Το δραστικό συστατικό του Cistanche: Echinacoside για την αντιφλεγμονώδη αναστολή και τη νευροπροστατευτική δράση

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com

Εχινακοσίδη, ένα Ενεργός Ψηφοφόρος του Cistanche Herba, Ασκήσεις a Νευροπροστατευτικό Αποτέλεσμα σε a Ο Κάινιτς Οξύ Αρουραίος Μοντέλο με ΑνασταλτικήΦλεγμονώδης Διαδικασίες και Ενεργοποιητικός ο Akt/GSK3 Μονοπάτι

Cheng Wei Lu,a,b Hsi Lung Hsieh,c,d Tzu Yu Lin,a,b Ting Yang Hsieh,e Shu Kuei Huang,a και η Su Jane Wang^*,f,g

Εχινακοσίδηείναι μια κύρια ένωση του βοτάνου Cistanche και έχει δραστηριότητα αναστολής της απελευθέρωσης γλουταμικού στον εγκέφαλο. Δεδομένης της συμμετοχής της διεγερτοτοξικότητας που προκαλείται από το τεράστιο γλουταμικό στην παθοφυσιολογία της επιληψίας, διερευνήσαμε την αντιεπιληπτική δράση της εχινακοσίδης σε επιληπτικές κρίσεις που προκαλούνται από το καϊνικό οξύ σε αρουραίους. Οι αρουραίοι έχουν χορηγηθεί ενδοπεριτοναϊκάεχινακοσίδηγια 30 λεπτά πριν από την ενδοπεριτοναϊκή ένεση με καϊνικό οξύ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μοτίβα συμπεριφοράς που μοιάζουν με επιληπτικές κρίσεις που προκαλούνται από το καϊνικό οξύ, αυξημένες συγκεντρώσεις γλουταμικού, προκάλεσαν νευρωνική απώλεια και μικρογλοιακή ενεργοποίηση και διέγειραν την έκφραση του γονιδίου της προφλεγμονώδους κυτοκίνης στον ιππόκαμπο. Αυτές οι επαγόμενες από το καϊνικό οξύ εναλλαγές βρέθηκαν να εξασθενούν απόεχινακοσίδηπροεπεξεργασία. Επιπλέον, η μειωμένη φωσφορυλίωση της Akt και της συνθάσης γλυκογόνου κινάσης 3 (GSK3), καθώς και η έκφραση Bcl-2 στον ιππόκαμπο, αντιστράφηκε με την προκαταρκτική αγωγή με εχινακοσίδη. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η εχινακοσίδη ασκεί τις αντιεπιληπτικές και νευροπροστατευτικές της δράσεις σε ένα μοντέλο αρουραίου καϊνικού οξέος μέσω της καταστολής της φλεγμονώδους απόκρισης και της ενεργοποίησης της σηματοδότησης Akt/GSK3. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη προτείνει ότι η εχινακοσίδη είναι δυνητικά χρήσιμη στην πρόληψη της επιληψίας.

Λέξεις-κλειδιά:εχινακοσίδη; καϊνικό οξύ; επιληψία; νευροπροστατευτικό αποτέλεσμα; ιππόκαμπος

Εχινακοσίδη σε κιστάνι

Η επιληψία είναι μια διαδεδομένη εγκεφαλική διαταραχή παγκοσμίως. Επηρεάζει περισσότερους από 65 εκατομμύρια ανθρώπους, σχεδόν το 1 τοις εκατό του παγκόσμιου πληθυσμού.1) Τα συνθετικά αντιεπιληπτικά φάρμακα είναι ευρέως διαθέσιμα στη φαρμακευτική αγορά. Ωστόσο, αυτά τα φάρμακα είναι αποτελεσματικά μόνο στο 60–70 τοις εκατό των ασθενών και έχουν ανεπιθύμητες παρενέργειες.2–4) Επομένως, υπάρχει μια ανεκπλήρωτη ανάγκη αναζήτησης ενός φαρμάκου με πιο αποτελεσματικό και ασφαλέστερο. Τα φαρμακευτικά φυτά αντιπροσωπεύουν μια πιθανή πηγή τέτοιων ενώσεων.^5,6)

Στην παραδοσιακή κινεζική βοτανοθεραπεία, το Cistanche Herba έχει χρησιμοποιηθεί από καιρό για τη θεραπεία της επιληψίας.7,8)Εχινακοσίδηείναι κύριο συστατικό του Cistanche Herba9) και έχει πολλές φαρμακολογικές ιδιότητες, όπως αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη, αντινεοπλασματική, ηπατοπροστατευτική και ανοσοτροποποιητική δράση.10,11) Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότιεχινακοσίδημπορεί να εισέλθει στον εγκέφαλο και να προκαλέσει νευροπροστασία.12-16) Προηγουμένως αποδείξαμε ότι η εχινακοσίδη μειώνει την απελευθέρωση γλουταμικού στα άκρα του εγκεφαλοφλοιώδους νεύρου αρουραίου. 18,19) προτείναμε ότι η εχινακοσίδη έχει αντιεπιληπτική δράση. Για να διευκρινιστεί αυτή η υπόθεση, χρησιμοποιήθηκε ένα μοντέλο αρουραίου καϊνικού οξέος σε αυτή τη μελέτη.

