Συνεργική ανοσία και προστασία σε ποντίκια με συν-ανοσοποίηση με εμβόλια DNA που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη Spike και άλλες δομικές πρωτεΐνες του SARS-CoV-2

Αφηρημένη:Η εμφάνιση νέων παραλλαγών του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου του κορωνοϊού 2 (SARS CoV-2) έχει προκαλέσει επαναλαμβανόμενες παγκόσμιες επιδημίες λοιμώξεων. Αυτές οι εξαιρετικά μεταλλαγμένες παραλλαγές μειώνουν την αποτελεσματικότητα των εμβολίων της τρέχουσας νόσου του κορωνοϊού 2019 (COVID-19), τα οποία έχουν σχεδιαστεί για να στοχεύουν μόνο την πρωτεΐνη ακίδας (S) του αρχικού ιού. Εκτός από το S του SARS-CoV-2, το ανοσοπροστατευτικό δυναμικό άλλων δομικών πρωτεϊνών (νουκλεοκαψίδιο, Ν, φάκελος, Ε, μεμβράνη, Μ) ως αντιγόνα στόχου εμβολίου είναι ακόμα ασαφές και αξίζει να διερευνηθεί. Σε αυτή τη μελέτη, αναπτύχθηκαν συνθετικά εμβόλια DNA που κωδικοποιούν τέσσερις δομικές πρωτεΐνες SARS-CoV-2 (pS, pN, pE και pM) και τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν με τρεις δόσεις μέσω ενδομυϊκής ένεσης και ηλεκτροπόρωσης. Συγκεκριμένα, η ταυτόχρονη ανοσοποίηση με δύο εμβόλια DNA που εξέφραζαν τις πρωτεΐνες S και N προκάλεσε υψηλότερα αντισώματα εξουδετέρωσης και ήταν πιο αποτελεσματική στη μείωση του ιικού φορτίου SARS-CoV{10}} σε σχέση με την πρωτεΐνη S μόνη στα ποντίκια. Επιπλέον, η συν-ανοσοποίηση pS είτε με pN είτε με pE + pM προκάλεσε υψηλότερη ειδική για την πρωτεΐνη S κυτταρική ανοσία μετά από τρεις ανοσοποιήσεις και προκάλεσε ηπιότερες ιστοπαθολογικές αλλαγές σε σχέση με το pS μόνο μετά την πρόκληση. Ο ρόλος των διατηρημένων δομικών πρωτεϊνών του SARS-CoV-2, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών N/E/M, θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω για τις εφαρμογές τους στο σχεδιασμό εμβολίων, όπως τα εμβόλια mRNA.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Λέξεις-κλειδιά: COVID-19; SARS-CoV-2}}; συν-ανοσοποίηση? Εμβόλιο DNA; πρωτεΐνη ακίδα? δομική πρωτεΐνη

1. Εισαγωγή

Το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο coronavirus 2 (SARS-CoV-2) είναι η αιτία της νόσου του κορωνοϊού 2019 (COVID-19), η οποία έχει προκαλέσει εκατομμύρια μολύνσεις και θανάτους παγκοσμίως και έχει θέσει σε κίνδυνο την ανθρώπινη υγεία και την παγκόσμια οικονομία . Αν και οι αποτελεσματικές θεραπευτικές προσεγγίσεις δεν είναι ακόμη διαθέσιμες, έχουν προχωρήσει γρήγορα, συμπεριλαμβανομένης της εφαρμογής της θεραπείας με κύτταρα CAR-T και της νανοτεχνολογίας [1,2]. Ο εμβολιασμός είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος ελέγχου της πανδημίας και αρκετά εμβόλια έχουν εγκριθεί για χρήση από διάφορους ρυθμιστικούς φορείς υγείας [3,4]. Το γονιδίωμα του κορωνοϊού κωδικοποιεί τέσσερις κύριες δομικές πρωτεΐνες, συγκεκριμένα, τις πρωτεΐνες της ακίδας (S), του νουκλεοκαψιδίου (Ν), της μεμβράνης (Μ) και του φακέλου (Ε), οι οποίες είναι υπεύθυνες για τη συγκρότηση του ιού και την καταστολή της ανοσοαπόκρισης του ξενιστή [5. ]. Η πρωτεΐνη S αποτελείται από 1273 υπολείμματα αμινοξέων που περιέχουν δύο υπομονάδες, συγκεκριμένα, S1 και S2. Μεσολαβεί στην είσοδο του ιού και αποτελεί σημαντικό στόχο για την ανάπτυξη εμβολίων κατά του κορωνοϊού [6–11]. Ωστόσο, η πρωτεΐνη SARS-CoV-2 S έχει υψηλή συχνότητα μετάλλαξης. Δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι στον SARS-CoV-2, έναν ιό RNA, η μετάλλαξη είναι συνεχής και αναπόφευκτη. Έχουν εμφανιστεί πέντε παραλλαγές ανησυχίας SARS-CoV-2 (VOC) από τον Σεπτέμβριο του 2020, συμπεριλαμβανομένων των B.1.1.7 (UK, Alpha), B.1.351 (Νότια Αφρική, Beta), P.1 (Βραζιλία, Gamma), B.1.617.2 (Ινδία, Δέλτα) και B.1.1.529 (Νότια Αφρική, Omicron) (Andreano and Rappuoli, 2021· Gupta, 2021). Όλα έχουν αρκετές μεταλλάξεις στην πρωτεΐνη ακίδας [12]. Αυτές οι παραλλαγές απειλούν την αποτελεσματικότητα των σημερινών εμβολίων για τον COVID-19, τα οποία έχουν σχεδιαστεί για να στοχεύουν μόνο την πρωτεΐνη ακίδας.

Η πρωτεΐνη Ν του SARS-CoV-2 δεσμεύεται στο ιικό RNA μέσω ενός 140-μήκους αμινοξέος-δεσμευτικού τομέα RNA στον πυρήνα του με τρόπο "σφαιρίδιο σε χορδή". Είναι σε μεγάλο βαθμό συντηρημένο μεταξύ των κοροναϊών, μοιράζοντας μια ταυτότητα ~90% αλληλουχίας με αυτή του SARS-CoV και είναι επίσης η μόνη δομική πρωτεΐνη μέσα στο ιοσωμάτιο [13]. Επιπλέον, παίζει σημαντικό ρόλο στη συσκευασία του ιικού RNA στο σύμπλεγμα του ριβονουκλεοκαψιδίου και είναι απαραίτητο για την αντιγραφή του ιικού RNA, τη συγκρότηση ιοσωμάτων και την απελευθέρωση από τα κύτταρα ξενιστές [14]. Με βάση την υψηλή ομοιότητα αλληλουχίας της πρωτεΐνης Ν στους κοροναϊούς, μπορεί να προταθεί ως στόχος εμβολίου διασταυρούμενης προστασίας. Βρήκαμε προηγουμένως ότι η συν-ανοσοποίηση με δύο εμβόλια DNA που εκφράζουν πρωτεΐνες Ε και Μ παρέχει μερική προστασία έναντι του SARS-CoV-2 και αυτή η μέθοδος θα πρέπει να ληφθεί υπόψη κατά την ανάπτυξη του εμβολίου [15]. Ανάλογα με το έγγραφο τοπίου από τον ΠΟΥ, υπάρχουν συνήθως επτά στρατηγικές για τα υποψήφια εμβόλια SARS-CoV-2, τα οποία μπορούν περαιτέρω να χωριστούν σε τρεις κατηγορίες: πρώτον, εμβόλια βασισμένα σε πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων των εμβολίων αδρανοποιημένου ιού, που μοιάζουν με ιούς σωματίδια και εμβόλια υπομονάδας πρωτεΐνης. Δεύτερον, τα εμβόλια που βασίζονται σε γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των εμβολίων που έχουν φορέα ιού, των εμβολίων DNA και των εμβολίων mRNA. Τρίτον, ένας συνδυασμός προσεγγίσεων που βασίζονται σε πρωτεΐνες και βασισμένες σε γονίδια, όπως τα εμβόλια ζωντανού εξασθενημένου ιού. Οι τεχνολογίες DNA, ως νέες στρατηγικές εμβολίων που βασίζονται σε γονίδια, μπορούν να συγκρίνουν γρήγορα πολλαπλά υποψήφια εμβόλια και στρατηγικές κατά τη διάρκεια προκλινικών δοκιμών [16,17]. Θεωρητικά, σχεδόν όλες οι ιικές πρωτεΐνες είναι πιθανά ανοσογόνα και στόχοι εμβολίων. Ωστόσο, από όσο γνωρίζουμε, η ανοσογονικότητα και το προστατευτικό δυναμικό των συνθετικών εμβολίων DNA στην κωδικοποίηση των πρωτεϊνών S SARS-CoV{-2 και άλλων δομικών πρωτεϊνών δεν έχει ακόμη αναφερθεί συστηματικά. Τέσσερα εμβόλια DNA που εκφράζουν πρωτεΐνες SARS-CoV-2 S, N, E και Ml αξιολογήθηκαν για την ανοσογονικότητα και την προστατευτική τους αποτελεσματικότητα σε ποντίκια για τη διερεύνηση των ανοσολογικών επιδράσεων του S σε συνδυασμό με άλλες δομικές πρωτεΐνες.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Κύτταρα

