Η γήρανση του δέρματος είναι ένα σύνθετο βιολογικό φαινόμενο λόγω της φυσιολογικής μείωσης

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Αφηρημένη:Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να ελεγχθεί η ανασταλτική δράση των εκχυλισμάτων φρούτων από την Washingtonia filifera σε ένζυμα που σχετίζονται με τη γήρανση του δέρματος. Τα εκχυλίσματα πολτού δεν άσκησαν σημαντική αναστολή ενζύμων ενώ τα εκχυλίσματα σπόρων από το W.filifera εμφανίζουν αντι-ελαστάση, αντι-κολλαγενάση και αντι-τυροσινάση δράση. Η τυροσινάση αναστάλθηκε ήπια, ενώ παρατηρήθηκε ισχυρότερη επίδραση σε σχέση με την αναστολή της ελαστάσης και της κολλαγενάσης. Τα αλκοολούχα εκχυλίσματα έδωσαν καλύτερα αποτελέσματα από τα υδατικά εκχυλίσματα. Μεταξύ αυτών, τα εκχυλίσματα μεθανόλης έδειξαν ότι οι εξέχουσες ενζυμικές ανασταλτικές δραστηριότητες είναι η τιμή IC5o για την ελαστάση και την κολλαγενάση συγκρίσιμη και ακόμη καλύτερη από την ένωση αναφοράς. Ο τρόπος αναστολής των πιο δραστικών εκχυλισμάτων διερευνήθηκε με ανάλυση διαγράμματος Lineweaver-Burk. Τα εκχυλίσματα σπόρων από το W.filifera διερευνήθηκαν επίσης για τη φωτοπροστατευτική τους δράση με την εξίσωση Mansur και η αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος W.filifera αξιολογήθηκε σε κύτταρα υπό οξειδωτικό στρες. Για να αξιολογηθεί η ασφάλεια του εκχυλίσματος, αναλύθηκε η επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων των ανθρώπινων κερατινοκυττάρων.χαμένη αυτοκρατορία cistancheΤο εκχύλισμα μεθανόλης παρουσίασε την καλύτερη φωτοπροστατευτική δράση και άσκησε αντιοξειδωτική δράση σε ένα κυτταρικό σύστημα χωρίς κυτταροτοξική δράση. Τα συνολικά αποτελέσματα δείχνουν ότι τα εκχυλίσματα W.filifera είναι πολλά υποσχόμενες πηγές βιοδραστικών ενώσεων που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σε καλλυντικά και φαρμακευτικά παρασκευάσματα.

Λέξεις-κλειδιά:αναστολή ενζύμου; κολλαγενάση; ελαστάση; τυροσινάση; φυτικά εκχυλίσματα? σπόροι? γήρανση του δέρματος? Φιλιφερά Ουάσιγκτον

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

1. Εισαγωγή

Η γήρανση του δέρματος είναι ένα πολύπλοκο βιολογικό φαινόμενο λόγω της φυσιολογικής μείωσης των λειτουργιών του δέρματος και πολλών εξωγενών περιβαλλοντικών παραγόντων, όπως η υπεριώδης ακτινοβολία, οι χημικές ουσίες και τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS). Το δέρμα είναι το μεγαλύτερο και πιο εκτεθειμένο μέρος του σώματος και η έκθεση στην ηλιακή ακτινοβολία UV αντιπροσωπεύει έναν από τους πιο σημαντικούς εξωτερικούς παράγοντες που προκαλούν στρες: η φωτοεπαγόμενη γήρανση του δέρματος που σχετίζεται με το οξειδωτικό στρες. Το ROS που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία μπορεί να ξεκινήσει πολύπλοκα μοριακά μονοπάτια, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης ενζύμων που αποικοδομούν τις πρωτεΐνες της εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) στο χόριο, αλλάζοντας την ακεραιότητα του δέρματος [1]. Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της γήρανσης του δέρματος είναι πράγματι η απώλεια της δομής της ECM, η οποία περιλαμβάνει πολλές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένου του κολλαγόνου και της ελαστίνης, οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ελαστικότητας του δέρματος [2]. Η αποικοδόμηση της ECM οφείλεται κυρίως στην ενισχυμένη δραστηριότητα πρωτεολυτικών ενζύμων, όπως η κολλαγενάση και η ελαστάση. Η αναστολή αυτών των ενζυματικών δραστηριοτήτων από φυσικές φυτικές ενώσεις μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την πρόληψη της γήρανσης του δέρματος [3]. Η κολλαγενάση (EC 3.4.24.3) ανήκει στην οικογένεια των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας και μπορεί να αποικοδομήσει την τριπλή ελικοειδή περιοχή του κολλαγόνου υπό φυσιολογικές συνθήκες.μικρονισμένο καθαρισμένο κλάσμα φλαβονοειδών 1000 mg χρήσειςΤο κολλαγόνο είναι το ινώδες συστατικό του ECM και η κύρια δομική πρωτεΐνη στο ανθρώπινο δέρμα, παρέχοντας δομική υποστήριξη για τα οστά, τους τένοντες, τους συνδέσμους και τα αιμοφόρα αγγεία. Η ελαστάση (EC3.4.21.36) είναι ένα πρωτεολυτικό ένζυμο που εμπλέκεται στη φυσιολογική αποικοδόμηση της ελαστίνης, της πρωτεΐνης ECM που είναι υπεύθυνη για την ελαστικότητα του δέρματος. Αύξηση της δραστηριότητας της ελαστάσης έχει βρεθεί σε αρκετές ασθένειες, για παράδειγμα, ψωρίαση, δερματίτιδα, φλεγμονώδεις διεργασίες και πρόωρη γήρανση του δέρματος, που συνδέονται στενά με το σχηματισμό ρυτίδων[4].

