοντα εμπόδια και να βελτιστοποιηθούν οι πλατφόρμες ανακάλυψης φαρμάκων [5].
Η τεχνολογία Organ-on-a-chip (OoC) έχει αναδειχθεί ως μια νέα ιδέα για την επίλυση αυτών των προβλημάτων. Αυτή η πλατφόρμα σχεδιάστηκε λαμβάνοντας υπόψη τις τρέχουσες ελλείψεις και έχει δείξει πολλές υποσχέσεις στον τομέα της νεφρολογίας [6]. Επιπλέον, τα μοντέλα OoC έχουν μεγάλες δυνατότητες ως αντικατάσταση μοντέλων πειραματόζωων, παρέχουν λύση για διαφορές μεταξύ των ειδών και μπορούν να βοηθήσουν να τερματιστεί η σκληρότητα των ζώων και οι ηθικές συζητήσεις [7]. Υπάρχουν λίγα in vitro μοντέλα που χρησιμοποιούν ταυτόχρονα πρωτογενείς νεφρικούς ινοβλάστες με ενδοθηλιακά και επιθηλιακά κύτταρα, τα οποία είναι σημαντικά κύτταρα σενεφρόίνωση. Ο ρόλος κάθε κυττάρου σείνωσημελετάται χωριστά. Ωστόσο, υπάρχει περιορισμένη γνώση σχετικά με την αλληλεπίδραση των κυττάρων.
Στην παρούσα μελέτη αναπτύξαμείνωση-συσκευές μίμησης που χρησιμοποιούν ανθρώπινους πρωτογενείς ινοβλάστες. Επιβεβαιώσαμε ότι το TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)Η θεραπεία έχει διάφορες επιπτώσεις στηννεφρική ίνωσημοντέλο. Συγκεκριμένα, οι ινοβλάστες διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο ως τελεστικά κύτταρα, προάγουν το σχηματισμό ενός προ-ινωτικού μικροπεριβάλλοντος και εκκρίνουν αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες. Επομένως, με βάση αυτή τη νέα μέθοδο, οι ινοβλάστες μπορεί να παρέχουν ένα ιδανικό σύστημα κυτταρικού μοντέλου για τη μελέτη της νεφρικής νόσου. Αξιολογήσαμε εάν οι ινοβλάστες που προέρχονται από ινωτική νεφρική νόσο επηρεάζουν την ακεραιότητα των κυττάρων που καλλιεργούνται σε τρεις διαστάσεις (3D). Τέλος, παρουσιάζουμε μια μελέτη απόδειξης αρχής που καταδεικνύει τις δυνατότητες του ανθρώπουνεφρική ίνωση- μίμηση συσκευών ως μοντέλο για την πρόβλεψη της απόκρισης στον άνθρωπονεφρική ίνωση.
επιδράσεις του cistanche: θεραπεία νεφρικής λοίμωξης
2. Αποτελέσματα
2.1. Αναγνώριση της ακτίνης άλφα λείων μυών (a-SMA) και της κερατίνης-8(KRT-8) από TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)σε κελιά HK-2
Στην πρώιμη φάση, εξετάσαμε γνωστούς δείκτες τουίνωσηκαι ο κυτταροσκελετός σε δισδιάστατες (2D)καλλιέργειες. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές χρώσης ανοσοφθορισμού για την εκτίμηση της έκφρασης -SMA της ίνωσης και του δείκτη σωληναριακής μετάπτωσης στο μεσεγχυματικό (EMT) και των επιπέδων KRT8 ως δείκτης κυτταροσκελετού. Η χρώση με ανοσοφθορισμό έδειξε ότι η έκφραση του -SMA ήταν αρχικά ασθενής και τα επίπεδα KRT8 ήταν υψηλά στα μονοστιβαδικά HK-2 επιθηλιακά κύτταρα. Δεν υπήρξε σημαντική μεταβολή στην ένταση φθορισμού από το TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)(5 ng/mL) ή τη θεραπεία με ειδικό αναστολέα των επιθηλιακών κυττάρων HK-2 για 24 ώρες (Εικόνα 1).