Τα κύτταρα Huh7.5 και τα κύτταρα ανθρώπινου εμβρυϊκού νεφρού 293T καλλιεργήθηκαν στους 37 ◦C σε υγρή ατμόσφαιρα σε 5% CO2 καθ' όλη τη διάρκεια της μελέτης. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM (HyClone, Logan, UT, USA), συμπληρωμένο με 10% FBS (GEMINI Co., Shanghai, Κίνα) και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Gibco, Νέα Υόρκη, ΝΥ, ΗΠΑ). Όλες οι κυτταρικές σειρές επιβεβαιώθηκαν αρνητικές για μόλυνση από μυκόπλασμα.

2.2. Κατασκευή εμβολίων DNA που κωδικοποιούν SARS-CoV-2 S/N/E/M

Το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη SARS-CoV-2 S/N, που περιέχει μια Ν-τερματική αλληλουχία Kozak (GCCACC) ακολουθούμενη από ένα κωδικόνιο έναρξης (ATG), συντέθηκε χρησιμοποιώντας ένα βελτιστοποιημένο για θηλαστικά κωδικόνιο (GenScript Co., Nanjing , Κίνα). Στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε στον φορέα έκφρασης pcDNA3.1 (+) μέσω πέψης EcoRI και XbaI και ονομάστηκε pS/pN (εμβόλια DNA) (Εικόνα 1Α). Η πρωτεΐνη pE/PM κατασκευάστηκε και αναγνωρίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Τα εμβόλια παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ Maxiprep χωρίς ενδοτοξίνες (Qiagen, Πεκίνο, Κίνα) και οι αλληλουχίες επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας αλληλουχία DNA Sanger. Η έκφραση της πρωτεΐνης S/N επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας στύπωμα western και αντι-S (Sino Biological, Beijing, Κίνα)/αντι-Ν αντισώματα αραιωμένα σε 1:1000. Αυτά τα πειράματα διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15,18].

Εικόνα 1. Σχεδιασμός και έκφραση κατασκευών εμβολίων πρωτεϊνών S/N που βασίζονται σε ανασυνδυασμένο DNA SARS-CoV-2. (Α) Σχηματικό διάγραμμα των εμβολίων που βασίζονται σε ανασυνδυασμένο DNA που κωδικοποιούν πρωτεΐνες SARS-CoV-2 spike (PS), νουκλεοκαψίδιο (pN), φακέλου (pE) και/ή μεμβρανών (PM). (Β) Η έκφραση της πρωτεΐνης στόχου σε εμβόλια DNA επικυρώθηκε μέσω της ανάλυσης στυπώματος western κυττάρων 293Τ που επιμολύνθηκαν με τα πλασμίδια pS/pN/pE/pM.

2.3. Ανοσοποίηση και πρόκληση

Θηλυκά ποντίκια BALB/c (Charles River Laboratories, Γαλλία) ηλικίας 6 εβδομάδων στεγάστηκαν στο Εθνικό Ινστιτούτο Επαγγελματικής Υγείας και Ελέγχου Δηλητηριάσεων σε περιβάλλον 21 ◦C και ελεγχόμενη υγρασία με κύκλους φωτός/σκότους 12 ωρών. Εν τω μεταξύ, παρέχεται τροφή και νερό κατά βούληση και όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Πειραμάτων σε Ζώα του Κινεζικού Κέντρου Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (Κίνα CDC). Η έρευνα συμμορφώθηκε με τους σχετικούς κανόνες δεοντολογίας.

Τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε πέντε ομάδες και ανοσοποιήθηκαν μόνο με pS/pN ή συν-ανοσοποιήθηκαν με pS + pN ή pS + pE + PM τις ημέρες 0, 21 και 42 μέσω ενδομυϊκής ένεσης συν ηλεκτροπόρωση (35 mg/50 mL) (Εικόνα 2) [19,20]. Εν συντομία, εμβόλια DNA εγχύθηκαν στον πρόσθιο κνημιαίο μύ (ΤΑ) και δέχθηκαν αμέσως ηλεκτρισμό χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρόδιο διάταξης δύο βελονών με απόσταση 5 mm (ECM830, BTX) με βελόνες. Οι οροί από τα ποντίκια συλλέχθηκαν για ανάλυση χυμικής ανοσοαπόκρισης και οι σπλήνες ποντικών υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για να μετρηθεί η κυτταρική ανοσοαπόκριση (Εικόνα 2).

Εικόνα 2. Σχηματική της πρόκλησης ανοσοποίησης και SARS-CoV-2. Χρονική πορεία εμβολιασμού, πρόκληση και δειγματοληψία αίματος/ιστού. Τα ποντίκια BALB/C χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες.

Πειράματα πρόκλησης SARS-CoV-2 διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15,21]. Εν συντομία, τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν και στη συνέχεια μετατράπηκαν ενδορινικά με 2,5 × 108 PFU Ad5-hACE2 σε συνολικό όγκο 45 μL. Πέντε ημέρες μετά τη μεταγωγή, τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν και στη συνέχεια προκλήθηκαν ενδορινικά με 1 × 105 TCID50 SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC HB-02/2019) σε συνολικό όγκο 50 µL αλατούχου ορού ρυθμιστής. Όλη η εργασία με ζωντανό SARS-CoV-2 σε μοντέλα ποντικιών πραγματοποιήθηκε σε εργαστήρια Βιοασφάλειας Ζώων Επιπέδου 3 (ABSL-3).