Το Cistanche μπορεί να αντιγηρανθεί

Επιπλέον, μία από τις σημαντικότερες αλλαγές που σχετίζονται με τις ρυτίδες στους ηλικιωμένους είναι η εμφάνιση υπερμελάγχρωσης κηλίδων, γνωστών και ως γεροντική φακοφθαλμία ή κηλίδες ηλικίας. Συνδέονται άμεσα με την ανομοιόμορφη μελάγχρωση λόγω της δραστηριότητας ενός άλλου ενζύμου που σχετίζεται με τη γήρανση που ονομάζεται τυροσινάση. Η τυροσινάση (EC 1.14.18.1) είναι το περιοριστικό της ταχύτητας ένζυμο στο μεταβολισμό της μελανίνης. Καταλύει την υδροξυλίωση της L-τυροσίνης σε 3,4-διυδροξυφαινυλαλανίνη (L-DOPA), ακολουθούμενη από την οξείδωση της L-DOPA σε ντοπακινόνη. Ο οξειδωτικός πολυμερισμός των παραγώγων ντοπακινόνης δημιουργεί μελανίνη [5]. Η σύνθεση χρωστικών μελανίνης είναι μια φυσιολογική διαδικασία που παίζει καθοριστικό ρόλο στην πρόληψη της βλάβης του δέρματος που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία απορροφώντας την υπεριώδη ηλιακή ακτινοβολία. Παρά τα πλεονεκτήματά της, η υπερβολική παραγωγή ή η μη φυσιολογική συσσώρευση μελανίνης προκαλεί δερματικά προβλήματα όπως οι τυπικές κηλίδες ηλικίας. Δεδομένου ότι το δέρμα είναι το πιο ορατό όργανο του σώματος, η πρόωρη εμφάνιση ρυτίδων και η υπερμελάγχρωση μπορεί επίσης να προκαλέσει συναισθηματική δυσφορία σε μερικούς ανθρώπους.

Έτσι, οι αναστολείς όλων των ενζύμων που περιγράφηκαν παραπάνω μπορεί να αντιπροσωπεύουν όλο και πιο σημαντικά συστατικά σε καλλυντικά και φάρμακα για την πρόληψη της γήρανσης του δέρματος [6]. Τα φυσικά φυτικά προϊόντα θα μπορούσαν να είναι μια πολλά υποσχόμενη πηγή βιοδραστικών ενώσεων. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον για εφαρμογές αντιγήρανσης, τα εκχυλίσματα διαθέτουν πολλαπλές ευεργετικές λειτουργίες, όπως η αναστολή των ενζύμων που σχετίζονται με τη γήρανση και η ικανότητα δέσμευσης των ελεύθερων ριζών.

