Η στόχευση της καθεψίνης Β από την κυκλοαστραγενόλη ενισχύει την αντικαρκινική ανοσία των CD8 T κυττάρων μέσω της αναστολής της αποδόμησης του MHC-I Μέρος 1

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ

ΙστορικόΗ απώλεια αντιγόνων όγκου και η εξάντληση των CD8 Τ κυττάρων που προκαλούνται από την οδό PD-1/PD-L1 είναι σημαντικοί παράγοντες για την ανοσολογική διαφυγή του όγκου. Τα τελευταία χρόνια, υπάρχει αυξανόμενη έρευνα για την παραδοσιακή κινεζική ιατρική στη θεραπεία όγκων. Η κυκλοαστραγενόλη (CAG), ένα αποτελεσματικό ενεργό μόριο στο Astragalus membranaceus, έχει βρεθεί ότι έχει αντιικές, αντιγηραντικές, αντιφλεγμονώδεις και άλλες λειτουργίες. Ωστόσο, η αντικαρκινική δράση και ο μηχανισμός του δεν είναι ξεκάθαροι.

Το γλυκοσίδιο του cistanche μπορεί επίσης να αυξήσει τη δραστηριότητα του SOD στους ιστούς της καρδιάς και του ήπατος και να μειώσει σημαντικά την περιεκτικότητα σε λιποφουσκίνη και MDA σε κάθε ιστό, καθαρίζοντας αποτελεσματικά διάφορες δραστικές ρίζες οξυγόνου (OH-, H2O2, κ.λπ.) και προστατεύοντας από βλάβη του DNA που προκαλείται από ρίζες ΟΗ. Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες του Cistanche έχουν ισχυρή ικανότητα δέσμευσης ελεύθερων ριζών, υψηλότερη αναγωγική ικανότητα από τη βιταμίνη C, βελτιώνουν τη δραστηριότητα του SOD στο εναιώρημα σπέρματος, μειώνουν την περιεκτικότητα σε MDA και έχουν μια ορισμένη προστατευτική δράση στη λειτουργία της σπερματικής μεμβράνης. Οι πολυσακχαρίτες Cistanche μπορούν να ενισχύσουν τη δραστηριότητα των SOD και GSH-Px σε ερυθροκύτταρα και ιστούς πνευμόνων πειραματικά γηρασμένων ποντικών που προκαλούνται από D-γαλακτόζη, καθώς και να μειώσουν την περιεκτικότητα σε MDA και κολλαγόνο στους πνεύμονες και στο πλάσμα και να αυξήσουν την περιεκτικότητα σε ελαστίνη. ένα καλό αποτέλεσμα σάρωσης στο DPPH, παρατείνει το χρόνο της υποξίας σε γηρασμένα ποντίκια, βελτιώνει τη δραστηριότητα του SOD στον ορό και καθυστερεί τον φυσιολογικό εκφυλισμό του πνεύμονα σε πειραματικά γηρασμένα ποντίκια Με τον κυτταρικό μορφολογικό εκφυλισμό, τα πειράματα έχουν δείξει ότι το Cistanche έχει την καλή αντιοξειδωτική ικανότητα και έχει τη δυνατότητα να είναι φάρμακο για την πρόληψη και τη θεραπεία ασθενειών της γήρανσης του δέρματος. Ταυτόχρονα, η εχινακοσίδη στο Cistanche έχει σημαντική ικανότητα να καθαρίζει τις ελεύθερες ρίζες DPPH και έχει την ικανότητα να καθαρίζει δραστικά είδη οξυγόνου και να αποτρέπει την αποικοδόμηση του κολλαγόνου που προκαλείται από ελεύθερες ρίζες, και έχει επίσης μια καλή επίδραση επιδιόρθωσης στη βλάβη των ανιόντων από τις ελεύθερες ρίζες θυμίνης.

Κάντε κλικ στο cistanche πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

ΜέθοδοιΗ αντικαρκινική δράση του CAG διερευνήθηκε σε μοντέλα όγκων μεταμοσχευμένων σε ποντίκια MC38 και CT26. Η αντικαρκινική δράση του CAG αναλύθηκε περαιτέρω μέσω αλληλουχίας πολλαπλών ωμικών μονοκυττάρων. Η τεχνολογία προσδιορισμού προσβασιμότητας με απόκριση στο στόχο χρησιμοποιήθηκε για την εύρεση της πρωτεΐνης στόχου του CAG. Στη συνέχεια, ο αντικαρκινικός μηχανισμός του CAG διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας ομοεστιακή μικροσκοπία, ανοσοκατακρήμνιση και επιμόλυνση μεταλλαγμένων πλασμιδίων. Τέλος, διερευνήθηκε η συνδυασμένη αντικαρκινική δράση των αντισωμάτων CAG και PD-1 σε ποντικούς ή οργανοειδή.

