Κοινωνική ανοσία στις μέλισσες: Βασιλικός πολτός ως όχημα για τη μεταφορά θραυσμάτων βακτηριακού παθογόνου μεταξύ των φωλιών

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ

Η κοινωνική ανοσία είναι μια σουίτα συμπεριφορικών και φυσιολογικών χαρακτηριστικών που επιτρέπουν στα μέλη της αποικίας να προστατεύουν το ένα το άλλο από παθογόνα και περιλαμβάνει τη στοματική μεταφορά ανοσολογικών ενώσεων μεταξύ των φωλιών. Στις μέλισσες, ο βασιλικός πολτός είναι ένα αδενικό έκκριμα που παράγεται από ένα υποσύνολο εργατών που ταΐζουν τη βασίλισσα και τις νεαρές προνύμφες και το οποίο περιέχει πολλές αντιμικροβιακές ενώσεις. Μια σχετική μορφή κοινωνικής ανοσίας, το transgenerational immune priming (TGIP), επιτρέπει στις βασίλισσες να μεταφέρουν θραύσματα παθογόνου στα αναπτυσσόμενα αυγά τους, όπου αναγνωρίζονται από το ανοσοποιητικό σύστημα του εμβρύου και προκαλούν υψηλότερη αντίσταση στα παθογόνα στους νέους απογόνους. Αυτά τα θραύσματα παθογόνου μεταφέρονται από τη βιτελογενίνη (Vg), μια πρόδρομη πρωτεΐνη του κρόκου αυγού που χρησιμοποιείται επίσης από τις νοσοκόμες για τη σύνθεση βασιλικού πολτού.

Επομένως, ο βασιλικός πολτός μπορεί να χρησιμεύσει ως όχημα για τη μεταφορά θραυσμάτων παθογόνου από εργάτες σε άλλους συντρόφους. Για να το διερευνήσουμε αυτό, δείξαμε πρόσφατα ότι τα βακτήρια που καταπίνονται μεταφέρονται στους αδένες που παράγουν ζελέ των νοσοκόμων και εδώ, δείχνουμε ότι θραύσματα παθογόνων ενσωματώνονται στον βασιλικό πολτό. Επιπλέον, δείχνουμε ότι η κατανάλωση παθογόνων κυττάρων προκαλεί υψηλότερα επίπεδα ενός αντιμικροβιακού πεπτιδίου που βρίσκεται στον βασιλικό πολτό, την defensin-1.

Η από του στόματος χορήγηση ανοσολογικών ενώσεων μπορεί να επηρεάσει σημαντικά την ανθρώπινη ανοσοποιητική λειτουργία. Αυτές οι ενώσεις μπορούν να βελτιώσουν την ανοσία ενισχύοντας ή ρυθμίζοντας το ανοσοποιητικό σύστημα του σώματος. Η ανοσία είναι η αντίσταση του οργανισμού στις ασθένειες, συμπεριλαμβανομένων των μηχανισμών άμυνας όπως τα κύτταρα του ανοσοποιητικού και τα αντισώματα. Οι ενώσεις ανοσοποίησης από το στόμα μπορούν να ενεργοποιήσουν τη δραστηριότητα των ανοσοκυττάρων, να αυξήσουν την παραγωγή αντισωμάτων στο σώμα και να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό παθογόνων βακτηρίων και ιών, βελτιώνοντας έτσι την ανοσία και μειώνοντας τον κίνδυνο μόλυνσης. Επιπλέον, η από του στόματος χορήγηση ανοσολογικών ενώσεων μπορεί να μειώσει τη φλεγμονή και να μειώσει τον πόνο και την ενόχληση που σχετίζεται με τη νόσο, βελτιώνοντας έτσι την ποιότητα ζωής. Έτσι, υπάρχει ισχυρή σχέση μεταξύ της από του στόματος χορήγησης ανοσολογικών ενώσεων και της ανοσίας. Από αυτό, μπορούμε να δούμε ότι πρέπει να δώσουμε προσοχή στη βελτίωση του ανοσοποιητικού μας. Το Cistanche μπορεί να ενισχύσει την ανοσία. Οι πολυσακχαρίτες στο κρέας μπορούν να ρυθμίσουν την ανοσολογική απόκριση του ανθρώπινου ανοσοποιητικού συστήματος, να βελτιώσουν την ικανότητα στρες των ανοσοκυττάρων και να ενισχύσουν το αποτέλεσμα της αποστείρωσης των ανοσοκυττάρων.

Κάντε κλικ στα οφέλη για την υγεία του κιστάνσε

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ:

Μέλισσες, Κοινωνική ανοσία, Βασιλικός πολτός, Αμερικάνικη βρωμιά.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Ο βασιλικός πολτός έχει γοητεύσει από καιρό τους βιολόγους λόγω του βασικού ρόλου που διαδραματίζει στην ανάπτυξη της κάστας των μελισσών. Αυτή η αδενική έκκριση παράγεται από ένα υποσύνολο της εργατικής κάστας που είναι γνωστή ως νοσοκόμες και ταΐζεται στη βασίλισσα καθ' όλη την ανάπτυξή της και την ενήλικη ζωή της, ενώ οι προνύμφες που προορίζονται για εργάτριες τρέφονται με βασιλικό πολτό για τις πρώτες 3 ημέρες της ζωής τους προτού μεταβούν σε άλλο διατροφή με βάση τη γύρη (Johansson, 1955, Haydak, 1970, Townsend and Lucas, 1940). Καθώς προχωρούσαν οι μέθοδοι αναλυτικής χημείας, οι επιστήμονες άρχισαν να μελετούν τα θρεπτικά συστατικά του βασιλικού πολτού και διαπίστωσαν ότι περιείχε πολλές ουσίες που σκοτώνουν παθογόνα που προστατεύουν τη βασίλισσα και τις νεαρές προνύμφες από ασθένειες (Blum et al., 1959; Fontana et al., 2004; Fujiwara et al., 1990· Okamoto et al., 2003· Romanelli et al., 2011· Sugiyama et al., 2012· Vucevic et al., 2007). Η μεταφορά αντιπαθογόνων ενώσεων μεταξύ των φωλιών είναι μια μορφή κοινωνικής ανοσίας, μια σουίτα συμπεριφορικών και φυσιολογικών χαρακτηριστικών που βοηθούν τα μέλη της αποικίας να προστατεύουν το ένα το άλλο από παθογόνα (Cremer et al., 2007).