2.4. Ενζυμική Ανοσοροφητική Δοκιμασία

Οι συνδεδεμένες με ένζυμα ανοσοπροσροφητικές δοκιμασίες (ELISA) διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Εν συντομία, S (αγορασμένα από Sino Biological)/Ν πρωτεΐνες (δώρο από την Song) αραιωμένες σε ανθρακικό ρυθμιστικό διάλυμα (0.1 Μ, pH 9,6) επικαλύφθηκαν σε πλάκες EIA/RIA {{6}φρεατίου (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 ◦C. Οι πλάκες μπλοκαρίστηκαν με 200 μL ορού κατσίκας 10% σε PBS στους 37 ◦C για 2 ώρες, ακολουθούμενο από πλύση πέντε φορές με PBST. Στη συνέχεια, δείγματα ορού αραιωμένα σειριακά σε ορό κατσίκας 2% σε PBS προστέθηκαν και επωάστηκαν για 2 ώρες στους 37 ◦C, ακολουθούμενα από πέντε πλύσεις με PBST. Προστέθηκε συζευγμένο με HRP κατσίκα αντι-ποντικού IgG Ab (1:5000) στους 37 ◦C για 1 ώρα. Προστέθηκαν συνολικά 100 μL υποστρώματος ΤΜΒ σε κάθε φρεάτιο και σβήστηκαν με 50 μL 2Μ H2SO4. Η απορρόφηση διαβάστηκε σε μήκος κύματος 450 nm χρησιμοποιώντας SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Χονγκ Κονγκ, Κίνα).

φυτικό κιστανάκι που ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Πειράματα μόλυνσης και εξουδετέρωσης ψευδοϊών

Η δοκιμασία εξουδετέρωσης ψευδοϊού πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21,22]. Ένα πλασμίδιο που εκφράζει την πρωτεΐνη S του προγονικού ιού κατασκευάστηκε προηγουμένως [22]. Συντέθηκε το γονίδιο πρωτεΐνης ακίδας παραλλαγής SARS-CoV-2 Omicron (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) (δώρο από τη Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, Κίνα) χρησιμοποιώντας ένα βελτιστοποιημένο για θηλαστικά κωδικόνιο και κλωνοποιημένο στον φορέα pcDNA3.1, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία, πλασμίδια που εκφράζουν έναν ανταποκριτή λουσιφεράσης και πλασμίδια που εκφράζουν την πρωτεΐνη S συν-μορφομετατράπηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ 293Τ χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο επιμόλυνσης DNA GENE X-treme HP. Η κυτταρική καλλιέργεια ανανεώθηκε 6 ώρες μετά τη διαμόλυνση και το υπερκείμενο που περιείχε ψευδοϊό συλλέχτηκε μετά από 48 ώρες και αποθηκεύτηκε στους -70 ◦C. Στη δοκιμασία εξουδετέρωσης ψευδοϊού, ένα ίσο μείγμα ορού-ιού στη συνέχεια επωάστηκε σε 37 όγκους του υπερκειμένου που περιέχει ψευδοϊό και στη συνέχεια προστέθηκε στον αραιωμένο ορό. ◦C για 1 ώρα. Τα μέσα καλλιέργειας κυττάρων Huh7.5 στη συνέχεια αντικαταστάθηκαν με 100 µL του μείγματος ορού-ιού και επωάστηκαν στους 37 ◦C για 12 ώρες. Κύτταρα που καλλιεργήθηκαν μόνο με ψευδοϊούς SARS-CoV-2 εκτελέστηκαν παράλληλα. Τα μέσα αντικαταστάθηκαν στη συνέχεια με DMEM (2% FBS) και η επώαση επωάστηκε στους 37 ◦C για 48 ώρες. Στη συνέχεια, το σήμα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ λουσιφεράσης πυγολαμπίδας Bright-Glo (Promega).

2.6. Δοκιμασία εξουδετέρωσης SARS-CoV-2

Ο SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019) χρησιμοποιήθηκε σε αυτό το πείραμα. Εν συντομία, οι οροί αραιώθηκαν δύο φορές από μια αρχική αραίωση 1:10, αναμίχθηκαν με ίσο όγκο (10–15 pfu/πηγάδι) ζωντανού SARS-CoV-2 και επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 ◦C, μετά από την οποία προστέθηκαν στα σπαρμένα κύτταρα Vero. Μετά από επώαση στους 37 ◦C για 48 ώρες, παρατηρήθηκε ένα κυτταροπαθητικό αποτέλεσμα (CPE) και συλλέχθηκαν 100 μL του υπερκειμένου της καλλιέργειας για εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος και PCR αντίστροφης μεταγραφής φθορισμού σε πραγματικό χρόνο (RT-PCR). Η μέση δόση εξουδετέρωσης (ND50) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Reed-Munch [15].

2.7. Δοκιμασία IFN-ELISpot

Οι δεξαμενές πεπτιδίων που καλύπτουν ολόκληρη την πρωτεΐνη S/N/E/M ως διαδοχικά 15-μερή που επικαλύπτονται από 10 αμινοξέα συντέθηκαν από την Scilight Biotechnology, LLC. Περίπου 2,5 mg από κάθε καθαρισμένο πεπτίδιο στη δεξαμενή πεπτιδίων υπήρχαν ανά φιαλίδιο. Το πείραμα διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Εν συντομία, 96-πλάκες φρεατίων (BD ELISPOT Set, USA) επικαλύφθηκαν με Ab anti-IFN-σύλληψης και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ◦C. Οι πλάκες μπλοκαρίστηκαν με το πλήρες μέσο καλλιέργειας μετά από πλύση τρεις φορές. Τα σπληνοκύτταρα συλλέχθηκαν αφού τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία τις ημέρες 35 και 120 φρέσκα εναιωρήματα μονοκυττάρων από κάθε ομάδα επιστρώθηκαν στα 5 χ 106 ανά φρεάτιο και προστέθηκαν πεπτίδια. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37◦C σε 5% CO2 για 22 ώρες και ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλακών ELISpot (Biosys, So. Pasadena, CA, USA). Μια μονάδα σχηματισμού κηλίδων (SFU) αντιπροσωπεύει μια IFN- που εκκρίνει κύτταρα Τ.

2.8. Πρόκληση αξιολόγησης προστασίας σε ποντίκια μετά τον SARS-CoV-2

Τα πειράματα διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15,21]. Εν συντομία, οι πνεύμονες συλλέχθηκαν μετά την ευθανασία των ποντικών. Οι μισοί από τους ιστούς χρησιμοποιήθηκαν για εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος, RT-PCR φθορισμού σε πραγματικό χρόνο και TCID50. Το άλλο μισό στάλθηκε στο College of Veterinary Medicine, China Agricultural University για παθολογική αξιολόγηση.

2.9. Στατιστική ανάλυση

Οι μη ζευγαρωμένες δοκιμές t, οι δοκιμές ANOVA δύο κατευθύνσεων και η δοκιμή πολλαπλών συγκρίσεων του Dunnett πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC). p-τιμές < 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p < 0,001, **** p < 0,0001).

3. Αποτελέσματα

3.1. Χαρακτηρισμός Εμβολίων DNA

Τα επίπεδα πρωτεΐνης Ε και Μ ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας στύπωμα western. Μετρήσαμε την έκφραση των κωδικοποιούμενων πρωτεϊνών S/N/E/M του SARS-CoV-2 σε κύτταρα HEK-293Τ επιμολυσμένα με πλασμίδια pS/pN/pE/pM μέσω ανάλυσης western blot, χρησιμοποιώντας αντι -S/anti-N αντισώματα και ένα anti-6 x αντίσωμα His, στα κυτταρολύματα. Οι ζώνες προσέγγισαν το προβλεπόμενο μοριακό βάρος των πρωτεϊνών S (140-142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) και M (22-25 kDa) (Εικόνα 1Β).

