Η αιτία της νόσου των πολυκυστικών νεφρών

για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Η υπερέκφραση της PKD1 προκαλεί πολυκυστική νόσο των νεφρών

Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté και Marie Trude

Οι υποκείμενοι παθογενετικοί μηχανισμοίαυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο(ADPKD) μένει να διευκρινιστεί. Ενώ υπάρχουν στοιχεία ότι Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)η γονιδιακή απλοανεπάρκεια και η απώλεια της ετεροζυγωτίας μπορεί να προκαλέσουν σχηματισμό κύστης σε ποντίκια, παράδοξα υψηλά επίπεδα Pkd1 (πολυκυστική νεφρική νόσος 1) έχει ανιχνευθεί έκφραση στους νεφρούς της ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο) ασθενείς. Για να προσδιορίσετε εάν Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)Το κέρδος της λειτουργίας μπορεί να είναι μια παθογενετική διαδικασία, ένα βακτηριακό τεχνητό χρωμόσωμα Pkd1 (Pkd1-BAC) τροποποιήθηκε με ομόλογο ανασυνδυασμό για να στοχεύσει αποκλειστικά μια παρατεταμένη έκφραση Pkd1 κατά προτίμηση στον ενήλικο νεφρό. Δημιουργήθηκαν αρκετές διαγονιδιακές γραμμές που υπερέκφρασαν ειδικά το Το διαγονίδιο Pkdl στους νεφρούς 2- έως 15-διπλασιάζεται πάνω από τα ενδογενή επίπεδα Pkd1. Όλα τα διαγονιδιακά ποντίκια ανέπτυξαν αναπαραγώγιμα σωληναριακό και σπειραματικό κόστος και νεφρική ανεπάρκεια και πέθαναν από νεφρική ανεπάρκεια. Αυτό το μοντέλο καταδεικνύει ότι η υπερέκφραση του Pkd1 άγριου τύπου από μόνη της είναι αρκετή για να προκαλέσει κυστεογένεση που μοιάζει με ανθρώπινη ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο). Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν επίσης μια εντυπωσιακή αυξημένη νεφρική έκφραση c-myc σε ποντικούς από όλες τις διαγονιδιακές σειρές, υποδεικνύοντας ότι το c-myc είναι κρίσιμος in vivo μεταγενέστερος τελεστής του Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)molecular Dathwavs, Αυτή η μελέτη όχι μόνο παρήγαγε μια ανεκτίμητη και πρώτη PKD(πολυκυστική νεφρική νόσο)μοντέλο για την αξιολόγηση της μοριακής παθογένεσης και των θεραπειών, αλλά παρέχει επίσης στοιχεία ότι το κέρδος της λειτουργίας θα μπορούσε να είναι ένας παθογενετικός μηχανισμός στην ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο).

Κάντε κλικ στο Cistanche για νεφρική νόσο

Αυτοσωμικό επικρατέςπολυκυστική νεφρική νόσο(ADPKD) είναι μια από τις πιο συχνές γενετικές ασθένειες στον άνθρωπο. Χαρακτηρίζεται από την προοδευτική ανάπτυξη πολλαπλών νεφρικών κύστεων που επηρεάζουν όλα τα τμήματα του νεφρώνα. Άλλες εκδηλώσεις περιλαμβάνουν το σχηματισμό κύστεων στο ήπαρ και το πάγκρεας καθώς και ενδοκρανιακά ανευρύσματα και καρδιαγγειακά ελαττώματα. ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο)συνήθως οδηγεί σε νεφρική ανεπάρκεια με εξέλιξη σε νεφρική νόσο τελικού σταδίου μέχρι την ύστερη μέση ηλικία.

Περίπου το 85 τοις εκατό του ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο)περιπτώσεις σχετίζονται με μεταλλάξεις στην PKD1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)γονίδιο. Αυτό το PKD1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)Το γονίδιο είναι μεγάλο, εκτείνεται σε 54 kb και αποτελείται από 46 εξόνια. Δημιουργεί μια μεταγραφή 14.2-kb και κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 4., 302-αμινοξέων που ονομάζεται πολυκυστίνη-1(4, 9-11). Η ανθρώπινη έκφραση PKD1 και πολυκυστίνης-1 έχει αναλυθεί σε φυσιολογική και ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο)νεφρά. Κατά τη νεφρική ανάπτυξη, η πολυκυστίνη-1 ανιχνεύεται εύκολα σε σπειραματικά και σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα (ανασκοπείται στην αναφορά 37 και αναφορές σε αυτήν). Σε φυσιολογικούς ενήλικες, εμείς και άλλοι έχουμε δείξει ότι η PKD1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)Το RNA και η πρωτεΐνη εκφράζονται σε μέτρια έως χαμηλά επίπεδα στα συλλεκτικά και στα απομακρυσμένα σωληνάρια, ενώ τα επίπεδα αυξήθηκαν (~2-πλάσια) στην ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο)νεφροί (22, 39). Είναι ενδιαφέρον ότι η επίμονη ή ενισχυμένη έκφραση πολυκυστίνης-1 ανιχνεύεται στην πλειονότητα των νεφρικών επιθηλιακών κύστεων, αν και η χρώση απουσίαζε σε μια σημαντική μειοψηφία των κύστεων(29). Εκτός από τα νεφρά, το PKD1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)Η έκφραση είναι συνήθως ευρέως διαδεδομένη σε άλλους ενήλικους ιστούς, συμπεριλαμβανομένων των επιθηλιακών και μη επιθηλιακών τύπων κυττάρων (6,14,18,29,30, 39).

Περισσότερα από 200 διαφορετικά PKD1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)έχουν περιγραφεί μεταλλάξεις, οι περισσότερες από τις οποίες είναι μεταλλάξεις διαγραφής-εισαγωγής, μετατόπισης πλαισίου ή ανούσιες μεταλλάξεις. Αυτά προβλέπεται ότι θα οδηγήσουν σε κολοβωμένες μορφές της πρωτεΐνης, σύμφωνα με την αδρανοποίηση ενός αλληλόμορφου.