Μια σχετική μορφή κοινωνικής ανοσίας, η διαγενεακή ανοσολογική εκκίνηση (TGIP), έχει επίσης συγκεντρώσει μεγάλη προσοχή τα τελευταία χρόνια (Sadd et al., 2005; Moret, 2006; Freitak et al., 2009, 2014; Zanchi et al., 2011; López et al., 2014· Knorr et al., 2015· Salmela et al., 2015). Εδώ, τα θηλυκά έντομα που επιβιώνουν από μια επίθεση παθογόνου μπορούν να μεταφέρουν θραύσματα παθογόνου στα αυγά τους και να παράγουν απογόνους που είναι πιο ανθεκτικοί στις ασθένειες. Αυτά τα θραύσματα παθογόνου περιέχουν μοριακά μοτίβα που σχετίζονται με παθογόνο, δομικά συστατικά που βρίσκονται στα κυτταρικά τοιχώματα των μικροβιακών κυττάρων, τα οποία πυροδοτούν μια ανοσολογική απόκριση στους αναπτυσσόμενους απογόνους. Ενώ το TGIP έχει αποδειχθεί σε μέλισσες, οι μελέτες βασίστηκαν στην έγχυση εμβολίου στις βασίλισσες και αυτό παρουσίασε ένα πρόβλημα: πώς θα μπορούσε μια βασίλισσα να εμβολιαστεί με παθογόνα υπό φυσικές συνθήκες, δεδομένου ότι τρέφεται αποκλειστικά με βασιλικό πολτό και δεν έχει καμία ευκαιρία να καταναλώσει δυνητικά μολυσμένο νέκταρ και γύρη που συλλέγουν οι τροφοσυλλέκτες της; Μια σημαντική ανακάλυψη από την ομάδα μας άφησε να εννοηθεί ένα νέο πιθανό μονοπάτι. Οι βασίλισσες μεταφέρουν θραύσματα παθογόνου στα αυγά τους χρησιμοποιώντας βιτελογενίνη (Vg) (Salmela et al., 2015), μια πρόδρομη πρωτεΐνη του κρόκου αυγού που χρησιμοποιείται επίσης από νοσοκόμες για τη σύνθεση βασιλικού πολτού (Amdam et al., 2003).

Έτσι, οι μέλισσες μπορούν να χρησιμοποιήσουν τον βασιλικό πολτό ως όχημα για τη μεταφορά θραυσμάτων παθογόνου μεταξύ νοσοκόμων και βασίλισσες και τις προνύμφες ως μέρος ενός ανοσοποιητικού μονοπατιού σε επίπεδο αποικίας. Σε ένα πρώτο βήμα για την αποσαφήνιση αυτής της οδού, δείξαμε ότι οι νοσοκόμες που κατάποσαν βακτήρια μπόρεσαν να τα μεταφέρουν από το μέσο έντερο τους στους αδένες που παράγουν ζελέ και ότι η κατάρρευση της έκφρασης vg εμπόδισε αυτή τη διαδικασία (Harwood et al., 2019). Τώρα, επιδιώκουμε να προσδιορίσουμε εάν οι νοσοκόμες που καταπίνουν βακτηριακά παθογόνα μπορούν να τα ενσωματώσουν στον βασιλικό τους πολτό και εάν η κατάποση παθογόνων αυξάνει επίσης τη συγκέντρωση άλλων αντιμικροβιακών συστατικών στον βασιλικό πολτό.

Η κατανόηση των μονοπατιών του ανοσοποιητικού στις μέλισσες είναι σημαντική όχι μόνο για τον τομέα της οργανικής βιολογίας αλλά και για την ανθρώπινη διατροφική ασφάλεια. Οι μέλισσες είναι οι κορυφαίοι επικονιαστές εντόμων στη γεωργία, προσθέτοντας τουλάχιστον 15 δισεκατομμύρια δολάρια ετησίως στην αξία των καλλιεργειών μόνο στις ΗΠΑ (δελτίο τύπου του USDA, 6 Απριλίου 2020.

Ωστόσο, οι υψηλές ετήσιες απώλειες αποικιών συνεχίζουν να μαστίζουν τους Αμερικανούς μελισσοκόμους (Υπουργείο Γεωργίας των Ηνωμένων Πολιτειών, 2019), λόγω πολλαπλών στρεσογόνων παραγόντων όπως η έκθεση σε φυτοφάρμακα και η κακή διατροφή. Ωστόσο, τα παράσιτα και τα παθογόνα των μελισσών είναι επίσης σημαντικοί παράγοντες και συχνά ανιχνεύονται σε αποικίες που έχουν χαθεί (Υπουργείο Γεωργίας των Ηνωμένων Πολιτειών, 2019). Αυτά τα παθογόνα περιλαμβάνουν ένα πλήθος βακτηρίων, μυκήτων και ιών, πολλά από τα οποία δεν έχουν φαρμακολογική θεραπεία. Η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο η κοινωνική ανοσία μεσολαβεί στις λοιμώξεις από παθογόνους παράγοντες θα μπορούσε να επιτρέψει πιο ολοκληρωμένα θεραπευτικά σχήματα και να βοηθήσει στη μείωση του φόρτου της νόσου που συμβάλλει στις απώλειες αποικιών.

Είναι σημαντικό να κατανοήσουμε πώς έλαβαν οι μηχανισμοί κοινωνικής ασυλίας στις 12 Ιουνίου 2020. Αποδεκτό στις 17 Φεβρουαρίου 2021 συμπληρώνει τις ανοσολογικές άμυνες που υπάρχουν σε μεμονωμένες μέλισσες.

Οι μέλισσες έχουν πολλά στρώματα άμυνας, ξεκινώντας με δομικούς φραγμούς όπως μια υδατοστεγή επιδερμίδα που εμποδίζει την είσοδο παθογόνων (Moret and Moreau, 2012). Τα παθογόνα που καταπίνονται θα καταλήξουν στο μέσο έντερο, το όργανο που είναι υπεύθυνο για την πέψη και την απορρόφηση, και εδώ αντιμετωπίζουν ένα άλλο φυσικό εμπόδιο, την περιτροφική μήτρα (Brandt et al., 1978; Lehane, 1997; Hegedus et al., 2009). Αυτή είναι μια χιτινώδης ουσία που εκκρίνεται από τα επιθηλιακά κύτταρα του μέσου εντέρου και λειτουργεί ως κόσκινο για να εμποδίζει την απορρόφηση μεγάλων σωματιδίων όπως τα παθογόνα κύτταρα.

Εάν τα παθογόνα παραβιάσουν αυτούς τους φυσικούς φραγμούς, ανιχνεύονται από υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων παθογόνων που ενεργοποιούν αρκετές κυτταρικές και χυμικές ανοσοαποκρίσεις. Οι κυτταρικές άμυνες μπορεί να περιλαμβάνουν φαγοκυττάρωση από αιμοκύτταρα (Evans and Spivak, 2010; Marringa et al., 2014; Lavine and Strand, 2002), ενώ οι χυμικές αποκρίσεις μπορεί να περιλαμβάνουν την παραγωγή μελανίνης για την ενθυλάκωση ξένων σωματιδίων (González-Santobayo, και Cóguar 2012) και την παραγωγή αντιμικροβιακών πεπτιδίων (AMPs) που σκοτώνουν άμεσα παθογόνα (Bulet και Stöcklin, 2005· Bulet et al., 1999· Evans et al., 2006). Η απόκριση μελανοποίησης προκαλείται όταν η πρωτεάση της σερίνης από το δηλητήριο της μέλισσας (Bi-VSP) ενεργοποιεί τον καταρράκτη της φαινολοοξειδάσης που οδηγεί στην παραγωγή μελανίνης (Choo et al., 2010). Τα AMP, όπως η λυσοζύμη και η ντεφενσίνη-1, επάγονται μετά την ενεργοποίηση των οδών Toll ή ανοσολογικής ανεπάρκειας (IMD) (De Gregorio et al., 2002).