ΑποτελέσματαΒρήκαμε ότι το CAG ανέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη του όγκου in vivo. Ο άτλαντας πολλαπλών ωμικών μονοκυττάρων μας έδειξε ότι το CAG προήγαγε την παρουσίαση αντιγόνων επιφάνειας κυττάρων όγκου και χαρακτηρίστηκε από την ενισχυμένη λειτουργία θανάτωσης των CD8 συν Τ κυττάρων. Μηχανιστικά, το CAG δεσμεύτηκε με την πρωτεΐνη-στόχο καθεψίνη Β, η οποία στη συνέχεια ανέστειλε τη λυσοσωμική αποικοδόμηση του κύριου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας Ι (MHC-I) και προώθησε το άθροισμα n του MHC-I στην κυτταρική μεμβράνη, ενισχύοντας τον προ-σταθμό του αντιγόνου όγκου. . Εν τω μεταξύ, ο συνδυασμός CAG με αντίσωμα PD-1 ενίσχυσε αποτελεσματικά τη θανάτωση του όγκου CD8 συν Τ κύτταρα σε ποντίκια με ξενομοσχεύματα και οργανοειδή καρκίνου του παχέος εντέρου. Συμπέρασμα Τα δεδομένα μας ανέφεραν για πρώτη φορά ότι η μείωση της ρύθμισης της καθεψίνης Β προσδίδει αντικαρκινική ανοσία και εξάλειψε τον αντικαρκινικό μηχανισμό του φυσικού προϊόντος CAG.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ένας από τους πιο συχνούς καρκίνους παγκοσμίως. Το ποσοστό επίπτωσης και το ποσοστό θνησιμότητας κατατάσσονται μεταξύ των τριών κορυφαίων, απειλώντας σοβαρά την ανθρώπινη ζωή και υγεία.1 Οι συνήθεις μέθοδοι θεραπείας περιλαμβάνουν χειρουργική χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία, στοχευμένα φάρμακα και ανοσοθεραπεία.2–4 Ωστόσο, τα καρκινικά κύτταρα συνήθως παρουσιάζουν απώλεια επιφανειακών αντιγόνων και εκφράζουν υψηλά επίπεδα αναστέλλουν μόρια για να ξεφύγουν από την επιτήρηση των κυττάρων του ανοσοποιητικού. Επομένως, για να λύσουν το πρόβλημα της διαφυγής του ανοσοποιητικού όγκου, οι ερευνητές ανέπτυξαν αναστολείς σημείων ελέγχου του ανοσοποιητικού και θεραπεία νεοαντιγόνων για να εμποδίσουν την κάλυψη των καρκινικών κυττάρων στα κύτταρα του ανοσοποιητικού. τα κύτταρα δεν έχουν μεταφερθεί σημαντικά. Ως εκ τούτου, είναι ιδιαίτερα σημαντικό να βρεθούν φάρμακα που μπορούν να προάγουν την παρουσίαση αντιγόνων επιφάνειας όγκου. Η αναγνώριση καρκινικών κυττάρων από κυτταροτοξικά CD8 συν Τ κύτταρα εξαρτάται από την οδό TCR/CD3/μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MHC-I). Το TCR λαμβάνει το αντιγόνο που υπάρχει από την πρωτεΐνη CI δενδριτικού κυττάρου/καρκινικής μεμβράνης και μεταδίδει το σήμα για τη στενή σύνδεση του CD3, το οποίο στη συνέχεια επεκτείνεται βαθύτερα στο κυτταρόπλασμα.{10}} Ταυτόχρονα, με την ενεργοποίηση του σήματος CD28/B7. , τα CD8 συν Τ κύτταρα μπορούν να συνενεργοποιηθούν για να αναγνωρίσουν και να σκοτώσουν καρκινικά κύτταρα.11 Πρόσφατες μελέτες έχουν βρει ότι, στη διαδικασία εξέλιξης του όγκου, τα λυσοσώματα έχουν ως αποτέλεσμα τη μείωση της συσσωμάτωσης MHC-I στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων, κάτι που δεν λειτουργεί αποτελεσματικά παρόντα αντιγόνα.12 13 Οι Liu et al ανέφεραν ότι η αναστολή του PCSK9 μπορεί να αποτρέψει την αποικοδόμηση του MHC-I στα λυσοσώματα και να επιτρέψει στο MHC-I να επιστρέψει στην κυτταρική μεμβράνη για να παρουσιάσει αντιγόνα.12 Επομένως, η αποκατάσταση της λειτουργίας παρουσίασης αντιγόνων του MHC-I είναι ιδιαίτερα σημαντικό για την παρεμπόδιση της διαφυγής του ανοσοποιητικού όγκου.

Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχει διαπιστώσει ότι η εφαρμογή ενεργών μορίων της παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής και η αντικαρκινική παρέμβαση έχει μεγάλες προοπτικές.14 15 Η κυκλοαστραγενόλη (CAG) είναι ένα αποτελεσματικό ενεργό μόριο στο Astragalus membranaceus, το οποίο έχει αντιιικό, αντιβακτηριακό, αντι- φλεγμονώδεις και άλλες φαρμακολογικές επιδράσεις, αλλά η αντικαρκινική της δράση αναφέρεται σπάνια.16–19 Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η CAG ανέστειλε την ανάπτυξη μεταγενέστερων όγκων καρκίνου του παχέος εντέρου. καθεψίνη Β (CTSB), προάγοντας την παρουσίαση αντιγόνου των καρκινικών κυττάρων και στη συνέχεια ενισχύοντας την ικανότητα θανάτωσης των CD8 συν Τ κυττάρων.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Αντισώματα και αντιδραστήρια

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 τοις εκατό). Αντισώματα CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929 ), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426 ), Actin (Cat#{{ 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), Τομπουλίνη (Cat#10094-1-AP, PRID: AB_2210695) ​​και Κιτ ανίχνευσης ανοσοϊστοχημείας κατά ποντικού/κουνελιού (Cat#PK10006) αγοράστηκαν από την Proteintech. Αντισώματα H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853), και CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) αγοράστηκαν από τη Santa Cruz Biotechnology. Το αντίσωμα του Ki-67 (Cat#12202, PRID: AB{_2620142) αγοράστηκε από την τεχνολογία Cell Signaling Technology. Το αντίσωμα Na/K ATPase (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) αγοράστηκε από την Abcam. Αντισώματα κυτταρομετρίας ροής CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB{_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB{_2833003 ) και CD{ {31}}Το PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802) αγοράστηκαν από την BD Bioscience. Το αντίσωμα κυτταρομετρίας ροής του Gzmb-FITC (Cat# 515403, RRID: AB_2114575) αγοράστηκε από την BioLegend. Αντισώματα κυτταρομετρίας ροής του NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB{_469664) και IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID :AB_466192) αγοράστηκαν από την Thermo Fisher Scientific. Το μέσο DMEM (Cat#01-052-1ACS), η PenicilinStreptomycin (Cat#15140122) και ο εμβρυϊκός ορός βοοειδών (Cat#C04001-500) αγοράστηκαν από τη Biological Industries. Ο ορός κατσίκας (Cat#88RNG001) και το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης Pierce BCA (Cat#23225) αγοράστηκαν από την Thermo Fisher Scientific. Τα αντισώματα αντι-ανθρώπινου PD-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) και αντι-ποντικού PD-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) αγοράστηκαν από το Bio X cell. Το MACS Tumor Tissue Dissociation Kit (Cat#{130-095-929) αγοράστηκε από την Miltenyi Biotec.

Κυτταρικής καλλιέργειας

Οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου ποντικού MC38 και CT26 διατηρήθηκαν στο εργαστήριό μας.20 Οι σειρές l του καρκίνου του παχέος εντέρου του ανθρώπου ελήφθησαν από τη Συλλογή Type Culture Collection της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα MC38, CT26 και HCT-116 καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM που περιείχε 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη στους 37 βαθμούς σε επωαστήρα 5 τοις εκατό CO2.

Πείραμα μεταμοσχεύσεων όγκου

Θηλυκά ποντίκια C57BL/6JGpt ηλικίας έξι οκτώ εβδομάδων, ποντίκια BALB/c και γυμνά ποντίκια BALB/,c αγοράστηκαν από την GemPharmatech (Nanjing, Κίνα). MC38 ή CT26 καρκινικά κύτταρα (1×106) εμβολιάστηκαν υποδορίως σε κάθε ποντικό. Όταν ο όγκος αυξάνεται στα 100 mm3, το μικρόφωνο χωρίστηκε τυχαία στην ομάδα φυσιολογικού ορού ρυθμισμένου με φωσφορικά (PBS) (π.χ. μία φορά την ημέρα) και στην ομάδα CAG (π.χ. 50 mg/kg μία φορά την ημέρα). Οι όγκοι του όγκου προσδιορίστηκαν με μέτρηση με παχύμετρο χρησιμοποιώντας τον τύπο V=μήκος×πλάτος2/2. Όταν ο όγκος του όγκου των ποντικών της ομάδας PBS έφτασε τα 1000 mm3, ο όγκος των ποντικών αφαιρέθηκε, φωτογραφήθηκε και ζυγίστηκε.