Το καϊνικό οξύ είναι ένα παράγωγο γλουταμικού και η μοναδική του συστηματική ένεση σε τρωκτικά έχει ως αποτέλεσμα επιληπτικές κρίσεις, νευροφλεγμονή και νευρωνικό εκφυλισμό ή θάνατο στον εκλεκτικό πληθυσμό νευρώνων στον εγκέφαλο.20–22) Αυτές οι παθολογικές εναλλαγές είναι παρόμοιες με την επιληψία του ανθρώπινου κροταφικού λοβού.23 ,24) Η χορήγηση καϊνικού οξέος σε τρωκτικά θεωρείται γενικά ότι προκαλεί ένα επαρκές μοντέλο επιληψίας. Μέχρι σήμερα, καμία μελέτη δεν έχει διερευνήσει τις αντιεπιληπτικές και νευροπροστατευτικές ιδιότητες τουεχινακοσίδησε ένα ζωικό μοντέλο με ένεση καϊνικού οξέος. Ως εκ τούτου, η μελέτη μας στοχεύει να αξιολογήσει την επίδραση και τον πιθανό μηχανισμό τηςεχινακοσίδηπροχορήγηση σε αρουραίους που έλαβαν θεραπεία με καϊνικό οξύ.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Δραστηριότητα ζώων και κατασχέσεων

Αρσενικοί αρουραίοι Sprague–Dawley (BioLASCO, Taipei, Taiwan) βάρους 150–200 g χρησιμοποιήθηκαν σε όλη τη μελέτη. Οι αρουραίοι κατανεμήθηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες ως εξής: i) Ομάδα 1: ομάδα που υπέστη αγωγή με διμεθυλοσουλφοξείδιο (μάρτυρας). ii) Ομάδα 2: ομάδα κατεργασμένη με καϊνικό οξύ. iii) Ομάδα 3:εχινακοσίδη10 mg/kg συν ομάδα καϊνικού οξέος. iv) Ομάδα 4:εχινακοσίδη50 mg/kg συν ομάδα καϊνικού οξέος. Η εχινακοσίδη (ChemFaces, Wuhan, PRC) εγχύθηκε (ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση) 30 λεπτά πριν από την ενδοπεριτοναϊκή ένεση καϊνικού οξέος (15 mg/kg). Η δραστηριότητα επιληπτικών κρίσεων βαθμολογήθηκε κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 4 ωρών μετά την ένεση καϊνικού οξέος σύμφωνα με την κλίμακα Racine.25) Η δόση και το πρόγραμμα χορήγησης επιλέχθηκαν με βάση προηγούμενες μελέτες.22,26,27) Τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από το Ίδρυμα Animal Care and Use Committee στο Fu Jen Catholic University και πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εκδόθηκαν, τα οποία ακολούθησαν τον Οδηγό Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας για τη Φροντίδα και τη Χρήση του Εργαστηρίου (NAC 2011).

Προσδιορισμός Επιπέδων Γλουταμινικού

Τέσσερις ώρες μετά τη θεραπεία με καϊνικό οξύ, οι αρουραίοι θυσιάστηκαν με αποκεφαλισμό. Ολόκληρος ο εγκέφαλος τεμαχίστηκε και ο ιππόκαμπος κάθε αρουραίου συλλέχθηκε για ανάλυση. Η συγκέντρωση γλουταμικού στον ιστό του ιππόκαμπου του εγκεφάλου προσδιορίστηκε σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφονται από προηγούμενες μελέτες.28,29)

Ουδέτερη χρώση κόκκινου και φθοριού-νεφρίτη Β

Τρεις ημέρες μετά την ένεση καινικού οξέος, οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένυδρη χλωράλη (650 mg/kg) και εγχύθηκαν διακαρδιακά με ένα σταθεροποιητικό διάλυμα που περιείχε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 0,1 Μ (PBS, ρΗ 7,4). Οι εγκέφαλοι αφαιρέθηκαν αμέσως μετά την έγχυση και αποθηκεύτηκαν σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Μετά τη στερέωση, οι εγκέφαλοι βυθίστηκαν με 30 τοις εκατό σακχαρόζη στους 4 βαθμούς για 24 ώρες. Τα δείγματα καταψύχθηκαν γρήγορα και τομές πάχους 30-μm κόπηκαν με χρήση παγωμένου μικροτόμου. Ελεύθερα επιπλέοντα τμήματα χρωματίστηκαν με ουδέτερο κόκκινο (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) και Fluoro-Jade B (Milipore, CA, USA). Β-θετικά κύτταρα Fluoro-Jade στην περιοχή CA3 του ιππόκαμπου προσδιορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως.^30,31)