Ωστόσο, ένα σημαντικό ποσοστό είναι μια εσφαλμένη έννοια ή μεταλλάξεις εντός πλαισίου που βρίσκονται σε όλο το γονίδιο και είναι συχνά μοναδικές σε μια συγκεκριμένη οικογένεια (33, 34). Όπως υποδηλώνει το όνομα, ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο)είναι κυρίαρχο και το μεταδιδόμενο μεταλλαγμένο PKD1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)Το αλληλόμορφο είναι αρκετό για την πρόκληση της νόσου. Ωστόσο, η εστιακή φύση των νεφρικών κύστεων στην ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο)υποδηλώνει ότι ο μηχανισμός μετάλλαξης για την PKD1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)μπορεί να είναι δύο χτυπήματα ή απώλεια ετεροζυγωτίας. Η υποστήριξη αυτού του μηχανισμού λήφθηκε με την ανίχνευση του PKD1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)κλωνικές σωματικές μεταλλάξεις σε κύτταρα από σημαντικό ποσοστό κύστεων (3, 21, 32). Ένας μηχανισμός απώλειας ετεροζυγωτίας θα μπορούσε να ευθύνεται για τον ευρέως διαφορετικό φαινότυπο που παρατηρείται συνήθως σε μεμονωμένες οικογένειες.

Μελέτες στο ποντίκι Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)γονίδιο μπορεί να παρέχει πολύτιμες γνώσεις σχετικά με τη λειτουργία ή τις λειτουργίες PKD1 λόγω της στενής ομοιότητας μεταξύ του ανθρώπινου γονιδίου και του ποντικού και του γονιδιακού προϊόντος. Σε φυσιολογική ανάπτυξη, η Pkd1 ποντικού εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα από το στάδιο του μοριδίου και ανιχνεύεται σε όλα τα παράγωγα κυττάρων νευρικής ακρολοφίας. συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου του ενήλικα, του αορτικού τόξου, του χόνδρου και της μεσεγχυματικής συμπύκνωσης (16, 17). Ομόζυγα μεταλλαγμένα ποντίκια που στοχεύτηκαν για διαγραφή Pkd1 έχουν αναφερθεί ότι πεθαίνουν στη μήτρα και ότι αναπτύσσουν νεφρικές και παγκρεατικές κύστεις (2,19,24-26, 40). Αυτές οι προηγούμενες προσπάθειες δημιουργίας μοντέλων ποντικών δυστυχώς δεν παρείχαν βιώσιμα ζώα μεταγεννητικά. Ωστόσο, η εμφάνιση νεφρικών κύστεων σε αυτά τα ομόζυγα μεταλλαγμένα ποντίκια Pkd1 θα ήταν σύμφωνη με την υπόθεση ενός μηχανισμού μετάλλαξης δύο χτυπημάτων σε ανθρώπους που περιλαμβάνει μετάλλαξη βλαστικής σειράς και σωματική αδρανοποίηση του φυσιολογικού αλληλόμορφου. Ωστόσο, τα ποντίκια που ήταν ετερόζυγα για τη στοχευμένη διαγραφή Pkd1 εμφάνισαν επίσης PKD με περιστασιακές κύστεις ήπατος και παγκρέατος παρά την όψιμη έναρξη της ενηλικίωσης, υποστηρίζοντας έναν μηχανισμό απλοανεπάρκειας ή μείωσης της δόσης γονιδίων. Επιπλέον, η απώλεια ετεροζυγωτίας ή απλοανεπάρκειας μπορεί να μην είναι ο μοναδικός μηχανισμός για την ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο)παθογένεση. Πράγματι, αυτοί οι μηχανισμοί διαφέρουν με την επίμονη ή ενισχυμένη έκφραση της PKD1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)παρατηρείται στην πλειονότητα των ανθρώπινων νεφρικών κύστεων εκτός εάν παράγονται μη λειτουργικές πρωτεΐνες. Αυτό το εύρημα της παρατεταμένης ή αυξημένης έκφρασης PKD1 εγείρει το ερώτημα εάν ένα κέρδος λειτουργίας ή υπερέκφραση μπορεί να είναι λειτουργικό. Για να διερευνήσουμε τον παθογενετικό μηχανισμό κέρδους λειτουργίας Pkd1, απομονώσαμε και χαρακτηρίσαμε ένα μυϊκό βακτηριακό τεχνητό χρωμόσωμα Pkd1 (Pkd1-BAC) το οποίο στη συνέχεια τροποποιήθηκε με ομόλογο ανασυνδυασμό σε Escherichia coli για την έκφραση στόχου του Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)συγκεκριμένα στα νεφρά. Αναφέρουμε την παραγωγή τριών διαγονιδιακών γραμμών που εξέφρασαν το διαγονίδιο Pkd1 σε διαφορετικά επίπεδα. Όλα τα ποντίκια εμφάνισαν αναπαραγώγιμα έναν αριθμό ομοιοτήτων με την ανθρώπινη ADPKD και ανέπτυξαν σταθερά πρώιμη έναρξη με ταχεία εξέλιξη των μορφολογικών και λειτουργικών αλλοιώσεων των νεφρών και πέθαναν από νεφρική ανεπάρκεια στη μέση ηλικία. Επιπλέον, η τρέχουσα μελέτη περιγράφει έναν in vivo μηχανισμό με τον οποίο το Pkd1 μπορεί να μεσολαβήσει σε αυτόν τον φαινότυπο PKD. Αυτά τα ποντίκια αντιπροσωπεύουν το πρώτο μοντέλο PKD που παράγεται από τη μοναδική νεφρική υπερέκφραση της ορθολογικής PKD1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)γονίδιο.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Απομόνωση κλώνων BAC που περιέχουν το Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)τόπος. Pkd1-κλώνοι BAC από το βακτηριακό στέλεχος ξενιστή Ε. coli DH10B (RecA; RecBC) απομονώθηκαν από μια βιβλιοθήκη pBelo11BAC ποντικού 129Sv (Research Genetics). Η διαλογή των σούπερ δεξαμενών BAC πραγματοποιήθηκε με PCR με τους ακόλουθους εκκινητές: 5 περιοχές, 5-CTG ATGAGTTCTGGCCATGGATG-3 (προς τα εμπρός Pkd1 εξόνιο 1) και 5-CTGCCA GCCAATGCCATAGTCAC{10}} (αντίστροφα Pkd1 εξόνιο 1); και 3 περιοχές, 5-TCG GCCCTAGCGTCTGCAGCC-3 (μπροστινό εξόνιο Pkd1 39) και 5-TCCAGTCC CACCTACAGCCAAC-3 (αντίστροφο εξόνιο Pkd1 40). Ένας θετικός κλώνος για αμφότερες την ενίσχυση ταυτοποιήθηκε και αναλύθηκε σε τυπική ηλεκτροφόρηση γέλης και παλμικού πεδίου γέλης (PFGE) που ακολουθήθηκε από στύπωμα Southern. Για ανάλυση στυπώματος Southern, έχουν σχεδιαστεί επτά ανιχνευτές Pkd1 ποντικού: γονιδιωματικό εξόνιο 1 (516 bp, νουκλεοτίδια [nt] 1 έως 516, αριθμός πρόσβασης NCBI U70209), γονιδιωματικό εξόνιο 2-3 (220 bp), γονιδιωματικό εξόνιο {{ 31}} (8.479 bp), cDNA εξόνιο 15-20 (1.724 bp; nt 6455 έως 8179), cDNA εξόνιο 25-34 (1.315 bp; nt 9415 έως 10730), cDNA εξόνιο 36-45 1,655 bp, nt 10963 έως 12618), και γονιδιωματικό εξόνιο 45-46 (1,640 bp) (16). Πολλές περιοχές συμπεριλαμβανομένων των άκρων του ενθέτου BAC αυτού του Pkd1-BAC ποντικού έχουν επίσης προσδιοριστεί και επιβεβαιωθεί ότι είναι ορθολογικές με το ανθρώπινο γονίδιο PKD1 και τις συνεχόμενες περιοχές.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Παραγωγή SBPkdl(πολυκυστική νεφρική νόσος 1) rAc-BAC με ομόλογο ανασυνδυασμό. Για να προσδιοριστεί εάν το κέρδος συνάρτησης Pkd1 από μόνο του είναι αρκετό για την παραγωγή του ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο)φαινότυπο, πρώτα απομονώσαμε έναν γονιδιωματικό κλώνο που περιέχει ολόκληρο το γονίδιο Pkdl σε μια βιβλιοθήκη φορέα BAC 129/Sv. Αυτή η βιβλιοθήκη υποβλήθηκε σε διαλογή με PCR με δύο σετ εκκινητών για το γονίδιο Pkd1 που κάλυπτε το εξόνιο 1 στο 5' άκρο και τα εξόνια 39 έως 40 προς το 3' άκρο (Σχήμα 1). Ένας θετικός κλώνος BAC για το γονίδιο Pkd1 ταυτοποιήθηκε που περιελάμβανε ολόκληρο το παρακείμενο σώμα γονιδίου Tsc2. Το ένθετο Pkd1 χαρακτηρίστηκε λεπτομερώς για να διασφαλιστεί ότι η γονιδιωματική δομή ταιριάζει με εκείνη του ενδογενούς Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)γονίδιο του στελέχους ποντικού 129/Sv από το οποίο προήλθε το ένθετο και από το συγγενικό στέλεχος C57BL/6J. Οι γονιδιωματικοί χάρτες του τόπου Pkd1 στο BAC και σε αυτά τα συγγενή στελέχη με ανάλυση κηλίδας Southern, με τέσσερις πέψεις με ένζυμα περιορισμού και επτά ανιχνευτές που καλύπτουν ολόκληρο το γονίδιο Pkdl, εμφανίστηκαν πανομοιότυποι χωρίς ενδείξεις αναδιατάξεων (Εικ. 1). Αυτό το BAC περιείχε ένα ένθετο ~121-kb που περιλαμβάνει-37 kb upstream και-39 kb μιας κατάντη ακολουθίας του Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)γονίδιο όπως προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση και αλληλούχιση.

