Περίληψη

Οξεία νεφρική βλάβη (ΑΚΙ)είναι μια κρίσιμη κατάσταση που χαρακτηρίζεται από ταχεία μείωση τουνεφρική λειτουργίαλόγω πολλαπλών παραγόντων όπως η νεφροτοξικότητα, η σήψη και η ισχαιμία.Κάκωση νεφρούείναι μια μακροπρόθεσμη, πολύπλοκη διαδικασία, με την αρχική βλάβη να εξελίσσεται δυνητικάχρόνια νεφρική νόσοκαι μάλιστανεφρική ανεπάρκεια τελικού σταδίου. Το AKI εκδηλώνεται μέσω νεφρικής παρεγχυματικής βλάβης, σωληναριακής νέκρωσης και μειωμένου ρυθμού σπειραματικής διήθησης, οδηγώντας σε μειωμένη παραγωγή ούρων, ανισορροπία ηλεκτρολυτών, συσσώρευση μεταβολικών αποβλήτων και αυξημένα επίπεδα αζώτου ουρίας αίματος (BUN), κρεατινίνης ορού (Scr) και ουρικού οξέος. Το AKI εμφανίζεται συχνά ως μέρος κλινικών συνδρόμων όπως η καρδιακή ανεπάρκεια ή η ηπατική ανεπάρκεια, επηρεάζοντας το 10-15% των νοσηλευόμενων ασθενών και έως και το 50% των ασθενών σε μονάδες εντατικής θεραπείας (ΜΕΘ). Η ταχεία εμφάνιση και η κακή πρόγνωση της ΑΚΙ την έχουν καταστήσει παγκόσμια πρόκληση για τη δημόσια υγεία. Οι τρέχουσες δυτικές ιατρικές θεραπείες βασίζονται κυρίως σε υποστηρικτικές θεραπείες και θεραπείες υποκατάστασης, οι οποίες είναι δαπανηρές και συχνά αποδίδουν μη βέλτιστα αποτελέσματα. Η παραδοσιακή κινεζική και μογγολική ιατρική, με τις ρίζες της σε χιλιάδες χρόνια ολιστικής πρακτικής, προσφέρει μια προσέγγιση πολλαπλών στόχων, πολλαπλών οδών και πολλαπλών αποτελεσμάτων με υψηλή αποτελεσματικότητα και ασφάλεια. Τα τελευταία χρόνια, η παραδοσιακή ιατρική έχει γίνει ένα καυτό ερευνητικό θέμα για τη θεραπεία ΑΚΙ. Έτσι, η διερεύνηση του μηχανισμού της μογγολικής ιατρικής που περιέχει Cistanche στη θεραπεία με AKI έχει σημαντική αξία.

Η μογγολική σύνθετη ιατρική με βάση το Cistanche είναι μια κλασική συνταγή που αποτελείται απόCistanche, ρόδι, κανέλα, μακρύ πιπέρι (Piper longum), Alpinia officinarum, Amomum villosum, καιBorneol. Σύμφωνα με την παραδοσιακή μογγολική ιατρική θεωρία, ο νεφρός βρίσκεται στη θέση "Badagan" μεταξύ των πέντε σπλάχνων και οι νεφρικές ασθένειες είναι συχνά τύπου Badagan, που προκαλούνται από το κρύο. Οι φόρμουλες που περιέχουν κιστάνσο, είναι ζεστές στη φύση τους, πιστεύεται ότι διώχνουν το κρύο των νεφρών και ασκούν προστατευτικά αποτελέσματα στη νεφρική λειτουργία, σύμφωνα με τη μογγολική αρχή της «θεραπείας του κρύου με θερμότητα». Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τέτοιες φόρμουλες, όταν χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με άλλα μογγολικά φάρμακα, παρέχουν προστασία των νεφρών σε μοντέλα AKI. Με βάση αυτό, η παρούσα μελέτη στοχεύει να χρησιμοποιήσει τη φαρμακολογία δικτύου και την πειραματική επικύρωση για να διερευνήσει τα βιοενεργά συστατικά, τους θεραπευτικούς στόχους και τις βασικές οδούςΜογγολική ιατρική που περιέχει κιστάνζη για τη βελτίωση της ΑΚΙ, θέτοντας θεωρητικά θεμέλια για την κλινική εφαρμογή και περαιτέρω ανάπτυξή του.