Ανοσοϊστοχημεία

Οι τομές πλύθηκαν με {{0}}.1 M PBS και μπλοκαρίστηκαν με 0.5 τοις εκατό κανονικό ορό κατσίκας σε {{20}}.1 M PBS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η επώαση του πρωτογενούς αντισώματος (μονόκλωνο αντίσωμα αντι-ΟΧ-42 ποντικού, 1: 1000· AbD Serotec, Οξφόρδη, Η.Β.) διεξήχθη δύο όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Μετά από επαναλαμβανόμενες πλύσεις με PBS, οι τομές επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένη ανοσοσφαιρίνη G κατά ποντικού (IgG) (1: 200) για 90 λεπτά, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το διάλυμα συμπλόκου αβιδίνης-βιοτίνης (ABC) (1: 1000) για 1 ώρα στο δωμάτιο θερμοκρασία, και αντέδρασε με 0,025 τοις εκατό 3,3'-διαμινοβενζιδίνη και 0,0025 τοις εκατό H2O2 μέχρι να επιτευχθεί η επιθυμητή ένταση χρώσης. Οι τομές τοποθετήθηκαν σε διαφάνειες χρησιμοποιώντας τυπικά πρωτόκολλα. Οι χρωματισμένες αντικειμενοφόρες πλάκες εξετάστηκαν και απεικονίστηκαν με μικροσκόπιο (Όλυμπος, Τόκιο, Ιαπωνία).31) Η ανάλυση ενός σώματος μικρογλοιακών κυττάρων και του μήκους της διεργασίας πραγματοποιήθηκε με ImageJ.³²)

Ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης Ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης

πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως.33) Εν συντομία, η περιοχή CA3 του ιππόκαμπου αφαιρέθηκε και στερεώθηκε σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη και 2,5 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη στους 4 βαθμούς για 24–36 ώρες. Μετά από πλύσεις με PBS, οι περιοχές CA3 στερεώθηκαν εκ των υστέρων σε 1 τοις εκατό τετροξείδιο του οσμίου για 2 ώρες, αφυδατώθηκαν με αιθανόλη και ενσωματώθηκαν σε εποξειδική ρητίνη. Εξαιρετικά λεπτές τομές (70 nm) παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας υπερμικρότομο (EM UC7, Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία). Οι τομές χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο και παρατηρήθηκαν μέσω ηλεκτρονικής μικροσκοπίας μετάδοσης (Model JEM-1400, JEOL Ltd., Τόκιο, Ιαπωνία).

Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο

Η εξαγωγή RNA και η ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως.34,35) Το ολικό RNA εξήχθη από τον ιππόκαμπο χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης miRNA mirVana™ (Life Technologies, Grand Island, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το γονιδιωματικό DNA αφαιρέθηκε με επώαση με δεοξυριβονουκλεάση (DNase) I. Το cDNA συντέθηκε με (NoScript σύστημα αντίστροφης μεταγραφής, Promega, Madison, WI, ΗΠΑ) και χρησιμοποιήθηκε για το SYBR Green (Roche Diagnostics, Mannheim, Γερμανία) ενίσχυση χρόνου PCR με συγκεκριμένους εκκινητές χρησιμοποιώντας το σύστημα LightCycler 480 (Roche Diagnostics). Το πρωτόκολλο αποτελούνταν από ένα αρχικό στάδιο μετουσίωσης στους 95 βαθμούς για 3 λεπτά, ακολουθούμενο από 45 κύκλους μετουσίωσης στους 95 βαθμούς για 10 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 56 βαθμούς για 30 δευτερόλεπτα. Τα επίπεδα mRNA κάθε γονιδίου στόχου κανονικοποιήθηκαν σε αυτά του mRNA της αφυδρογονάσης της γλυκεραλδεΰδης{12} (GAPDH). Η αναδίπλωση-επαγωγή υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2−ΔΔCT όπως περιγράφηκε σε προηγούμενη μελέτη.³⁴)