Αυτός ο κλώνος Pkd1-BAC τροποποιήθηκε από δύο διαδοχικά συμβάντα ομόλογου ανασυνδυασμού στο E.coli. Το Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)γονίδιο επισημάνθηκε στο εξόνιο 10 με υποκατάσταση ενός νουκλεοτιδίου (G έως Α) για τη δημιουργία μιας νέας θέσης EcoRI στη θέση 2355 στον χάρτη cDNA. Αυτή η μετάλλαξη σιωπηλού σημείου δημιουργήθηκε για να διακρίνει το Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)γονίδιο και μεταγραφή του BAC από αυτό ενδογενούς προέλευσης. Επιπλέον, έχουμε αντικαταστήσει τα 5'ρυθμιστικά στοιχεία του γονιδίου Pkd1-BAC, εκμεταλλευόμενοι τα προηγουμένως αναγνωρισμένα "SB" ειδικά για το νεφρικό επιθήλιο στοιχεία από το SBM (συνδεδεμένο με το c-Myc) ή το SBF που συνδέεται με το c- fos)κατασκευή-trans-γονίδιο για περιορισμό της έκφρασης στους νεφρούς (36,38) (Εικ. 2α).

Αυτό το νέο SBPkd1TAc-BAC υποβλήθηκε σε πέψη με Notl, μια μοναδική θέση που βρίσκεται αμέσως ανάντη των στοιχείων SB, και ClaI μέσα στο γονιδιακό σώμα Tsc2, περικόπτοντας τα ρυθμιστικά στοιχεία Tsc2 και το 5' του γονιδιακού σώματος για να διασφαλιστεί η έλλειψη εξωγενούς έκφρασης Tsc2 σε όλους τους ιστούς και για την αφαίρεση των προκαρυωτικών αλληλουχιών BAC vector (Εικ. 1 και 2). Αυτό το γραμμικοποιημένο θραύσμα 70-kb Notl-Clal απομονώθηκε, καθαρίστηκε και ποσοτικοποιήθηκε για μικροέγχυση ωαρίου (36).

Παραγωγή και ανάλυση διαγονιδιακών ποντικών SBPkd1rAc. Τέσσερις διαγονιδιακοί ιδρυτές που φέρουν πολλά αντίγραφα του διαγονιδίου SBPkd1rAc ανέπτυξαν με συνέπεια PKD(πολυκυστική νεφρική νόσο). Από τα τέσσερα ποντίκια ιδρυτή SBPkdlrAc που προσδιορίστηκαν με ανάλυση Southern, δημιουργήθηκαν τρεις διαγονιδιακές σειρές SBPkd1rAG με δύο έως εννέα αντίγραφα του διαγονιδίου (Εικ. 2b). Ο χαρακτηρισμός της ακεραιότητας διαγονιδίου σε αυτές τις γραμμές παρακολουθήθηκε με 5', εσωτερικούς και 3' ανιχνευτές όπως φαίνεται από αντιπροσωπευτικά παραδείγματα στο Σχ. 2b. Οι διαγονιδιακές γραμμές αποκάλυψαν με τον ανιχνευτή 5'"SB" μια ζώνη στα 10,9 kb σύμφωνα με το διαγονίδιο SBPkd1rAc που ενσωματώθηκε σε έναν προσανατολισμό από το κεφάλι προς την ουρά και αποκαλύφθηκε με τον ανιχνευτή 3' μια ζώνη 7.{14}}kb. (Εικ. 2β). Επιπλέον, ο εσωτερικός ανιχνευτής ανίχνευσε την ενδογενή ζώνη Pkd1 των 9.4-kb καθώς και τις ζώνες 6.9-kb και 2.5-kb του διαγονιδίου λόγω της θέσης εισαγωγής EcoRI στο εξόνιο 10 (Εικ. 2β). Αυτά τα ποντίκια περιείχαν πλήρη αντίγραφα του διαγονιδίου με βάση την ανάλυση γονιδιωματικής αλληλοεπικαλυπτόμενης δομής.

Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)κέρδος λειτουργίας σε ενήλικα διαγονιδιακά ποντίκια SBPkdlrAc. Η έκφραση του διαγονιδίου SBPkdlrAG και του γονιδίου Pkd1 διερευνήθηκε σε διάφορα όργανα. Η ποσοτικοποίηση των επιπέδων μεταγραφής από το διαγονίδιο και/ή το ενδογενές γονίδιο διεξήχθη με ανάλυση στυπώματος Northern (Σχ. 3α). Όπως αναμενόταν, οι μεταγραφές διαγονιδίου και ενδογενούς γονιδίου ήταν παρόμοιου μήκους (14,2 kb). Με βάση την έκφραση GAPDH ελέγχου, οι νεφροί από όλες τις σειρές ποντικών SBPkd1TAG είχαν σταθερά αυξημένη έκφραση μεταγραφής σε σύγκριση με τα φυσιολογικά επίπεδα Pkdl σε νεφρούς ενηλίκων (n=3) παρόμοιας ηλικίας. Το νεφρικό διαγονίδιο και η ενδογενής έκφραση για τις διαφορετικές διαγονιδιακές σειρές εμφάνισαν ένα εύρος από 2- έως 15-φορές πάνω από τα επίπεδα ελέγχου νεφρικής ενδογενούς Pkd1 (Εικ. 3a). Ειδικότερα, η διαγονιδιακή γραμμή 39 (n {{11} }) έδειξε υψηλότερο Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)επίπεδα από τις γραμμές 3(n=3) και 41 (n =4). Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης Pkd1 που μετρήθηκαν με ανάλυση στυπώματος Northern συσχετίστηκαν με αυτά που ελήφθησαν με PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας εκκινητές στα εξόνια 1 και 2 (Σχ. 3b).

Η ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης διαγονιδίου συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου και ημιποσοτική RT-PCR στις τρεις διαγονιδιακές σειρές σε ενήλικη ηλικία χρησιμοποιώντας εκκινητές στην 5'μη μεταφρασμένη περιοχή (Β, -προαγωγέας σφαιρίνης) και στο εξόνιο 2 της Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)(Εικ.3β). Η έκφραση SBPkdlrAc σε διαγονιδιακά ποντίκια συγκρίθηκε με το προϊόν γονιδίου ριβοσωμικής πρωτεΐνης S16 ως εσωτερικό πρότυπο. Οι συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν για την ημιποσοτική ενίσχυση RT-PCR ήταν εντός του γραμμικού εύρους. Η διαγονιδιακή έκφραση με PCR πραγματικού χρόνου και ημιποσοτική RT-PCR έδειξε σταθερά και συγκεκριμένα την υψηλότερη έκφραση στο νεφρό από όλες τις διαγονιδιακές σειρές σε σχέση με άλλα όργανα (Εικ. 3b και c). Τα επίπεδα νεφρικής έκφρασης για ένα μεμονωμένο δείγμα ήταν αναπαραγώγιμα με οποιαδήποτε από τις τεχνικές ανίχνευσης που χρησιμοποιήθηκαν. Τα υψηλότερα επίπεδα Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)Η διαγονιδιακή νεφρική έκφραση μετρήθηκε για τις γραμμές 39 και 41. Για να παρακολουθηθεί εάν η αυξημένη Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)έκφραση που προέκυψε από το διαγονίδιο ή το ενδογενές γονίδιο, η ίδια ομάδα ποντικών από τις τρεις διαγονιδιακές σειρές συγκρίθηκε για έκφραση νεφρικού διαγονιδίου Pkd1 και για ολική (διαγονιδιακή και ενδογενή) έκφραση νεφρού Pkd1 με PCR πραγματικού χρόνου. Είναι ενδιαφέρον ότι οι γραμμές 39 και 41 σε σχέση με τη γραμμή 3 έδειξαν ότι η αυξημένη νεφρική έκφραση διαγονιδίου Pkdl ήταν παρόμοια ή μεγαλύτερη από αυτήν της ολικής νεφρικής έκφρασης Pkd1, δείχνοντας το διαγονίδιο ως ειδικά υπεύθυνο για αυτήν την επαγόμενη έκφραση. Σε διάφορα όργανα (συμπεριλαμβανομένης της καρδιάς, του πνεύμονα, του εγκεφάλου, του ήπατος, του παγκρέατος και του σπλήνα), το διαγονίδιο SBPkd1rAg έδειξε πολύ ασθενή έκφραση που ανιχνεύτηκε περιστασιακά σε σπλήνα και πνεύμονα, με μικρή έως μη ανιχνεύσιμη έκφραση σε άλλα όργανα (Εικ. 3β). Η ποσοτικοποίηση με PCR πραγματικού χρόνου έδειξε ένα 10- έως ένα,000-πλάσιο χαμηλότερο επίπεδο της διαγονιδιακής έκφρασης σε εξωνεφρικούς ιστούς σε σχέση με την έκφραση των νεφρών (Εικ. 3γ). Τα ρυθμιστικά στοιχεία "SB" του διαγονιδίου SBPkdlrA προσέδωσαν προτιμησιακή νεφρική έκφραση. Αυτή η συγκεκριμένη κατανομή οργάνων προσδιορίστηκε επίσης όταν χρησιμοποιήθηκε σε διαγονίδια που συνδέονται με c-myc (SBM) και c-fos (SBF) (36, 38).

C-myc, ένας μεταγενέστερος τελεστής του Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)μονοπάτια σηματοδότησης σε ποντίκια SBPkdlrAc. Για να αποκτήσουμε μια εικόνα για τον ενδοκυτταρικό παθογενετικό μηχανισμό των διαγονιδιακών ποντικών SBPkdlrAg, προσπαθήσαμε στη συνέχεια να παρακολουθήσουμε το επίπεδο νεφρικής έκφρασης c-myc με βάση την προηγούμενη παρατήρησή μας για την απορρύθμιση του c-myc στην ανθρώπινη ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο)νεφροί(22). Πραγματοποιήθηκε ανάλυση των νεφρών και από τις τρεις διαγονιδιακές γραμμές 3(n =4), 39(n =7) και 41 (n=4) καθώς και από τους ελέγχους (n=4). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3d, υπάρχει μια ουσιαστική έκφραση του ενδογενούς c-myc που επάγεται σε ποντικούς SBPkd1TAG σε σχέση με ποντίκια ελέγχου παρόμοιας ηλικίας. Είναι ενδιαφέρον ότι το επίπεδο έκφρασης c-myc σε ορισμένους νεφρούς SBPkd1-c. Ειδικότερα, η γραμμή 39, έφτασε σε επίπεδα συγκρίσιμα με αυτά που παρατηρήθηκαν στο διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού PKD SBM που παρήχθη με νεφρική έκφραση c-myc.