Στην προηγούμενη εργασία μας, περιγράψαμε την αντιοξειδωτική ικανότητα και αρκετές βιολογικές δραστηριότητες των εκχυλισμάτων σπόρων W.filifera [7]. Ουάσιγκτον filifera (Lindl.) H. Wendl., κοινώς γνωστός ως ο φοίνικας των θαυμαστών της Καλιφόρνια ή ο φοίνικας των θαυμαστών της ερήμου, είναι ένας αειθαλής φοίνικας εγγενής στη Νότια Καλιφόρνια, την Αριζόνα, το Μεξικό και τις ζώνες της ερήμου.οφλαβονοειδέςΑυτός ο φοίνικας, με ύψος 15-20 m, δεν παράγει χουρμάδες αλλά έχει γλυκούς και νόστιμους βρώσιμους καρπούς. Αυτά τα μούρα έχουν έναν πολύ μεγάλο, καφέ σπόρο που περιβάλλεται από ένα λεπτό πολτό (Εικόνα 1). Το W.filifera έχει μελετηθεί σχετικά με, για παράδειγμα, τη χρήση του ως πιθανή πηγή νέων κυτταρινικών ινών [8] και τη θρεπτική αξία των καρπών του [9]. Η φαινολική σύνθεση και η αντιοξειδωτική δράση των εναέριων τμημάτων έχουν επίσης αναφερθεί [10]. Στην προηγούμενη μελέτη μας, αναφέραμε την καλή αντιοξειδωτική δράση του W.πουριτανς βιταμίνη cεκχυλίσματα σπόρων filifera, τα οποία φαινόταν να είναι πηγή φαινολικών και φλαβονοειδών μορίων[7]. Τα ίδια εκχυλίσματα άσκησαν ανασταλτική δράση στα ένζυμα της οξειδάσης της ξανθίνης και της χολινεστεράσης, τα οποία αντιπροσωπεύουν βασικά ένζυμα στη θεραπεία της ουρικής αρθρίτιδας και της νόσου του Αλτσχάιμερ, αντίστοιχα.

Στόχος αυτής της εργασίας ήταν η επέκταση του χαρακτηρισμού αυτού του φυτού και η αξιολόγηση της πιθανής χρήσης των εκχυλισμάτων του ως αντιγηραντικού παράγοντα. Ως εκ τούτου, τα εκχυλίσματα πολτού και σπόρων διερευνήθηκαν για τις ανασταλτικές τους δραστηριότητες έναντι της δράσης ελαστάσης, κολλαγενάσης και τυροσινάσης, καθώς αντιπροσωπεύουν τα βασικά ένζυμα-στόχους για την πρόληψη και τη θεραπεία της φωτογήρανσης του δέρματος. Επιπλέον, τα εκχυλίσματα W.filifera που παρουσιάζουν τις καλύτερες υποσχόμενες δραστηριότητες αναλύθηκαν για την in vitro κυτταροτοξικότητα, την κυτταρική αντιοξειδωτική δράση και τα φωτοπροστατευτικά τους αποτελέσματα.

2.Αποτελέσματα και Συζήτηση

2.1. Αναστολή ενζύμου

Τα εκχυλίσματα πολτού και σπόρων W. filifera δοκιμάστηκαν αρχικά σε συγκέντρωση 50 μg/mL.sistancheΌλα τα εκχυλίσματα πολτού δεν άσκησαν σημαντική αναστολή ενζύμου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι ενζυμικές ανασταλτικές δραστηριότητες των εκχυλισμάτων σπόρων υπολογίστηκαν και εκφράστηκαν ως η μισή-μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (επίσης). Ο Πίνακας 1 δείχνει τις τιμές ICso που λαμβάνονται από τα εκχυλίσματα σπόρων σε σύγκριση με εκείνες των τυπικών αναστολέων, προκειμένου να αξιολογηθεί η ανασταλτική ισχύς των δειγμάτων. Όπως μπορεί να παρατηρηθεί, όλα τα εκχυλίσματα αναστέλλουν ασθενώς τη δραστηριότητα της τυροσινάσης, με τιμές ICso υψηλότερες από αυτές του τυπικού, κοτζικού οξέος. Παρατηρήθηκε καλύτερη αναστολή έναντι των δραστηριοτήτων ελαστάσης και κολλαγενάσης και τα αιθανολικά (EEG και EES) και μεθανολικά εκχυλίσματα (MEG και MES) είχαν τα καλύτερα αποτελέσματα. Η ανασταλτική δράση αυτών των δειγμάτων έναντι της ελαστάσης ήταν παρόμοια. οι τιμές ICso κυμαίνονταν από 10,75 έως 19,75 ug/mL και ήταν συγκρίσιμες με αυτές του θετικού μάρτυρα (ελαανολικό οξύ;ICso=11,75 ug/mL).

Αντίθετα, η δραστηριότητα της κολλαγενάσης αναστέλλεται έντονα από τα εκχυλίσματα, τα οποία έδειξαν υψηλότερη ισχύ από την τυπική γαλλική επιγαλλοκατεχίνη, με το ICso να είναι έως και τρεις φορές χαμηλότερο από τον θετικό έλεγχο. Λαμβάνοντας υπόψη ότι τα εκχυλίσματα ήταν ένα μείγμα πολλών ενώσεων, η συγκέντρωση των μεμονωμένων δραστικών μορίων ήταν ακόμη χαμηλότερη από την τιμή IC50, καθιστώντας έτσι τα εκχυλίσματα ακόμη πιο υποσχόμενες πηγές ανασταλτικών ενώσεων.