3.2. Ισχυρή και παρατεταμένη παραγωγή Anti-S και/ή anti-N IgG που προκαλείται από pS και/ή pN DNA

Εμβόλια Ο ορός συλλέχθηκε από ποντικούς BALB/c στις 35, 56, 96 και 120 ημέρες (Εικόνα 2). Τα επίπεδα Anti S/anti-N IgG ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ELISA. Το μέγεθος της S- ή N-ειδικής απόκρισης IgG που προκαλείται από το pS ή το pN αυξήθηκε στον ορό μετά την πρώτη και τη δεύτερη ενίσχυση. Οι τίτλοι αντι-S και αντι-Ν IgG ήταν υψηλότεροι στην ομάδα pS + pN από ό,τι στις άλλες ομάδες. Ωστόσο, η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Εικόνα 3Α, Β). Δεν ανιχνεύθηκαν ισχυρές αποκρίσεις αντισώματος ειδικά για την πρωτεΐνη E/M, κάτι που είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα προηγούμενης μελέτης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) [15].

Εικόνα 3. Αποκρίσεις Β-κυττάρων στον SARS-CoV-2 σε ποντίκια BALB/c. (Α) Τίτλοι τελικού σημείου δέσμευσης IgG ορού για τις πρωτεΐνες SARS-CoV-2 S (A) και N (Β). (Γ) Οι τίτλοι εξουδετέρωσης προσδιορίστηκαν με βάση ένα σύστημα ψευδοτυπικού ιού SARS-CoV-2. (Δ) Οι τίτλοι εξουδετέρωσης κατά του SARS-CoV-2 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας έναν ιό SARS-CoV-2. (Ε) Δοκιμασία εξουδετέρωσης βασισμένη σε σύστημα ψευδοτυπικού ιού SARS-CoV{15}} Omicron. Εμφανίζονται οι αναλογίες αναστολής για τους ορούς από τις εικονικές (μπλε), pS (κόκκινο), pS + pN (πράσινο), pS + pE + pM (ροζ) και pN (πορτοκαλί). Οι ράβδοι σφαλμάτων αντιπροσωπεύουν το SEM και οι τιμές p υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας μια αμφίδρομη ANOVA και την ανάλυση post hoc του Sidak, όπου * p < 0.05

3.3. Υψηλά επίπεδα εξουδετερωτικών αντισωμάτων που προκαλούνται από συν-ανοσοποίηση με εμβόλια pS και pN

Οι τίτλοι εξουδετέρωσης των σειριακά αραιωμένων δειγμάτων ορού προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τον ψευδότυπο ιό SARS-CoV-2. Τα υψηλότερα επίπεδα εξουδετερωτικών αντισωμάτων (nAbs) παρατηρήθηκαν στην ομάδα pS + pN, με τους αμοιβαίους γεωμετρικούς μέσους τίτλους EC50 να φτάνουν τους 2988 (την ημέρα 35) και τους 3578 (την ημέρα 56) (Εικόνα 3C). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία μικροεξουδετέρωσης ζωντανού ιού (MN), όπου τα επίπεδα των nAbs στην ομάδα pS + pN ήταν υψηλότερα από εκείνα στην ομάδα S τις ημέρες 56 και 96 (p < 0}.05· Εικόνα 3D). Επιπλέον, τα επίπεδα των nAbs στην ομάδα pS + pN την ημέρα 56 (δεύτερη ενίσχυση) ήταν σημαντικά υψηλότερα από εκείνα την ημέρα 35 (ρ < 0,05, Εικόνα 3D).

Η δραστηριότητα εξουδετέρωσης κάθε σχήματος εμβολίου κατά της παραλλαγής SARS-CoV-2 Omicron προσδιορίστηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας την ψευδοτυποποιημένη πλατφόρμα και δείγματα ορού. Το προφίλ εξουδετέρωσης έναντι του ιού Omicron τις ημέρες 35 και 56 ήταν παρόμοιο με αυτό έναντι του προγονικού ιού (Εικόνα 3Ε), υποδηλώνοντας ότι η θεραπεία PS + pN είχε διασταυρούμενη εξουδετερωτική ισχύ.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

3.4. Αποκρίσεις Τ-κυττάρων που προκαλούνται από εμβολιασμό DNA

Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, οι αποκρίσεις των Τ-κυττάρων έναντι των αντιγόνων SARS-CoV-2 S/N/E/M εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας το IFN-ELISpot, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Όπως αναμενόταν, τόσο τα σχήματα PS + pN όσο και pS + pE + pM προκάλεσαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα IFN + Τ κυττάρων ειδικά για την πρωτεΐνη S την ημέρα 120 από ό,τι την ημέρα 35 (p < 0. 05· Εικόνα 4Α). Επιπλέον, ο αριθμός των IFN + Τ κυττάρων ειδικών για την πρωτεΐνη Ν την ημέρα 120 (δεύτερη ενίσχυση) ήταν σημαντικά υψηλότερος από εκείνον την ημέρα 35 στην ομάδα pS + pN (ρ < 0,05, Εικόνα 4Β). Τέλος, ο αριθμός των IFN + Τ κυττάρων ειδικών για την πρωτεΐνη Μ την ημέρα 120 (δεύτερη ενίσχυση) ήταν σημαντικά υψηλότερος από εκείνον την ημέρα 35 και στις δύο ομάδες (ρ < 0,05, Εικόνα 4D).

Εικόνα 4. Αποκρίσεις Τ κυττάρων σε μεμονωμένες δομικές πρωτεΐνες SARS-CoV-2 σε ποντικούς BALB/c. (Α) Οι αποκρίσεις των Τ-κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας IFN-ELISpot σε σπληνοκύτταρα διεγερμένα για 20 ώρες με επικαλυπτόμενες δεξαμενές πεπτιδίων που εκτείνονται στο SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, και (Δ) πρωτεΐνες Μ. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια αμφίδρομη ANOVA και τη δοκιμασία post hoc του Sidak, όπου * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,01 και **** p < 0,0001.

3.5. Συνεργική προστασία που προκαλείται από συν-ανοσοποίηση με pS/pN ή pS/pE/pM

Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε την προστατευτική αποτελεσματικότητα των εμβολίων DNA χρησιμοποιώντας ποντίκια hACE2 ανοσοποιημένα μετά την πρόκληση με τον προγονικό ιό SARS-CoV-2. Μετά την πρόκληση, τα ποντίκια της εικονικής ομάδας παρουσίασαν σταδιακή απώλεια βάρους. Αντίθετα, τα ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν είτε με pS είτε με pS+ εμφάνισαν ήπια απώλεια βάρους αμέσως μετά τη μόλυνση, ακολουθούμενη από ανάρρωση (Εικόνα 5Α). Δεν ανιχνεύθηκε ζωντανός ιός στα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με pS, pS + pN ή pS + pE + pM. Επιπλέον, ο εμβολιασμός pS + pN μείωσε σημαντικά τους αριθμούς αντιγράφων ιικού RNA σε σύγκριση με αυτούς που ελήφθησαν μόνο με τον εμβολιασμό pS (ρ=0.0228· Εικόνα 5Β). Επιπλέον, η ιστοπαθολογία του πνεύμονα έδειξε ότι τα ποντίκια και στις δύο ομάδες ψευδών και pN εμφάνισαν εστιακές κηλίδες φλεγμονής, υπεζωκοτική διήθηση, κυψελιδική κατάρρευση, υψηλά επίπεδα διήθησης φλεγμονωδών κυττάρων και αιμορραγικές περιοχές. Σε σύγκριση, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία είτε με pS + pN είτε με pS + pE + pM εμφάνισαν ηπιότερες ιστοπαθολογικές αλλαγές και χαμηλότερες βαθμολογίες INHAND μετά την πρόκληση από την άλλη ομάδα (Εικόνα 5C).

