Τα οφέλη της ακτεοσίδης - θεραπεία γλοιοβλαστώματος

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

TAE WOONG HWANG;DONG HUN KIM; DA BI KIM1;TAE WON JANG;GUN-HWA KIM;MINHO MOON;KYUNG AH YOON;DAE EUN CHO;JAE HO PARK;JWA-JIN KIM

1. Εισαγωγή

Γλοιοβλάστωμαείναι ο πιο κοινός τύπος κακοήθους πρωτοπαθούς όγκου εγκεφάλου και ο πιο διηθητικός και καταστροφικός πρωτοπαθής όγκος εγκεφάλου (1,2), με μέσο ποσοστό επιβίωσης ~ 18 μήνες με επιθετική πολυτροπική θεραπεία. Οι τρέχουσες θεραπευτικές αποφάσεις είναι περιορισμένες και περιλαμβάνουν ακτινοβολία, χημειοθεραπεία και χειρουργική επέμβαση σε συνδυασμό με τον αλκυλιωτικό παράγοντα τεμοζολομίδη (TMZ) (3,4). Παρά τη διαθεσιμότητα επιθετικών θεραπειών, οι ασθενείς μεγλοιοβλάστωμαέχουν γενικά κακή πρόγνωση (5). Το TMZ είναι το κύριο χημειοθεραπευτικό φάρμακο που χρησιμοποιείται στην κλινική θεραπεία κακοήθων νοσημάτωνγλοιοβλάστωμα(6-8); Ως αλκυλιωτικός παράγοντας της σειράς, είναι σε θέση να διεισδύσει στον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (9-11). Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του κακοήθους γλοιοβλαστώματος και της εκτεταμένης εισβολής στον εγκέφαλο, η σταθερά αυξανόμενη αντίσταση του φαρμάκου στην ΤΜΖ μειώνει τη θεραπευτική του αποτελεσματικότητα (12,13). Κατά συνέπεια, νέα θεραπευτικά φάρμακα για την αντιμετώπισηγλοιοβλάστωμααναζητούνται επειγόντως.

Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα κύτταρα γλοιώματος υφίστανται κυτταρικό θάνατο μέσω αυτοφαγίας ή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου τύπου II, ως απόκριση στην ΤΜΖ (14,15). Η αυτοφαγία μπορεί να ανασταλεί από την 3-μεθυλαδενίνη (3-MA) ​​μέσω της μετατροπής της πρωτεΐνης 1 ελαφριάς αλυσίδας 3 (LC3)-I που σχετίζεται με μικροσωληνάρια σε LC3-II, μειώνοντας έτσιγλοιοβλάστωμακυτταρικός θάνατος (16,17); Ωστόσο, ο ρόλος της αυτοφαγίας εξαρτάται από το κυτταρικό πλαίσιο. Με εξαίρεση τον κυτταροτοξικό ρόλο κατά τη δράση της ΤΜΖ, η πρόκληση αυτοφαγίας από το κυτταρικό στρες είναι μια κυτταροπροστατευτική διαδικασία που εξαλείφει τα επαγόμενα από το στρες κυτταροπλασματικά συσσωματώματα, οργανίδια και μακρομόρια σε κύτταρα θηλαστικών μέσω του λυσοσωμικού συστήματος. Με τη σειρά τους, τα κύτταρα που εμπλέκονται στη διατήρηση της ομοιόστασης λαμβάνουν ενέργεια μέσω αυτών των καταβολικών διεργασιών (18,19). Οι περίπλοκοι ρόλοι της αυτοφαγίας υποδηλώνουν ότι ένας ενεργοποιητής αυτοφαγίας μπορεί να έχει αντικαρκινικές επιδράσεις σε συνδυασμό με θεραπεία με TMZ προκαλώνταςγλοιοβλάστωμακυτταρική αυτοφαγία χωρίς να ασκεί επιβλαβείς επιπτώσεις ή να παρέχει οφέλη στους φυσιολογικούς ιστούς. Αξίζει να σημειωθεί ότι το TMZ έχει επιδείξει συνεργιστικά θεραπευτικά αποτελέσματα σε συνδυασμό με βιταμίνη D, συμπεριλαμβανομένης της κατασταλμένης κυτταρικής βιωσιμότητας και της ενισχυμένης αυτοφαγίας σεγλοιοβλάστωμακύτταρα. Επιπλέον, ο συνδυασμός TMZ και βιταμίνης D έχει αποδειχθεί ότι ασκεί αντικαρκινικές επιδράσεις in vivo, συμπεριλαμβανομένου του μειωμένου μεγέθους του όγκου και του παρατεταμένου ποσοστού επιβίωσης. Αυτές οι μελέτες υποδηλώνουν ότι η συνδυαστική θεραπεία μπορεί να έχει συνεργιστικά αντικαρκινικά αποτελέσματα μέσω αυτοφαγικών μηχανισμών σε TMZ που βασίζονταιγλοιοβλάστωμαθεραπεία (15).