Διάσταση ενός κυττάρου από το ποντίκι για μονοκύτταρο RNA/ATACseq

Οι συμπαγείς όγκοι από ποντίκια υποβλήθηκαν σε πέψη χρησιμοποιώντας κιτ διάστασης όγκου για να ληφθούν μονοκύτταρα μονοκύτταρα. Single celSingle-cell s με συγκέντρωση 1000 κελιά/1000 κύτταρα φορτωμένα στα single cell single-cell ελεγκτή χρωμίου 10×genomics ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή 10×genomics. Αντιδραστήρια αντίστροφης μεταγραφής, σφαιρίδια γέλης με γραμμικό κώδικα και έλαιο καταμερισμού αναμίχθηκαν με τα κύτταρα για γονίδιο για να δημιουργηθούν σφαιρίδια γέλης σε γαλακτώματα (GEM) για αντίστροφη μεταγραφή. Προεπεξεργασία δεδομένων scRNA-seq και έλεγχος qua y.

Με βάση το γονιδίωμα αναφοράς του ποντικιού GRCm38 (mm10), ο αγωγός CellRanger V.4.0.0 (10×Genomics) για την επεξεργασία RNA μονοκυττάρου. δεδομένα αλληλουχίας για κάθε πείραμα (GSE197229). Οι μήτρες ψηφιακής έκφρασης γονιδίων συγκολλήθηκαν σε R (V.4.0.4) χρησιμοποιώντας το πακέτο Seurat (V.4.0.0).21 Πριν από την ανάλυση dBeforem, τα κύτταρα φιλτράρονταν με αριθμό UMI (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

Προεπεξεργασία και ποιοτικός έλεγχος δεδομένων SeaTac-seq

Τα δεδομένα ATAC-seq ενός κελιού (GSE197229) υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία από το cell ranger-at (V.2.0.0) με τη γραμμή εντολών count. Για την επακόλουθη επεξεργασία και ανάλυση δεδομένων scATAC-seq, χρησιμοποιήσαμε το πακέτο ArchR (V.1.0.1).24 Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε τη συνάρτηση addArchRGethe nome ('mm10') για σχολιασμό γονιδιώματος και δημιουργήσαμε ένα αρχείο βέλους με τη συνάρτηση cre ArrowFiles με τις προεπιλεγμένες παραμέτρους. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε τη συνάρτηση filterDoublets για να διαγράψουμε τα πιθανά διπλά και δημιουργήσαμε ένα έργο ArchR χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση ArchRProject με προεπιλεγμένες παραμέτρους. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε το πακέτο Harmony για να αφαιρέσουμε το εφέ παρτίδας με τη συνάρτηση addHarmony.25 Για μείωση διαστάσεων, χρησιμοποιούμε τη συνάρτηση addIterativeLSI στο ArchR για να εκτελεστεί με τις παραμέτρους def t. Για την ενσωμάτωση ενός κελιού, επιλέξαμε το αντικείμενο reduceDims με αρμονία και χρησιμοποιήσαμε τη συνάρτηση addTSNE με την παράμετρο 'perplexity=30' για οπτικοποίηση.

Ολοκληρωμένη ανάλυση δεδομένων siRNA-seq και scATAC-seq

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Για να βελτιώσουμε την ακρίβεια των προβλέψεων για την καλύτερη ενσωμάτωση των δύο συνόλων δεδομένων, ενσωματώσαμε για άλλη μια φορά τα δεδομένα scATAC-seq και scRNA-seq χρησιμοποιώντας τη λειτουργία «περιορισμένης ολοκλήρωσης». Εν συντομία, σχολιάσαμε τα δεδομένα scATAC-seq με κυτταρικούς τύπους με βάση τις βαθμολογίες γονιδίων του scATAC-seq. Στη συνέχεια, δημιουργήσαμε μια περιορισμένη λίστα έτσι ώστε η ομοιότητα γονιδιακής έκφρασης υπολογίστηκε μόνο στον ίδιο τύπο κυττάρου τόσο για scATAC-seq όσο και για scRNA-seq. Η ομαδοποίηση χωρίς επίβλεψη με το t-SNE αποκάλυψε 13 συστάδες υποκυττάρων, οι οποίες σχολιάστηκαν από γνωστούς ή υποτιθέμενους δείκτες στον διαδικτυακό συμπληρωματικό Πίνακα 1.

Τροχιά γενεαλογίας ψευδοχρόνου

Η τροχιά της κυτταρικής γενεαλογίας των καρκινικών κυττάρων συνήχθη χρησιμοποιώντας το πακέτο R Monocle2 (V.2.18.0). 26 Τα μονοκύτταρα μαθαίνουν το ρητό κύριο γράφημα από δεδομένα γονιδιωματικής ενός κυττάρου με το Reversed Graph Embedding για την ταξινόμηση των κυττάρων, λύνοντας έτσι σύνθετα βιολογικές διεργασίες σθεναρά και με ακρίβεια.27 Χρησιμοποιήσαμε τη συνάρτηση ''διαφορικόGeneTest'' για να εξαγάγουμε το DEG από κάθε σύμπλεγμα και μετά την κατασκευή της κυτταρικής τροχιάς, ανιχνεύσαμε τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια στον ψευδοχρόνο. Όλα τα γονίδια που εξαρτώνται από ψευδοχρόνο οπτικοποιήθηκαν με τη συνάρτηση γραφικής_ψευδοχρόνου{10}}heatmap λαμβάνοντας ένα αντικείμενο CellDataSet. Τα διαγράμματα τροχιάς γραμμής και οι καμπύλες ομαλής έκφρασης που βασίζονται στο CellDataSet δημιουργήθηκαν από γονίδια γραφικής παράστασης_κυττάρου_τροχίας και γραφικής παράστασης_σε_ψευδοχρόνο, αντίστοιχα.28

Κλήση παραλλαγής αριθμού αντιγράφων ενός κελιού

Για να αναγνωρίσουμε κακοήθη κύτταρα με κλωνικές παραλλαγές αριθμού χρωμοσωμικών αντιγράφων μεγάλης κλίμακας (CNV), χρησιμοποιήσαμε το πακέτο inferCNV R για να συμπεράνουμε τα γενετικά προφίλ κάθε κυττάρου με βάση τη μέση έκφραση μεγάλων συνόλων γονιδίων σε κάθε χρωμοσωμική περιοχή του γονιδιώματος του όγκου σε σύγκριση με φυσιολογικά κύτταρα.29 Σε βάση δείγμα προς δείγμα, τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος χρησιμοποιήθηκαν ως αναφορά για την εκτίμηση των CNV στα κύτταρα που σχετίζονται με τον καρκίνο.