Εικόνα 5. Προστατευτική αποτελεσματικότητα της ανοσοποίησης μετά την πρόκληση με ζωντανό ιό SARS-CoV-2. (Α) Τα ποντίκια ζυγίζονταν καθημερινά (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM), n=4) για τρεις ημέρες μετά την πρόκληση. (Β) Τίτλος λοιμώδους SARS-CoV-2 σε ομογενοποιήματα πνεύμονα την τρίτη ημέρα μετά την πρόκληση, όπως προσδιορίστηκε μέσω της ανάλυσης TCID5{{1{0}} και του αριθμού αντιγράφου RNA. Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από διόρθωση πολλαπλής σύγκρισης του Dunnett (* p < 0.05, ** p <0,01, *** p < 0,001 και **** p < 0,0001). (Γ) Ιστοπαθολογική ανάλυση πνεύμονα με χρήση χρώσης Η&Ε.

4. Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, η ταυτόχρονη ανοσοποίηση με δύο εμβόλια DNA που εκφράζουν τις πρωτεΐνες S και N προκάλεσε υψηλά επίπεδα nAbs και ήταν εξαιρετικά αποτελεσματική στη μείωση του ιικού φορτίου SARS-CoV-2 σε ποντίκια. Τα εμβόλια DNA που εκφράζουν την πρωτεΐνη S προκάλεσαν αυξημένα επίπεδα κυτταρικής ανοσίας ειδικά για την πρωτεΐνη S μετά από τρεις ανοσοποιήσεις όταν τα ποντίκια συν-ανοσοποιήθηκαν με πρωτεΐνες N/E και M και ανακούφισαν τις ιστοπαθολογικές αλλαγές μετά την πρόκληση. Από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη αναφορά που αποκαλύπτει τη συνεργική ενίσχυση της ανοσίας και της προστασίας σε ποντίκια χρησιμοποιώντας εμβόλιο DNA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη S όταν συν-ανοσοποιούνται με εμβόλια DNA που κωδικοποιούν άλλες δομικές πρωτεΐνες του SARS-CoV{{8 }}.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Ανοσοκυρίαρχοι επίτοποι Β-κυττάρων σε περιοχές Ν αντιγόνου έχουν παρατηρηθεί σε αρκετές μελέτες. Τα εμβόλια με βάση το Ν συνήθως δεν μπορούν να επάγουν nAbs, πιθανότατα επειδή η πρωτεΐνη Ν δεν εμφανίζεται στην επιφάνεια του ιού. Συγκεκριμένα, η ταυτόχρονη ανοσοποίηση με τις πρωτεΐνες S και N προκάλεσε υψηλότερα επίπεδα nAbs έναντι του προγονικού ιού και του ιού Omicron SARS-CoV-2 από τις άλλες ομάδες. Οι αυξημένες αποκρίσεις nAb σχετίζονται με καλύτερη ιική κάθαρση και προστατευτική αποτελεσματικότητα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η θεραπεία pS + pN ήταν πιο αποτελεσματική από τη θεραπεία pS μόνη της στη μείωση του ιικού φορτίου SARS-CoV-2 μετά την πρόκληση. Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι τα χάμστερ που ανοσοποιήθηκαν με ένα εμβόλιο που συνεκφράζει τις πρωτεΐνες Μ και Ν προστατεύονταν από σοβαρή απώλεια βάρους και παθολογία των πνευμόνων και είχαν σημαντικά μειωμένους τίτλους ιών στον στοματοφάρυγγα και τους πνεύμονες μετά την πρόκληση SARS-CoV-2. η οποία είναι συνεπής με τα αποτελέσματά μας [23]. Δυστυχώς, η μείωση στους τίτλους του ιού δεν μπορεί να αποδοθεί ειδικά στην πρωτεΐνη Μ ή Ν και τα επίπεδα nAb δεν αξιολογήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Μια μελέτη εμβολίου mRNA SARS-CoV-2 ανέφερε ότι η συν-ανοσοποίηση S + N προκάλεσε αυξημένη απόκριση των Τ-κυττάρων CD{19}} ειδικών για S και εξουδετερώνοντας τη δραστηριότητα αντισωμάτων, παρέχοντας καλύτερη προστασία στους πνεύμονες έναντι του Δέλτα παραλλαγή σε σύγκριση με το S μόνο, κάτι που συνάδει με τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης [24]. Μια άλλη μελέτη ανέφερε ότι η πρωτεΐνη Ν του κορωνοϊού μεταδοτικής γαστρεντερίτιδας προώθησε τη σύνθεση εξουδετερωτικών αντισωμάτων όταν τα κύτταρα TGEV-IMMUNE των χοίρων διεγέρθηκαν με συνδυασμό πρωτεϊνών S και N in vitro, και αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να εξηγηθεί από την απόκριση των βοηθητικών Τ-λεμφοκυττάρων σε την πρωτεΐνη Ν [25].

Ανοσοκυρίαρχοι επίτοποι Τ-λεμφοκυττάρων CD{4+/CD8+ σε περιοχές Ν-αντιγόνου έχουν αναγνωριστεί προηγουμένως. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα εμβόλια που βασίζονται στην πρωτεΐνη SARS-CoV-2 N επάγουν αποτελεσματικά κυτταρικές ανοσοαποκρίσεις. Η ομάδα S + N έδειξε αυξημένα επίπεδα κυτταρικής ανοσίας ειδικά για την πρωτεΐνη S μετά από τρεις ανοσοποιήσεις. Μια μελέτη εμβολίου mRNA SARS-CoV-2 ανέφερε ότι το συνδυαστικό S + N προκάλεσε μια αυξημένη απόκριση των CD{12}} Τ-κυττάρων ειδικά για S σε σύγκριση με το S μόνο, κάτι που είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματά μας [24]. Μια άλλη μελέτη ανέφερε ότι οι αποκρίσεις των Τ-κυττάρων στα αντιγόνα S και N μετά από τον πρώτο εμβολιασμό hAd5 S + N με διπλό αντιγόνο ήταν ισοδύναμες με αυτές από ασθενείς που είχαν μολυνθεί προηγουμένως από SARS-CoV-2- και σε μοντέλα πρόβλεψης πυριτίου Τ-κυττάρων Η δέσμευση του επιτόπου HLA πρότεινε ότι οι αποκρίσεις των Τ-κυττάρων στο εμβόλιο hAd5 S + N θα διατηρήσουν την αποτελεσματικότητά τους έναντι της παραλλαγής B.1.351. Επιπλέον, το πλάσμα από ασθενείς που είχαν μολυνθεί προηγουμένως με SARS-CoV-2-εμφάνισε υψηλότερη συγγένεια δέσμευσης σε κύτταρα που εκφράζουν το κατασκεύασμα διπλού αντιγόνου S-Fusion + N-ETSD παρά μόνο στο hAd5 S-Fusion, υποδηλώνοντας περαιτέρω ότι η ανοσογονικότητα του Το εμβόλιο διπλού αντιγόνου S + N είναι καλύτερο από αυτό του εμβολίου μονού αντιγόνου S [26].