Ακτεοσίδηείναι ένα φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιο που διανέμεται ευρέως σε πολλά τονωτικά παραδοσιακά κινέζικα φυτικά φάρμακα (20,21). Μια σειρά από φαρμακολογικές δράσεις, συμπεριλαμβανομένων των αντιοξειδωτικών, αντικαρκινικών, αντιφλεγμονωδών, αντινεφριτικών και αντιμεταστατικών δράσεων, έχουν συσχετιστεί μεακτεοσίδη(22-24). Προηγούμενες μελέτες το έχουν δείξειακτεοσίδηέχει προστατευτική δράση έναντι της ηπατικής βλάβης που προκαλείται από τετραχλωράνθρακα και D-γαλακτοζαμίνη. Οι μηχανισμοί που διέπουν τις προστατευτικές επιδράσεις της ακτεοσίδης σχετίζονται πιθανώς με την ικανότητά της να αναστέλλει τη βιοενεργοποίηση που προκαλείται από το P450 και τα αποτελέσματα σάρωσης ελεύθερων ριζών που προκαλούνται από την έκθεση σε τετραχλωράνθρακα (25,26).

Επομένως, τα στοιχεία δείχνουν ότι και τα δύοακτεοσίδηκαι η TMZ προκαλούν αντικαρκινικές επιδράσεις μέσω του κυτταρικού θανάτου. Ωστόσο, η συσχέτισή τους και οι αντικαρκινικές επιδράσεις στο πλαίσιο τηςγλοιοβλάστωμααπομένει να διευκρινιστεί. Ως εκ τούτου, ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να επαληθεύσει τις συνεργιστικές αντικαρκινικές επιδράσεις τουακτεοσίδησε συνδυασμό με το TMZ inγλοιοβλάστωμαθεραπεία. Πραγματοποιήθηκε μια δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων για να αναλυθούν τα αντικαρκινικά αποτελέσματα της συνδυαστικής θεραπείας στο C6γλοιοβλάστωμακύτταρα (ένας αρουραίοςγλοιοβλάστωμακυτταρική γραμμή), και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με αυτά που ακολούθησαν θεραπεία μόνο με ΤΜΖ. Για να εξεταστεί περαιτέρω ο μηχανισμός του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από τη συνθεραπεία μεακτεοσίδηκαι γονίδια TMZ, απόπτωσης και αυτοφαγίας σε κύτταρα C6 εξετάστηκαν.

ακτεοσίδη κατά του όγκου

2. Υλικά και μέθοδοι

Κυτταρικής καλλιέργειας:

Ο αρουραίος C6γλοιοβλάστωμαΗ κυτταρική σειρά αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό στείρες συνθήκες στους 37°C σε υγρό περιβάλλον με 5 τοις εκατό CO2 σε τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό ορό βοοειδών (FBS) και 1 τοις εκατό αντιβιοτικά και αντιμυκητιασικά (όλα Welgene, Daegu , Κορέα).

Φυτική ύλη:

Abeliophyllum distichum Nakai [κουπόνι αρ. Το Park1001(ANH)] συλλέχτηκε στο θεματικό πάρκο Misun-hyang, Seongbul-Mountain Recreation Forest, Κορέα.