Παρά το ισχυρό αντιπαθογόνο οπλοστάσιο, οι μέλισσες διαθέτουν λιγότερα γονίδια που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό από τα μοναχικά είδη μελισσών (Evans et al., 2006; Claudianos et al., 2006), χάρη σε μεγάλο βαθμό στην εξέλιξη της κοινωνικής ανοσίας. Ο βασιλικός πολτός περιέχει πολλά από τα ένζυμα και τα πεπτίδια που μόλις συζητήθηκαν, συμπεριλαμβανομένου του Bi-VSP, της λυσοζύμης και της ντεφενσίνης-1, καθώς και οξειδάση γλυκόζης, η οποία παράγει υπεροξείδιο του υδρογόνου που επίσης σκοτώνει παθογόνα (Fontana et al., 2004; Fujiwara et al., 1990· Romanelli et al., 2011· Furusawa et al., 2008· Han et al., 2011· Fujita et al., 2012). Αυτή η ενισχυμένη τροφή είναι ιδιαίτερα σημαντική για τα πιο ευάλωτα μέλη της αποικίας, τις νεαρές προνύμφες, των οποίων η άμυνα του ανοσοποιητικού εξακολουθεί να αναπτύσσεται. Για παράδειγμα, οι νεαρές προνύμφες έχουν χαμηλότερα επίπεδα προ-φαινολοοξειδάσης (Chan and Foster, 2008; Chan et al., 2009) (σημαντική στον καταρράκτη μελανοποίησης) και AMPs (Chan and Foster, 2008) και το μεσαίο έντερο που ωριμάζει ακόμη. Η περιτροφική μήτρα αφήνει το επιθήλιο του μέσου εντέρου ευάλωτο σε παραβίαση (Yue et al., 2008; Garcia-Gonzalez and Genersch, 2013; Riessberger-Gallé et al., 2016).

Ως αποτέλεσμα, οι προνύμφες είναι ευαίσθητες σε ορισμένες ασθένειες που είναι αρκετά αβλαβείς για τους ενήλικες. Αυτό περιλαμβάνει την αμερικανική βρωμιά, που προκαλείται από τα θετικά κατά Gram βακτήρια Paenibacillus larvae που σχηματίζουν σπόρους (Genersch, 2010· Hansen and Brødsgaard, 1999). Η αμερικανική λοίμωξη από όρνιθα δεν είναι μόνο θανατηφόρα για τις αποικίες αλλά και δαπανηρή για τους μελισσοκόμους επειδή τα σπόρια είναι ανθεκτικά και παραμένουν βιώσιμα για χρόνια, πράγμα που σημαίνει ότι οι μελισσοκόμοι αναγκάζονται να καταστρέψουν τις μολυσμένες κυψέλες. Έτσι, οι προνύμφες επωφελούνται από την τροφή που συμπληρώνεται με ενώσεις που σκοτώνουν παθογόνα ή με σωματίδια παθογόνου που μπορούν να προκαλέσουν ανοσολογική εκκίνηση.

Σε αυτή τη μελέτη, ο στόχος μας ήταν διπλός: πρώτον, να προσδιορίσουμε εάν οι νοσοκόμες που καταναλώνουν αμερικάνικα βλαστικά κύτταρα θα μπορούσαν να ενσωματώσουν θραύσματα παθογόνου στον βασιλικό πολτό τους και δεύτερον, να εξακριβώσουμε εάν αυτό προκαλεί υψηλότερα επίπεδα ανοσοποιητικών πρωτεϊνών που βρίσκονται στον βασιλικό πολτό. Για το σκοπό αυτό, ταΐσαμε νοσοκόμες με κύτταρα προνύμφης P. που είχαν επισημανθεί με φθορισμό και θανατώθηκαν από τη θερμότητα και εξετάσαμε τον βασιλικό πολτό που παρήγαγαν στη συνέχεια. Χρησιμοποιήσαμε μικροσκόπιο φθορισμού για να επιβεβαιώσουμε την παρουσία θραυσμάτων κυττάρων βακτηρίων στον βασιλικό πολτό και φασματομετρία μάζας για να συγκρίνουμε το πρωτεομικό προφίλ του βασιλικού πολτού από αποικίες που προσβλήθηκαν και αποικίες ελέγχου. Ειδικότερα, δοκιμάσαμε την υπόθεση ότι ο βασιλικός πολτός από αποικίες που προκλήθηκαν θα ήταν υψηλότερος στις ανοσοποιητικές πρωτεΐνες οξειδάση γλυκόζης, Bi-VSP, λυσοζύμη και ντεφενσίνη-1.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Καλλιέργεια παθογόνων βακτηρίων

Τα φυτικά κύτταρα του P. larvae ελήφθησαν από τη συλλογή καλλιέργειας του Πανεπιστημίου του Göteburg και καλλιεργήθηκαν υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης βακτηρίων. Εν συντομία, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ζωμό MYPG και διατηρήθηκαν στους 37 βαθμούς όλη τη νύχτα σε αναδευόμενο επωαστήρα, προτού επιστρωθούν σε άγαρ MYPG και αφέθηκαν να επωαστούν για 1 εβδομάδα στους 37 βαθμούς. Μετά από αυτό, τα βλαστικά κύτταρα συλλέχθηκαν και εναιωρήθηκαν σε 1× ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS), πριν θανατωθούν με θερμότητα σε αυτόκλειστο. Τα προκύπτοντα μη βιώσιμα βακτηριακά κύτταρα συζεύχθηκαν στη συνέχεια σε μια φθορίζουσα χρωστική χρησιμοποιώντας το κιτ επισήμανσης σωματιδίων ερυθρού φαγοκυττάρου pHrodo™ (Invitrogen #a10026) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μόλις βάφτηκαν, τα κύτταρα P. larvae εναιωρήθηκαν σε 1× PBS σε συγκέντρωση 10 mg ml−1 και αποθηκεύτηκαν στους 4 βαθμούς μέχρι να είναι έτοιμα για χρήση.

Πείραμα μελισσών και διατροφής

Οι φυσικά ζευγαρωμένες ευρωπαϊκές μέλισσες, Apis mellifera Linnaeus 1758, διατηρήθηκαν σε τυπικά κουτιά κυψέλης Langstroth στο Πανεπιστήμιο του Ελσίνκι στην πανεπιστημιούπολη Vikki στη Φινλανδία. Αυτές οι τυπικές κυψέλες Langstroth χρησίμευσαν ως δωρητές για μικρότερες αποικίες χωρίς βασίλισσες που στεγάζονται σε κυψέλες που ζευγαρώνουν. Για να δημιουργηθούν αυτές οι μικρότερες αποικίες χωρίς βασίλισσες, ένα τμήμα χτένας γόνου που περιείχε 1-προνύμφες μιας ημέρας διαστάσεων 12 cm×12 cm αφαιρέθηκε από την κυψέλη δότη και μεταφέρθηκε σε ένα μίνι κουτί Nuc ζευγαρώματος. Περίπου 100–200 νοσοκόμες μεταφέρθηκαν επίσης από την ίδια κυψέλη δότη και τοποθετήθηκαν στο κουτί mini-mating Nuc. Οι νοσοκόμες αναγνωρίστηκαν ως εκείνα τα άτομα που εθεάθησαν να εισέρχονται σε κύτταρα γόνου και να ταΐζουν προνύμφες στην κυψέλη δότη.