Ο ζωντανός ιός δεν ανιχνεύθηκε στους πνεύμονες και η απώλεια βάρους μετά την πρόκληση μετριάστηκε στις ομάδες pS, pS + pN και pS + pE + pM, ενώ η θεραπεία με pN δεν μείωσε αποτελεσματικά τον τίτλο του ιού. Αυτά τα ευρήματα υπογραμμίζουν την αναγκαιότητα και την αποτελεσματικότητα της πρωτεΐνης S ως στόχου εμβολίου. Σημειωτέον, η συν-ανοσοποίηση με pS και pN είχε καλύτερα αποτελέσματα από το pS ή το pN στην κάθαρση του ιού. Η ομάδα pS + pE + pM έδειξε λιγότερες ιστοπαθολογικές αλλαγές στους πνεύμονες, κάτι που είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα της προηγούμενης μελέτης μας [15]. Η ομάδα S + N είχε χαμηλά αντίγραφα ιικού RNA στον πνεύμονα, μειωμένη απώλεια βάρους και γρήγορο χρόνο ανάρρωσης μετά τον SARS-CoV-2 σε σύγκριση με την ομάδα που ανοσοποιήθηκε μόνο με S/N, κάτι που ήταν σύμφωνο με αποτελέσματα αυτής της μελέτης. Ωστόσο, καμία από τις ομάδες δεν ανίχνευσε τους τίτλους εξουδετερωτικών αντισωμάτων, κάτι που μπορεί να εξηγηθεί από διαφορές στην ποικιλία των εμβολίων και στα πειραματόζωα [26]. Μια μελέτη εμβολίου με φορέα αδενοϊού SARS-CoV-2 ανέφερε ότι το εμβόλιο S παρείχε οξεία εγκεφαλική προστασία μόνο όταν συν-ανοσοποιήθηκε με ένα εμβόλιο Ν [27]. Μια άλλη μελέτη ανέπτυξε εμβόλια Tri: ChAd, Bi: ChAd και Mono: ChAd που εκφράζουν τις πρωτεΐνες S1/N/RdRp, N/RdRp και S1, αντίστοιχα, και τα εξέτασε σε ένα ζωικό μοντέλο B.1.351. Εκτεταμένη βαριά παθολογία παρατηρήθηκε στους πνεύμονες Mono: ChAdlungs, ενώ οι πνεύμονες Bi: ChAd και Tri: ChAd εμφανίστηκαν σχεδόν απαλλαγμένοι από αυτήν την παθολογία [28].

Επιπλέον, τα μη εμβολιασμένα ζώα είχαν υψηλά ιικά φορτία στους πνεύμονες, ενώ η θεραπεία Tri: ChAd μείωσε σημαντικά τα ιικά φορτία κατά 3,5 log. Συγκριτικά, και τα δύο εμβόλια Bi: ChAd και Mono: ChAd μείωσαν μόνο μέτρια το ιικό φορτίο. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η προστατευτική επίδραση του εμβολίου διπλού αντιγόνου S/N έναντι των παραλλαγών μπορεί να είναι καλύτερη από εκείνη του εμβολίου μονού αντιγόνου S, κάτι που είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματά μας [28]. Μερικές μελέτες έχουν αναφέρει ότι ποντίκια ανοσοποιημένα με πρωτεΐνη Ν αναπτύσσουν σοβαρή φλεγμονή των πνευμόνων μετά από μόλυνση από SARS-CoV [29-31]. Προηγούμενες μελέτες έχουν επίσης αναφέρει ότι η ανοσοποίηση με εμβόλιο φορέα αδενοϊού που εκφράζει την πρωτεΐνη Ν του ιού της ηπατίτιδας ποντικών προστατεύει τα ποντίκια από θανατηφόρα μόλυνση, γεγονός που δείχνει ότι η πρωτεΐνη Ν θα μπορούσε να δημιουργήσει προστατευτική δράση [32]. Επιπλέον, η ομάδα που ανοσοποιήθηκε με το εμβόλιο CRT/N DNA είχε σημαντικά μειωμένο τίτλο ιού μετά την πρόκληση, με έναν ιό δαμαλίτιδας που εκφράζει την πρωτεΐνη SARS-CoV N [33].

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Μια μελέτη για την πρωτεΐνη S έδειξε ότι το συνδυασμένο εμβόλιο DNA/πρωτεΐνης επήγαγε τόσο χυμική όσο και κυτταρική ανοσία καλύτερα από το εμβόλιο DNA/πρωτεΐνη μόνο [8]. Τα εμβόλια που στοχεύουν μόνο την πρωτεΐνη S έχουν επιδείξει μειωμένη αποτελεσματικότητα στην προστασία από ήπιο έως μέτριο COVID-19 που προκαλείται από αναδυόμενες παραλλαγές. Οι ρόλοι των διατηρημένων δομικών πρωτεϊνών SARS-CoV-2, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών N/E/M, είναι άξιοι προσοχής στο σχεδιασμό και τις εφαρμογές των εμβολίων, καθώς οι αποκρίσεις των Τ-κυττάρων που προκαλούνται από το εμβόλιο έναντι των διατηρημένων επιτόπων γενικά δεν επηρεάζονται από μεταλλάξεις . Μια μελέτη ανέφερε ότι ασθενείς που αναρρώθηκαν από SARS (n=23) εξακολουθούσαν να έχουν μακροχρόνια Τ-λεμφοκύτταρα μνήμης που αντιδρούν στην πρωτεΐνη SARS-CoV N 17 χρόνια μετά το ξέσπασμα του 2003, η οποία εμφάνισε ισχυρή διασταυρούμενη αντιδραστικότητα στον SARS CoV {15}} πρωτεΐνη Ν, επικυρώνοντας περαιτέρω τη χρήση της πρωτεΐνης Ν ως στόχο διασταυρούμενης προστασίας του εμβολίου [34]. Αυτή η μελέτη έδειξε ότι η συν-ανοσοποίηση pS/pN συσχετίστηκε με υψηλότερες αποκρίσεις nAb, καλύτερη κάθαρση του ιού και βελτιωμένες κυτταρικές ανοσολογικές αποκρίσεις και μπορεί να παρέχει καλύτερη προστασία μετά την πρόκληση SARS-CoV-2 σε σύγκριση με το pS μόνο. Επιπλέον, οι παραλλαγές του SARS-CoV-2 έχει αποδειχθεί ότι μολύνουν πολλά είδη ζώων και έχει παρατηρηθεί μετάδοση από άνθρωπο σε ζώο σε ορισμένα άγρια ​​ζώα και κατοικίδια [7]. Επομένως, το κτηνιατρικό εμβόλιο SARS-CoV-2 χρειάζεται περισσότερη προσοχή. Επιπλέον, η νανοτεχνολογία μπορεί να είναι ένα ισχυρό εργαλείο για τη βελτιστοποίηση των εμβολίων και αξίζει περισσότερης προσοχής [2].

Αυτή η μελέτη έχει αρκετούς περιορισμούς. Πρώτον, παρατηρήσαμε μόνο τη στρατηγική εμβολίου DNA σε ποντικούς BALB/c και μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να αξιολογήσουν τις ανοσογονικές επιδράσεις αυτών των σχημάτων εμβολίων σε άλλα ζωικά μοντέλα. Δεύτερον, απαιτείται πρόσθετη έρευνα για την πλήρη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που κρύβονται πίσω από τις αυξημένες αποκρίσεις CD8 Τ-κυττάρων ειδικών για nAb και S που προκαλούνται από συν-ανοσοποίηση χρησιμοποιώντας τις πρωτεΐνες S και N και για την αξιοποίηση αυτής της γνώσης για τη βελτιστοποίηση του COVID-19 σχεδιασμός εμβολίου. Τέλος, η λειτουργία των ειδικών για τη Ν πρωτεΐνη αντισωμάτων αξίζει περαιτέρω μελέτης.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη αξιολόγησε το ανοσοπροστατευτικό δυναμικό της ταυτόχρονης ανοσοποίησης με τις πρωτεΐνες S, N, E και M SARS-CoV-2. Αρκετά εμβόλια που στοχεύουν μόνο την πρωτεΐνη S έχουν μειωμένη προστατευτική επίδραση στα αναδυόμενα στελέχη. Τα αποτελέσματά μας θα θέσουν τα θεμέλια για την ανάπτυξη ενός διασταυρούμενου εμβολίου για τον COVID-19 για τον έλεγχο των τρεχουσών και των αναδυόμενων παραλλαγών του SARS-CoV-2 και την πρόληψη πιθανών πανδημιών κορονοϊού.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Zmievskaya, Ε.; Valiullina, Α.; Ganeeva, Ι.; Petukhov, Α.; Rizvanov, Α.; Bulatov, E. Application of CAR-T Cell Therapy πέρα ​​από την Ογκολογία: Αυτοάνοσες ασθένειες και Ιογενείς Λοιμώξεις. Biomedicines 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. Rashidzadeh, Η.; Danafar, Η.; Rahimi, Η.; Mozafari, F.; Salehiabar, Μ.; Rahmati, MA; Rahamooz-Haghighi, S.; Mousazadeh, Ν.; Mohammadi, Α.; Ertas, YN; et al. Νανοτεχνολογία κατά του νέου κοροναϊού (σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο κορωνοϊός 2): Διάγνωση, θεραπεία, θεραπεία και μελλοντικές προοπτικές. Nanomedicine 2021, 16, 497–516. [CrossRef]