Ανοσοκηλίδωση

Είκοσι μικρογραμμάρια εκχυλισμάτων πρωτεΐνης από τον ιππόκαμπο διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου 10 τοις εκατό (SDS-PAGE) που ακολουθείται από ηλεκτροφορητική μεταφορά σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε χρησιμοποιώντας 5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκε με τα κατάλληλα αντισώματα σε 1 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς, ακολουθούμενη από επώαση με ένα δευτερεύον αντίσωμα για 1 ώρα. Τα πρωτογενή αντισώματα ήταν μονοκλωνικά αντισώματα κουνελιού που κατευθύνονται κατά Akt (1: 2000), pAktSer473 (1: 2000), κινάση συνθάσης γλυκογόνου 3 (GSK3) (1: 2000), pGSK3 Ser9 (1: 500), Bcl-2 ( 1: 1000), και -ακτίνη (1: 2000) που ελήφθη από την Cell Signaling Technology (ΜΑ, ΗΠΑ). Το δευτερογενές συζευγμένο με υπεροξειδάση αντίσωμα κατσίκας κατά κουνελιού (1: 5000) ελήφθη από την Santa Cruz (CA, USA). Οι ζώνες οπτικοποιήθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Amersham, Buckinghamshire, UK) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανάλυσης απεικόνισης γέλης. Η ένταση κάθε ζώνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Syngene (Synop tics, Cambridge, UK).

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος±τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το t-test Student δύο ουρών κατά τη σύγκριση δύο ομάδων και με μονόδρομη ANOVA με πολλαπλές συγκρίσεις post hoc τεστ του Tukey όταν συγκρίθηκαν περισσότερες από δύο ομάδες. Η ανάλυση ολοκληρώθηκε με χρήση λογισμικού SPSS (Έκδοση 17.0; SPSS Inc., Σικάγο, IL, ΗΠΑ). Π<0.05 was="" considered="" statistically="">

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Επίδραση της εχινακοσίδης σε επιληπτικές κρίσεις που προκαλούνται από το καϊνικό οξύ και αύξηση των επιπέδων γλουταμινικού ιπποκάμπου

Για την αξιολόγηση της νευροπροστατευτικής δράσης τουεχινακοσίδηέναντι της διεγερτοτοξικότητας που προκαλείται από το καϊνικό οξύ, οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε προηγούμενη αγωγή μεεχινακοσίδη(5, 10 και 50 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση) για 30 λεπτά πριν από την ενδοπεριτοναϊκή ένεση με καϊνικό οξύ (15 mg/kg). Η ενδοπεριτοναϊκή ένεση καϊνικού οξέος (15 mg/kg) οδήγησε σε επιληπτικές κρίσεις με λανθάνουσα κατάσταση και βαθμολογίες 92,5±5,3 λεπτά και 4,9±0,1, αντίστοιχα (Εικ. 1Α, Β). Μια σημαντική αύξηση στον λανθάνοντα χρόνο των επιληπτικών κρίσεων[F(2, 43)=40.2, p<0.01; fig.="" 1a]="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" seizure="" score="" [f(2,="" 40)="21.5,"><0.001; fig.="" 1b]="" were="" observed="" in="" echinacoside="" (10="" or="" 50="" mg/kg)-pretreated="" rats.="" however,="" echinacoside="" at="" 5="" mg/kg="" had="" no="" significant="" effect="" on="" seizure="" latency="" and="" score="" (p="">0.05; σύκα. 1Α, Β). Δεδομένης της ισχυρής εξασθένησης της επιληπτικής δραστηριότητας που παρατηρήθηκε με 10 ή 50 mg/kg εχινακοσίδης, αυτές οι δύο δόσεις εχινακοσίδης χρησιμοποιήθηκαν σε μεταγενέστερα πειράματα για την αξιολόγηση των μηχανισμών που διέπουν την ικανότητα της εχινακοσίδης να αναστέλλει τις επιληπτικές κρίσεις που προκαλούνται από το καϊνικό οξύ. Το Σχήμα 1C δείχνει ότι η αύξηση των επιπέδων γλουταμικού ιππόκαμπου σημειώθηκε σε αρουραίους που έλαβαν θεραπεία με καϊνικό οξύ στις 4 ώρες σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε θεραπεία με διμεθυλοσουλφοξείδιο (έλεγχος, p<0.001). however,="" decreased="" hippocampal="" glutamate="" levels="" were="" obtained="" in="" the="" echinacoside="" group="" (10="" or="" 50="" mg/kg)="" [f(3,="" 16)="6.1,"><0.01; fig.="">

Επίδραση της εχινακοσίδης σε νευρωνική βλάβη που προκαλείται από το καϊνικό οξύ στην περιοχή CA3 του ιππόκαμπου