 

 

 

συμπληρώματα cistanche γιαΑσθενείς με οξεία νεφρική βλάβη (ΑΚΙ).

Κάντε κλικ στην εικόνα για να λάβετε περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με το συμπλήρωμα βότανο cistanche

 

 

1. Υλικά και Μέθοδοι

1.1 Δικτυακή Φαρμακολογική Ανάλυση

1.1.1 Προσδιορισμός Δραστικών Ενώσεων και Στόχων

Χρησιμοποιώντας τις λέξεις-κλειδιά "Cistanche, Piper longum, Alpinia officinarum, κανέλα, ρόδι, Amomum villosum, Borneol", αναζητήσαμε τοΒάση δεδομένων Φαρμακολογίας Συστημάτων Παραδοσιακής Κινεζικής Ιατρικής (TCMSP)[http://tcmsp-e.com] για την ανάκτηση βιοδραστικών ενώσεων και των στόχων τους. Τα κριτήρια διαλογής ήταν:βιοδιαθεσιμότητα από το στόμα (OB) μεγαλύτερη από ή ίση με 30%καιομοιότητα φαρμάκου (DL) Μεγαλύτερη ή ίση με 0,18. Για το Cistanche και την κανέλα, τα οποία στερούνται συστατικών που πληρούν αυτά τα όρια, συμπληρώσαμε τα δεδομένα ένωσης/στόχου χρησιμοποιώντας βιβλιογραφική ανασκόπηση καιSwissTargetPrediction[https://www.swisstargetprediction.ch/]. Δεδομένου ότι το κύριο συστατικό της βορνεόλης είναι το χλωριούχο αμμώνιο, αποκλείστηκε από περαιτέρω ανάλυση. Όλοι οι πρωτεϊνικοί στόχοι που συλλέχθηκαν τυποποιήθηκανΟνόματα γονιδίων Homo sapiensχρησιμοποιώντας τοUniProtβάση δεδομένων [https://www.uniprot.org].

1.1.2 Κατασκευή Δικτύου Σύνθετου-Στόχου

Τα δεδομένα που συλλέχθηκαν οργανώθηκαν σε αρχεία NETWORK και TYPE και αναλύθηκαν χρησιμοποιώνταςCytoscape 3.9.1για την κατασκευή ενός δικτύου αλληλεπίδρασης ένωσης-στόχου για τη μογγολική ιατρική που βασίζεται στο Cistanche.

1.1.3 Διαλογή Στόχων που σχετίζονται με το AKI

Οι στόχοι που σχετίζονται με το AKI ελήφθησαν χρησιμοποιώντας τις λέξεις-κλειδιά "οξεία νεφρική βλάβη" και "οξεία νεφρική ανεπάρκεια" από:

GeneCards[https://www.genecards.org/]

ΟΜΙΜ[https://omim.org/]

Βάση δεδομένων θεραπευτικού στόχου (TTD)[https://db.idrblab.net/ttd/]

Τράπεζα Φαρμάκων[https://www.drugbank.com/]

PharmGKB[https://www.pharmgkb.org/]

Τα διαγράμματα Venn δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα διαδικτυακό εργαλείο [https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/] για τον εντοπισμό επικαλυπτόμενων στόχων μεταξύ των βάσεων δεδομένων.