Εικόνα 1. Ο ανοσοφθορισμός δείχνει ότι η έκφραση του άλφα-SMA και της κερατίνης-8(KRT8) διατηρήθηκε με θεραπεία του TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)ή τον αναστολέα σε κύτταρα HK-2.(Α) Η έκφραση του άλφα-SMA και του (B)CCK-8 δεν είχε καμία επίδραση στα κύτταρα HK-2 από το TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)(5ng/mL) ή τον αναστολέα. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν αρχικά σε πυκνότητα 1×10 μοιρών ανά φρεάτιο (ac)μη επεξεργασμένο μάρτυρα και (df) διεγέρθηκαν με 5 ng/mL TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-) ή (gi) 10 μM αναστολέα (SB431542) για 24 ώρες και σταθεροποιήθηκε με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με αντι- -SMA και αντι-κυτταροκερατίνη-8 για 20 λεπτά. Πραγματοποιήθηκε συν-χρώση με χρωστική Hoechst H33342 για ταυτοποίηση κυτταρικών πυρήνων. Οι ράβδοι κλίμακας σε μικρογραφίες δείχνουν 200 um.
η σκόνη κιστάνι βελτιώνει τη λειτουργία των νεφρών
2.2. Έκφραση KRT8 μειώθηκε κατά TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)σε ένα τσιπ
Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε τα επίπεδα έκφρασης των -SMA και KRT8 σε 3D-καλλιεργημένη HK-2 και το συνολικό μήκος των ενδοθηλιακών κυττάρων της ανθρώπινης ομφαλικής φλέβας (HUVECs) GFP που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)και έναν ειδικό αναστολέα. Για να το πετύχουμε αυτό, δημιουργήσαμε αρχικά ένα μοτίβο τσιπ ιστού που περιλαμβάνει δύο τύπους κυττάρων, τα επιθηλιακά κύτταρα HK-2 και τα GFP-HUVECs. Μετά την επιβεβαίωση της κατασκευής, εκθέσαμε το τσιπ ιστού με TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)(5 ng/mL) ή έναν ειδικό αναστολέα (10 um SB431542) για 24 ώρες.
Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2A-C, η έκφραση του -SMA δεν άλλαξε ειδικά από το TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)ή τη θεραπεία με ειδικό αναστολέα. Ωστόσο, η έκφραση του KRT8 μειώθηκε στο συγκαλλιεργούμενο τσιπ τύπου δύο κυττάρων. Επιπλέον, η προσθήκη ενός αναστολέα TGF-ß1 αύξησε την έκφραση του KRT8.
Εξετάσαμε τον σχηματισμό ενός τρισδιάστατου σωληνοειδούς τριχοειδούς δικτύου από το TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)θεραπεία σε HUVECs, καθώς τα ενδοθηλιακά κύτταρα μπορούν να σχηματίσουν αυθόρμητα ένα τρισδιάστατο σωληνοειδές τριχοειδές δίκτυο. Σύμφωνα με τις πολιτισμικές μας συνθήκες, ο σχηματισμός παχύρρευστων γραμμών μειώθηκε σημαντικά. Ωστόσο, οι τριχοειδείς λεπτές γραμμές αυξήθηκαν στο TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)επεξεργασμένα GFP-HUVEC. Στην περίπτωση του TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)θεραπεία με αναστολέα στο τρισδιάστατο τσιπ που καλλιεργήθηκε, το συνολικό μήκος των παχιών και παχιών γραμμών έδειξε αντίστροφη τάση προς TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)θεραπευτική αγωγή. Παρατηρήθηκε αύξηση στο μήκος της παχιάς γραμμής σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου που δεν υποβλήθηκε σε αγωγή. Παρόμοιο μοτίβο παρατηρήθηκε στη διάμετρο της παχιάς γραμμής στο GFP-HUVEC μετά το TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)θεραπεία και θεραπεία με αναστολείς. Η διάμετρος του GFP-HUVEC καταστέλλεται από το TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)θεραπεία αλλά αυξήθηκε ανεξάρτητα από το πάχος της γραμμής από τον αναστολέα σε σύγκριση τόσο με τους ελέγχους όσο και με τον TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-). Το συνολικό μήκος και η διάμετρος της παχιάς γραμμής αυξήθηκαν δραματικά με τη θεραπεία με αναστολέα TGF- 1 σε σύγκριση με τη θεραπεία ελέγχου χωρίς θεραπεία και τη θεραπεία με TGF- 1. Συγκεκριμένα, τα ληφθέντα αποτελέσματα έδειξαν αυξημένη πυκνότητα μικροσκοπικών αγγείων στο TGF-(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)-ομάδα που έλαβε θεραπεία σε σύγκριση με τις αντίστοιχες που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία. Αντίθετα, η πυκνότητα των παχιών αγγείων στο TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)η ομάδα θεραπείας ήταν χαμηλότερη από εκείνη στην ομάδα ελέγχου που δεν υποβλήθηκε σε θεραπεία (Εικόνα 2Δ, Ε).