2.2.Κινητική Ανάλυση από Lineweaver-Burk Plot

Επικεντρώσαμε την προσοχή μας στα εκχυλίσματα αιθανόλης και μεθανόλης προκειμένου να διερευνήσουμε τον τρόπο αναστολής αυτών των ενζύμων, καθώς είχαν καλύτερη επίδραση ενάντια στις δραστηριότητες ελαστάσης και κολλαγενάσης. Η κινητική της αναστολής προσδιορίστηκε από τη διπλή αντίστροφη γραφική παράσταση Lineweaver-Burk. Οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν αυξάνοντας τη συγκέντρωση του αντίστοιχου υποστρώματος απουσία και παρουσία των εκχυλισμάτων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις.

Ο Πίνακας 2 δείχνει ότι το EEG και το EES δρούσαν ως μη ανταγωνιστικοί αναστολείς έναντι της ελαστάσης. Στην πραγματικότητα, η κινητική ανάλυση αυτών των εκχυλισμάτων παρήγαγε μια οικογένεια παράλληλων γραμμών για την αύξηση των συγκεντρώσεων εκχυλίσματος (Σχήμα 2Α, Β). Αυτή η κιρετική ανάλυση δείχνει ότι αυτά τα εκχυλίσματα μπορούν να συνδεθούν με το σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος. Η σταθερά ισορροπίας (Krs) υπολογίστηκε από την επανασχεδίαση των τομέων (1/Vmax) έναντι της συγκέντρωσης του αναστολέα, με αποτέλεσμα μια τιμή 3,91 και 8,89 ug/mL για EEG και EES, αντίστοιχα. Ο τρόπος αναστολής των μεθανολικών εκχυλισμάτων αποκάλυψε πράγματι ότι αυτά τα εκχυλίσματα δρουν ως μη ανταγωνιστικός αναστολέας. Μάλιστα, αυξάνοντας τη συγκέντρωση των εκχυλισμάτων, βρέθηκε μια οικογένεια ευθειών γραμμών με διαφορετικές κλίσεις, όλες που τέμνονται στην τετμημένη (Εικόνα 2Γ,Δ). Αυτή η ανάλυση δείχνει ότι τα εκχυλίσματα μπορούν να συνδεθούν όχι μόνο με το σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος αλλά και με το ελεύθερο ένζυμο. Οι σταθερές ισορροπίας για τη σύνδεση με το ελεύθερο ένζυμο (Kj) και με το σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος (Kis) ελήφθησαν είτε από την κλίση (Km/Vmax) είτε από τις τιμές 1/Vmax (υ-τομές) που απεικονίζονται σε γραφική παράσταση έναντι της συγκέντρωσης αναστολέα, αντίστοιχα.Τέλος, η κινητική συμπεριφορά της κολλαγενάσης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις εκχυλισμάτων φαίνεται στο Σχήμα 3Α-Δ. Όλα τα εκχυλίσματα έδρασαν ως μη ανταγωνιστικοί αναστολείς με τιμές Krs στην περιοχή των 7.58-13.04 ug/mL (Πίνακας 2).

Στην προηγούμενη εργασία μας, αναλύσαμε τα αλκοολικά εκχυλίσματα σπόρων W. filifera, χρησιμοποιώντας HPLC-DAD-ESI/MS. Έχουμε επισημάνει ότι οι κύριες φαινολικές ενώσεις αυτών των εκχυλισμάτων αποτελούνται από flavan-3-ol [7]. Μεταξύ αυτών, οι προκυανιδίνες τύπου Β ήταν οι κύριες ενώσεις στα εκχυλίσματα των σπόρων W.filifera. Μια θετική σχέση μεταξύ του βαθμού πολυμερισμού της προκυανιδίνης και της ικανότητας των προκυανιδινών να αναστέλλουν την ελαστάση παρατηρήθηκε σε προηγούμενη εργασία [11,12]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ανασταλτική δράση έναντι της ελαστάσης και της κολλαγενάσης από ορισμένες ενώσεις προκυανιδίνης [13,14]. Η συνεργική δράση αυτών των ενώσεων θα μπορούσε να συμβάλει στην εξήγηση της σημαντικής αναστολής του μεθανολικού εκχυλίσματος W.filifera έναντι και των δύο ενζύμων.