Συνολικά, δημιουργήθηκαν N{{0}} μικρές αποικίες χωρίς βασίλισσες, η καθεμία από μια ξεχωριστή κυψέλη δωρητών. Οι αποικίες έγιναν χωρίς βασίλισσα για να παρακινηθούν οι νοσοκόμες να παράγουν περισσότερο βασιλικό πολτό για να φτιάξουν μια νέα βασίλισσα (Sahinler και Kaftanoglu, 1997). Οι νοσοκόμες και οι νεαρές προνύμφες σφραγίστηκαν στα κουτιά mini ζευγάρωσης Nuc για 3 ημέρες και εφοδιάστηκαν με διάλυμα σακχαρόζης 30% σε τροφοδότη σύριγγας αναρτημένη από την οροφή. Ν=3 αποικίες έλαβαν δίαιτα ελέγχου, ενώ η Ν=3 είχε σημασμένες με φθορισμό προνύμφες P. που προστέθηκε στη σακχαρόζη τους σε τελική συγκέντρωση παθογόνου 0,6 mg ml−1. Οι δίαιτες ελέγχου και παθογόνων ανανεώνονταν με φρέσκα τρόφιμα καθημερινά. Μετά τις 3 ημέρες, ο πρόσφατα κατατεθειμένος βασιλικός πολτός συλλέχθηκε από τις κηρήθρες γόνου εργατών κάθε αποικίας και χωρίστηκε σε μία από τις δύο ροές εργασίας: μικροσκοπία φθορισμού ή ανάλυση πρωτεϊνικής.

Μικροσκόπιο φθορισμού

Ο βασιλικός πολτός από κάθε χτένα μεταφέρθηκε σε σωλήνες αντίδρασης 200 μΐ. Για να υπολογίσουμε τον όγκο του ζελέ που ελήφθη από κάθε κυψέλη, προγεμίσαμε 30 σωλήνες αντίδρασης με αυξανόμενους όγκους νερού που κυμαίνονταν από 1 έως 30 μl και βάλαμε δύο παρατηρητές ανεξάρτητα και τυφλά να αξιολογήσουν ποιος όγκος νερού ταίριαζε με τον όγκο του βασιλικού πολτού. Και στις 6 περιπτώσεις, κάθε δείγμα βασιλικού πολτού έλαβε την ίδια εκτίμηση όγκου από τους δύο παρατηρητές. Στη συνέχεια, κάθε δείγμα βασιλικού πολτού αραιώθηκε με 1 × PBS (ρΗ 7,4) σε τελική συγκέντρωση 10 τοις εκατό κατ' όγκο και στροβιλίστηκε. Στη συνέχεια τα δείγματα εφαρμόστηκαν σε αιμοκυτταρόμετρο και εξετάστηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού Leica DM6000. Στο αιμοκυτταρόμετρο, το οπτικό πεδίο χωρίζεται ομοιόμορφα σε 9 τμήματα και κάναμε παρατηρήσεις σε 5 συνολικά τμήματα: τα 4 γωνιακά τμήματα και το κεντρικό τμήμα. Αυτό μας επέτρεψε να υπολογίσουμε τη συγκέντρωση των φθοριζόντων σωματιδίων ανά μικρολίτρο βασιλικού πολτού (C), χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:

όπου P είναι ο συνολικός αριθμός θετικών σωματιδίων φθορισμού που παρατηρούνται σε κάθε δείγμα, S είναι ο συνολικός αριθμός τετραγώνων που παρατηρούνται στο αιμοκυτταρόμετρο (N{{0}}), V είναι ο όγκος κάθε τετραγώνου που παρατηρείται στο αιμοκυτταρόμετρο (0,1 µl) και D είναι ο συντελεστής αραίωσης του βασιλικού πολτού (αραίωση 10×). Όλα τα δείγματα παρατηρήθηκαν κάτω από τις ίδιες ρυθμίσεις μικροσκοπίου.

Η κάμερα ορίστηκε σε ανάλυση {{0}}bit (Waters, 2009), η οποία αποδίδει μια τιμή έντασης φωτεινότητας που κυμαίνεται από 0 έως 65.535. Για να αναγνωρίσουμε θετικά σήματα φθορισμού στα δείγματα διατροφής παθογόνων, έπρεπε πρώτα να καθορίσουμε ένα βασικό επίπεδο θορύβου περιβάλλοντος, πάνω από το οποίο θα μπορούσαμε να προσδιορίσουμε εάν ένα σήμα ήταν πραγματικός φθορισμός ή απλώς ένα τεχνούργημα. Για να γίνει αυτό, εξετάσαμε τις τιμές έντασης από κάθε εικόνα των δειγμάτων ελέγχου-δίαιτας μας και σε καθεμία, αφαιρέσαμε την τιμή ελάχιστης έντασης από τη μέγιστη τιμή έντασης για να λάβουμε ένα εύρος θορύβου περιβάλλοντος (Waters, 2009). Στη συνέχεια, συγκρίναμε όλες τις εικόνες δειγμάτων διατροφής ελέγχου-διατροφής για να λάβουμε μια μέση και τυπική απόκλιση του εύρους του θορύβου περιβάλλοντος. Στη συνέχεια, θεωρήσαμε ότι οποιοδήποτε σήμα παρατηρήσαμε στα δείγματα δίαιτας παθογόνων ως θετικό σήμα φθορισμού πάνω από το θόρυβο περιβάλλοντος, εάν ήταν τουλάχιστον 3 τυπικές αποκλίσεις (P Μικρότερο ή ίσο με 0,01) πάνω από το μέσο εύρος έντασης υποβάθρου. Το μέσο εύρος έντασης υποβάθρου (sd) ήταν 329±27