Επαγωγή κάλου:

Για να προκληθεί σχηματισμός τύλου (27), απομονώθηκαν εκφυτεύματα φύλλων 1-cm2 από τα φρέσκα φυτά. Το μόσχευμα καλλιεργήθηκε σε μέσο Murachige and Skoog (4 τοις εκατό σακχαρόζη, 0,9 τοις εκατό άγαρ συμπληρωμένο με 1 mg/l ναφθαλινοοξικό οξύ και 1 mg/l 2,4-διχλωροφαινοξυοξικό οξύ, pH 5,7) σε 25˚C. Ο κάλος προκλήθηκε 20 ημέρες αργότερα. Μια επαρκής ποσότητα απόακτεοσίδηελήφθη μέσω υποκαλλιέργειας για διαχωρισμό και καθαρισμόακτεοσίδηαπό τον κάλο (Εικ. 1). Διαφορετικές παρτίδες καθαρισμένουακτεοσίδηχρησιμοποιήθηκαν σε κάθε πείραμα. Κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε τρεις φορές χρησιμοποιώντας διαφορετική παρτίδα.

Απομόνωση και καθαρισμός:

Τα κλάσματα οξικού αιθυλεστέρα συμπυκνώθηκαν υπό κενό και χρησιμοποιήθηκαν ως δείγμα για τον καθαρισμό του ακτεοσιδίου.Ακτεοσίδηαπομονώθηκε και καθαρίστηκε με το σύστημα Accelerated Chromatographic Isolation (Isolera™ Spektra, Biotage, Uppsala, Σουηδία) χρησιμοποιώντας φυσίγγια SNAP KPHOSPHO-SIL και SNAP Ultra (Biotage). οακτεοσίδηπου καθαρίστηκε από τον κάλο αναλύθηκε ποσοτικά με χρήση του τυπικού ακτεοζίτη με ανάλυση HPLC-PDA. Τέλος, ακτεοσίδη μεγαλύτερης ή ίσης με 95 τοις εκατό καθαρότητας ελήφθη από τον κάλο και χρησιμοποιήθηκε ως δείγμα για χημειοθεραπεία με βάση το τεμοζολομίδιογλοιοβλάστωμα.

Δοκιμασία βρωμιούχου 3-(4,5-διμεθυλθειαζολ-2-l)-,5-διφαινυλτετραζολίου (MTT):

Για να προσδιοριστεί η μισή-μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση ΤΜΖ (τιμή IC50) έναντι των κυττάρων C6, 1x104 κύτταρα σε εναιωρήματα μονοκυττάρου σπάρθηκαν σε μεμονωμένα φρεάτια πλακών 96 φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37°C πριν από την επεξεργασία με ΤΜΖ στην υποδεικνυόμενη συγκεντρώσεις (1, 5, 10 και 20 mM) στους 37˚C για 24 ώρες. Μετά τον προσδιορισμό της τιμής TMZ IC50 ως 5 mm, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 24 ώρες με 5 mM ΤΜΖ, 50 μΜακτεοσίδηή ένας συνδυασμός των δύο (5 mM ΤΜΖ και 50 μΜακτεοσίδη). Διάλυμα ΜΤΤ (5 mg/ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο (10 μl) και καλλιεργήθηκε στους 37°C για 2 ώρες. Στη συνέχεια, το μέσο αφαιρέθηκε και προστέθηκε DMSO σε όγκο 200 μΐ το καθένα και αντέδρασε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Η απορρόφηση στα 595 nm μετρήθηκε για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων.

Δοκιμασία επούλωσης τραυμάτων:

Ένα εναιώρημα κυττάρων C6 σε 1 ml καλλιεργήθηκε σε μια πλάκα 12 φρεατίων και αναπτύχθηκε σε συρροή. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΤΜΖ,ακτεοσίδη, ή TMZ plusακτεοσίδηκαι στη συνέχεια ξύνεται με ένα αποστειρωμένο άκρο πιπέτας 10‑μl για να δημιουργηθεί ένα τεχνητό τραύμα. Στις 0 και 24 ώρες μετά τον τραυματισμό, καταγράφηκαν ψηφιακές εικόνες της διαδικασίας επούλωσης του τραύματος χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Η μετανάστευση κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση του μεγέθους της ουλής στις 0 και 24 ώρες χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης εικόνας, λογισμικό ImageJ 1.43u/Java1.6.0_22 (NIH, Bethesda, Maryland, ΗΠΑ). Κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε τρεις φορές και οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Ανοσοκηλίδωση:

Τα κύτταρα C6 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΤΜΖ,ακτεοσίδη, ή TMZ plusακτεοσίδηγια 24 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν σε πάγο με το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 τοις εκατό Nonidet P-40, 1 τοις εκατό δεοξυχολικό νάτριο, 0,1 τοις εκατό SDS) συμπληρωμένο με κοκτέιλ πρωτεάσης και αναστολέων φωσφατάσης (Roche, Basel, Switzerland) για 30 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση στα 18.341 xg για 15 λεπτά στους 4°C, ελήφθη το υπερκείμενο. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη χρήση αναλύσεων πρωτεΐνης Bradford (Bio-rad, Hercules, CA, USA). Ίσες ποσότητες συνολικών πρωτεϊνών (30 μg) φορτώθηκαν σε μεμονωμένα φρεάτια και κλασματοποιήθηκαν μέσω ηλεκτροφόρησης μέσω SDS-PAGE 10-15 τοις εκατό. Οι πρωτεΐνες ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (EMD Millipore, Bedford, ΜΑ, ΗΠΑ). Μετά την επώαση σε διάλυμα αποκλεισμού που περιέχει 5 τοις εκατό μη λιπαρό γάλα σε αλατούχο διάλυμα Tween/Tris-ρυθμιστικό διάλυμα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν με αραιωμένα πρωτογενή αντισώματα 1:1 (αρ. κατ. 9662, κασπάση 3, Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, ΗΠΑ), λέμφωμα Β0-κυττάρου 2 (sc‑ 7382, Bcl-2), Bcl-2-σχετιζόμενη πρωτεΐνη Χ (αρ. κατ. 2772, Bax), φωσφορυλιωμένη (p-)p53 (sc-101762), ολική-p53 (sc-6243), -ακτίνη (κατ. αρ. 4970, όλα; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA), LC‑3 (L8918, Sigma; Merck KGaA, Darmstadt, Γερμανία), Rab7 (αρ. κατ. 9367, Cell Signaling Technology, Inc. ), p62 (αρ. κατ. 114), p-p38 (αρ. κατ. 9211), total-p38 (αρ. κατ. 9212), p-c-Jun N-τερματική κινάση (αρ. κατ. 9251, σ. ‑JNK), total‑JNK (αρ. κατ. 9252), p‑εξωκυτταρικό σήμα ρυθμιζόμενη κινάση (αρ. κατ. 9101, p‑ERK), ολικό‑ERK (αρ. κατ. 9102, όλα τα Cell Signaling Technology, Inc. .) διανυκτέρευση στους 4˚C. Ακολούθησε επώαση με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου (1:2,000· LF-SA8001A, Goat Anti-Mouse IgG-HRP) ή LF-SA8002A (Goat Anti-Rabbit IgG-HRP) Frontier, Seoul, Korea.) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια οπτικοποιήθηκαν με έκθεση στο Chemi-Doc (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, cA, USA).

Χρώση ανοσοφθορισμού:

Η πρωτεΐνη 1 της μεμβράνης που σχετίζεται με το λυσοσωμικό (LAMP1) και η LC3 είναι δείκτες για λυσοσωμική και αυτοφαγία. Τα κύτταρα (1x105 κύτταρα/φρεάτιο) παρασκευάστηκαν σε αποστειρωμένες γυάλινες καλυπτρίδες (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) εις τριπλούν. Μετά τη θεραπεία με TMZ,ακτεοσίδη, ή TMZ plusακτεοσίδηγια 24 ώρες, τα κύτταρα στερεώθηκαν σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά, μπλοκαρίστηκαν με 5 τοις εκατό κανονικό ορό κοτόπουλου (S‑3000; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA), 0,1 τοις εκατό Triton X ‑100 και στη συνέχεια επωάστηκε 1 ώρα για διαπερατότητα και για αποκλεισμό των μη ειδικών αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με το anti-LAMP1 (1:200; sc-19992, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) και αντι-LC3 (1:400; PM036, MBL International, Woburn, MA, USA) όλη τη νύχτα στις 4˚ ΝΤΟ. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επωάστηκαν για επιπλέον 2 ώρες στο σκοτάδι με ένα μείγμα Alexa Fluor 488 και 594 δευτερογενών αντισωμάτων (1:200· Alexa Fluor 488 (A-11008) και 594 (A-11007), Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) και πλύθηκε ξανά με PBS. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (Sigma, Merck KGaA) και στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Στη συνέχεια, οι διαφάνειες τοποθετήθηκαν και οι εικόνες καταγράφηκαν με ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ LSM-700.