Ο βαθμός νευρωνικής βλάβης αξιολογήθηκε 3 ημέρες μετά την ένεση καϊνικού οξέος μέσω ουδέτερης κόκκινης χρώσης ή Fluoro-Jade B για την ανίχνευση επιζώντων νευρώνων και εκφυλισμένων νευρώνων, αντίστοιχα. Η ουδέτερη κόκκινη χρώση αποκάλυψε μια φαινομενική νευρωνική απώλεια σε CA3 αρουραίων που έλαβαν ένεση με καϊνικό οξύ, σε σύγκριση με αρουραίους που έλαβαν θεραπεία με διμεθυλοσουλφοξείδιο (έλεγχος, p<0.001; figs.="" 2a,="" c).="" however,="">εχινακοσίδηη προκαταρκτική θεραπεία (10 ή 50 mg/kg) μείωσε αποτελεσματικά την απώλεια νευρώνων που προκαλείται από το καϊνικό οξύ στο CA3 [F(2, 13)=11.6, p<0.001; figs.="" 2a,="" c].="" similarly,="">εχινακοσίδη-τα ζώα που έλαβαν θεραπεία παρουσίασαν μειωμένο φθορισμό Fluoro-Jade B FL στις περιοχές CA3 του ιππόκαμπου μετά από ένεση καϊνικού οξέος (σελ.<0.001), compared="" with="" the="" strong="" damage="" observed="" in="" kainic="" acid-injected="" rats="" [f(2,="" 24)="6.9,"><0.001; figs.="" 2b,="" d].="" in="" addition,="" transmission="" electron="" microscopy="" shows="" that="" neuronal="" injury="" in="" ca3="" was="" not="" obvious="" in="" the="" dimethylsulfoxide-treated="" (control)="" group.="" however,="" in="" the="" kainic="" acid-treated="" group,="" nerve="" cells="" had="" ultrastructural="" changes.="" nerve="" cells="" exhibited="" autophagosome="" formations,="" deformed="" nuclei="" with="" the="" condensed,="" and="" disruptive="" cell="" plasma="" membrane.="" in="" contrast,="" the="" neuronal="" injury="" in="" the="" echinacoside-pretreated="" group="" was="" apparently="" attenuated="" compared="" with="" the="" kainic="" acid-injected="" rats="" (fig.="">

Επίδραση της εχινακοσίδης στην ενεργοποίηση μικρογλοίας που προκαλείται από το καϊνικό οξύ και στη γονιδιακή έκφραση των προφλεγμονωδών

Κυτοκίνες στον ιππόκαμπο Στο μοντέλο για επιληπτικές κρίσεις που προκαλούνται από το καϊνικό οξύ και νευρωνικό θάνατο του ιππόκαμπου, η μικρογλοιακή ενεργοποίηση και η παραγωγή προφλεγμονώδους κυτοκίνης αυξάνονται στον ιππόκαμπο.36,37) Προκειμένου να διερευνηθεί εάνεχινακοσίδηεπηρεάστηκε η φλεγμονώδης απόκριση στον ιππόκαμπο αρουραίων στους οποίους έγινε ένεση με καϊνικό οξύ, η ενεργοποίηση μικρογλοίας αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το αντίσωμα αντι-ΟΧ42. Σε αρουραίους που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διμεθυλοσουλφοξείδιο (ομάδα ελέγχου), τα σώματα μικρογλοιακών κυττάρων στις περιοχές CA3 ήταν μικρά και οι διαδικασίες τους ήταν μακριές και λεπτές (Εικ. 4Α). Ωστόσο, ο αριθμός των ενεργοποιημένων μικρογλοιακών κυττάρων στην περιοχή CA3 των αρουραίων στους οποίους έγινε ένεση ΚΑ αυξήθηκε σημαντικά, τα σώματα των μικρογλοιακών κυττάρων μεγεθύνθηκαν (σ.<0.01; figs.="" 4a,="" b),="" and="" their="" cellular="" processes="" became="" shorter="" and="" thicker=""><0.001; figs.="" 4a,="" c).="" in="" the="" animals="" pretreated="" with="">εχινακοσίδηΑρουραίοι που υποβλήθηκαν σε προηγούμενη αγωγή (10 ή 50 mg/kg), ο αριθμός των ενεργοποιημένων μικρογλοιακών κυττάρων μειώθηκε σημαντικά και τα σώματα των μικρογλοιακών κυττάρων ήταν λεπτά [F(2, 13)=6.2, p<0.01; fig.="" 4b]="" and="" their="" cytoplasmic="" processes="" were="" ramified="" [f(2,="" 28)="47.5,"><0.001; fig.="" 4c].="" in="" addition,="" the="" expression="" levels="" of="" interleukin-1β,="" interleukin-6,="" and="" tumor="" necrosis="" factor-α="" mrna="" in="" the="" hippocampus="" were="" apparently="" elevated="" at="" 1="" d="" after="" kainic="" acid="" injection,="" compared="" to="" dimethylsulfoxideinjected="" animals="" (control)=""><0.001). however,="" decreased="" mrna="" levels="" for="" these="" pro-inflammatory="" cytokines="" were="" obtained="" in="" the="" echinacoside="" group="" [interleukin-1β,="" f(3,="" 18)="154.7,"><0.001; interleukin-6,="" f(3,="" 17)="17.9,"><0.001; tumor="" necrosis="" factor-α,="" f(3,="" 16)="31.1,"><0.001; figs.="">