Ανάλυση εμπλουτισμού

Οι αναλύσεις διαδρομής KEGG και σχολιασμού GO πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το R πακέτο clusterProfiler (V.3.11.1) με παραμέτρους PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10 και MaxGSSize=500.20Η ανάλυση εμπλουτισμού συνόλου γονιδίων (GSEA) εφαρμόστηκε χρησιμοποιώντας 50 σύνολα γονιδίων χαρακτηριστικών (h.all.V.7.4.symbols. gmt) για τον εντοπισμό σημαντικά εμπλουτισμένων λειτουργικές διαδρομές μέσω λογισμικού GSEA (V.4.1.0), με κριτήρια διαλογής ονομαστικής τιμής P<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Ποσοτική ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο

Τα κύτταρα MC38 και HCT-116 σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων για 6 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CAG για άλλες 24 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με ψυχρό PBS και φυγοκεντρήθηκαν στα 180g για 5 λεπτά στους 4 βαθμούς. Ταυτόχρονα, μετά την άλεση του ιστού όγκου. Το συνολικό RNA εξήχθη από κύτταρα MC38, HCT-116 και ιστό όγκου χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TRIzol, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο όγκος αντίδρασης ήταν 20 μL που περιείχε: 1 μg RNA, 5 μL 5 × Hiscript III qRT SuperMix και χωρίς RNase dH2 O. Το cDNA υποβλήθηκε σε ποσοτική PCR, με όγκο αντίδρασης 10 μL με 1 μL cDNA, 5 μL μίγμα qPCR, 0,75 μL (Forward and Reverse) και 3,25 μL dH2O χωρίς RNase. Οι εκκινητές συντέθηκαν από την GenScript Biotech Corporation (Nanjing, Κίνα) σύμφωνα με τις ακόλουθες αλληλουχίες (online συμπληρωματικός πίνακας 2).

Ανακάλυψη στόχων μέσω μιας προσέγγισης προφίλ προσβασιμότητας που ανταποκρίνεται στο στόχο

Ο έλεγχος των πρωτεϊνών που δεσμεύουν CAG πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως.31 32 Εν συντομία, χρησιμοποιήθηκε η προσέγγιση αποκρινόμενης σε στόχο προσβασιμότητας (TRAP) για την ανακάλυψη των πρωτεϊνών δέσμευσης για CAG στο κυτταρικό περιβάλλον παρακολουθώντας τη λυσίνη που προκαλείται από εμπλοκή συνδέτη αλλαγές προσβασιμότητας σε επίπεδο πρωτεώματος. Εν συντομία, δύο δίσκοι κυττάρων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10μΜ CAG και διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), αντίστοιχα. Μετά από επώαση 1-ώρας, τα κύτταρα διαπερατήθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα M-PER (Thermo Scientific) και τα προϊόντα λύσης που προέκυψαν επισημάνθηκαν ομοιοπολικά με την προσθήκη συμπλόκου φορμαλδεΰδης και βορανίου πυριδίνης που μαζί επισημαίνουν ειδικά υπολείμματα πρωτεϊνικής λυσίνης σε θερμοκρασία δωματίου για προφίλ προσβασιμότητας . Στη συνέχεια, τα προϊόντα λύσης καταβυθίστηκαν με οργανικό διαλύτη και τα συλλεχθέντα σφαιρίδια επαναδιαλύθηκαν σε 8 mol/L ουρίας, ανήχθησαν με διθειοθρεϊτόλη (DTT) στους 56 βαθμούς για 30 λεπτά, ακολουθούμενη από αλκυλίωση χρησιμοποιώντας ιωδοακεταμίδιο (ΙΑΑ) στο σκοτάδι για 30 λεπτά. Μια κατάλληλη ποσότητα διαλύματος DTT προστέθηκε ξανά για να αντιδράσει με περίσσεια ΙΑΑ. Στη συνέχεια, το πρωτεόμιο αραιώθηκε με διάλυμα διττανθρακικού αμμωνίου μέχρις ότου η τελική συγκέντρωση της ουρίας φτάσει στο 1mol/L. Τα συλλεχθέντα προϊόντα πέψης πρωτεΐνης αφαλατώθηκαν σε στήλες C18 HLB (Waters, Milford, Μασαχουσέτη, ΗΠΑ) και τα εμπλουτισμένα πεπτίδια ξηράνθηκαν και ανασυστάθηκαν σε υδατικό διάλυμα μυρμηκικού οξέος 0,1 τοις εκατό (FA). Το σύστημα AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF (Waters) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δειγμάτων για ποσοτικό προφίλ των αλλαγών προσβασιμότητας της λυσίνης ως απόκριση στη δέσμευση CAG για ανακάλυψη στόχου. Η απόκτηση εξάρτησης δεδομένων στη θετική λειτουργία χρησιμοποιήθηκε για τη λήψη δεδομένων. Η ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Καναδάς). Συγκεκριμένα, η cys αλκυλίωση επιλέχθηκε ως σταθερή τροποποίηση και η οξείδωση μεθειονίνης και η διμεθυλίωση λυσίνης, που επιτεύχθηκε με σήμανση TRAP, ορίστηκαν ως μεταβλητές τροποποιήσεις. Εν συντομία, πεπτίδια που περιέχουν διμεθυλίωση που προκαλείται από TRAP και εμφάνισαν σημαντικές αλλαγές αφθονίας με και χωρίς επώαση CAG ορίστηκαν ως πεπτίδια που αποκρίνονται στο στόχο. Η αναλογία της αφθονίας κάθε πεπτιδίου σημασμένου με TRAP υποδεικνύει την έκταση της αλλαγής προσβασιμότητας και συνδέεται στενά με τη συγγένεια δέσμευσης συνδέτη. Η δοκιμή t Student διεξήχθη για να εκτιμηθεί εάν οι ανιχνευόμενες αλλαγές προσβασιμότητας των επισημασμένων πεπτιδίων είναι στατιστικά σημαντικές. Μια διαομαδική τιμή p (σελ<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Οργανοειδής καλλιέργεια