Πρόσθετοι θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι

Για να επιβεβαιώσουμε ότι τα επισημασμένα βακτήρια μπορούν να φθορίζουν στον βασιλικό πολτό, συλλέξαμε δείγματα βασιλικού πολτού από πολλές περιοχές της Ευρώπης και της Βόρειας Αμερικής (Αυστρία, Νορβηγία, Αριζόνα και Ιλινόις, ΗΠΑ), τα αραιώσαμε στο 10 τοις εκατό σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS, και προστέθηκαν επισημασμένα βακτήρια (1 τοις εκατό κατ' όγκο) απευθείας στα δείγματα. Χρησιμοποιήσαμε ρυθμιστικό διάλυμα PBS σε τυπικό pH 7,4 (όπως χρησιμοποιήθηκε παραπάνω), ή σε μειωμένο pH 4.0 που ταιριάζει με την οξύτητα του βασιλικού πολτού για να προσδιορίσουμε εάν η οξύτητα του περιβάλλοντος επηρεάζει το επίπεδο φθορισμού, όπως αναφέρεται στο κατασκευαστής κιτ ετικετών. Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε επίσης έναν πρόσθετο αρνητικό έλεγχο (pH 4,0 PBS, χωρίς επισημασμένα βακτήρια) για να επιβεβαιώσουμε ότι οι παρατηρήσεις του φθορισμού δεν οφείλονταν σε τεχνουργήματα μικροσκοπίας ή αυτοφθορισμό συστατικών υλικού. Βρήκαμε ότι δείγματα βασιλικού πολτού από όλες τις γεωγραφικές περιοχές έδειξαν φθορισμό όταν προστέθηκαν επισημασμένα βακτήρια, ανεξάρτητα από το pH του ρυθμιστικού που χρησιμοποιήθηκε (Εικ. S1). Αυτή η εργασία μικροσκοπίας εκτελέστηκε σε Zeiss AxioZoom V16 χρησιμοποιώντας μια μονόχρωμη κάμερα Axiocam HRm.

Προετοιμασία δείγματος για πρωτεομική ανάλυση

Τα δείγματα βασιλικού πολτού αραιώθηκαν με την προσθήκη 150 μl 8 mol l−1 ουρίας και υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε λουτρό νερού. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσαρμόστηκε στα 2,1 mg ml−1 χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Bradford με τελικό όγκο 100 μl. Οι δεσμοί κυστεΐνης μειώθηκαν με 45 mmol l-1 διθειοθρεϊτόλη (#D0632, Sigma-Aldrich) για 20 λεπτά στους 37 βαθμούς και αλκυλιώθηκαν με 0,1 mol l-1 ιωδοακεταμίδιο (#57670 Fluka, Sigma-Aldrich) σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα υπέστησαν πέψη προσθέτοντας 0,75 μg τρυψίνης (Τροποποιημένη Τρυψίνη Βαθμού Αλληλουχίας, V5111, Promega) όλη τη νύχτα στους 37 βαθμούς. Μετά την πέψη, τα πεπτίδια καθαρίστηκαν με C18 micro spin στήλες (Harvard Apparatus) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα αποξηραμένα πεπτίδια ανασυστάθηκαν σε ρυθμιστικό Α (30 μΐ 0,1 τοις εκατό τριφθοροξικό οξύ σε 1 τοις εκατό ακετονιτρίλιο).

Υγρή χρωματογραφία συζευγμένη με διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC-MS/MS)

Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε υγρό χρωματογράφο EASY-nLC1{{10}}00 (Thermo Fisher Scientific) συνδεδεμένο με υβριδικό φασματόμετρο μάζας Velos Pro-Orbitrap Elite (Thermo Fisher Scientific) με πηγή ιόντων νανοηλεκτροψεκασμού ( Thermo Fisher Scientific). Τα δείγματα LC-MS/MS διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας μια διάταξη δύο στηλών που αποτελείται από μια στήλη παγίδας C18-Pepmap 2 cm (Thermo Fisher Scientific), ακολουθούμενη από μια αναλυτική στήλη C18-Pepmap 15 cm ( Thermo Fisher Scientific). Η γραμμική βαθμίδα διαχωρισμού αποτελούνταν από 5 τοις εκατό ρυθμιστικό διάλυμα Β (0,1 τοις εκατό τριφθοροξικό οξύ σε 98 τοις εκατό ακετονιτρίλιο) για 5 λεπτά, 35 τοις εκατό ρυθμιστικό διάλυμα Β για 60 λεπτά, 80 τοις εκατό ρυθμιστικό διάλυμα Β για 5 λεπτά και 100 τοις εκατό ρυθμιστικό διάλυμα Β για 10 λεπτά σε ροή ρυθμός 0,3 μl min−1. Για κάθε δοκιμή LC-MS/MS, εγχύθηκαν 6 μΙ του δείγματος και αναλύθηκαν. Ελήφθη πλήρης σάρωση MS με ανάλυση 60,000 στο κανονικό εύρος μάζας στον αναλυτή τροχιάς και ακολούθησε το CID-MS2 top 20 πιο έντονα πρόδρομα ιόντα εντός της παγίδας ιόντων (ενέργεια 35). Τα δεδομένα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό LTQ Tune.

Αναγνώριση πρωτεΐνης

Σε μια προσέγγιση πρωτεομικής κυνηγετικής όπλου, οι πρωτεΐνες χωνεύονται ενζυματικά σε μικρότερα πεπτίδια και στη συνέχεια αυτά τα πεπτίδια αντιστοιχίζονται με πρωτεΐνες σε ένα σχολιασμένο γονιδίωμα. Μερικές από αυτές τις πεπτιδικές αλληλουχίες μπορεί να μοιράζονται πολλές πρωτεΐνες, ενώ μερικές είναι μοναδικές σε μία μεμονωμένη πρωτεΐνη στο πρωτεϊνό. Η ανάλυσή μας έδωσε συνολικά 496 χτυπήματα πρωτεΐνης που περιείχαν τουλάχιστον 1 ταίριασμα φάσματος πεπτιδίου (PSM) και 1 μοναδικό πεπτίδιο.

Για να αποκλείσουμε περαιτέρω τα ψευδώς θετικά, θεωρήσαμε μόνο τις πρωτεΐνες με τουλάχιστον 2 μοναδικά πεπτίδια ως αξιόπιστες πρωτεϊνικές επιτυχίες, όπως έχει γίνει σε άλλες μελέτες πρωτεϊνικής του βασιλικού πολτού (Hu et al., 2019; Zhang et al., 2014) και εν μέρει επειδή η πειραματική διακύμανση στα στάδια προετοιμασίας του δείγματος επηρεάζει περισσότερο τις λιγότερο άφθονες πρωτεΐνες σε φασματομετρικά δείγματα μάζας (Zhang et al., 2010). Οι πρωτεΐνες σχολιάστηκαν στο γονιδίωμα της μέλισσας Amel_4.5 και χρησιμοποιήσαμε το UniProt και τη GenBank για να επιβεβαιώσουμε τις ταυτότητες και τις λειτουργίες τους. Στη συνέχεια, συγκρίναμε την αφθονία 4 πρωτεϊνών που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σε βασιλικό πολτό διατροφής ελέγχου και δίαιτας παθογόνου: οξειδάση γλυκόζης, BiVSP, λυσοζύμη και ντεφενσίνη-1.