1.1.4 Προσδιορισμός βασικών ενώσεων και στόχων, Κατασκευή δικτύου PPI

Χρησιμοποιώντας τοΑναλυτής δικτύουλειτουργία στο Cytoscape, αναλύσαμε το δίκτυο σύνθετων-στόχων. Κόμβοι μεβαθμός κεντρικότητα, μεταξύ κεντρικότητας, καικεντρικότητα εγγύτηταςπάνω από τη διάμεσο, καιμέσο μήκος της συντομότερης διαδρομήςκάτω από τη διάμεση τιμή, επιλέχθηκαν μέσω τεσσάρων γύρων για την ταυτοποίηση των ενώσεων του πυρήνα. Κοινοί στόχοι μεταξύ της ένωσης και στόχων που σχετίζονται με την ασθένεια εισήχθησαν στοΣΕΙΡΑβάση δεδομένων [https://cn.string-db.org/], είδη που ορίζονται σε Homo sapiens, για την κατασκευή τουαλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (PPI)δίκτυο. Το δίκτυο εξήχθη σε μορφή TSV για περαιτέρω ανάλυση στο Cytoscape. Τρεις γύροι διαλογής απέδωσανπιθανούς στόχους, και έξι γύροι απέδωσανβασικούς στόχους. Οδίκτυο πυρήνα στόχου-δυνητικού στόχουκατασκευάστηκε επίσης στο Cytoscape.

1.1.5 Ανάλυση εμπλουτισμού GO και KEGG

Η ανάλυση εμπλουτισμού πραγματοποιήθηκε σεRStudio 4.3.1χρησιμοποιώνταςBioconductor και ClusterProfilerπακέτα. Οι σχολιασμοί γονιδιακής οντολογίας (GO) περιλάμβαναν βιολογική διεργασία (BP), κυτταρικό συστατικό (CC) και μοριακή λειτουργία (MF).Εμπλουτισμός διαδρομής KEGGδιενεργήθηκε επίσης. Η οπτικοποίηση ολοκληρώθηκε μέσωBioinformatics.com.cn[https://www.bioinformatics.com.cn/].

1.1.6 Κατασκευή Δικτύου Core Compound–Target–Disease–Pathway Network

Οι προσδιορισμένες βασικές ενώσεις, οι πιθανοί στόχοι, οι σχετικές ασθένειες και οι οδοί σηματοδότησης ενσωματώθηκαν για την κατασκευή ενόςδίκτυο πυρήνα ένωσης-στόχος-ασθένεια-μονοπάτιχρησιμοποιώντας το Cytoscape 3.9.1.

1.1.7 Μοριακή σύνδεση

Οι δομές βασικών ενώσεων κατεβάστηκαν απόPubChem[https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/] σε μορφή SDF και μετατράπηκε σε MOL2 χρησιμοποιώνταςΑνοίξτε τη Babel 2.4.1. Οι δομές πρωτεϊνών του πυρήνα ανακτήθηκαν από τοΠΣΠ[https://www.rcsb.org/], επιλεγμένο με βάση την προέλευση του Homo sapiens, την υψηλή ανάλυση και κατά προτίμηση τις απλές αλυσίδες. Η μοριακή σύνδεση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώνταςAutoDockTools 1.5.7, με 50 εκτελέσεις χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Γενετικού Αλγόριθμου. Επιλέχθηκε η καλύτερη διαμόρφωση σύνδεσης με την υψηλότερη συγγένεια δέσμευσης και τους περισσότερους δεσμούς υδρογόνου. Τα αποτελέσματα απεικονίστηκαν σεPyMOL 2.5.7.

1.2 Πειραματική επικύρωση

1.2.1 Πειραματόζωα

Αρσενικά ποντίκια KM 4 εβδομάδων βαθμού SPF (22 ± 2 g) αγοράστηκαν από την SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. (Αρ. άδειας SCXK (Jing) 2024-0001). Τα ποντίκια στεγάστηκαν στο εργαστήριο ζώων του Ιατρικού Κολλεγίου Baotou, στο Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Εσωτερικής Μογγολίας. Συνθήκες: 12 ώρες κύκλος φωτός/σκότους, 24 ± 2 βαθμοί, υγρασία 55 ± 5%, τροφοδοσία κατά βούληση. Τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Ιδρύματος (Αρ. Έγκρισης BYDY-DL2023-36).