Νεφρικές ανωμαλίες σε ποντικούς SBPkd1raG παρόμοιες με PKD(πολυκυστική νεφρική νόσο). To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size(Fig.4a and b). SBPkdl-AG kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n =25;n>6 για κάθε γραμμή) ανέπτυξαν πολλαπλές σωληναριακές (Τ) και σπειραματικές κύστεις (G) (Εικ.4d,f, και g). Κύστες παρατηρήθηκαν σε σωληνάρια από τις περιοχές του φλοιού και του μυελού καθώς και σωληνάρια συλλογής από τη θηλή (Εικ. 4δ και ε). Τα διαγονιδιακά ποντίκια εμφάνισαν σωληναριακή επιθηλιακή υπερπλασία (κεφαλή βέλους) που περιελάμβανε κυστικά και μη κυστικά σωληνάρια και συχνή υπερτροφία (Εικ. 4g και h), αλλά η σοβαρότητα διέφερε μεταξύ των μεμονωμένων ποντικών. Η διάμεση ίνωση (F), οι περιαγγειακές λεμφικές διηθήσεις και οι πρωτεϊνικοί γύψοι (Ρ) παρατηρήθηκαν συχνά (Εικ. 4d και e).

Για να ορίσουμε με μεγαλύτερη ακρίβεια τη θέση εντοπισμού του αυξημένου Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)έκφρασης στους νεφρούς, πραγματοποιήσαμε in situ υβριδισμό χρησιμοποιώντας τον ανιχνευτή εξονίου 36-45 που χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως(16). Το σήμα υβριδισμού εντοπίστηκε ειδικά στα επιθηλιακά κύτταρα που καλύπτουν την κύστη και τα υπερπλαστικά σωληνάρια καθώς και τις σπειραματικές κύστεις. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε κάποιο σήμα πάνω από το επιθήλιο των μη κυστικών ή ελαφρώς διεσταλμένων σωληναρίων, που πιθανώς εντοπίζουν σωληνάρια που προορίζονται να υποστούν μελλοντικές κυστικές αλλαγές (Εικ. 4i και j).

Πραγματοποιήθηκε επίσης νεφρική ιστολογική ανάλυση σε διαγονιδιακά ποντίκια κατά τη γέννηση(n =8), μεταγεννητική ημέρα 10(P10)(n =3),P20(n =5),P35(n { {7}}) και P45(n=3) σε σύγκριση με αρνητικά συγγενείς της ίδιας ηλικιακής ομάδας (n 2 έως 4). Είναι ενδιαφέρον ότι όλα τα νεογέννητα διαγονιδιακά ποντίκια εμφάνισαν σωληναριακή και σπειραματική διαστολή σε σχέση με τα αρνητικά νεογνά ελέγχου (Εικ. 4k και l), υποδεικνύοντας ότι οι νεφρικές ανωμαλίες ξεκίνησαν στη μήτρα, όπως παρατηρήθηκε σε ποντικούς SBM και σε ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο)ασθενείς. Η σωληναριακή και σπειραματική διάταση αυξήθηκε σε μέγεθος και αριθμό με την προοδευτική ηλικία. Μέχρι το P35, τα διαγονιδιακά ποντίκια εμφάνισαν πιο σοβαρή υπερπλασία και ενδείξεις σπειραματοσκλήρωσης. Αλλαγές νεφρικών φυσιολογικών λειτουργιών σε ποντικούς SBPkd1TAG. Οι νεφρικές φυσιολογικές λειτουργίες όλων των διαγονιδιακών ποντικών εμφάνισαν χαρακτηριστικά παρόμοια με την PKD(πολυκυστική νεφρική νόσο), ενώ τα μη διαγονιδιακά νεογνά δεν ανέπτυξαν ποτέ την ασθένεια. Μέσα σε λίγους μήνες μετά τη γέννηση, τα προσβεβλημένα ζώα ανέπτυξαν χρόνια νεφρική ανεπάρκεια. Αυτά τα ζώα παρακολουθήθηκαν για νεφρικές λειτουργικές παραμέτρους με μέτρηση των επιπέδων ορού και ούρων, αζώτου ουρίας αίματος (BUN) και κρεατινίνης, ωσμωτικότητα ούρων, πρωτεΐνης ούρων και απέκκρισης ιόντων (Πίνακας 1). Όλα τα ποντίκια από τις τρεις σειρές σε σύγκριση με τους ελέγχους εμφάνισαν ελαττώματα συγκέντρωσης, ένα κοινό εύρημα στην ADPKD, και κατά συνέπεια εμφάνισαν μειωμένες συγκεντρώσεις BUN, κρεατινίνης, πρωτεΐνης και σιδήρου στα ούρα. Οι ιδρυτές και οι απόγονοι των διαγονιδιακών SBPkd1TAG (η 6) από κάθε γραμμή παρακολουθήθηκαν ποιοτικά για πρωτεϊνουρία σε δείγματα ούρων με SDS-PAGE (Εικ. 5). Τα ποντίκια ηλικίας άνω των 2 μηνών εμφάνισαν μη εκλεκτική πρωτεϊνουρία που προχωρούσε με την ηλικία. Επιπλέον, τα επίπεδα του BUN ορού και της κρεατινίνης ορού ήταν αυξημένα, αποκαλύπτοντας νεφρική ανεπάρκεια (Πίνακας 2). Επειδή η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια συνήθως οδηγεί σε αλλαγές στις αιματολογικές παραμέτρους, αυτές εξετάστηκαν σε διαγονιδιακά ποντίκια SBPkd1TAG ηλικίας 3 έως 14 μηνών (Πίνακας 2). Αυτά τα διαγονιδιακά ποντίκια ήταν αναιμικά, όπως αποδεικνύεται από τον σημαντικά μειωμένο αριθμό ερυθρών αιμοσφαιρίων, με την αιμοσφαιρίνη και τον αιματοκρίτη να φτάνουν τα μισά από τα φυσιολογικά επίπεδα. Άλλες παράμετροι των ερυθρών αιμοσφαιρίων, όπως το ποσοστό των δικτυοερυθροκυττάρων, δεν επηρεάστηκαν, όπως αναμενόταν όταν προκλήθηκαν από νεφρική βλάβη. Αυτά τα ζώα πέθαιναν σταθερά από νεφρική ανεπάρκεια σε ηλικία 5.9  2.8 μηνών (n 42) για τη διαγονιδιακή γραμμή 39 και σε μεταγενέστερες ηλικίες, 14.6 3.1 μηνών (n 20) και 11 ετών. .7 6.5 μήνες (n 7), για τις γραμμές 3 και 41, αντίστοιχα.