Σχήμα 1. Χημική δομή του ακτεοσιδίου.

Κυτταρομετρία ροής.

Τα κύτταρα αναλύθηκαν για Mitotracker Green και MitoSOX με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCanto II, όπως υποδεικνύεται από τον κατασκευαστή (BD Biosciences). Μετά από δύο πλύσεις με PBS, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και διαπερατήθηκαν με 0,25 τοις εκατό Triton X-100 σε PBS για 20 λεπτά. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4°C (1:200) και στη συνέχεια με δευτερεύοντα αντισώματα για 1 ώρα σε πάγο. Μετά από δύο πλύσεις με PBS, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη και προσδιορίστηκαν αμέσως. Τα δεδομένα κυτταρομετρίας ροής συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 10,000 κύτταρα και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo 7.6.1 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA).

Στατιστική ανάλυση:

Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το GraphPad Prism 5.0 και παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με μια μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης με το post hoc τεστ πολλαπλών συγκρίσεων του Tukey για τη σύγκριση των μέσων τιμών μεταξύ πολλαπλών ομάδων. Π<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Cistanche Echinacoside: Αντι-απόπτωση

3. Αποτελέσματα

3.1 Συνθεραπεία με TMZ και ακτεοσιδικά κατασταλτικάγλοιοβλάστωμαπολλαπλασιασμός και μετανάστευση των κυττάρων.

Συνδυασμένη θεραπεία με TMZ καιακτεοσίδηανέστειλε τη βιωσιμότητα των κυττάρων C6. Η TMZ μείωσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 2Α), ενώ η ακτεοσίδη μόνη της δεν είχε σημαντική επίδραση σε οποιοδήποτε επίπεδο θεραπείας (Εικ. 2Β). Μετά από επώαση σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει ΤΜΖ με ή χωρίς ακτεοσίδη για 24 ώρες, πραγματοποιήθηκε ανάλυση ΜΤΤ για σύγκριση των κυτταροτοξικότητας διαφορετικών επιπέδων θεραπείας. Η TMZ κατέστειλε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων, ενώ η ακτεοσίδη δεν κατέστειλε σημαντικά την κυτταρική ανάπτυξη. Η συνδυασμένη θεραπεία με ΤΜΖ και ακτεοσίδη μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικ. 2C). Η θεραπεία με TMZ ή ακτεοσίδη που εφαρμόζεται μόνη της μείωσε την ικανότητα επούλωσης πληγών (Εικ. 3Α). Η απόσταση του τραύματος (ποσοστό) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τα αποτελέσματα που φαίνονται στο Σχ. 3Α με λογισμικό ImageJ. Η απόσταση του τραύματος αυξήθηκε σημαντικά μετά τη θεραπεία συνδυασμού (Εικ. 3Β), σε σύγκριση με οποιαδήποτε μεμονωμένη θεραπεία. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η συν-θεραπεία με ΤΜΖ και ακτεοσίδη ήταν ένας αποτελεσματικός αναστολέας τηςγλοιοβλάστωμαπολλαπλασιασμός και μετανάστευση των κυττάρων.

3.2 Η ακτεοσίδη και η ΤΜΖ επηρεάζουν την απόπτωση συνεργιστικά στα κύτταρα C6.