2.3.Sun Protection Factor

Η φωτοπροστατευτική δράση είναι πολύ σημαντική για ενώσεις με πιθανή εφαρμογή στο δέρμα, έτσι προσδιορίσαμε τον παράγοντα αντηλιακής προστασίας (SP) των εκχυλισμάτων μας. Ο δείκτης προστασίας SPF υποδεικνύει την ικανότητα μιας ουσίας να απορροφά τις ακτίνες UV, προστατεύοντας το δέρμα από τις τοξικές επιδράσεις που παράγονται από μια τέτοια ακτινοβολία. Τα καλλυντικά φυτικής προέλευσης έχουν μεγάλες δυνατότητες στην απορρόφηση της υπεριώδους ακτινοβολίας, επειδή τα φυτικά εκχυλίσματα περιέχουν πολυφαινόλες, όπως φλαβονοειδή ή καροτενοειδή. Αυτές οι ενώσεις, έχοντας αρωματικούς δακτυλίους, μπορούν να απορροφήσουν τις ακτίνες UV και, ως εκ τούτου, μπορούν να λειτουργήσουν ως αντηλιακό φίλτρο. Δεδομένου ότι τα εκχυλίσματα αλκοολούχων σπόρων του W.filifera περιέχουν φαινολικές και φλαβονοειδή ενώσεις [7], αξιολογήθηκαν τα φωτοπροστατευτικά αποτελέσματα αυτών των εκχυλισμάτων. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3, όλα τα εκχυλίσματα που αναλύθηκαν, σε συγκέντρωση 100 ug/mL, έδειξαν τιμές SPF που κυμαίνονταν από 1,52 έως 3,35. Τα εκχυλίσματα μεθανόλης αποκαλύφθηκε ότι διαθέτουν τα καλύτερα φωτοπροστατευτικά αποτελέσματα. Οι ακτίνες UV είναι υπεύθυνες για δερματικές παθήσεις και πυροδοτούν τις διεργασίες που έχουν ως αποτέλεσμα τη γήρανση του δέρματος, το οξειδωτικό στρες και το σχηματισμό ρυτίδων. Έτσι, η μείωση της απορρόφησης αυτής της ακτινοβολίας ενισχύει, με έμμεσο τρόπο, τις αντιοξειδωτικές δραστηριότητες και την αναστολή των ενζύμων που σχετίζονται με τη γήρανση.

2.4. Κυτταρική βιωσιμότητα και ενδοκυτταρικό επίπεδο ROS

Δεδομένου ότι το οξειδωτικό στρες είναι ένας βασικός παράγοντας για την πρόκληση της γήρανσης και των βλαβών που σχετίζονται με την ηλικία, εξετάσαμε επίσης εάν τα εκχυλίσματα W. filifera ανέστειλαν την επαγόμενη από HO2-δημιουργία ROS σε ένα κυτταρικό σύστημα. Σε προηγούμενη εργασία, περιγράψαμε τις αντιοξειδωτικές δραστηριότητες των εκχυλισμάτων σπόρων χρησιμοποιώντας μια φασματοφωτομετρική μέθοδο (δοκιμασία ABTS)[7]. Τα δείγματα αποκαλύφθηκαν ότι ήταν μια καλή πηγή φαινολικών ενώσεων με αντιοξειδωτικές ιδιότητες, με το MEG να παρουσιάζει την καλύτερη δράση. Δεδομένου ότι αυτό το εκχύλισμα είχε την καλύτερη αντιοξειδωτική δράση και επίσης μεγάλες δυνατότητες, λαμβάνοντας υπόψη τις ανασταλτικές δραστηριότητες έναντι του ενζύμου που δοκιμάστηκε (χολινεστεράση, οξειδάση ξανθίνης και τα ένζυμα γήρανσης που παρουσιάζονται εδώ), αποφασίσαμε να επιβεβαιώσουμε την αντιοξειδωτική ικανότητα του MEG σε ένα κυτταρικό μοντέλο.

Πρώτον, οι επιδράσεις του εκχυλίσματος W.filifera στη βιωσιμότητα των κυττάρων διερευνήθηκαν σε κύτταρα HaCaT. Η κυτταρική σειρά HaCaT των απαθανατισμένων ανθρώπινων κερατινοκυττάρων έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς ως μοντέλο για τη μελέτη της επιδερμικής ομοιόστασης [15]. Προκειμένου να προσδιοριστεί η ασφάλεια αυτού του εκχυλίσματος, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του δείγματος για 24 ώρες και εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας μια δοκιμή ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το εκχύλισμα δεν ήταν κυτταροτοξικό στα κύτταρα HaCaT και παρατηρήθηκε μόνο μια μικρή μείωση (βιωσιμότητα 80 τοις εκατό) στα 100 ug/mL (Εικόνα 4). Δεδομένου ότι η βιωσιμότητα δεν επηρεάστηκε μέχρι τα 50 ug/mL (βιωσιμότητα 96 τοις εκατό), αποφασίσαμε να πραγματοποιήσουμε περαιτέρω κυτταρικούς πειραματισμούς χρησιμοποιώντας μέχρι αυτή τη συγκέντρωση εκχυλίσματος. Αξιολογήσαμε τα επίπεδα ROS στα κύτταρα πριν και μετά το οξειδωτικό στρες και μετά τη θεραπεία με MEG. Η μελέτη διεξήχθη χρησιμοποιώντας διοξική 21,7'-διχλωροφλουορεσκεΐνη (DCFH-DA), η οποία διαχέεται εύκολα μέσω της κυτταρικής μεμβράνης και υδρολύεται από τις ενδογενείς εστεράσες σε DCFH. Οι γρήγορες αυξήσεις στο DCF υποδεικνύουν την οξείδωση του DCFH από ενδοκυτταρικά ROS, όπως H2O2. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, η επώαση H2O2 αύξησε σημαντικά τον σχηματισμό ROS στα κύτταρα HaCaT, αλλά η θεραπεία με το εκχύλισμα μπόρεσε να αναστείλει το H2O2-προκάλεσε την παραγωγή ROS με τρόπο δόσης-απόκρισης. Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τις αντιοξειδωτικές αναλύσεις και υποδηλώνουν ότι το MEG μπορεί επίσης να μειώσει τον σχηματισμό ROS στα κύτταρα.