Στατιστική ανάλυση

Για να αξιολογήσουμε την αφθονία των πρωτεϊνών που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό μεταξύ του βασιλικού πολτού της δίαιτας ελέγχου και του βασιλικού πολτού με παθογόνο, συγκρίναμε τις τιμές PSM των επιλεγμένων πρωτεϊνών μας. Χρησιμοποιήσαμε μη παραμετρικές δοκιμές αθροίσματος κατάταξης Wilcoxon για να αντιμετωπίσουμε το περιορισμένο μέγεθος δείγματος (N=3 ανά θεραπεία). Χρησιμοποιήσαμε συγκρίσεις μιας ουράς καθώς οι προγραμματισμένες υποθέσεις μας προέβλεπαν ότι αυτές οι επιλεγμένες ανοσοποιητικές πρωτεΐνες θα ρυθμίζονταν προς τα πάνω στον βασιλικό πολτό από αποικίες που τρέφονταν με παθογόνο. Οι αναδιπλώσεις στην αφθονία πρωτεϊνών υπολογίστηκαν ως (PSMpathogen−PSMcontrol)/PSMcontrol. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε R (έκδοση 3.5.2).

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Θραύσματα παθογόνου σε βασιλικό πολτό

Διαπιστώσαμε ότι τα δείγματα βασιλικού πολτού από όλες τις αποικίες δίαιτας παθογόνων περιείχαν σωματίδια που φθορίζονταν σε σημαντικά υψηλότερη ένταση από το καθιερωμένο όριο φθορισμού υποβάθρου (βλ. Υλικά και Μέθοδοι), υποδηλώνοντας ότι τα βακτηριακά θραύσματα ενσωματώθηκαν στον βασιλικό πολτό. Κανένα δείγμα βασιλικού πολτού με δίαιτα ελέγχου δεν περιείχε σωματίδια που ξεπέρασαν αυτό το όριο (Εικ. 1). Κατά μέσο όρο, οι αποικίες με δίαιτα παθογόνων είχαν 66,67±28,87 (μέση ± sd) φθορίζοντα σωματίδια ανά μικρολίτρο βασιλικού πολτού (N=3) ​​ενώ οι αποικίες που τροφοδοτήθηκαν με έλεγχο είχαν 0 φθορίζοντα σωματίδια ανά μικρολίτρο βασιλικού πολτού ( Ν=3) (Εικ. 1).

Proteomics

Βρήκαμε συνολικά 496 επιτυχίες πρωτεΐνης και από αυτές, οι 44 είχαν τουλάχιστον 2 μοναδικά πεπτίδια που τους είχαν εκχωρηθεί (Πίνακας 1). Οι πιο άφθονες πρωτεΐνες σε όλα τα δείγματα ήταν οι κύριες πρωτεΐνες του βασιλικού πολτού, όπως ήταν αναμενόμενο. Γενικά, οι πρωτεΐνες που παρατηρήσαμε στα δείγματά μας ήταν αρκετά συνεπείς με άλλες πρόσφατες πρωτεομικές μελέτες του βασιλικού πολτού (Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Fujita et al., 2012, 2013; Hu et al., 2019; Zhang et al., 2014), αλλά υπάρχουν μερικές πρωτεΐνες που εντοπίστηκαν σε αυτή τη μελέτη που δεν έχουν αναφερθεί αλλού. Αυτά περιλαμβάνουν την Transferrin, ένα μόριο μεταφοράς σιδήρου (Kucharski and Maleszka, 2003) που βρίσκεται επίσης στον ιστό του αδένα από το δηλητήριο της μέλισσας (Peiren et al., 2008). Σερπίνη-5, ένας αναστολέας πρωτεάσης σερίνης γνωστός ότι ρυθμίζει την ενεργοποίηση της προφαινολοοξειδάσης σε άλλα έντομα (Li et al., 2016). Αγκινάρα, μια χημειοαισθητηριακή πρωτεΐνη με λειτουργίες στην κίνηση των προνυμφών στο Drosophila melanogaster (Andrés et al., 2014); και NPC{15}}όπως ένας μεταφορέας χοληστερόλης με υπονοούμενες αλλογονικές λειτουργίες στις μέλισσες (Thompson et al., 2006). Βρήκαμε επίσης 3 πρόσθετες πρωτεΐνες στα δείγματα βασιλικού πολτού μας με παθογόνο: υπεροξειδάση γλουταθειόνης, ισομεράση πεπτιδυλ-προλυλ cis-trans και μια αχαρακτηρισμένη πρωτεΐνη (LOC725202). Αυτές οι πρωτεΐνες βρέθηκαν επίσης στα δείγματα της δίαιτας ελέγχου-μάρτυράς μας, αλλά απέτυχαν να ικανοποιήσουν τα κριτήριά μας να έχουν 2 μοναδικά πεπτίδια (Πίνακας 1).

Κατά τη σύγκριση δειγμάτων δίαιτας ελέγχου και δίαιτας παθογόνου, παρατηρήσαμε πολύ μικρή αλλαγή στη σχετική αφθονία πρωτεϊνών εντός του βασιλικού πολτού (Πίνακας 1). Μεταξύ των εστιακών ανοσολογικών πρωτεϊνών μας, δεν βρήκαμε σημαντική διαφορά στα επίπεδα πρωτεΐνης μεταξύ των θεραπειών για την οξειδάση της γλυκόζης (U=7, P=0.9), Bi-VSP (U=1.5, Ρ=0.134), ή λυσοζύμη (U=2, Ρ=0.184). Ωστόσο, βρήκαμε σημαντικά περισσότερη AMP defensin-1 σε δείγματα δίαιτας παθογόνων παρά σε δείγματα δίαιτας ελέγχου (U=0, P=0.05) ( Εικ. 2). Είχε πάσο-αλλαγή συν 0,68.

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Αυτή η μελέτη δείχνει ότι οι νοσοκόμες που καταπίνουν κύτταρα του παθογόνου P. larvae φαίνεται να ενσωματώνουν θραύσματα των κυττάρων στον βασιλικό πολτό που παράγουν (Εικ. 1). Πρόσφατα δείξαμε ότι τα βακτήρια που καταπίνονται από εργάτες μεταφέρονται στους υποφαρυγγικούς αδένες, τη θέση σύνθεσης του βασιλικού πολτού (Harwood et al., 2019) και εδώ δείχνουμε ότι ενσωματώνονται στον βασιλικό πολτό. Αυτό το εύρημα αντιπροσωπεύει μια αγνοημένη οδό κοινωνικής ανοσίας που μπορεί να επιτρέψει στους συντρόφους να μοιράζονται την ανοσολογική μνήμη. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν επίσης ότι η σύνθεση του βασιλικού πολτού μπορεί να είναι ευαίσθητη σε ξένο υλικό που κυκλοφορεί συστηματικά στην αιμολέμφο. Σε μια παρόμοια πρόσφατη μελέτη, οι ερευνητές διαπίστωσαν ότι οι νοσοκόμες που τρέφονταν με δίκλωνο RNA (dsRNA) μπόρεσαν να ενσωματώσουν αυτά τα μόρια στον βασιλικό πολτό και να τα μεταφέρουν σε προνύμφες, όπου το dsRNA παρέμεινε βιολογικά ενεργό (Maori et al., 2019). Το dsRNA ενεργοποιεί την αντιική οδό παρεμβολής RNA (RNAi) που προκαλεί σίγηση γονιδίου ειδικής αλληλουχίας και το συνθετικό dsRNA χρησιμοποιείται συχνά για στοχευμένες μελέτες εξουδετέρωσης γονιδίων (Fire et al., 1998). Επιπλέον, μια άλλη μελέτη έδειξε ότι οι νοσοκόμες που τρέφονται με φυτοφάρμακα μπορούν επίσης να ενσωματώσουν ίχνη αυτών των αγροχημικών στον βασιλικό πολτό τους (Böhme et al., 2018), αν και εδώ δόθηκε έμφαση στο πόσο καλά οι υποφαρυγγικοί αδένες εμποδίζουν τα συστηματικά φυτοφάρμακα να εισέλθουν στον βασιλικό πολτό .