ΣΥΚΟ. 1. Σχηματική αναπαράσταση και λεπτομερής ανάλυση χάρτη περιορισμού ενός Pkd1-BAC ποντικού.

Μοτίβα πέψης γονιδιωματικού DNA του Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)-Το BAC συγκρίθηκε με αυτό του Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)τόπος στα 129Sv και C57Bl/6J συγγενή στελέχη ποντικών. Παρήχθησαν επτά ανιχνευτές που περιελάμβαναν το μεγαλύτερο μέρος του γονιδίου Pkd1 ποντικού:

(α) εξόνιο 1, (β) εξόνιο 2-3, (γ) εξόνιο 7-15, (δ) εξόνιο 15-20, (ε) εξόνιο 25-34, (στ) εξόνιο 36-45 και (g) εξόνιο 45-46, με επισήμανση από a έως g στο γονιδιωματικό Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)αναπαράσταση και πάνω από μεμονωμένες κηλίδες.

Ανάλυση κηλίδας Southern μετά από πέψεις περιορισμού (BamHI, EcoRI, HindIII και KpnI) του γονιδιωματικού DNA από το Pkd1-BAC και το Pkd1 ποντικού(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)Οι τόποι έδειξαν πανομοιότυπα μοτίβα και με τους επτά ανιχνευτές. Μ, HindIII δείκτης; 129, 129/Sv; C57, C57Bl/6J.

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Εδώ, αναφέρουμε την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό ενός Pkd1-BAC ποντικού. Αυτό το Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)γονίδιο επισημάνθηκε και ρυθμιστικά στοιχεία αντικαταστάθηκαν για να στοχεύσουν την έκφραση ειδικά στους νεφρούς από δύο διαδοχικά συμβάντα ομόλογου ανασυνδυασμού. Διαγονιδιακά ποντίκια που παρήχθησαν με αυτό το νέο γονίδιο SBPkd1TAG εμφάνισαν 2- έως 15-πλάσια αύξηση στην έκφραση Pkd1 και ανέπτυξαν με δυνατότητα αναπαραγωγής πρώιμες μορφολογικές αλλοιώσεις των νεφρών τυπικές της PKD. Η νεφρική ανεπάρκεια είναι εμφανής στη μέση ηλικία και τα ποντίκια πεθαίνουν πρόωρα από νεφρική ανεπάρκεια. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν επίσης ότι ο μηχανισμός υπερέκφρασης Pkd1 που είναι υπεύθυνος για αυτόν τον φαινότυπο προκαλείται από τη σηματοδότηση ενεργοποίησης του c-myc in vivo. Αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι το κέρδος λειτουργίας Pkd1 ποντικού στους νεφρούς είναι αρκετό για την παραγωγή ενός νεφρικού φαινότυπου PKD. Δεδομένου ότι το γονίδιο Pkd1 ποντικού δεν είναι διπλό όπως συμβαίνει στους ανθρώπους (27), έχουμε άμεσα ταυτοποιήσει και απομονώσει έναν κλώνο BAC που περιείχε ολόκληρο το γονίδιο Pkd1. Ο πλήρης χαρακτηρισμός του ποντικού 129/Sv Pkd1-BAC, έμμεση σύγκριση με δύο άλλα συγγενή στελέχη ποντικών, επιβεβαίωσε την ακεραιότητα του τόπου Pkd1. Το ένθετο Pkd1-BAC περιείχε 37 έως 39 kb ανοδικές και κατάντη αλληλουχίες από το γονίδιο Pkd1. Η ανάλυσή μας έδειξε ότι το γονίδιο Pkd1 σε αυτό το BAC ήταν ένας καλόπιστος τόπος άγριου τύπου ποντικού που θα μπορούσε να χρησιμεύσει για περαιτέρω μελέτες. Αν και υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι ο σχηματισμός κύστης στην ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο)μπορεί να προκύψει από απώλεια ετεροζυγωτίας μετά από σωματική αδρανοποίηση της φυσιολογικής PKD1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)αλληλόμορφο (3, 21, 32), υπάρχουν επίσης ενδεικτικά στοιχεία για παρατεταμένη ή ακόμη και αυξημένη έκφραση πολυκυστίνης-1 στο κυστικό σωληναριακό επιθήλιο (22, 29). Η τελευταία παρατήρηση εγείρει το ερώτημα εάν η υπερέκφραση της Pkd1 αυτή καθεαυτή είναι μια επαρκής κοντινή αιτία κυστεογένεσης. Σε διαγονιδιακά ποντίκια που φέρουν την ανθρώπινη PKD1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1), TSC2, RAB 26, NTHL1 και SLC9A3R2 γονίδια, μόνο μια μειοψηφία ποντικών ανέπτυξε κύστεις και κανένα δεν είχε ανιχνεύσιμη έκφραση διαγονιδίου στην ενήλικη ζωή παρά τα 30 αντίγραφα του διαγονιδίου (31). Σε αυτά τα διαγονιδιακά ποντίκια, ήταν δύσκολο να καθοριστεί ένας σαφής ρόλος για την υπερέκφραση Pkd1 στην κυστογένεση. Το μοντέλο μας διαφέρει, καθώς δύο έως εννέα αντίγραφα άγριου τύπου Pkd1 μόνο, χωρίς συνεχόμενα γονίδια, ενσωματώθηκαν σε διαγονιδιακά ποντίκια. Δεδομένου ότι το γονίδιο Pkd1 έχει βασικές λειτουργίες σε διάφορα όργανα ή ιστούς, όπως περιγράφεται για πολλά ποντίκια με κατάλυση του γονιδίου Pkd1, η συστηματική υπερέκφραση του Pkd1 θα μπορούσε να οδηγήσει σε πρόσθετα συγχυτικά αποτελέσματα. Συνεπώς, έχουμε ασχοληθεί με τον ρόλο του κέρδους λειτουργίας Pkd1 χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση που στοχεύει το Pkd1 ειδικά στους νεφρούς. Με ομόλογο ανασυνδυασμό, έχουμε υποκαταστήσει πρώτα την ανάντη ρυθμιστική περιοχή Pkd1 με τα νεφρικά περιορισμένα ρυθμιστικά στοιχεία "SB", αποτρέποντας έτσι τη μειωμένη γονιδιακή έκφραση που παρατηρείται κανονικά για το Pkd1 στην ενήλικη ζωή καθώς και τη δυνητική δευτερεύουσα ρύθμιση βρόχου ανάδρασης (36, 38). Δεύτερον, επισημάναμε το διαγονίδιο Pkd1 ποντικού (Pkd1TAG) με μια σιωπηλή σημειακή μετάλλαξη στο εξόνιο 10, αλλά δεν εισαγάγαμε μια ετικέτα επιτόπου για να διασφαλίσουμε ότι θα παραχθεί μια πλήρως λειτουργική πρωτεΐνη "άγριου τύπου" με διατηρημένη δομή και ακεραιότητα. Από αυτό το τροποποιημένο BAC, ένα θραύσμα SBPkd1TAG καθαρίστηκε μακριά από το γονίδιο Tsc2 και τον φορέα BAC για να αποτραπεί η παρεμβολή από το γονίδιο Tsc2, το οποίο μπορεί επίσης να προκαλέσει έναν κυστικό φαινότυπο (8, 20, 28), καθώς και για να αποφευχθεί η ανασταλτική επίδραση του προκαρυωτικές αλληλουχίες (5).