Τα οργανοειδή ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κατασκευάστηκαν και καλλιεργήθηκαν από την Chongqing Kingbiotech.33 Δείγματα ιστού ασθενών που αποκτήθηκαν από τη χειρουργική επέμβαση τεμαχίστηκαν σε όσο το δυνατόν μικρότερα κομμάτια με αποστειρωμένο ψαλίδι. Τα κομμάτια ιστού αναμίχθηκαν επιμελώς με Matrigel (Corning, Cat#356231) στην κατά προσέγγιση αναλογία 1:4 σε πάγο. Η επακόλουθη επεξεργασία αναφερόταν σε δημοσιευμένα πρωτόκολλα. Εν συντομία, τα τεμάχια-εναιωρήματα Matrigel σπάρθηκαν γρήγορα στην πλάκα πολλαπλών φρεατίων για να σχηματίσουν ημισφαιρικά σταγονίδια και μεταφέρθηκαν στους 37 βαθμούς για 15-20 λεπτά, επιτρέποντας στα σταγονίδια να στερεοποιηθούν. Προστέθηκε η κατάλληλη ποσότητα μέσου καλλιέργειας (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​σε κάθε φρεάτιο και άλλαζε το μέσο κάθε 2–4 ημέρες.

Απομόνωση και καλλιέργεια ανθρώπινων CD8 Τ κυττάρων

Προσθέστε τον ίδιο όγκο φυσιολογικού ορού στο περιφερικό αίμα υγιών ατόμων που περιέχει αντιπηκτικά για να αραιώσετε το πλήρες αίμα. Προσθέστε έναν ορισμένο όγκο διαλύματος διαχωρισμού σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης 15 mL, προσθέστε αργά το αραιωμένο πλήρες αίμα κατά μήκος του τοιχώματος του σωλήνα στην κορυφή του διαλύματος διαχωρισμού και φυγοκεντρήστε στα 750 g για 20 λεπτά. Μετά τη φυγοκέντρηση, χρησιμοποιήστε μια πιπέτα για να αναρροφήσετε προσεκτικά τα μονοκύτταρα στη μεσαία λευκή στιβάδα σε ένα φυγοκεντρικό σωλήνα 15 mL, προσθέστε έναν ορισμένο όγκο PBS για να επαναιωρήσετε, φυγοκεντρήστε 250 g για 5 λεπτά και απορρίψτε το υπερκείμενο. Μετά την προσθήκη ανθρώπινων μαγνητικών σφαιριδίων CD8 στα κυτταρικά ιζήματα, τα CD8 Τ κύτταρα ταξινομήθηκαν με στήλη ταξινόμησης LS. Τα CD8 Τ κύτταρα προστέθηκαν στη διάτρητη πλάκα προεπικαλυμμένη με αντίσωμα 5 μg/mL CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB{_2865578) και στη συνέχεια 10 ng/mL IL{{15} } (Peprotech Cat# 212-12) και 5 μg/mL CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) προστέθηκαν λειτουργικά αντισώματα καλλιεργημένα για 24 ώρες.

Coculture

Αφού τα οργανοειδή επωάστηκαν με CAG για 24 ώρες, το φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε και στη συνέχεια τα οργανοειδή και τα ενεργοποιημένα CD8 Τ κύτταρα εναιωρήθηκαν στο πήκτωμα μήτρας, μετά το εναιώρημα προστέθηκε στην πλάκα των έξι φρεατίων και τοποθετήθηκε στο 37 βαθμού επωαστήρα για 15 λεπτά, και στη συνέχεια προστέθηκαν 2 mL πλήρους μέσου καλλιέργειας χωρίς ορό για 24 ώρες.

Δυτική κηλίδα

Τα κύτταρα MC38 και HCT-116 σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων για 6 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CAG για άλλες 24 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με ψυχρό PBS και φυγοκεντρήθηκαν στα 180 g για 5 λεπτά στους 4 βαθμούς. Η συνολική πρωτεΐνη λύθηκε με λύση WB-IP που περιείχε 1 τοις εκατό αναστολέα πρωτεάσης για 30 λεπτά σε πάγο. Η συνολική πρωτεΐνη αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ ποσοτικοποίησης πρωτεΐνης BCA. Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου SDS 10% -12% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (φθοριούχο πολυβινυλιδένιο) στα 350 mA για 90 λεπτά. Οι μεμβράνες PVDF αποκλείστηκαν με 5 τοις εκατό BSA για 1 ώρα, οι λωρίδες με το υποδεικνυόμενο πρωτεύον αντίσωμα όλη τη νύχτα και με το δευτερεύον αντίσωμα επωάστηκαν για 90 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, οι λωρίδες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας σύστημα υποστρώματος χημειοφωταύγειας LumiGLO (KPL, Gaithersburg, Maryland, ΗΠΑ).

Κυτταρομετρία ροής

Μετά την πέψη του ιστού του όγκου και παρασκευάστηκε το μονοκυτταρικό εναιώρημα. Η επιφανειακή χρώση πραγματοποιήθηκε με αντισώματα επιφανειακού αντιγόνου στο ρυθμιστικό διάλυμα FCM (Flow Cytometry) (PBS που περιέχει 1 τοις εκατό FBS) και χρωματίστηκε σε πάγο με κατάλληλα αντισώματα για 30 λεπτά. Οι αντιδραστικές βαφές (eBioscience) χρησιμοποιήθηκαν για την εξάλειψη των νεκρών κυττάρων. Η ενδοκυτταρική χρώση κυτοκίνης διεξήχθη με σταθεροποιητικό διάλυμα κυττάρων BD/διάλυμα εξωκυτταρικής μεμβράνης, και τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και διαποτίστηκαν, και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με αντισώματα κατά των κυτοκινών σε ρυθμιστικό διάλυμα Perm/Wash (BD Biosciences).

Μεταλλαγμένα πλασμίδια CTSB επιμολύνθηκαν

Κύτταρα HCT-116 σπάρθηκαν σε τρυβλία 6- φρεατίων για 12 ώρες και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με CTSB-WT-EGFP ή CTSB μεταλλαγμένα πλασμίδια (Y75A, A77V και G198A) για 36 ώρες.

Παρεμβολή επιμόλυνσης ή πλασμίδιο υπερέκφρασης του CTSB σε κύτταρα MC38 ή κύτταρα HCT-116

Κύτταρα MC38 (1×106 /φρεάτιο) εμβολιάστηκαν σε τρυβλία 6-φρεατίων για 6 ώρες, στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με παρεμβαλλόμενο RNA CTSB (αλληλουχία: Forward-GGACAUAGAUCUACCUGAATT και Reverse-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) για 48 ώρες ή επίπεδα πρωτεΐνης, και τα επίπεδα mRNA ανιχνεύθηκαν Ctsb και H2-k1. Κύτταρα HCT{10}} (1×106 /φρεάτιο) εμβολιάστηκαν σε τρυβλία 6-πηγαδιού για 6 ώρες, στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με παρεμβολή CTSB (αλληλουχία: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) ή πλασμίδιο υπερέκφρασης για 48 ώρες και το mRNA ή ανιχνεύθηκαν επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης CTSB και HLA-A.