Εικόνα 2. Έκφραση KRT8 σε HK-2 και συνολικό μήκος και διάμετρος των HUVEC.(Α) Ο ανοσοφθορισμός δείχνει ότι η έκφραση του -SMA διατηρήθηκε και η έκφραση του KRT8 μειώθηκε δραματικά με τη θεραπεία του TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)στο Χονγκ Κονγκ-2. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν και διεγέρθηκαν με 5 ng/mL TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)ή αναστολέα 10 μm (SB 431542) για 24 ώρες και σταθεροποιήθηκε με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αντι- -SMA και αντι-κυτταροκερατίνη-8 για 20 λεπτά. Πραγματοποιήθηκε συν-χρώση με χρωστική Hoechst H33342 για ταυτοποίηση κυτταρικών πυρήνων. Η έκφραση του -SMA(ac) δεν είχε καμία αλλαγή αλλά το KRT8(df) στα κύτταρα HK{-2 και η έκφραση GFP σε HUVEC (gi) άλλαξαν σημαντικά από το TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)(5 ng/mL) και ο αναστολέας (B, C). Στο συνολικό μήκος των HUVEC, το λεπτό δοχείο αυξήθηκε αλλά το παχύ δοχείο μειώθηκε κατά TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-). Η διάμετρος αυξήθηκε τόσο στα λεπτά όσο και στα παχιά αγγεία. Αυτά τα αποτελέσματα αντιστράφηκαν από τον αναστολέα SB431542 (D, E). Οι ράβδοι κλίμακας στα μικρογραφήματα δείχνουν 100 μm.*σελ<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
σε ποιες περιπτώσεις χρησιμοποιείται το κιστάνι: θεραπεία χρόνιων νεφρικών παθήσεων
2.3. TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)Επηρεάζει τρεις τύπους κυττάρων του τσιπ με δομή πολλαπλών διαμερισμάτων
Για να μελετήσετε το TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)απαντήσεις του προτεινόμενου τσιπ 3D, πραγματοποιήσαμε ανοσοχρώση σε κάθε διαμέρισμα ξεχωριστά (Εικόνα 3). Σε αυτή την ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενείς ανθρώπινοι νεφρικοί ινοβλάστες. Τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FACS και επιβεβαιώθηκε ότι ήταν θετικά για το αντίσωμα δείκτη ινοβλαστών. Μετά την επώαση των τριών τύπων κυττάρων με TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)για 24 ώρες, πραγματοποιήθηκε ανοσοχρώση για την αξιολόγηση της έκφρασης -SMA και KRT8. Η έκφραση του a-SMA ρυθμίστηκε προς τα πάνω από τη θεραπεία με TGF-1 και παρατηρήθηκαν αντίθετα αποτελέσματα με το TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)θεραπεία με αναστολείς. Αντίθετα, η έκφραση του KRT8 υπορυθμίστηκε από το TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)και έδειξε αντίθετη απόκριση στο TGF-(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)αναστολέας (Εικόνα 4A-C).
Εικόνα 3. Δείγμα εικόνας με σχηματική επίδειξη συσκευής της κατασκευής και του πειραματικού χρονοδιαγράμματος.(Α) Οι δύο πρώτες εικόνες δείχνουν τη διάταξη. Η αριστερή εικόνα δείχνει μια συνολική φωτογραφία από πάνω προς τα κάτω της συσκευής. Οι κάτω εικόνες δείχνουν τη διατομή. Σχηματική όψη με λεπτομέρειες των διαστάσεων των οδηγών υγρού. (Β) Αυτό το σχήμα περιγράφει τα πειραματικά χρονοδιαγράμματα γιαίνωση- συσκευές μίμησης. Η διαδικασία φόρτωσης τεσσάρων βημάτων για κάθε φρεάτιο. Τοποθεσία κάθε περιοχής σχεδίασης υδρογέλης, καθώς και η τοποθέτηση των μέσων σε από πάνω προς τα κάτω και ισομετρική διατομή. (1) Συνολικά 1,5 uL υδρογέλης 1 οδηγούνται αυθόρμητα στο κεντρικό κανάλι. (2) Το κεντρικό κανάλι είναι γεμάτο με 5 uL υδρογέλης. (3)Συνολικά 10uL υδρογέλης 3 διαμορφώνονται στο πάτωμα της δεξαμενής. (4) Διανέμονται συνολικά 200 μL μέσου. Κόκκινη γραμμή κλίμακας=9 mm.