Τα αποτελέσματα της ανάλυσης western blot αποκάλυψαν ότι τα επίπεδα της διασπασμένης κασπάσης-3, Bax και φωσφορυλιωμένης ρ53 ήταν υψηλότερα και τα επίπεδα Bcl-2 ήταν χαμηλότερα μετά από θεραπεία συνδυασμού με TMZ καιακτεοσίδηπαρά μετά από θεραπεία μόνο με ΤΜΖ (Εικ. 4Α).ΑκτεοσίδηΗ μεσολαβούμενη μιτοχονδριακή λειτουργία και η δημιουργία αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), που είναι βασικοί μεσολαβητές της αποπτωτικής σηματοδότησης, παρατηρήθηκαν στη συνέχεια στα κύτταρα C6 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με TMZ. Για την επαλήθευση της μιτοχονδριακής μάζας, πραγματοποιήθηκε ανάλυση ταξινόμησης κυττάρων ενεργοποιημένης με φθορισμό χρησιμοποιώντας MitoTracker Green. Συνθεραπεία με TMZ καιακτεοσίδηοδήγησε σε υψηλότερη μιτοχονδριακή μάζα από τη θεραπεία μόνο με ΤΜΖ (Εικ. 4Β). Η παραγωγή ROS ήταν σημαντικά υψηλότερη μετά τη συν-θεραπεία με ΤΜΖ και ακτεοσίδη από τη θεραπεία με TMZ μόνο (Εικ. 4C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η δημιουργία ROS και η μιτοχονδριακή λειτουργία είναι σημαντικές στην απόπτωση που προκαλείται από τη θεραπεία με TMZ συν ακτεοσίδη. Η ταυτόχρονη θεραπεία με TMZ και ακτεοσίδη προκαλεί αυτοφαγία σε κύτταρα C6. Η ΤΜΖ έχει αναφερθεί ότι προκαλεί αυτοφαγία (28,29). Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη εξέτασε τον βαθμό στον οποίο η αυτοφαγία προκλήθηκε από τη θεραπεία με TMZ συν ακτεοσίδη. Τα κύτταρα C6 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΤΜΖ με ή χωρίς ακτεοσίδη. μετά από 24 ώρες, και τα κύτταρα χρωματίστηκαν για ανοσοφθορισμό για να ανιχνευθούν τα LAMP1 και LC3 ως δείκτες αυτοφαγίας. Υψηλότερα επίπεδα έκφρασης των LAMP1 και LC3 παρατηρήθηκαν μετά τη θεραπεία συνδυασμού (Εικ. 5Α). Εξετάστηκε επίσης η έκφραση πρωτεΐνης που σχετίζεται με την αυτοφαγία και διαπιστώθηκε ότι η TMZ προκάλεσε τη μετατροπή του LC3-I σε LC3-II, το οποίο αποτελεί υπογραφή της δημιουργίας αυτοφαγοσωμάτων. Παρατηρήθηκε υψηλότερος ρυθμός μετατροπής του LC3-I σε LC3-II μετά από συν-θεραπεία με TMZ και ακτεοσίδη σε σχέση με τη θεραπεία μόνο με TMZ. Τα επίπεδα έκφρασης των Rab7 και p62 έδειξαν επαγωγή αυτοφαγίας στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΤΜΖ (Εικ. 5Β). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η συν-θεραπεία με TMZ και ακτεοσίδη ενίσχυσε την αυτοφαγική διαδικασίαγλοιοβλάστωμακύτταρα.

3.3 Η ακτεοσίδη επάγει την έκφραση του γονιδίου της οδού MAPK σε θεραπεία με βάση την TMZ.

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η TMZ ρυθμίζει την οδό MAPK, συμπεριλαμβανομένων των p38, JNK και ERK (30). Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη διερεύνησε εάνακτεοσίδηεπηρεάζει την έκφραση του γονιδίου MAPK που σχετίζεται με την TMZ. Τα κύτταρα C6 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΤΜΖ με ή χωρίςακτεοσίδη. Μετά από 24 ώρες, η θεραπεία με TMZ είχε ως αποτέλεσμα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης των p‑p38, p‑JNK και p‑ERK. Η έκφραση των ρυθμιζόμενων με TMZ γονιδίων ήταν σημαντικά υψηλότερη μετά τη θεραπεία με TMZ συν ακτεοσίδη από τη θεραπεία με TMZ μόνο (Εικ. 6). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότιακτεοσίδηεπηρεάζει τους θεραπευτικούς μηχανισμούς που βασίζονται στην TMZ μέσω της οδού MAPK.