Τεχνολογία σύνδεσης

Η τρισδιάστατη δομή του CTSB λήφθηκε από τη βάση δεδομένων πρωτεϊνών (PDB ID: 2iPP) και οι δομές του CAG λήφθηκαν από το PubChem. Η διαδικασία σύνδεσης πραγματοποιήθηκε στο Autodock 2 με χονδροειδή σύνδεση χρησιμοποιώντας έναν αλγόριθμο προσομοίωσης ανόπτησης και μια επακόλουθη βελτίωση χρησιμοποιώντας έναν γενετικό αλγόριθμο.

Δοκιμασία κυτταρικής θερμικής μετατόπισης

Τα κύτταρα MC38 σπάρθηκαν σε πλάκες 10cm όλη τη νύχτα και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CAG ή 0,1 τοις εκατό DMSO για άλλες 2 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με ψυχρό PBS και φυγοκεντρήθηκαν στα 180 g για 5 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια χωρίστηκαν ομοιόμορφα σε σωλήνες φυγοκέντρησης (70 μL κάθε σωληνάριο) και θερμάνθηκαν για 3 λεπτά στην ακόλουθη θερμοκρασία: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 και 67 βαθμούς, τα δείγματα ψύχθηκαν για 3 λεπτά σε θερμοκρασίες και στη συνέχεια διατηρήθηκε στον πάγο. Στη συνέχεια, τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε ψυγείο στους -80 βαθμούς όλη τη νύχτα. Τα δείγματα αποψύχθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά και στη συνέχεια ψύχθηκαν στους -80 βαθμούς για 4 ώρες. Τέλος, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στους 12, 000g για 25 λεπτά, το υπερκείμενο προστέθηκε στο ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης και αναλύθηκαν με στύπωμα Western.

Ανοσοϊστοχημική χρώση

Τομές παραφίνης ιστού όγκου βυθίστηκαν σε ξυλόλιο για 20 λεπτά για να αποκηρωθούν, και στη συνέχεια σε 100 τοις εκατό, 75 τοις εκατό και 50 τοις εκατό αιθανόλη για 10 λεπτά. Αφού οι φέτες υποβλήθηκαν σε επιδιόρθωση αντιγόνου με επισκευαστικό διάλυμα αντιγόνου κιτρικού νατρίου, το ενδογενές υπεροξείδιο του υδρογόνου απενεργοποιήθηκε με 3 τοις εκατό υπεροξείδιο του υδρογόνου. Μετά από αποκλεισμό με 5 τοις εκατό ορό κατσίκας για 1 ώρα, προστέθηκε το αντίσωμα αντι-Ki67 (1:200) και επωάστηκε όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Το σημασμένο με HRP αντι-ποντικού/κουνελιού πολυμερές (100 μL) προστέθηκε και τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά, ακολουθούμενα από 100 μL διαλύματος εργασίας DAB και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Μετά από 1 λεπτό χρώσης με αιματοξυλίνη, τα δείγματα πλύθηκαν σε 50 τοις εκατό, 75 τοις εκατό και 100 τοις εκατό αιθανόλη και ξυλόλιο για 5 λεπτά και χρησιμοποιήθηκε ουδέτερο κόμμι για τη σφράγιση του φιλμ. Το φιλμ παρατηρήθηκε και φωτογραφήθηκε με μικροσκόπιο.

Στατιστικόςανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism (V.8.0). Όλα τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ο μέσος όρος±SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Μια μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης που ακολουθήθηκε από το post hoc τεστ Dunnett χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των διαφορών όταν υπήρχαν περισσότερες από δύο ομάδες. Το Student's t-test χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων. Μια στατιστική σημασία ορίστηκε στο p<0.05.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Ανάλυση πολλαπλών ωμικών μονοκυττάρων του CAG που αναστέλλει την ανάπτυξη μεταμοσχευμένου καρκίνου του παχέος εντέρου σε ποντίκια

Για να διερευνήσουμε εάν το CAG έχει αντινεοπλασματική δράση, μεταμοσχεύσαμε πρώτα καρκινικά κύτταρα MC38 σε ποντίκια C57BL/6. Σημειώσαμε ότι η CAG ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη όγκων (διαδικτυακό συμπληρωματικό σχήμα S1A, B). Στη συνέχεια, μεταμοσχεύσαμε κύτταρα CT26 σε ποντίκια BALB/c και διαπιστώσαμε ότι το CAG ανέστειλε επίσης την ανάπτυξη όγκων (διαδικτυακό συμπληρωματικό σχήμα S1C, D).

Για να αποκαλύψουμε περαιτέρω τον συγκεκριμένο μηχανισμό με τον οποίο το CAG αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου, το αναλύσαμε χρησιμοποιώντας τις τεχνικές scRNA-seq και scATAC-seq (εικόνα 1Α). Χωρίσαμε τον κυτταρικό πληθυσμό σε τέσσερις ομάδες: καρκινικά κύτταρα, ινοβλάστες, μυελοειδή κύτταρα και λεμφοκύτταρα (εικόνα 1Β, διαδικτυακό συμπληρωματικό σχήμα S2A, B). Βρήκαμε ότι τα καρκινικά κύτταρα (52 τοις εκατό) και οι ινοβλάστες (41 τοις εκατό) διηθήθηκαν κυρίως σε ιστούς όγκου, ενώ τα κύτταρα του ανοσοποιητικού αντιστοιχούσαν μόνο στο 7 τοις εκατό. Στη συνέχεια χωρίσαμε τα καρκινικά κύτταρα σε οκτώ υποομάδες και τους ινοβλάστες σε τρεις υποομάδες (εικόνα 1C–E). Στη συνέχεια, η ανάλυση εμπλουτισμού γονιδίων υψηλής έκφρασης σε κάθε πληθυσμό κυττάρων έδειξε ότι οι μοριακές οδοί MHC-I στα καρκινικά κύτταρα εμπλουτίστηκαν, όπως και τα αντικαρκινικά σήματα των Τ κυττάρων και των κυττάρων ΝΚ (διαδικτυακό συμπληρωματικό σχήμα S2C). Στη συνέχεια, τέσσερις ομάδες κυττάρων βρέθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας ανάλυση ολοκλήρωσης scATAC-seq και scRNA-seq (εικόνα 2D–G). Μετά τη σύγκριση, βρήκαμε ότι καρκινικά κύτταρα (κύτταρα C01, C03), CD8 συν Τ κύτταρα, Spp1 συν κύτταρα TAM και ινοβλάστες (κύτταρα F01 και F02) εμφανίστηκαν στην αλληλουχία ATAC (εικόνα 1F, G) και περαιτέρω, σε υψηλή έκφραση παράγοντες μεταγραφής εμπλουτίστηκαν σε αυτά τα κύτταρα (εικόνα 1 Η). Μέσω αυτών των αναλύσεων, υποθέτουμε ότι η αναστολή της ανάπτυξης του όγκου από το CAG σχετίζεται στενά με τις αλλαγές σε αυτά τα κύτταρα.