Το μεθανολικό εκχύλισμα που αναλύθηκε σε αυτή την εργασία έδειξε υψηλές αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Η φαινολική σύνθεση αυτού του εκχυλίσματος αποτελούνταν από φλαβαν-3-όλη και οι προκυανιδίνες τύπου Β ήταν οι κύριες φαινολικές ενώσεις [7]. Οι προκυανιδίνες, μια ομάδα πολυφαινολικών βιοφλαβονοειδών, έχει αναφερθεί ότι εμφανίζουν ένα ευρύ φάσμα βιολογικών, φαρμακολογικών και χημειοπροστατευτικών ιδιοτήτων έναντι των ελεύθερων ριζών οξυγόνου[16,17]. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η αντιριζική δράση των προκυανιδινών είναι ισχυρή σε υψηλές συγκεντρώσεις[18]. Επιπλέον, τα εκχυλίσματα προανθοκυανιδίνης είναι πιο αποτελεσματικοί καθαριστές ριζών υπεροξειδίου από την αντιοξειδωτική βιταμίνη C και το Trolox [19].

3. Υλικά και Μέθοδοι

3.1.Χημικά

Όλα τα χημικά αντιδραστήρια ελήφθησαν ως καθαρά εμπορικά προϊόντα από τη Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ) εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά, και χρησιμοποιήθηκαν χωρίς περαιτέρω καθαρισμό.

3.2.Προετοιμασία δειγμάτων φυτού

Οι καρποί του W.filifera συλλέχθηκαν στην Τυνησία στις περιοχές Gabes (G) και Sousse (S) και τα φυτικά υλικά παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφηκε προηγουμένως [7]. Ο πολτός και οι σπόροι λυοφιλοποιήθηκαν ξεχωριστά και στη συνέχεια τα φυτικά υλικά (25 g) εκχυλίστηκαν σε 100 mL νερού (ΑΕ, υδατικό εκχύλισμα), αιθανόλης (Ε, εκχύλισμα αιθανόλης) ή μεθανόλης (ΜΕ, εκχύλισμα μεθανόλης) για 72 ώρες, στο δωμάτιο θερμοκρασία, σε συνεχή ανάδευση. Μετά από διήθηση και φυγοκέντρηση στις 10,000 rpm, τα υδατικά εκχυλίσματα στη συνέχεια λυοφιλοποιήθηκαν, ενώ τα ληφθέντα εκχυλίσματα αιθανόλης και μεθανόλης συμπυκνώθηκαν υπό κενό, χρησιμοποιώντας έναν περιστροφικό εξατμιστή για περαιτέρω ανάλυση. Οι ξηρές δόσεις (1 mg/mL) διαλύθηκαν σε DMSO πριν από τη χρήση.

3.3.Ενζυματική Αναστολή

Τα αποτελέσματα όλων των δοκιμασιών που περιγράφονται παρακάτω εκφράστηκαν ως ποσοστό του τυφλού ελέγχου. Οι συγκεντρώσεις των εκχυλισμάτων που είχαν ως αποτέλεσμα 50 τοις εκατό αναστολή της ενζυμικής δραστηριότητας (ICso) προσδιορίστηκαν με παρεμβολή των καμπυλών δόσης-απόκρισης. Το μοντέλο αναστολής προσδιορίστηκε με την εκτέλεση δοκιμασιών σε διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος και την απουσία και παρουσία των εκχυλισμάτων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Τα δεδομένα κινητικής αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την γραφική παράσταση Lineweaver-Burk. Τα δεδομένα από τις δοκιμασίες δραστικότητας καταγράφηκαν με ένα φασματοφωτόμετρο Ultrospec 2100 (Biochrom Ltd., Cambridge, UK).