1.2.2 Παρασκευή φαρμάκων

Μογγολικό φάρμακο με βάση το Cistanche (Αριθμός παρτίδας. 907031) αλέστηκε μέσω κόσκινου 100 mesh και εναιωρήθηκε σε 0,5% CMC-Na.

1.2.3 Αντιδραστήρια και όργανα

Βασικά αντιδραστήρια:

CMC-Na (Solarbio, Πεκίνο)

Λιποπολυσακχαρίτης (Sigma-Aldrich, Σαγκάη)

Κιτ εξαγωγής RNA και αντίστροφης μεταγραφής (Sevier Biotech, Wuhan)

κύριο μείγμα qPCR, ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA, κιτ BCA, αντισώματα: PI3K, Akt, p-Akt, -ακτίνη (Proteintech, Wuhan)

Κιτ ανίχνευσης ECL (Sevier Biotech, Wuhan)

Βασικά όργανα:

Αναγνώστης μικροπλάκας (Thermo Fisher)

Φυγόκεντρος (JIDI-16R)

Σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο (Thermo Fisher)

Σύστημα απεικόνισης gel (Tanon, Σαγκάη)

1.2.4 Ομαδοποίηση, Μοντελοποίηση και Διαχείριση

32 ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 4 ομάδες (n=8):

Ελεγχος

Μοντέλο

Ομάδα χαμηλής δόσης Cistanche (450 mg/kg)

Ομάδα Cistanche υψηλής δόσης (900 mg/kg)

Οι ομάδες Cistanche έλαβαν καθημερινή στοματική καθετηριασμό για 7 ημέρες. Την Ημέρα 7, 2 ώρες μετά τη χορήγηση, όλες οι ομάδες εκτός από τον έλεγχο ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά μεLPS (10 mg/kg)να προκαλέσουν ΑΚΙ. Η ομάδα ελέγχου έλαβε φυσιολογικό ορό.

1.2.5 Μορφολογία νεφρού, σωματικό βάρος και δείκτης νεφρών

24 ώρες μετά τη μοντελοποίηση, το σωματικό βάρος και το βάρος των νεφρών καταγράφηκαν. Δείκτης νεφρού=συνολικό βάρος νεφρού (g) / σωματικό βάρος (kg).

1.2.6 Βιοχημικές Δοκιμές

Τα επίπεδα BUN, Scr και ουρικού οξέος ορού μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ.

1.2.7 Ιστοπαθολογική Ανάλυση

Οι ιστοί των νεφρών σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, αφυδατώθηκαν, ενσωματώθηκαν σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώνταςΑΥΤΟΣ χρώση. Η βλάβη των ιστών εκτιμήθηκε με μικροσκόπιο φωτός.

1.2.8 qRT-PCR για TNF- , IL-6, IL-1

Ολικό RNA από ιστό νεφρού εκχυλίστηκε, αντιστράφηκε η μεταγραφή και ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green qPCR. Το GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Η σχετική έκφραση mRNA υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τοΜέθοδος 2^-ΔΔCt.

1.2.9 Western Blotting για PI3K/Akt Pathway

Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από ιστό νεφρού χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα RIPA. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με δοκιμασία BCA. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν μέσω SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF, μπλοκαρίστηκαν και διερευνήθηκαν με πρωτογενή και δευτερεύοντα αντισώματα. Τα σήματα αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας ECL και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώνταςImageJλογισμικό.

1.3 Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώνταςGraphPad Prism 9.5. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ωςμέσος όρος ± SD. Για κανονικά κατανεμημένα δεδομένα με ίση διακύμανση,μονόδρομη ANOVAακολουθούμενη απόΔοκιμή LSD-tχρησιμοποιήθηκε. Για μη κανονικά ή άνισα δεδομένα διακύμανσης,Kruskal-Wallis H τεστεφαρμόστηκε. ΕΝΑΤιμή P < 0,05θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.