Το Cag προάγει την παρουσίαση αντιγόνου των καρκινικών κυττάρων

Για να αναλύσουμε τον αντικαρκινικό μηχανισμό του CAG, αναλύσαμε πρώτα τον πληθυσμό των καρκινικών κυττάρων και χωρίσαμε τα καρκινικά κύτταρα σε οκτώ υποομάδες (εικόνα 2Α, Β, διαδικτυακό συμπληρωματικό σχήμα S3A). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, σε σύγκριση με την ομάδα PBS, τα κύτταρα της ομάδας C05 μειώθηκαν σημαντικά ενώ τα κύτταρα της ομάδας C07 αυξήθηκαν (εικόνα 2C). Εν τω μεταξύ, για να επαληθεύσουμε την ακρίβεια της ομαδοποίησης των καρκινικών κυττάρων μας, συγκρίναμε το CNV των λεμφοκυττάρων και των μυελοειδών κυττάρων ως κυττάρων αναφοράς. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CNV των καρκινικών κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερο από αυτό των κυττάρων του ανοσοποιητικού (διαδικτυακό συμπληρωματικό σχήμα S3B). Κατά την ανάλυση των υποομάδων καρκινικών κυττάρων, διαπιστώσαμε ότι τα γονίδια απόκρισης ιντερφερόνης Isg15, Irf7, Ifit3 και Ifi47 εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό στους πληθυσμούς κυττάρων C07 και C08 της ομάδας CAG σε σύγκριση με την ομάδα PBS (διαδικτυακό συμπληρωματικό σχήμα S3C). Η ανάλυση του πληθυσμού των καρκινικών κυττάρων διαπίστωσε ότι τα μονοπάτια που σχετίζονται με την παρουσίαση αντιγόνου εμπλουτίστηκαν σημαντικά σε πολλαπλούς κυτταρικούς πληθυσμούς. Ως εκ τούτου, εικάζουμε ότι η CAG μπορεί να προάγει την παρουσίαση αντιγόνου των καρκινικών κυττάρων για να παίξει έναν αντικαρκινικό ρόλο (εικόνα 2D). Στη συνέχεια, επιλέξαμε τα γονίδια που σχετίζονται με την παρουσίαση αντιγόνου και βρήκαμε ότι το επίπεδο έκφρασης στην ομάδα CAG ήταν σημαντικά υψηλότερο από αυτό στην ομάδα PBS (εικόνα 2Ε, διαδικτυακή συμπληρωματική εικόνα S3D). Βρήκαμε επίσης ότι το CAG προήγαγε την παρουσίαση αντιγόνου σε ιστούς όγκου (εικόνα 2F, G).

Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε scATAC-seq για να αναλύσουμε τους συγκεκριμένους λόγους πίσω από την παρουσίαση αντιγόνου καρκινικών κυττάρων που προάγουν το CAG. Βρήκαμε ότι ο πληθυσμός των καρκινικών κυττάρων εξέφραζε σε μεγάλο βαθμό τους μεταγραφικούς παράγοντες Fos, Junb, Jund, Fosb και Fosl1 (εικόνα 2Η, Ι). Στη συνέχεια, κατασκευάσαμε έναν χάρτη της αλληλεπίδρασης μεταξύ παραγόντων μεταγραφής και αντίστοιχων γονιδίων για να εξηγήσουμε ότι το CAG προώθησε την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με το αντιγόνο των κυττάρων όγκου (εικόνα 2J). Σε ιστούς όγκου, βρήκαμε επίσης ότι οι μεταγραφικοί παράγοντες Junb, Fos, Jund και Fosb υπερεκφράστηκαν σημαντικά στην ομάδα PBS υπό θεραπεία CAG (εικόνα 2K–N, διαδικτυακή συμπληρωματική εικόνα S3E-I). Μέχρι στιγμής, έχουμε βρει ότι το CAG μπορεί να προάγει την έκφραση μεταγραφικών παραγόντων γονιδίων που σχετίζονται με την παρουσίαση αντιγόνων, ενισχύοντας έτσι τη λειτουργία παρουσίασης αντιγόνου των καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, το πώς αυτά τα καρκινικά κύτταρα ανταποκρίνονται στις αποκρίσεις των ανοσοκυττάρων παραμένει ασαφές.

Για να αποκαλύψουμε το φαινόμενο με το οποίο το CAG προάγει την παρουσίαση αντιγόνου των καρκινικών κυττάρων, πραγματοποιήσαμε ανάλυση τροχιάς για να διερευνήσουμε πώς τα καρκινικά κύτταρα αλλοιώνονται μεταξύ τους ως απόκριση στις αποκρίσεις των ανοσοκυττάρων. Βρήκαμε ότι, με την πάροδο του χρόνου, τα καρκινικά κύτταρα C07 μετασχηματίστηκαν σε κύτταρα C05, C06 και C08 και ο εμπλουτισμός γονιδίων έδειξε επίσης ότι τα καρκινικά κύτταρα θα μετασχηματίζονταν σε παρουσίαση αντιγόνου (εικόνα 3Α-Ε).

Το CAG ενισχύει τη θανάτωση των κυττάρων του ανοσοποιητικού

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το CAG μπορεί να παρουσιάσει αντιγόνα καρκινικών κυττάρων, επομένως η ενίσχυση της παρουσίασης αντιγόνων καρκινικών κυττάρων θα οδηγήσει στην ενίσχυση της λειτουργίας των ανοσοκυττάρων; Για να το καταλάβουμε αυτό, αναλύσαμε τα λεμφοκύτταρα και τα μυελοειδή κύτταρα, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CAG προήγαγε τη διήθηση των CD8 συν Τ κυττάρων σε ιστούς όγκου και η διήθηση των CD8 συν Τ κυττάρων και των κυττάρων ΝΚ αυξήθηκε επίσης, ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής (διαδικτυακό συμπληρωματικό σχήμα S4A-F). Παρατηρήσαμε επίσης ότι το CAG ενίσχυσε την έκφραση των γονιδίων Ifitm2, Cxcr6 και S100a6 σε CD8 συν Τ κύτταρα,