Όπως απεικονίζεται στο σχήμα 4D-G, το μήκος της λεπτής γραμμής που μοιάζει με τριχοειδές αυξήθηκε σημαντικά κατά TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)θεραπεία στα GFP-HUVEC. Ωστόσο, το πάχος της παχιάς γραμμής μειώθηκε στο TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)επεξεργασμένα HUVEC. Η διάμετρος μειώθηκε κατά μέσο όρο για τα λεπτά και παχιά αγγεία στα HUVEC. Στην περίπτωση του TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)θεραπεία με αναστολέα στο τρισδιάστατο τσιπ που καλλιεργήθηκε, το συνολικό μήκος των παχύρρευστων και παχιών γραμμών έδειξε αντίθετη τάση από τη θεραπεία με TGF- 1. Περαιτέρω, το μήκος της παχιάς γραμμής αυξήθηκε σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου που δεν υποβλήθηκε σε αγωγή.
Εικόνα 4. Αλλαγή των τρισδιάστατων καλλιεργημένων HK-2 και HUVECs με πρωτογενείς νεφρικούς ινοβλάστες.Τα συνολικά κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 5×10 μοιρών ανά τσιπ 3D και διεγέρθηκαν με 5 ng/mL TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)ή αναστολέα 10 μm (SB 431542) για 24 ώρες και σταθεροποιήθηκε με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη. (Α) Τα κύτταρα στο τσιπ 3D χρωματίστηκαν με αντι-ο-SMA και αντι-κυτταροκερατίνη-8. Η έκφραση του -SMA (ac) αυξήθηκε και η έκφραση KRT8(df) μειώθηκε κατά TGF- 1 (5 ng/mL) σημαντικά. Το συνολικό μήκος των HUVEC. Τα λεπτά αγγεία αυξήθηκαν δραματικά και τα παχιά αγγεία μειώθηκαν από τον TGF-ß1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)(Δ, Ε). Η διάμετρος μειώθηκε για λεπτά και παχιά αγγεία (F, G). Αυτά τα αποτελέσματα αντιστράφηκαν από τον αναστολέα SB431542. Οι ράβδοι κλίμακας σε μικρογραφίες δείχνουν 100 μm.*σελ<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 Ρυθμίζει τους φλεγμονώδεις μεσολαβητές και τους αυξητικούς παράγοντες
Στη συνέχεια, διερευνήσαμε τις φλεγμονώδεις κυτοκίνες και τους αυξητικούς παράγοντες στο υπερκείμενο υγρό. IL-1, FGF-2, TGF- 2(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)και TGF- 3(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)Η έκκριση πρωτεΐνης ήταν δραματικά υψηλότερη σε τρισδιάστατα καλλιεργημένα τσιπ από ό,τι οι 2D ινοβλάστες που καλλιεργήθηκαν καλά, παρόλο που είχαν τον ίδιο συνολικό αριθμό κυττάρων. Ωστόσο, TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-) τα επίπεδα ήταν παρόμοια, καθώς τα μοντέλα που καλλιεργήθηκαν 2D ή 3D αντιμετωπίστηκαν με παρόμοιες συγκεντρώσεις TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)(Εικόνα 5Α-Ε). Ειδικότερα, η απελευθέρωση FGF-2 από ανθρώπινους πρωτογενείς νεφρικούς ινοβλάστες ήταν 20,9 ± 0.4 pg/ημέρα/5× 10 μοιρών κυττάρων της 2D μονοστρωματικής καλλιέργειας και 3094,8± 0,2 pg/ημέρα/5× κύτταρα 10 μοιρών, συμπεριλαμβανομένων των HUVEC και HK-2 του τσιπ που καλλιεργήθηκε 3D στον μη επεξεργασμένο μάρτυρα. Η έκκριση του FGF-2 από τον TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)η διέγερση ήταν 31.0±0.2 pg/ημέρα/5×10 βαθμού κύτταρα για την καλλιέργεια 2D και 3683,9± 0,8 pg/ημέρα/5×10 μοίρες κύτταρα για την 3D -καλλιεργημένο τσιπ. Αυτή η αύξηση στην παραγωγή πρωτεΐνης FGF-2 στην καλλιέργεια μονοστοιβάδας 2D παραλληλίστηκε με μια αύξηση στο μοντέλο τσιπ που καλλιεργήθηκε με 3D από το TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)θεραπεία (Εικόνα 5Β).