3. Fontanet, Α.; Cauchemez, S. Covid-19 ανοσία αγέλης: Πού βρισκόμαστε; Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 583–584. [CrossRef] [PubMed]

4. Jeyanathan, Μ.; Afkhami, S.; Smaill, F.; Miller, MS; Lichty, BD; Xing, Z. Ανοσολογικές εκτιμήσεις για τις στρατηγικές εμβολίων κατά του COVID-19. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 615–632. [CrossRef] [PubMed]

5. Vandelli, Α.; Monti, Μ.; Milanetti, Ε.; Αρμάος, Α.; Rupert, J.; Zacco, Ε.; Bechara, Ε.; Delli Ponti, R.; Tartaglia, GG Δομική ανάλυση του γονιδιώματος SARS-CoV-2 και προβλέψεις της ανθρώπινης αλληλεπίδρασης. Nucleic Acids Res. 2020, 48, 11270–11283. [CrossRef] [PubMed]

6. Jackson, CB; Farzan, Μ.; Chen, Β.; Choe, H. Μηχανισμοί εισόδου του SARS-CoV-2 στα κύτταρα. Nat. Rev. ΜοΙ. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef]

7. Conforti, Α.; Sanchez, Ε.; Salvatori, Ε.; Lione, L.; Compagnone, Μ.; Pinto, Ε.; Palombo, F.; D'Acunto, Ε.; Muzi, Α.; Roscilli, G.; et al. Ένα γραμμικό υποψήφιο εμβόλιο DNA που κωδικοποιεί τον τομέα δέσμευσης υποδοχέα SARS-CoV-2 προκαλεί ισχυρή ανοσολογική απόκριση και εξουδετερωτικά αντισώματα σε οικόσιτες γάτες. ΜοΙ. Εκεί. Μέθοδοι Clin. Dev. 2023. [CrossRef]

8. Borgoyakova, MB; Karpenko, LI; Merkulyeva, IA; Shcherbakov, DN; Rudometov, AP; Starostina, EV; Shanshin, DV; Isaeva, AA; Nesmeyanova, VS; Volkova, NV; et al. Ανοσογονικότητα του συνδυασμένου εμβολίου DNA/πρωτεΐνης κατά του COVID-19. Ταύρος. Exp. Biol. Med. 2023, 1–4. [CrossRef]

9. Qu, L.; Yi, Ζ.; Shen, Υ.; Lin, L.; Chen, F.; Xu, Υ.; Wu, Ζ.; Tang, Η.; Zhang, Χ.; Tian, ​​F.; et al. Εμβόλια κυκλικού RNA κατά του SARS-CoV-2 και των αναδυόμενων παραλλαγών. Cell 2022, 185, 1728–1744.e16. [CrossRef]

10. Corbett, KS; Edwards, DK; Leist, SR; Abiona, OM; Boyoglu-Barnum, S.; Gillespie, RA; Himansu, S.; Schäfer, Α.; Ziwawo, CT; DiPiazza, AT; et al. Ο σχεδιασμός του εμβολίου mRNA του SARS-CoV-2 ενεργοποιήθηκε από την ετοιμότητα πρωτότυπου παθογόνου. Nature 2020, 586, 567–571. [CrossRef]

11. Tian, ​​JH; Patel, Ν.; Haupt, R.; Zhou, Η.; Weston, S.; Hammond, Η.; Logue, J.; Portnoff, Α.; Norton, J.; Guebre-Xabier, Μ.; et al. Ανοσογονικότητα NVX-CoV2373 για υποψήφιο εμβόλιο γλυκοπρωτεΐνης SARS-CoV-2 σε μπαμπουίνους και προστασία σε ποντίκια. Nat. Commun. 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. Andreano, Ε.; Paciello, Ι.; Piccini, G.; Manganaro, Ν.; Pileri, Ρ.; Hyseni, Ι.; Leonardi, Μ.; Pantano, Ε.; Abbiento, V.; Benincasa, L.; et al. Η υβριδική ανοσία βελτιώνει τα Β κύτταρα και τα αντισώματα κατά των παραλλαγών του SARS-CoV-2. Nature 2021, 600, 530–535. [CrossRef]

13. Naqvi, AAT; Fatima, Κ.; Mohammad, Τ.; Fatima, U.; Singh, IK; Singh, Α.; Atif, SM; Hariprasad, G.; Hasan, GM; Hassan, MI Insights για το γονιδίωμα, τη δομή, την εξέλιξη, την παθογένεση και τις θεραπείες SARS-CoV-2: Προσέγγιση δομικής γονιδιωματικής. Biochim. Biophys. Acta ΜοΙ. Βάση. Dis. 2020, 1866, 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. Abbasi, J. India's New Covid-19 DNA Vaccine for Adolescents and Adults is a First. JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, J.; Deng, Υ.; Huang, Β.; Χέρι.; Wang, W.; Huang, Μ.; Zhai, C.; Zhao, Ζ.; Yang, R.; Zhao, Υ.; et al. Τα εμβόλια DNA που εκφράζουν τις πρωτεΐνες του φακέλου και της μεμβράνης παρέχουν μερική προστασία κατά του SARS-CoV-2 σε ποντίκια. Εμπρός. Immunol. 2022, 13, 827605. [CrossRef]

16. Tebas, Ρ.; Kraynyak, KA; Patel, Α.; Maslow, JN; Morrow, βουλευτής; Sylvester, AJ; Knoblock, D.; Gillespie, Ε.; Amonte, D.; Racine, Τ.; et al. Το ενδοδερμικό εμβόλιο SynCon® Ebola GP DNA είναι σταθερό στη θερμοκρασία και επιδεικνύει με ασφάλεια πλεονεκτήματα κυτταρικής και χυμικής ανοσογονικότητας σε υγιείς εθελοντές. J. Infect. Dis. 2019, 220, 400–410. [CrossRef]

17. Smith, TRF; Patel, Α.; Ramos, S.; Elwood, D.; Zhu, Χ.; Yan, J.; Gary, EN; Walker, SN; Schultheis, Κ.; Purwar, Μ.; et al. Ανοσογονικότητα ενός υποψηφίου εμβολίου DNA για τον COVID-19. Nat. Commun. 2020, 11, 2601. [CrossRef]

18. Zhao, Ζ.; Deng, Υ.; Niu, Ρ.; Song, J.; Wang, W.; Du, Υ.; Huang, Β.; Wang, W.; Zhang, L.; Zhao, Ρ.; et al. Η συν-ανοσοποίηση με εμβόλια CHIKV VLP και DNA προκαλεί μια πολλά υποσχόμενη χιουμοριστική απόκριση σε ποντίκια. Front Immunol. 2021, 12, 655743. [CrossRef]