Τα γονίδια Fcer1g, Gzmb, AW112010 και Zfp36i2 σε κύτταρα ΝΚ και γονίδια Nfkbia και Junb σε κύτταρα CD4 συν Τ (διαδικτυακό συμπληρωματικό σχήμα S4G). Η έκφραση των Ifng και Gzmb σε CD8 συν Τ κύτταρα ενισχύθηκε επίσης σημαντικά, όπως ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής (σε απευθείας σύνδεση συμπληρωματικό σχήμα S4H, I). Επιπλέον, βρήκαμε ότι μετά τη θεραπεία με CAG, η έκφραση των ανασταλτικών υποδοχέων Lag3, Tigit και Havcr2 στην επιφάνεια των CD8 συν Τ κυττάρων μειώθηκε και η έκφραση των γονιδίων Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5 και Pdcd1, που χαρακτηρίζουν τα η ενεργοποίηση των CD8 συν Τ κυττάρων, αυξήθηκε σημαντικά (διαδικτυακό συμπληρωματικό σχήμα S4J). Για να επαληθεύσουμε περαιτέρω ότι η CAG ενίσχυσε τη λειτουργία θανάτωσης των CD8 συν Τ κυττάρων προάγοντας ενισχυμένη παρουσίαση αντιγόνου όγκου, μεταμοσχεύσαμε κύτταρα CT26 σε μεταμοσχευμένους όγκους σε γυμνά ποντίκια και παρατηρήσαμε ότι η CAG δεν μπορούσε να αναστείλει αποτελεσματικά την ανάπτυξη όγκων (διαδικτυακό συμπληρωματικό σχήμα S4K-M ).

Μετά από αυτό, αναλύσαμε μυελοειδή κύτταρα και βρήκαμε ότι τα κύτταρα Spp1 συν TAM αυξήθηκαν μετά τη θεραπεία με CAG, ενώ ο αριθμός των κυττάρων C1qc συν TAM μειώθηκε και ο αριθμός των Il1b συν μονοκύτταρα αυξήθηκε (διαδικτυακό συμπληρωματικό σχήμα S5A-D). Μετά τη θεραπεία με CAG, τα κύτταρα Spp1 συν ΤΑΜ και C1qc συν ΤΑΜ ήταν πιο ευαίσθητα στον προφλεγμονώδη μετασχηματισμό ΤΑΜ. Η ανάλυση εμπλουτισμού διαπίστωσε ότι επικεντρώθηκε κυρίως στο Tnf-, Ifn-g, και στο μονοπάτι σηματοδότησης της φλεγμονώδους απόκρισης (διαδικτυακό συμπληρωματικό σχήμα S5E-H). Με βάση τα προαναφερθέντα αποτελέσματα, συμπεραίνουμε ότι η CAG ενισχύει τη λειτουργία αναγνώρισης και θανάτωσης των ανοσοκυττάρων προάγοντας την παρουσίαση αντιγόνου στα καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, ο τρόπος με τον οποίο ρυθμίζεται η CAG δεν είναι σαφής.

Ανακάλυψη της πρωτεΐνης στόχου CAG CTSB με παγίδα

Στη συνέχεια, θα διερευνήσουμε τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη στόχο CAG που παίζει αντικαρκινικό ρόλο. Επιλέξαμε τα καρκινικά κύτταρα ως αντικείμενο έρευνας επειδή διαπιστώσαμε ότι η CAG μπορεί να ενισχύσει την παρουσίαση αντιγόνου των καρκινικών κυττάρων, ενισχύοντας έτσι τη θανάτωση των κυττάρων του ανοσοποιητικού. Αρχικά συνθέσαμε το παράγωγο βιοτίνης του CAG και διαπιστώσαμε ότι μόνο το 3-ΟΗ μπορούσε να αντιδράσει (διαδικτυακό συμπληρωματικό σχήμα S6A). Στη συνέχεια, ερευνήσαμε εάν η CAG-βιοτίνη προάγει επίσης την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την παρουσίαση αντιγόνου στην κυτταρική σειρά όγκου ποντικού MC38. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η CAG-βιοτίνη δεν επηρέασε την έκφραση των γονιδίων H2-K1, Cd74 και Anxa1 (διαδικτυακό συμπληρωματικό σχήμα S6B-D).

Επομένως, χρησιμοποιήσαμε την προηγούμενη μέθοδο αναζήτησης στόχου TRAP στο εργαστήριο.32 CAG και DMSO επωάστηκαν και τα δύο με την κυτταρική σειρά MC38 (εικόνα 4Α). Επιλέξαμε την πρωτεΐνη με FC μεγαλύτερη ή ίση με 2 και ap Μικρότερη από ή ίση με 0.05 ως την υποψήφια πρωτεΐνη στόχο του CAG. Ακολουθώντας την αρχή ότι η δέσμευση μικρών μορίων με πρωτεΐνες θα οδηγήσει στη χαμηλή απόδοση σήμανσης της λυσίνης, επιλέξαμε το CTSB για τη μελέτη (εικόνα 4Β). Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία κυτταρικής θερμικής μετατόπισης (εικόνα 4C) και τη θερμοφόρηση σε μικροκλίμακα (MST) (εικόνα 4D) για να επαληθεύσουμε τη σύνδεση μεταξύ CAG και CTSB και βρήκαμε ότι η συγγένεια μεταξύ CAG και CTSB ήταν 26,6 nM (εικόνα 4D). Στη συνέχεια, προβλέψαμε τις θέσεις δέσμευσης μεταξύ CAG και CTSB σύμφωνα με την πρωτεϊνική κρυσταλλική δομή του CTSB στη βιβλιοθήκη PDB. Βρήκαμε ότι οι ομάδες υδροξυλίου και στα δύο άκρα του CAG και των θέσεων ALA77 και GLY198 του CTSB δεσμεύτηκαν με δεσμό υδρογόνου, ενώ οι θέσεις TYR75, PRO76 και ALA173 των CAG και CTSB δεσμεύτηκαν από τη δύναμη van der Waals (εικόνα 4Ε). . Για να επαληθεύσουμε τη θέση δέσμευσης μεταξύ CAG και CTSB, επιμολύναμε το μεταλλαγμένο πλασμίδιο του CTSB σε κύτταρα HCT-116. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η συγγένεια μεταξύ του μεταλλαγμένου πλασμιδίου σε A77V και G198A και CAG ήταν εκατοντάδες φορές υψηλότερη από αυτή του πλασμιδίου WT (εικόνα 4F, G). Στην επόμενη ενότητα, διερευνούμε τον συγκεκριμένο μηχανισμό με τον οποίο η CAG παίζει έναν αντικαρκινικό ρόλο μέσω του CTSB.

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】