Acteoside αντι-γλοιοβλάστωμα

Συζήτηση

Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης αποδεικνύουν ότι η συνδυασμένη θεραπεία με ΤΜΖ μεακτεοσίδηπροσφέρει θεραπευτικές δυνατότητες γιαγλοιοβλάστωμαθεραπεία και παρέχουν στοιχεία ότι η χημειοευαισθητοποίηση σε συνδυασμό ΤΜΖ καιακτεοσίδημπορεί να συμβεί μέσω της ενίσχυσης της αυτοφαγίας. Ως μετάλλαξη τουγλοιοβλάστωμαΤα κύτταρα μπορούν να οδηγήσουν σε απενεργοποίηση της αποπτωτικής οδού, την επαγωγή αυτοφαγίας από το TMZ plusακτεοσίδηη συνθεραπεία μπορεί να αντιπροσωπεύει μια εναλλακτική μέθοδο γιαγλοιοβλάστωμαθεραπεία. Ωστόσο, εάν η αυτοφαγία είναι ο μοναδικός μηχανισμός γιαγλοιοβλάστωμαθεραπεία με TMZ plusακτεοσίδημένει να διευκρινιστεί.

Η αυτοφαγία είναι ένας απαραίτητος κυτταρικός μηχανισμός για την αποικοδόμηση των πρωτεϊνών και των κυτταροπλασματικών οργανιδίων. Το καταβολικό πλεονέκτημα της επαγόμενης αυτοφαγίας μπορεί να είναι σημαντικό σε στρεσογόνες καταστάσεις. Επομένως, η πρόκληση αυτοφαγίας μπορεί να είναι ένας προσαρμοστικός μηχανισμός για την πρόληψη του κυτταρικού θανάτου (31-33). Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η μειωμένη αυτοφαγία συσχετίζεται με τον καρκίνο (34-36). Επιπλέον, αρκετές πρωτεΐνες και σηματοδοτικές οδοί που σχετίζονται με την αυτοφαγία απορυθμίζονται κατά τη διάρκεια του κακοήθους μετασχηματισμού, με αποτέλεσμα τη μείωση της αυτοφαγικής δραστηριότητας. Τα υψηλά επίπεδα έκφρασης της LC3 έχουν επίσης συσχετιστεί με αυξημένα ποσοστά επιβίωσης σε ασθενείς μεγλοιοβλάστωμαμε κακές επιδόσεις (37,38). Ομοίως, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι η αποκατάσταση της φυσιολογικής αυτοφαγίας μπορεί να είναι μια λανθάνουσα στρατηγική γιαγλοιοβλάστωμαθεραπεία, και μπορεί να χρησιμεύσει ως μηχανισμός για τον περιορισμό της ανώμαλης ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων.

Στην κανονική αυτοφαγία, συγκεκριμένα κυτταροπλασματικά συστατικά απομονώνονται μέσα στα αυτοφαγοσώματα τα οποία στη συνέχεια συντήκονται με ένα λυσόσωμα για να αποικοδομηθούν και να ανακυκλωθούν (39,40). Όταν η αυτοφαγία ρυθμίζεται προς τα πάνω, οι ρυθμοί σχηματισμού αυτοφαγοσωμάτων ξεπερνούν τους ρυθμούς λυσοσωμικής αποικοδόμησης. Αυτή η κατάσταση ονομάζεται αυτοφαγικό στρες. Εάν το στρες ή η μη φυσιολογική αυτοφαγία συνεχιστεί, ο κυτταρικός θάνατος μπορεί να συμβεί μέσω εξάντλησης ενέργειας ή αλλαγών στην ισορροπία beclin-1/Bcl-2. Η απόπτωση μπορεί επίσης να προκληθεί από υπερκινητικότητα του αυτοφαγοσώματος, καταπίνοντας κυτταροπλασματικά οργανίδια συμπεριλαμβανομένων των μιτοχονδρίων ή του ενδοπλασματικού δικτύου (41). Έχει προταθεί ότι η γενική αυτοφαγία μπορεί να προκαλέσει κυτταρικό θάνατο κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής κυτταροπλασματικής και οργανικής εναλλαγής σε υγιή κύτταρα. Σε αυτή τη διαδικασία, το κύτταρο «κανιβαλίζεται» από μέσα, ένα βασικό χαρακτηριστικό του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου τύπου II. Αν και οι μηχανισμοί με τους οποίουςακτεοσίδηενισχύει το θεραπευτικό αποτέλεσμα του βασισμένου σε TMZγλοιοβλάστωμαΗ θεραπεία παραμένει να διευκρινιστεί πλήρως, τα αντικαρκινικά αποτελέσματα που παρουσιάζονται από τη συνδυαστική θεραπεία που εξετάστηκε στην παρούσα μελέτη μπορεί να σχετίζονται με αυτούς τους αυτοφαγικούς μηχανισμούς.