Τέσσερα διαφορετικά διαγονιδιακά ποντίκια ιδρυτή SBPkd1TAG και τρεις ανεξάρτητες σειρές παρήχθησαν με ειδική νεφρική Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)- ενισχυμένη έκφραση. Ιδιαίτερα εντυπωσιακή είναι η πλήρης διείσδυση του φαινοτύπου σε αυτά τα διαγονιδιακά ποντίκια. Οι σειρές ιδρυτή SBPkd1TAG και ποντικιών μοιράζονταν πολλά κοινά φυσιοπαθολογικά χαρακτηριστικά με την ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο). Αυτές περιλαμβάνουν την ανάπτυξη κύστεων στο φλοιό, το μυελό και τα σπειράματα μαζί με επιθηλιακή υπερπλασία, διάμεση ίνωση και εστιακή διάμεση φλεγμονή.

Διότι το ΠΚΔ(πολυκυστική νεφρική νόσο)Ο φαινότυπος παρατηρήθηκε σταθερά σε όλα τα διαφορετικά διαγονιδιακά ποντίκια-ιδρυτές και η ενσωμάτωση διαγονιδίου στο γονιδίωμα του ποντικού είναι ένα τυχαίο φαινόμενο, ο φαινότυπος δεν μπορεί να προκύψει από το φαινόμενο της χρωμοσωμικής θέσης αλλά μόνο από την αυξημένη έκφραση Pkd1. Πράγματι, η έκφραση του διαγονιδίου Pkd1 σε όλες τις σειρές αποδείχθηκε ότι είναι νεφρική περιορισμένη, όπως είχε παρατηρηθεί προηγουμένως για άλλα διαγονίδια που ρυθμίζονται από τα στοιχεία "SB" (36, 38). Επιπλέον, αυτή η αυξημένη έκφραση Pkd1 προκλήθηκε από το διαγονίδιο και όχι από μια έμμεση ενδογενή ενεργοποίηση Pkd1. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας παρέχουν σαφείς ενδείξεις ότι το κέρδος της λειτουργίας μιας λειτουργικής Pkd1 άγριου τύπου μπορεί να προκαλέσει πολλαπλές νεφρικές κύστεις. Είναι σημαντικό ότι αυτά τα ποντίκια SBPkd1TAG αποτελούν το πρώτο μοντέλο ποντικού που δημιουργήθηκε από τη μοναδική υπερέκφραση του ορθολόγου ποντικού του ανθρώπινου γονιδίου PKD1.

Τα ποντίκια SBPkd1TAG αποδεικνύουν ότι το Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)Η υπερέκφραση είναι ένας πρωταρχικός παθογενετικός μηχανισμός της νεφρικής κυστογένεσης. Είναι σημαντικό ότι τα υψηλότερα επίπεδα διαγονιδιακής έκφρασης στους νεφρούς φάνηκε να συσχετίζονται με την εξέλιξη και τη σοβαρότητα του φαινοτύπου. Βρήκαμε επίσης ότι η υπερέκφραση Pkd1 στην ανάπτυξη του φαινοτύπου SBPkd1TAG είναι πιθανό να σηματοδοτήσει την ενεργοποίηση του c-myc in vivo. Πιθανότατα, αυτή η ενεργοποίηση θα μπορούσε ακόμη και να είναι άμεση μέσω της C-τερματικής ουράς πολυκυστίνης-1 που υφίσταται πρωτεολυτική διάσπαση και πυρηνική μετατόπιση (7). Εφόσον η ενισχυμένη νεφρική έκφραση του c-myc σε ενήλικα ποντίκια αποδείχθηκε ότι επάγει PKD, θα ήταν εξαιρετικά συνεπές να υποστηριχθεί το c-myc ως κύριος τελεστής κατάντη των οδών σηματοδότησης Pkd1. Αυτό το αποτέλεσμα συσχετίστηκε επίσης με τα προηγούμενα ευρήματά μας για αυξημένη έκφραση c-myc σε νεφρούς όλων των ανθρώπινων ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο)αναλύθηκε (22). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το c-myc είναι ένας κύριος μεσολαβητής του Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)κυστεογένεση. Τα αποτελέσματά μας από το μοντέλο κέρδους λειτουργίας Pkd1, μαζί με την απλοανεπάρκεια Pkd1 ποντικού και την απώλεια λειτουργίας, υποδεικνύουν ότι οποιαδήποτε απορρύθμιση Pkd1 θα μπορούσε να οδηγήσει σε κυστογένεση (2, 19, 23-26, 31, 40).