Ωστόσο, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η σύνθεση του βασιλικού πολτού μπορεί να είναι ευαίσθητη στην κατάσταση των μελισσών που θηλάζουν. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι ο βασιλικός πολτός μπορεί να χρησιμεύσει ως αγωγός για το AB Εικ. 1. Μικρογραφίες φθορισμού και φωτεινού πεδίου δειγμάτων βασιλικού πολτού από θεραπείες με δίαιτα ελέγχου και δίαιτα παθογόνου που παρατηρήθηκαν σε αιμοκυτταρόμετρο. Όλα τα δείγματα (Α, θεραπεία με δίαιτα ελέγχου, Β, θεραπεία με παθογόνο με δίαιτα) παρασκευάστηκαν ταυτόχρονα χρησιμοποιώντας πανομοιότυπα πρωτόκολλα και παρατηρήθηκαν κάτω από τις ίδιες ρυθμίσεις μικροσκοπίου χρησιμοποιώντας ένα Leica DM6000. Οι σκοτεινές εικόνες στις αριστερές στήλες τραβήχτηκαν με λέιζερ TRITC για τον προσδιορισμό του φθορισμού στο μήκος κύματος του Texas Red, ενώ οι εικόνες στις δεξιές στήλες είναι εικόνες φωτεινού πεδίου της ίδιας περιοχής για να δείξουν την εναπόθεση βασιλικού πολτού στο αιμοκυτταρόμετρο. Θετικές κηλίδες φθορισμού (λευκά βέλη) παρατηρήθηκαν μόνο στα δείγματα δίαιτας παθογόνου (Β) και όχι στα δείγματα δίαιτας ελέγχου (Α). 4 άμεσες ερωτήσεις.

Πρώτον, πώς η έκθεση σε ένα παθογόνο οδηγεί σε νοσοκόμες που παράγουν υψηλά επίπεδα defensin-1 στον βασιλικό πολτό; Μια πιθανότητα είναι ότι θραύσματα P. larvae συνδέονται με υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων παθογόνου στην οδό Toll (για θετικά κατά Gram βακτήρια) και προκαλούν μεγαλύτερη γονιδιακή μεταγραφή της ντεφενσίνης-1, αλλά τα στοιχεία για αυτό είναι κάπως ασυνεπή. Μελέτες έχουν δείξει ότι οι ενήλικες εργαζόμενοι που εκτίθενται σε βακτήρια, συμπεριλαμβανομένου του αμερικάνικου λάθους, θα αυξήσουν την έκφραση της άμυνας-1 (Evans et al., 2006; CasteelsJosson et al., 1994), αλλά μια πρόσφατη μελέτη απέτυχε να παρατηρήσει σημαντική ανοδική ρύθμιση της έκφραση ντεφενσίνης-1 σε ιστό κεφαλής νοσοκόμας μετά από έκθεση σε American foulbrood (López-Uribe et al., 2017).

Ωστόσο, τα AMP εντόμων όπως η ντεφενσίνη-1 μπορούν να παρατηρηθούν στην αιμολέμφο για εβδομάδες μετά την έκθεση σε παθογόνο (Casteels, 1998), ακόμη και όταν η μεταγραφή τέτοιων γονιδίων AMP υποχωρεί κατά τη διάρκεια αυτού του χρόνου (Uttenweiler-Joseph et al., 1998), Μόνο η μέτρηση της γονιδιακής έκφρασης μπορεί να χάσει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τη διαθεσιμότητα των τελικών πεπτιδικών προϊόντων. Εναλλακτικά, η έκθεση σε παθογόνο μπορεί να ρυθμίσει προς τα πάνω τη μετάφραση του mRNA της ντεφενσίνης-1 σε πεπτίδια ή να αυξήσει τον ρυθμό των μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων που χρησιμοποιούνται για την ενεργοποίηση του πεπτιδίου (Casteels-Josson et al., 1994), αλλά αυτό θα πρέπει να μελέτησε περαιτέρω.

Το δεύτερο ερώτημα που εγείρεται από αυτά τα αποτελέσματα είναι εάν μια σχετική αναδίπλωση του συν 0.68 στο defensin-1 είναι βιολογικά σχετική. Συμβατικά, πολλές μελέτες ανθρώπινης πρωτεομικής επιλέγουν ένα όριο συν 1,2 για σημαντική ανοδική ρύθμιση (Serang et al., 2013; Keenan et al., 2009), επομένως το defensin-1 δεν πληροί αυτό το κριτήριο. Ωστόσο, ακόμη και οι μέτριες αυξήσεις στη συγκέντρωση της ντεφενσίνης-1 στον βασιλικό πολτό μπορεί να βελτιώσουν την αντίσταση των προνυμφών στον αμερικανικό όρνιθα. Όχι μόνο έχει αποδειχθεί ότι η ντεφενσίνη-1 αναστέλλει άμεσα την αμερικανική τροφή (Bachanová et al., 2002; Bíliková et al., 2001) αλλά επίσης είναι αποτελεσματική έναντι των θετικών κατά Gram βακτηρίων σε συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο 1 μmol l− 1 (Fujiwara et αϊ., 1990). Επιπλέον, πολλά συστατικά του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος είναι γνωστό ότι λειτουργούν συνεργιστικά, όπου δύο συστατικά που συνεργάζονται έχουν μεγαλύτερες ανασταλτικές επιδράσεις στα παθογόνα από το άθροισμα κάθε συστατικού που λειτουργεί ανεξάρτητα.