19. Guan, J.; Deng, Υ.; Chen, Η.; Γιν, Χ.; Yang, Υ.; Tan, W. Η εκκίνηση με δύο εμβόλια DNA που εκφράζουν την πρωτεΐνη NS3 του ιού της ηπατίτιδας C που στοχεύει τα δενδριτικά κύτταρα προκαλεί ανώτερο ετερόλογο προστατευτικό δυναμικό σε ποντικούς. Αψίδα. Virol. 2015, 160, 2517–2524. [CrossRef]

20. Chen, Η.; Wen, Β.; Deng, Υ.; Wang, W.; Γιν, Χ.; Guan, J.; Ruan, L.; Tan, W. Ενισχυμένη επίδραση της ανοσοποίησης DNA συν in vivo ηλεκτροπόρωση με συνδυασμό πλασμιδίων πυρήνα του ιού ηπατίτιδας Β-PreS1 και S-PreS1. Clin. Vaccine Immunol. 2011, 18, 1789–1795. [CrossRef]

21. Yang, R.; Deng, Υ.; Huang, Β.; Huang, L.; Lin, Α.; Li, Υ.; Wang, W.; Liu, J.; Lu, S.; Zhan, Ζ.; et al. Ένα εμβόλιο mRNA COVID-19 με δομημένο πυρήνα με ευνοϊκό μοτίβο βιοκατανομής και πολλά υποσχόμενη ανοσία. Μεταφορά σήματος. Στόχος Ther. 2021, 6, 213. [CrossRef] [PubMed]

22. Yang, R.; Huang, Β.; Α, R.; Li, W.; Wang, W.; Deng, Υ.; Tan, W. Ανάπτυξη και αποτελεσματικότητα ψευδότυπου συστήματος SARS-CoV-2, όπως προσδιορίζεται από την εξουδετέρωση της αποτελεσματικότητας και τη δοκιμή αναστολής εισόδου in vitro. Biosaf. Υγεία 2020, 2, 226–231. [CrossRef] [PubMed]

23. Jia, Q.; Bielefeldt-Ohmann, Η.; Maison, RM; Masleša-Gali´c, S.; Cooper, SK; Bowen, RA; Horwitz, MRA αντιγραφικό εμβόλιο με βακτηρίδια που εκφράζει τη μεμβράνη SARS-CoV-2 και τις πρωτεΐνες νουκλεοκαψιδίου προστατεύει από σοβαρή νόσο-19-όπως η COVID-19- στα χάμστερ. NPJ Vaccines 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

24. Hajnik, RL; Plante, JA; Liang, Υ.; Alameh, M.-G.; Tang, J.; Zhong, C.; Adam, Α.; Scharton, D.; Rafael, GH; Liu, Υ.; et al. Ο συνδυαστικός εμβολιασμός mRNA ενισχύει την προστασία έναντι της παραλλαγής δέλτα SARS-CoV-2. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Antón, IM; González, S.; Bullido, MJ; Corsín, Μ.; Risco, C.; Langeveld, JP; Enjuanes, L. Συνεργασία μεταξύ δομικών πρωτεϊνών του κορωνοϊού μεταδιδόμενης γαστρεντερίτιδας (TGEV) στην in vitro επαγωγή των ειδικών για τον ιό αντισωμάτων. Virus Res. 1996, 46, 111–124. [CrossRef]

26. Deschambault, Υ.; Lynch, J.; Warner, Β.; Tierney, Κ.; Huynh, D.; Vendramelli, R.; Tailor, Ν.; Frost, Κ.; Booth, S.; Sajesh, Β.; et al. Η εφάπαξ ανοσοποίηση με ανασυνδυασμένους ιούς δαμαλίτιδας ACAM2000 που εκφράζουν την ακίδα και τις πρωτεΐνες νουκλεοκαψιδίου προστατεύουν τα χάμστερ από την κλινική ασθένεια που προκαλείται από τον SARS-CoV-2-. bioRxiv 2021. [CrossRef]

27. Penaloza-MacMaster, Ρ.; Class, J.; Dangi, Τ.; Το εμβόλιο νουκλεοκαψιδίου Richner, JM A SARS CoV-2 προστατεύει από την περιφερική διάδοση του ιού. bioRxiv 2021.

28. Afkhami, S.; D'Agostino, MR; Zhang, Α.; Stacey, HD; Marzok, Α.; Kang, Α.; Singh, R.; Bavananthasivam, J.; Ye, G.; Luo, Χ.; et al. Η χορήγηση του αναπνευστικού βλεννογόνου του εμβολίου επόμενης γενιάς για τον COVID{-19 παρέχει ισχυρή προστασία τόσο από τα προγονικά όσο και από τα παραλλαγμένα στελέχη του SARS-CoV-2. Cell 2022, 185, 896–915.e19. [CrossRef]

29. Zheng, Ν.; Xia, R.; Yang, C.; Γιν, Β.; Li, Υ.; Duan, C.; Liang, L.; Guo, Η.; Xie, Q. Ενίσχυσε την έκφραση της πρωτεΐνης νουκλεοκαψιδίου SARS-CoV στον καπνό και την ανοσογονικότητά της σε ποντίκια. Vaccine 2009, 27, 5001–5007. [CrossRef]

30. Yasui, F.; Kai, C.; Kitabatake, Μ.; Inoue, S.; Yoneda, Μ.; Yokochi, S.; Kase, R.; Sekiguchi, S.; Morita, Κ.; Hishima, Τ.; et al. Προηγούμενη ανοσοποίηση με νουκλεοκαψιδική πρωτεΐνη που σχετίζεται με το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS) (SARS-CoV) προκαλεί σοβαρή πνευμονία σε ποντίκια που έχουν μολυνθεί με SARS-CoV. J. Immunol. 2008, 181, 6337–6348. [CrossRef]

31. Deming, D.; Sheahan, Τ.; Heise, Μ.; Yount, Β.; Davis, Ν.; Sims, Α.; Suthar, Μ.; Harkema, J.; Whitmore, Α.; Pickles, R.; et al. Η αποτελεσματικότητα του εμβολίου σε γηρασμένα ποντίκια που προσβλήθηκαν με ανασυνδυασμένο SARS-CoV που φέρει επιδημικές και ζωονοσογόνες παραλλαγές ακίδας. PLoS Med. 2006, 3, e525. [CrossRef] [PubMed]

32. Wesseling, JG; Godeke, GJ; Schijns, VE; Prevec, L.; Graham, F.; Horzinek, MC; Rottier, ακίδα ιού ηπατίτιδας ποντικού PJ και πρωτεΐνες νουκλεοκαψιδίου που εκφράζονται από φορείς αδενοϊού προστατεύουν τα ποντίκια από μια θανατηφόρα μόλυνση. J. Gen. Virol. 1993, 74, 2061–2069. [CrossRef] [PubMed]

33. Kim, TW; Lee, JH; Hung, CF; Peng, S.; Roden, R.; Wang, MC; Viscidi, R.; Tsai, YC; Αυτός εγώ.; Chen, PJ; et al. Δημιουργία και χαρακτηρισμός εμβολίων DNA που στοχεύουν την πρωτεΐνη νουκλεοκαψιδίου του κορωνοϊού με σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο. J. Virol. 2004, 78, 4638–4645. [CrossRef] [PubMed]

34. Le Bert, Ν.; Tan, AT; Kunasegaran, Κ.; Tham, CYL; Χαφέζη, Μ.; Chia, Α.; Chng, MHY; Lin, Μ.; Tan, Ν.; Linster, Μ.; et al. SARS-CoV-2-ειδική ανοσία Τ-λεμφοκυττάρων σε περιπτώσεις COVID-19 και SARS και μη μολυσμένα μάρτυρες. Nature 2020, 584, 457–462. [CrossRef]