Σοβαρή Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)ανισορροπία σε ποντίκια που προκαλείται από Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)κατάλυση ή διαγονιδιακή υπερέκφραση προκάλεσε πρώιμη έναρξη και ταχεία εξέλιξη των νεφρικών κύστεων και επηρέασε μεγάλο ποσοστό σωληναρίων. Αντίθετα, μια ηπιότερη ανισορροπία Pkd1 όπως η απλοανεπάρκεια οδήγησε σε βραδύτερη εξέλιξη της PKD με πιο εστιακές κύστεις. Η φαινομενική παράδοξη ανάπτυξη ενός παρόμοιου φαινοτύπου μέσω της αντίθετης απορρύθμισης της πολυκυστίνης-1 θα μπορούσε να εξηγηθεί από το κοινό αποτέλεσμα, δηλαδή μια σχετική ανισορροπία συγκέντρωσης πρωτεΐνης που θα μπορούσε να αλλάξει τον σχηματισμό ή τη λειτουργία ενός ενεργού πολυπρωτεϊνικού συμπλέγματος πολυκυστίνης. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας και αυτά άλλων ερευνητών υποστηρίζουν ότι ο μηχανισμός σχηματισμού κύστης στην ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσαπολυκυστική νεφρική νόσο)είναι πιθανό να προκύψει από τρεις παθογενετικούς μηχανισμούς: κέρδος λειτουργίας, απώλεια λειτουργίας και επιδράσεις γονιδιακής δοσολογίας. Τα νέα ποντίκια SBPkd1TAG αποτελούν ένα ισχυρό μοντέλο νεφρικής κυστογένεσης που μπορεί να προσφέρει σημαντικές γνώσεις για την παθοφυσιολογία της PKD(πολυκυστική νεφρική νόσο), Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)μονοπάτια μεταγωγής σήματος και συνεργάτες που αλληλεπιδρούν. Η μελέτη αυτού του μοντέλου μπορεί επίσης να οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών για την αποκατάσταση της φυσιολογικής ισορροπίας πρωτεΐνης εντός του πολυμερούς συμπλέγματος Pkd1.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1. Blouin, MJ, H.Beauchemin, A.Wright, MEDe Paepe, M.Sorette, A.-M. Bleau.B. Νακαμότο. C.-N, Ou, G. Stamatovannopoulos, and M. Trudel 2000. Γενετική διόρθωση της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας: insights using transgenic mouse models. Nat. Med. 6:177-182.

2. Boulter, C., S.Mulroy, S.Webb, S. Fleming, K. Brindle, and R. Sandford. 2001. Καρδιαγγειακά, σκελετικά και νεφρικά ελαττώματα σε ποντίκια με στοχευμένη διαταραχή της Pkd1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)γονίδιο.Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ 98:12174-12179.

3. Brasier, JL, and EPHenske.1997. Απώλεια τουπολυκυστική νεφρική νόσοΗ (PKD1) περιοχή του χρωμοσώματος 16p13 σε κύτταρα νεφρικής κύστης υποστηρίζει ένα μοντέλο απώλειας λειτουργίας για την παθογένεση της κύστης. J. Clin. Investig.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connors, WRDackowski, LRPetry, TJVan Raay, JM Millholland, M. Venet, G.Miller, RM Hakim, GMLandes, KW Klinger, F. Qian, LF Onuchic, T.Watnick, GG Germino και NA Doggett.1995.Analysis of the genomic sequence for theαυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστική νεφρική νόσοΤο γονίδιο (PKD1) προβλέπει την παρουσία μιας επανάληψης πλούσιας σε λευκίνη. Βουητό. ΜοΙ. Genet.4:575-582.

5.Chada,K, J.Magram, K. Raphael,G.Radice, E.Lacy, and F.Costantini.1985. Ειδική έκφραση ενός ξένου γονιδίου σφαιρίνης σε ερυθροειδή κύτταρα διαγονιδιακών ποντικών. Nature 314:377-380.

6. Chauvet, V, F. Qian, N. Boute, Y. Cai, B.Phakdeekitacharoen, LF Onuchic, T.Attie-Bitach, L.Guicharnaud, O.Devuyst,GG Germino,και M.-C. Gubler.2002. Έκφραση PKD1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)και PKD2(πολυκυστική νεφρική νόσο 2)μεταγραφές και πρωτεΐνες στο ανθρώπινο έμβρυο και κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής ανάπτυξης των νεφρών. Είμαι. J. Pathol 160:973-983.

7.Chauvet, V., X. Tian, ​​H. Husson, DHGrimm, T.Wang, T.Hiesberger, P. Igarashi, AM Bennett, O. Ibraghimov-Beskrovnava, S. Somlo, and MJ Caplan.2004. Τα μηχανικά ερεθίσματα προκαλούν διάσπαση και πυρηνική μετατόπιση του άκρου πολυκυστίνης-1 C. J. Clin. Ερευνήστε. 114:1433-1443.

8. Cheadle, JPMP Reeve, JR Sampson και DJ Kwiatkowski.2000. Μοριακή γενετική πρόοδος στην κονδυλώδη σκλήρυνση. Βουητό. Genet.107:97-114. 9. Consortium, EPKD1993. Αναγνώριση και χαρακτηρισμός του γονιδίου της κονδυλώδους σκλήρυνσης στο χρωμόσωμα 16. Κύτταρο 75:1305-1315.

10. Consortium, EPKD1994. Το γονίδιο της πολυκυστικής νεφρικής νόσου 1 κωδικοποιεί ένα αντίγραφο 14 kb και βρίσκεται σε μια διπλή περιοχή στο χρωμόσωμα 16. Κύτταρο 77:881-894.

11. Κοινοπραξία, ΙΠΚΔ1995. Πολυκυστική νεφρική νόσος: η πλήρης δομή του PKD1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)γονίδιο και την πρωτεΐνη του. Κελί 81:289-298.

12. Couillard, M., R. Guillaume,N. Tanji, V. DAgati, and M. Trudel.2002. Η επαγόμενη από το c-myc απόπτωση στην πολυκυστική νεφρική νόσο είναι ανεξάρτητη από την αλληλεπίδραση FasL Fas. Cancer Res. 62:2210-2214.

13. De Paepe, ME, and M. Trudel.1994. Ο διαγονιδιακός ποντικός SAD: ένα μοντέλο ανθρώπινης δρεπανοκυτταρικής σπειραματοπάθειας. Kidney Int. 46:1337-1345.

14. Geng, L., Y. Segal, B. Peissel, N.Deng, Y. Pei, F. Carone, HGRennke, AM Glücksmann-Kuis, MC Schneider, M. Ericsson, STReeders και J.Zhou. 1996. Αναγνώριση και εντοπισμός πολυκυστίνης, η PKD1(πολυκυστική νεφρική νόσος 1)γονιδιακό προϊόν. J. Clin. Ερευνήστε. 98:2674-2682.

15. Gong, S., XWYang, C. Li, and N.Heintz.2002. Εξαιρετικά αποτελεσματική τροποποίηση βακτηριακών τεχνητών χρωμοσωμάτων (BACs) χρησιμοποιώντας νέους φορείς μεταφοράς που περιέχουν την αρχή αντιγραφής R6Ky. Genome Res. 12;1992-1998.