3.3.1. Δοκιμασία Αναστολής Τυροσινάσης

Η αναστολή της δραστηριότητας τυροσινάσης από εκχυλίσματα W.filifera προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας 3,4-διυδροξυφαινυλαλανίνη (L-DOPA) ως υπόστρωμα [20]. Το μίγμα της αντίδρασης περιείχε 25 mM ρυθμιστικό φωσφορικών (ρΗ 6,8), τυροσινάση μανιταριού (100 U/mL, τελική συγκέντρωση), με ή χωρίς διάλυμα φυτικού εκχυλίσματος. Στη συνέχεια, L-DOPA (0,5 mM) προστέθηκε στο μίγμα και η δραστικότητα προσδιορίστηκε ακολουθώντας την αύξηση της απορρόφησης στα 492 nm, που προέκυψε από το σχηματισμό του προϊόντος ντοπαχρώμιου. Το εύρος συγκέντρωσης του εκχυλίσματος που χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό αναστολής της τυροσινάσης μανιταριού ήταν 0-0,3 mg/mL. Στις αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν χωρίς φυτικά εκχυλίσματα, προστέθηκε DMSO στο μίγμα της αντίδρασης ως τυφλό δείγμα ελέγχου. Ως θετικός έλεγχος χρησιμοποιήθηκε το Kojic acid.

3.3.2. Δοκιμασία αναστολής ελαστάσης

Η αναστολή της ελαστάσης προσδιορίστηκε με παρακολούθηση της απελευθέρωσης της π-νιτροανιλίνης κατά τη διάρκεια της διάσπασης του υποστρώματος N-succ-(Ala)3-νιτροανιλίδιο (SANA) με τη δράση του ενζύμου με τη μέθοδο που περιγράφεται [21], με μικρές τροποποιήσεις. Η δοκιμασία διεξήχθη σε ρυθμιστικό διάλυμα 0.1 Μ Tris-HCl (ρΗ8.{10}}). Η παγκρεατική ελαστάση χοίρου (3,3 μg/mL) επωάστηκε με ή χωρίς το εκχύλισμα για 20 λεπτά και, μετά την μόνωση, προστέθηκε το υπόστρωμα (1,6 mM) και η ενζυμική δραστηριότητα παρακολουθήθηκε στα 410 nm. Ο έλεγχος πραγματοποιήθηκε με DMSO, ενώ ως θετικός έλεγχος χρησιμοποιήθηκε ολεανολικό οξύ.

3.3.3. Δοκιμασία αναστολής κολλαγενάσης

Η κολλαγενάση από το Clostridium histolyticum παρασκευάστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα Tricine {{0}}.05 Μ, pH 7,5, που περιέχει 0,4 M NaCl και 0,01 M CaClz, και επωάστηκε (1 U /mL) με δείγματα δοκιμής σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 15 λεπτά. Το συνθετικό υπόστρωμα N-(3-[2-Fury]]-ακρυλοϋλ)-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA), που παρασκευάστηκε στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα, προστέθηκε στη συνέχεια για να ξεκινήσει η αντίδραση ( με τελική συγκέντρωση 0,8 mM). Η απορρόφηση παρακολουθήθηκε στα 340 nm [21]. Ο έλεγχος πραγματοποιήθηκε με DMSO, ενώ η γαλλική επιγαλλοκατεχίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος.

3.4. Προσδιορισμός του In Vitro Συντελεστή Αντηλιακής Προστασίας

Ο παράγοντας αντηλιακής προστασίας των εκχυλισμάτων W. filifera προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο απορρόφησης UV, σύμφωνα με τη μεθοδολογία που περιγράφεται από τους Mansur et al. (1986) [22]. Οι απορροφήσεις των εκχυλισμάτων (0.1 mg/mL) μετρήθηκαν στην περιοχή των 290-320 nm, με αυξήσεις 5 nm, και έγιναν τρεις προσδιορισμοί σε κάθε σημείο. Ο SPF υπολογίστηκε εφαρμόζοντας την Εξίσωση Mansur: όπου CF=συντελεστής διόρθωσης(10); EE(A)= ερυθηματογόνος επίδραση ακτινοβολίας με φάσμα ηλιακής έντασης μήκους κύματος λ;I（）=. Abs（λ= φασματοφωτομετρικές τιμές απορρόφησης σε μήκος κύματος λ. Οι τιμές του EE (A) × I (A) είναι σταθερές. Προσδιορίστηκαν από τους Sayre et al. (1979)[23] και φαίνονται στον Πίνακα 4.