Επίδραση της εχινακοσίδης στην επαγόμενη από το καϊνικό οξύ μείωση στα επίπεδα του ιπποκάμπου Phospho-Akt, της συνθάσης κινάσης φωσφο-γλυκογόνου 3 και Bcl-2

Τα επίπεδα φωσφορυλιωμένης Akt (pAkt) (Ser473), φωσφορυλιωμένης GSK3 (pGSK3) (Ser9) και Bcl-2 προσδιορίστηκαν στον ιππόκαμπο (Εικ. 6). Μια σημαντική μείωση στην έκφραση pAkt, pGSK-3 και Bcl-2 στον ιππόκαμπο παρατηρήθηκε σε επίμυες που έλαβαν θεραπεία με καϊνικό οξύ στις 4 ώρες σε σύγκριση με αρουραίους που έλαβαν θεραπεία με διμεθυλοσουλφοξείδιο (μάρτυρας) (ρ<0.001). however,="" pretreatment="" with="">εχινακοσίδη(10 ή 50 mg/kg) αύξησαν σημαντικά τα επίπεδα pAkt, pGSK3 και Bcl-2 σε σύγκριση με τη θεραπεία με καϊνικό οξύ μόνο [pAkt, F(3, 19)=69.5, p<0.001; pgsk3β,="" f(3,="" 17)="60.3,"><0.001; bcl-2,="" f(3,="" 18)="26.1,"><0.001; figs.="">

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Τα στοιχεία έδειξαν ότι το γλουταμινικό διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην παθοφυσιολογία της επιληψίας.^17,18) Η γλουταμινεργική υπόθεση της επιληψίας υποδηλώνει ότι η επιληπτογόνος διαδικασία σχετίζεται με αυξημένη συγκέντρωση γλουταμικού στον εγκέφαλο και μια μείωση στη συγκέντρωση αυτού του νευροδιαβιβαστή είναι ικανή να παράγει αντιεπιληπτική δράση.^38–40) Μελέτη από το εργαστήριό μας το έδειξεεχινακοσίδημπορεί να μειώσει την απελευθέρωση γλουταμικού από τα νευρικά άκρα και πρότεινε ότι η εχινακοσίδη είναι πιθανό να έχει αντιεπιληπτική δράση.17) Αυτή η πρόταση επιβεβαιώθηκε στην τρέχουσα μελέτη χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο αρουραίου με ένεση καϊνικού οξέος. Το καϊνικό οξύ, ένα παράγωγο γλουταμικού, χρησιμοποιείται ευρέως για την πρόκληση επιληψίας σε μελέτες σε ζώα, επειδή τα νευροπαθολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά του είναι παρόμοια με εκείνα στους ανθρώπους.^23,24)