Εικόνα 5. Σύγκριση μοντέλων καλλιέργειας 2D και 3D ως πλατφορμών που μιμούνται τη νεφρική ίνωση.Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 5×10 μοιρών ανά φρεάτιο 2D ή τσιπ 3D και διεγέρθηκαν με 5 ng/mL TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)ή αναστολέα 10 um (SB 431542) για 24 ώρες. Οι πρωτογενείς ανθρώπινοι νεφρικοί ινοβλάστες χρησιμοποιήθηκαν στο μοντέλο της 2D-καλλιέργειας και στο 3D-καλλιεργημένο μοντέλο. Οι ινοβλάστες χρησιμοποιήθηκαν σε πυκνότητα 8×10* καλλιεργήθηκαν με HUVECs και HK-2. Η αναλογία πρωτογενούς ανθρώπινου νεφρικού ινοβλάστες προς HUVEC, ή αναλογία F: H, ήταν 1:5 για την αξιολόγησηίνωσηΚύτταρα .HK-2 χρησιμοποιήθηκαν σε πυκνότητα 2×104. Η ανίχνευση (A)IL-1,(B)βασικού αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGF-2) και (CE)TGF-βήτα 1, 2 και 3 στο υπερκείμενο διεξήχθη με πολλαπλή ανάλυση κυτοκίνες και πολλαπλή ανοσοδοκιμασία σφαιριδίων. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο± SE.*σελ<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-).
Οφέλη cistanche tubolosa: θεραπεία νεφρικών παθήσεων
Επιπλέον, υπολογίσαμε την έκφραση mRNA των προφλεγμονωδών κυτοκινών όπως τα IL-1, IL-6, IL-8 και TNF-. Τα αποτελέσματα μειώθηκαν σημαντικά από τον ανασυνδυασμένο ανθρώπινο TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)θεραπεία στο 3D-καλλιεργημένο τσιπ ως αντιφλεγμονώδη ιδιότητα του TGF-(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-). Βρήκαμε ότι η έκφραση του mRNA ρυθμίστηκε προς τα πάνω από το TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)αναστολέας (SB431542). Επιπλέον, η διαμεσολαβούμενη από αναστολέα έκφραση των IL-6, IL-8 και TNF- ρυθμίστηκε ειδικά προς τα κάτω σε σύγκριση με τον μάρτυρα που δεν υποβλήθηκε σε αγωγή (Εικόνα 6A-D). Το επίπεδο mRNA του VEGF, ενός ινωτικού παράγοντα, αυξήθηκε σημαντικά από τον TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)θεραπευτική αγωγή. Το επίπεδο mRNA του VEGF μειώθηκε από τον αναστολέα TGF- 1 (Εικόνα 6Ε), ενώ η έκφραση mRNA του IL-10 με αντι-ινωτικό αποτέλεσμα μειώθηκε σε ινωτικές καταστάσεις που προκαλούνται από τον TGF- 1 . Αντίθετα, η έκφραση I-10mRNA αυξήθηκε με θεραπεία με αναστολέα TGF- 1 (Εικόνα 6F).
Εικόνα 6. Η PCR πραγματικού χρόνου δείχνει τη συνολική έκφραση mRNA του τσιπ 3D.Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 5×10 μοιρών ανά τσιπ 3D και διεγέρθηκαν με 5 ng/mL TGF- 1(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)ή αναστολέα 10 um (SB431542) για 24 ώρες. Ολικό RNA που εξήχθη από το τρισδιάστατο-καλλιεργημένο τσιπ. Η έκφραση mRNA του (A)IL-1,(B)TNF-,(C)IL-6 και (D)IL-8 αντιπροσωπεύει το αντιφλεγμονώδες αποτέλεσμα του TGF{ {10}}(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-)θεραπευτική αγωγή. Η έκφραση (Ε)VEGF ως αγγειογενετικός παράγοντας αυξήθηκε. Η έκφραση (F)IL-10 ως αντι-ινωτικός παράγοντας μειώθηκε σημαντικά από τον TGF- 1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας-).