Για παράδειγμα, οι δοκιμασίες αναστολής της βακτηριακής ανάπτυξης έχουν δείξει ότι τα AMPs και η λυσοζύμη συνεργάζονται για να ενισχύσουν σημαντικά το ένα την αποτελεσματικότητα του άλλου (Chalk et al., 1994). Η λυσοζύμη έχει επίσης αποδειχθεί ότι καταπολεμά παθογόνα συνεργικά με την απολιποπρωτεΐνη-III (ApoLp-III) (Zdybicka-Barabas et al., 2013), μια πρωτεΐνη μεταφοράς λιπιδίων με αντιπαθογόνες λειτουργίες στα έντομα (Whitten et al., 2004; και Jin, 2015) που βρίσκεται στον βασιλικό πολτό (Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Zhang et al., 2014; Fujita et al., 2013). Τέλος, το ώριμο ανοσοποιητικό σύστημα των νεαρών προνυμφών μελισσών μπορεί να δυσκολεύεται να παράγει την άμυνά τους-1 όταν δέχεται επίθεση από αμερικανούς όρνιθες, καθώς μελέτες έχουν δείξει ότι μια τέτοια πρόκληση προκαλεί ελάχιστη έως καθόλου έκφραση άμυνας-1 στις προνύμφες (Romanelli et al., 2011 Cremer et al., 2007· Serang et al., 2013· Keenan et al., 2009, αν και βλέπε Bachanová et al., 2002 για εξαίρεση). Έτσι, πρόσθετη άμυνα-1 από εκτεθειμένες νοσοκόμες μπορεί να συμπληρώσει την έλλειψη αυτού του κρίσιμου AMP από τις προνύμφες. Συνολικά, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι ακόμη και οι μέτριες αυξήσεις της ντεφενσίνης-1 στον βασιλικό πολτό μπορεί να είναι βιολογικά σχετικές με την προστασία των πιο ευάλωτων μελών της αποικίας.

Αυτή η μελέτη έδειξε επίσης τον κρίσιμο ρόλο που παίζει η πρωτεΐνη Vg στην ανοσία των μελισσών. Λόγω του ρόλου του ως υποδοχέα αναγνώρισης προτύπων παθογόνου, ο οποίος έχει τεκμηριωθεί σε ένα ευρύ φάσμα ζωικών ταξινομήσεων (Salmela et al., 2015; Du et al., 2017; Garcia et al., 2010; Knight, 2019; Li et al., 2015. al., 2008, 2009; Liu et al., 2009; Zhang et al., 2011), καθώς και ο ρόλος του στο σχηματισμό αυγών, το Vg έχει αναγνωριστεί ως η πρωτεΐνη φορέας που μεταφέρει ανοσοδιεγέρτες στα αυγά της βασίλισσας (Salmela et al. al., 2015). Ομοίως, σε νοσηλευτές, πρόσφατα ευρήματα υποδηλώνουν ότι το Vg παίζει βασικό ρόλο στη μεταφορά των παθογόνων παραγόντων στους υποφαρυγγικούς αδένες (Harwood et al., 2019). Το Vg προσλαμβάνεται από τους υποφαρυγγικούς αδένες των νοσηλευτών για να χρησιμοποιηθεί ως δότης αμινοξέων στην παραγωγή βασιλικού πολτού (Amdam et al., 2003) και το Vg μπορεί να μεταφέρει βακτήρια στους αδένες για να ενσωματωθούν στον πολτό. Έτσι, το Vg μπορεί να παίζει ρόλο σε όλα τα στάδια της TGIP σε επίπεδο αποικίας στις μέλισσες, από τον πρώτο εμβολιασμό και την ενσωμάτωση στον βασιλικό πολτό έως την παράδοση στη βασίλισσα ή τις προνύμφες και τέλος στη μεταφορά στις ωοθήκες της βασίλισσας.

Αυτή η μελέτη έδειξε ότι η σύνθεση του βασιλικού πολτού μπορεί να αλλοιωθεί από μια πρόκληση παθογόνου, τόσο με την ενσωμάτωση θραυσμάτων παθογόνου όσο και μέσω αυξημένων επιπέδων της αμυντικής ουσίας AMP-1. Η ικανότητα μεταφοράς θραυσμάτων παθογόνου στον βασιλικό πολτό σημαίνει ότι η διαγενεακή ανοσολογική εκκίνηση μπορεί να λειτουργεί σε επίπεδο αποικίας στις μέλισσες. Εκτός από μια κατακόρυφη μεταφορά ανοσολογικών διεγερτών από ένα αναπαραγωγικό θηλυκό στους απογόνους του, οι μέλισσες μπορεί να έχουν μια πιο περίπλοκη οδό που πηγαίνει από ενήλικους απογόνους (νοσοκόμες) σε αναπαραγωγικά θηλυκά σε μελλοντικούς απογόνους, καθώς και οριζόντια μετάδοση από ενήλικους απογόνους σε ανώριμους απόγονος. Το πλεονέκτημα εδώ θα ήταν ότι οι προνύμφες εμβολιάζονται με ένα μεγαλύτερο ρεπερτόριο ανοσοδιεγερτών που συσσωρεύονται από τη συλλογική ανοσολογική εμπειρία των εργαζομένων που συγκεντρώνουν πόρους έξω από τη φωλιά, καθιστώντας τις προνύμφες πιο ανθεκτικές έναντι παθογόνων που είναι πιθανό να συναντήσουν όταν βγουν από τη φωλιά. .

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τους Siiri Fuchs, Salla Lohi, Mati Leponiemi, Franziska Dickel, Maarit Nurminen, Marianne Teichmann και Taina Stark για τη βοήθειά τους στη συλλογή δεδομένων και τη συμβουλευτική ανάλυσης. Ευχαριστούμε επίσης τον Austin Cyphersmith για την τεχνική βοήθεια με τη μικροσκοπία.

Ανταγωνιστικά συμφέροντα

Η GH και η GA δεν δηλώνουν ανταγωνιστικά ή οικονομικά συμφέροντα. Οι HS και DF αναφέρονται ως εφευρέτες σε ένα δίπλωμα ευρεσιτεχνίας (WO2017017313A1) για ένα βρώσιμο εμβόλιο μέλισσας. Αυτό το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας έχει εκχωρηθεί στην Dalan Animal Health Inc., όπου η DF υπηρετεί ως Επικεφαλής Επιστημονικός Υπεύθυνος. Η έρευνα που παρουσιάζεται σε αυτό το έγγραφο διεξήχθη ανεξάρτητα, χωρίς οικονομικούς, υλικούς ή αναλυτικούς πόρους που παρέχονται από την Dalan Animal Health Inc. ή οποιαδήποτε άλλη εμπορική επιχείρηση.

Συνεισφορές συγγραφέα

Εννοιολόγηση: GH, HS, GA; Μεθοδολογία: GH, HS; Επικύρωση: GH; Τυπική ανάλυση: GH, HS; Διερεύνηση: GH, HS; Πόροι: HS, DF, GA; Επιμέλεια δεδομένων: GH; Γραφή - πρωτότυπο προσχέδιο: GH; Συγγραφή - κριτική & μοντάζ: GH, HS, DF, GA; Οπτικοποίηση: GH; Επίβλεψη: GA; Διαχείριση έργου: DF, GA; Απόκτηση χρηματοδότησης: GH, DF, GA

Χρηματοδότηση

Η GH υποστηρίχθηκε από το Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Ερευνών και Υποστήριξης του Πολιτειακού Πανεπιστημίου της Αριζόνα (LM51097GH). Το DF υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση Business Finland (2348/31/2017) και επιχορήγηση της Ακαδημίας της Φινλανδίας (6303369). Το GA υποστηρίχθηκε από το Norges Forskningsråd (262137).

For more information:1950477648nn@gmail.com