Η ενδοπεριτοναϊκή ένεση καϊνικού οξέος σε αρουραίους προκαλεί επιληπτικές κρίσεις και νευρωνική βλάβη, ιδιαίτερα στις περιοχές CA3 του ιππόκαμπου.^41–43) Επιπλέον, αυτές οι παθολογικές εναλλαγές που παράγονται από το καϊνικό οξύ σχετίζονται με τη μαζική απελευθέρωση γλουταμικού.^41,44,45Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, παρατηρήσαμε ότι η ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση καϊνικού οξέος (15 mg/kg) προκάλεσε επιληπτική συμπεριφορά, αύξησε τα επίπεδα γλουταμικού στον ιππόκαμπο και προκάλεσε απώλεια πυραμιδικών κυττάρων στην περιοχή CA3 του ιππόκαμπου. Αυτές οι παθολογικές εναλλαγές που προκαλούνται από το καϊνικό οξύ εξασθενήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή προκαταρκτική θεραπεία μεεχινακοσίδη(10 ή 50 mg/kg). Επιπλέον, η βλάβη των νευρικών κυττάρων του ιππόκαμπου CA3 που αξιολογήθηκε με υπερδομική εναλλαγή με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης ανακουφίστηκε απόεχινακοσίδηστους αρουραίους καινικού οξέος. Επιπλέον, παρατηρήθηκε αυξημένος αριθμός αυτοφαγοσωμάτων σε κύτταρα CA3 μετά τη χορήγηση καϊνικού οξέος. Η προκαταρκτική θεραπεία με εχινακοσίδη κατέστειλε τον αυξημένο σχηματισμό αυτοφαγοσωμάτων. Προηγούμενες μελέτες έχουν προτείνει ότι η ενεργοποίηση της αυτοφαγίας εμπλέκεται στον θάνατο των νευρώνων που προκαλείται από το καϊνικό οξύ και η αναστολή της διαδικασίας αυτοφαγίας φαίνεται να είναι νευροπροστατευτική.^46,47) Παρόλο που ο μηχανισμός που διέπει την αντιεπιληπτική δράση τουεχινακοσίδηαπαιτεί περαιτέρω διερεύνηση, η νευροπροστατευτική δράση της εχινακοσίδης στο ζωικό μοντέλο καϊνικού οξέος μπορεί να προέκυψε από την αντιεπιληπτική δράση μέσω της αναστολής της διεγερτικής τοξικότητας του γλουταμικού και της ενεργοποίησης της αυτοφαγίας.

Η νευροφλεγμονή συμβάλλει σημαντικά στην καθυστερημένη εγκεφαλική βλάβη μετά από οξύ τραυματισμό και ασκεί επιζήμια επίδραση σε μια νευρολογική έκβαση.²⁷) Οι φλεγμονώδεις αποκρίσεις, όπως η ενεργοποίηση μικρογλοίας και η φλεγμονώδης παραγωγή κυτοκίνης, έχουν περιγραφεί στην ανθρώπινη επιληψία και σε πειραματικά μοντέλα επιληψίας.^36,48) Επιπλέον, η απελευθέρωση αυτών των προφλεγμονωδών κυτοκινών από τα ενεργοποιημένα μικρογλοιακά κύτταρα προάγει τη νευρωνική βλάβη που προκαλείται από το καϊνικό οξύ στον ιππόκαμπο.^36,37) Δείξαμε ότι, ενώ το καϊνικό οξύ αύξησε την ενεργοποίηση της μικρογλοίας και τη γονιδιακή έκφραση των προφλεγμονωδών κυτοκινών (ιντερλευκίνη-1, ιντερλευκίνη-6 και παράγοντας νέκρωσης όγκου- ) στον ιππόκαμπο, αυτές οι επιδράσεις καταστέλλονταν απόεχινακοσίδηπροεπεξεργασία. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότιεχινακοσίδημέσω της καταστολής των φλεγμονωδών διεργασιών μπορεί να συμβάλει στις αντιεπιληπτικές και νευροπροστατευτικές του επιδράσεις στο ζωικό μοντέλο καϊνικού οξέος. Όπως έχει ήδη παρατηρηθεί από προηγούμενες μελέτες μας, αρκετά φάρμακα και φυσικά προϊόντα ασκούν επίσης αντιεπιληπτικά αποτελέσματα και νευροπροστασία έναντι των επιληπτικών κρίσεων που προκαλούνται από το καϊνικό οξύ, μέσω της αντιφλεγμονώδους δράσης τους.^31,33,35)

Είναι γνωστό ότι πολυάριθμοι καταρράκτες σηματοδότησης πρωτεϊνικής κινάσης ενεργοποιούνται από το καϊνικό οξύ το οποίο παίζει σημαντικό ρόλο στη νευροπροστασία. Μεταξύ αυτών που εμφανίζονται να έχουν ιδιαίτερα σημαντική συμμετοχή είναι η Ακτ.^49,50,) Το Akt μεσολαβεί στις νευροπροστατευτικές του επιδράσεις ενεργοποιώντας διάφορα κατάντη υποστρώματα, συμπεριλαμβανομένων των GSK-3 και Bcl-2. Το Akt φωσφορυλιώνει το GSK-3 στο Ser9, οδηγώντας στην αδρανοποίησή του και στην ενίσχυση της επιβίωσης των νευρωνικών κυττάρων51) επειδή η ενεργή μορφή του GSK-3 ενεργοποιεί την οδό του μιτοχονδριακού θανάτου.^52,53) Το Bcl-2 είναι βασικό μέλος της οικογένειας αντι-αποπτωτικών Bcl-2 και παίζει βασικό ρόλο στην καταστολή του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από μιτοχόνδρια. Για παράδειγμα, το Bcl-2 μπορεί να προστατεύσει την ακεραιότητα της μιτοχονδριακής μεμβράνης και να εμποδίσει την απελευθέρωση του κυτοχρώματος C από τα μιτοχόνδρια, οδηγώντας στην επιβίωση των κυττάρων και στην αναστολή της απόπτωσης.⁵⁴) Έχει επίσης αναφερθεί ότι η υπερέκφραση του Bcl-2 προστατεύει τους νευρώνες από διεγερτοτοξικές προσβολές in vitro και in vivo. 54,55) Η παρούσα μελέτη παρατήρησε μειωμένη φωσφορυλίωση Akt (Ser473) και GSK3 (Ser9) καθώς και έκφραση Bcl-2 στον ιππόκαμπο αρουραίων μετά από έκθεση σε καϊνικό οξύ, κάτι που είναι σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες.^56,57) Επιπλέον, η προεπεξεργασία με εχινακοσίδη διέσωσε την επαγόμενη από το καϊνικό οξύ μείωση στην έκφραση pAkt και pGSK3 καθώς και Bcl-2. Έτσι, οι νευροπροστατευτικές επιδράσεις τουεχινακοσίδηστο ζωικό μοντέλο καϊνικού οξέος μπορεί εν μέρει να διαμεσολαβείται αποτρέποντας την καθοδική ρύθμιση της οδού Akt/GSK-3 /Bcl-2, αυξάνοντας έτσι την επιβίωση των νευρώνων.