3.5.Κυτταρική καλλιέργεια και ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS

Η κυτταρική σειρά κερατινοκυττάρων ανθρώπινου δέρματος HaCaT καλλιεργήθηκε σε Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) που περιέχει 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Gibco, NY, ΗΠΑ) και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη στους 37 βαθμούς, σε υγρή ατμόσφαιρα, με 5 ποσοστό CO2. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκε με τη χρωματομετρική ανάλυση 3-(4)5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2.5-βρωμιούχου διφαινυλτετραζολίου (MTT), ως που περιγράφηκε προηγουμένως, με μικρή τροποποίηση [24]. Μετά από επώαση 24 ωρών με MEG σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0-100 ug/mL), τα κύτταρα επισημάνθηκαν με διάλυμα ΜΤΤ για 3 ώρες στους 37 βαθμούς. Τα προκύπτοντα ιζήματα ιώδους φορμαζάνης διαλύθηκαν σε DMSO και η απορρόφηση κάθε φρεατίου προσδιορίστηκε στα 560 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας με αναφορά 630 nm.

Τα κυτταρικά επίπεδα ROS προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο DCFH-DA [25]. Τα κύτταρα HaCaT υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις MEG(0-50 ug/mL) για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με DCFH-DA (10 μΜ) στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά. Μετά την επώαση, προστέθηκε 1 mM HzO2 στα φρεάτια και η ένταση φθορισμού του DCF μετρήθηκε αμέσως χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλάκας φθορισμού σε μήκος κύματος διέγερσης 485 nm και μήκος κύματος εκπομπής 530 nm, λαμβάνοντας μετρήσεις σε διαστήματα 5 λεπτών για ελάχ.

3.6.Ανάλυση Δεδομένων

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση 士 τυπική απόκλιση (SD). Οι στατιστικές διαφορές αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism έκδοση 8 (San Diego, CA, USA). Η σύγκριση μεταξύ των ομάδων διεξήχθη με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ακολουθούμενη από τη δοκιμή πολλαπλών συγκρίσεων Tukey. Η τιμή εφαρμογής μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

4. Συμπεράσματα

Συμπερασματικά, αναφέρουμε, για πρώτη φορά, ότι τα εκχυλίσματα σπόρων από το W.filifera είναι αποτελεσματικά στην αναστολή των βασικών ενζύμων που εμπλέκονται στη γήρανση του δέρματος. Η φυσική ή «εγγενής» γήρανση είναι ένα φυσιολογικό φαινόμενο που εμφανίζεται σε όλους τους ανθρώπινους ιστούς ως συνέπεια του χρόνου. Ωστόσο, το δέρμα εκτίθεται επίσης σε εξωτερικούς παράγοντες που προκαλούν στρες που αντιπροσωπεύουν μια κύρια αιτία πρόωρης γήρανσης του δέρματος. Η «εξωγενής» γήρανση σχετίζεται κυρίως με την επαγόμενη από την υπεριώδη ακτινοβολία βλάβη του συνδετικού ιστού του δέρματος. Οι ακτίνες UV προκαλούν οξειδωτικό στρες, το οποίο είναι υπεύθυνο για την ενεργοποίηση των ενζύμων που υποβαθμίζουν το ECM και την εμφάνιση ρυτίδων και κηλίδων ηλικίας. Αυτό το χειρόγραφο αναφέρει τη σημασία που θα μπορούσαν να έχουν οι σπόροι του W.filifera σε αυτό το πλαίσιο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, τα εκχυλίσματα θα μπορούσαν να δράσουν στην πρόληψη της πρόωρης γήρανσης, δρώντας ταυτόχρονα σε πολλά μέτωπα.

Πρώτον, τα εκχυλίσματα μπορούν να δράσουν στην αρχή της διαδικασίας μέσω των φωτοπροστατευτικών τους επιδράσεων και, ως εκ τούτου, να μειώσουν την απορρόφηση των ακτίνων UV. Στη συνέχεια, έδειξαν καλή αντιοξειδωτική δράση με εκχύλισμα μεθανόλης, αποτρέποντας το σχηματισμό ROS σε ένα κυτταρικό σύστημα, χωρίς κυτταρική τοξικότητα. Τέλος, όλα τα εκχυλίσματα, ιδιαίτερα τα μεθανολικά δείγματα, θα μπορούσαν να αναστείλουν την κολλαγενάση, την ελαστάση και την τυροσινάση (η τελευταία σε μικρό βαθμό). Συνολικά, τα αποτελέσματα που ελήφθησαν δείχνουν ότι το W.filifera θα μπορούσε να είναι πηγή βιοδραστικών μορίων και να ενθαρρύνει περαιτέρω πειράματα προκειμένου να απομονωθούν τα μεμονωμένα ενεργά συστατικά που είναι υπεύθυνα για τις παρατηρούμενες δραστηριότητες.

Αυτό το άρθρο εξάγεται από το Plants 2021, 10, 151. https://doi.org/10.3390/plants10010151 https://www.mdpi.com/journal/plants