Ακτεοσίδηείναι ένα φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιο που προέρχεται από φυτά (22,26). Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει τις διάφορες βιολογικές δραστηριότητες της ακτεοσίδης. Οι αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης της διασπασμένης κασπάσης-3 και LC3 στην παρούσα μελέτη καταδεικνύουν ότι η θεραπεία με συνδυασμό ΤΜΖ καιακτεοσίδηπροκάλεσε απόπτωση και αυτοφαγία σε κύτταρα C6 (Εικ. 4 και 5). Η συνδυαστική θεραπεία αποδείχθηκε ότι έχει συνεργική επίδραση σταγλοιοβλάστωμακύτταρα. Αν και άλλοι πιθανοί μηχανισμοί αυτών των συνεργιστικών επιδράσεων παραμένουν προς αποσαφήνιση, η παρούσα μελέτη προσδιόρισε την πρόκληση αυτοφαγίας ως έναν κρίσιμο ογκοκτόνο μηχανισμόακτεοσίδηχημειοευαισθητοποίηση κατά τη διάρκεια που βασίζεται σε TMZγλοιοβλάστωμαθεραπεία.

Η ακτεοσίδη αντιμετωπίζει το γλοιοβλάστωμα

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Friedman HS, Kerby T και Calvert H: Temozolomide και θεραπεία κακοήθους γλοιώματος. Clin Cancer Res 6: 2585-2597, 2000.

2. Mrugala MM και Chamberlain MC: Μηχανισμοί νόσου: Temozolomide καιγλοιοβλάστωμα- κοιτάξτε το μέλλον. Nat Clin Pract Oncol 5: 476-486, 2008.

3. Agarwala SS και Kirkwood JM: Η τεμοζολομίδη, ένας νέος αλκυλιωτικός παράγοντας με δραστηριότητα στο κεντρικό νευρικό σύστημα, μπορεί να βελτιώσει τη θεραπεία του προχωρημένου μεταστατικού μελανώματος. Oncologist 5: 144-151, 2000.

4.Stevens MF, Hickman JA, Stone R, Gibson NW, Baig GU, Lunt E και Newton cG: Αντικαρκινικές ιμιδαζοτετραζίνες. 1. Σύνθεση και χημεία του 8-καρβαμοϋλ-3-(2-χλωροαιθυλ)ιμιδαζο[5,1-d]-1,2,3, 5-τετραζίνη-4(3 Η)-όνη, ενός νέου ευρέως φάσματος κατά του όγκου μέσο. J Med Chem 27: 196-201, 1984.

5. Fulda S: Θεραπεία που βασίζεται στον κυτταρικό θάνατογλοιοβλάστωμα. Cell Death dis 9: 121, 2018.

6. Chen PH, Shen WL, Shih CM, Ho KH, Cheng CH, Lin CW, Lee CC, Liu AJ και Chen KC: Η οδός Notch3 που αναστέλλεται από το CHAC1 εμπλέκεται στην κυτταροτοξικότητα του γλοιώματος που προκαλείται από το τεμοζολομίδιο. Neuropharmacology 116: 300-314, 2017.

7. Oshiro S, Tsugu H, Komatsu F, Ohmura T, Ohta M, Sakamoto S, Fukushima T και Inoue T: Αποτελεσματικότητα της θεραπείας με τεμοζολομίδη σε ασθενείς με υψηλού βαθμού γλοίωμα. Anticancer Res 29: 911-917, 2009.

8. Van den Bent MJ: Επικουρική θεραπεία γλοιωμάτων υψηλού βαθμού. Ann Oncol 17 (Suppl 10): x186‑x190, 2006.

9. Shen W, Hu JA και Zheng JS: Μηχανισμός αντικαρκινικών επιδράσεων που προκαλούνται από τεμοζολομίδη σε κύτταρα γλοιώματος. J Int Med Res 42: 164-172, 2014.

10.Barciszewska AM, Gurda D, Głodowicz P, Nowak S και Naskręt‑Barciszewska MZ: Ένας νέος επιγενετικός μηχανισμός δράσης τεμοζολομίδης σε κύτταρα γλοιώματος. PLoS One 10: e0136669, 2015.