Εχινακοσίδηείναι ένας πιθανός νέος θεραπευτικός υποψήφιος. Αυτό είναι επειδήεχινακοσίδημπορεί να εισέλθει στον εγκέφαλο και παρουσιάζει πολλά οφέλη.⁵⁸) Πολυάριθμες μελέτες το έχουν δείξειεχινακοσίδημετριάζει τη βλάβη του εγκεφάλου και ανακουφίζει την εξασθένηση της κινητικότητας ή της μνήμης σε διάφορα πειραματικά μοντέλα in vivo.^12,14,15,59) Αν και οι μηχανισμοί που αποτελούν τη βάση των νευροπροστατευτικών επιδράσεων τουεχινακοσίδηστον εγκέφαλο απαιτούν διευκρίνιση, έχουν εμπλακεί η αναστολή της νευροφλεγμονής, η αντιοξείδωση, η σάρωση ριζών χωρίς οξυγόνο και η αυξημένη νευρογένεση.^14–16) Εκτός από αυτούς τους πιθανούς μηχανισμούς, οι προηγούμενοι μας¹⁷) και τα παρόντα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της υπερδιέγερσης που προκαλείται από γλουταμικό μπορεί εν μέρει να συμβάλει στις νευροπροστατευτικές και αντιεπιληπτικές επιδράσεις τουεχινακοσίδηστον εγκέφαλο. Αυτό υποστηρίζεται από το γεγονός ότι η επιληπτική δραστηριότητα που προκαλείται από το καϊνικό οξύ, η νευροφλεγμονή και η εγκεφαλική βλάβη σχετίζονται με την υπερβολική απελευθέρωση γλουταμικού και την ενεργοποίηση των υποδοχέων γλουταμικού.^44,45) Επιπλέον, αρκετά κλινικά χρησιμοποιούμενα αντιεπιληπτικά φάρμακα έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν την επιληπτική δραστηριότητα που προκαλείται από το καϊνικό οξύ60,61) και μειώνουν την απελευθέρωση γλουταμικού στους ιστούς του εγκεφάλου ανθρώπου και αρουραίου.^62,63Αυτά τα ευρήματα επισήμαναν ότι τα μειωμένα επίπεδα γλουταμικού είναι σημαντικά για τις φαρμακοθεραπευτικές επιδράσεις των αντιεπιληπτικών φαρμάκων.

Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας το αποδεικνύουνεχινακοσίδη, μέσω της καταστολής των φλεγμονωδών διεργασιών, της μείωσης της υπερδιέγερσης που προκαλείται από γλουταμικό, καθώς και της αύξησης της ενεργοποίησης του Akt/GSK-3 και της έκφρασης Bcl-2, έχει σημαντική αντιεπιληπτική και νευροπροστατευτική δράση σε αρουραίους στους οποίους έγινε ένεση με καϊνικό οξύ. Αν και ο ρόλος τουεχινακοσίδησε ασθενείς με επιληψία απαιτεί περαιτέρω αξιολόγηση, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι θα μπορούσε να είναι μια πολύτιμη προσέγγιση στη θεραπεία της επιληψίας.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να ευχαριστήσουν τον κ. Yen-Sheng Wu του Εργαστηρίου Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου του Tzong Jwo Jang, College of Medicine, Fu Jen Catholic University. Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας (MOST 103-2320-B-030-001 MY3).

Σύγκρουση συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.