Τα νεφρικά CD169 plus plus τα μόνιμα μακροφάγα είναι ζωτικής σημασίας για την προστασία από την οξεία συστηματική καντιντίαση

edmund.chen@wecistanche.com

ΕισαγωγήΗ συστηματική καντιντίαση είναι η τέταρτη συχνή νοσοκομειακή λοίμωξη του αίματος που υπολογίζεται ότι επηρεάζει περισσότερους από 250,000 ασθενείς της μονάδας εντατικής θεραπείας κάθε χρόνο, παρά τη χορήγηση πρακτικών υγιεινής στα νοσοκομεία (Delaloye & Calandra, 2014; Kullberg & Arendrup, 2015). Αν και η τρέχουσα θεραπεία αυτής της λοίμωξης χρησιμοποιεί κυρίως αντιμυκητιακά φάρμακα, το ποσοστό θνησιμότητας μεταξύ των ασθενών παραμένει ανησυχητικά υψηλό (40-60 τοις εκατό) (Delaloye & Calandra, 2014; Bassetti et al, 2018; Lamoth et al, 2018). Ωστόσο, μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν κλινικά διαθέσιμα εμβόλια. Με τον αυξανόμενο πληθυσμό των εσωτερικών ασθενών που πάσχουν από χρόνιες ασθένειες και τις αναδυόμενες περιπτώσεις αντοχής στα αντιμυκητιακά φάρμακα, η κατανόηση της ανοσίας του ξενιστή έναντι αυτής της λοίμωξης θα είναι σημαντική για την ανάπτυξη ανοσοθεραπείας για τη βελτίωση ή τη συμπλήρωση των τρεχουσών αντιμυκητιασικών παρεμβάσεων (Armstrong-James et al, 2017; Desai et al, 2017, Bassetti et al, 2018). Ευρέως γνωστοί ως οι κεντρικοί παίκτες στην επεμβατική αντιμυκητιασική ανοσία, τα φαγοκύτταρα, ειδικότερα, τα πολυμορφοπύρηνα φαγοκύτταρα (ουδετερόφιλα) χρησιμοποιούν διάφορους μηχανισμούς για τον έλεγχο των μυκητιασικών λοιμώξεων, όπως η φαγοκυττάρωση, η απελευθέρωση δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) και μικροβιοκτόνων πρωτεϊνών και σχηματισμός NETosis Borregaard, 2010· Mantovani et al, 2011). Ο κεντρικός ρόλος των ουδετερόφιλων στην ανοσία Candida υπογραμμίζεται περαιτέρω από την κλινική συσχέτιση της ουδετεροπενίας και των ελαττωμάτων των ουδετερόφιλων ως προδιαθεσικών παραγόντων για συστηματική καντιντίαση (Lehrer & Cline, 1969; Wisplinghoff et al, 2004; Pfaller & Diekema, 14,200; . Ωστόσο, πολύ λιγότερα είναι γνωστά για τους ρόλους διαφορετικών μονοπύρηνων φαγοκυττάρων σε αυτή τη μόλυνση in vivo, εν μέρει λόγω της έλλειψης διαθέσιμων εργαλείων για την οριοθέτηση των διαφορετικών υποομάδων μακροφάγων και δενδριτικών κυττάρων στονεφρά,που είναι τα κύρια όργανα-στόχοι της συστηματικής καντιντίασης (Schraml et al, 2013; Gottschalk & Kurts, 2015).

Λέξεις-κλειδιά:νεφρό; νεφρική βλάβη? νεφρικός ιστός? νεφρική μυκητίαση? νεφρική βλάβη? νεφρική λειτουργία

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ/ΝΕΦΡΩΝ

Η σημασία των μακροφάγων στην επεμβατική ανοσία Candida έχει καταδειχθεί, εξ όσων γνωρίζουμε, για πρώτη φορά από τους Lionakis et al (2013). Εκμεταλλευόμενοι τα ποντίκια CX3CR1gfp/gfp, όπου ο αριθμός τουςνεφρώνΟ πληθυσμός των μακροφάγων μειώνεται σημαντικά, έδειξαν οι Lionakis et al (2013).νεφρώνΤα μόνιμοι μακροφάγα είναι οι κρίσιμοι υπερασπιστές πρώτης γραμμής ενάντια στην επίθεση του C. Albicans (Lionakis et al, 2013). Επίσης, αυτά τα μακροφάγα φάνηκε να εμπλέκονται στη ρύθμιση της στρατολόγησης ουδετερόφιλων στονεφράκατά τη διάρκεια της μόλυνσης από Candida (Kanayama et al, 2015). Εκτός από την προαγωγή της μυκητιακής κάθαρσης, τα μακροφάγα αναφέρθηκε ότι παίζουν ρόλονεφρώνεπισκευή ιστού (Tran et al, 2015). Το CD169, επίσης γνωστό ως Sialoadhesin ή λεκτίνη 1 που δεσμεύει το σιαλικό οξύ (Siglec-1), έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι είναι ένας ειδικός δείκτης που προσδιορίζει μακροφάγους που κατοικούν στον ιστό (TRMs) σε διάφορα περιφερειακά όργανα όπως οι πνεύμονες , σπλήνα, συκώτι καινεφρά(Purnama et al, 2014; Karasawa et al, 2015; Gupta et al, 2016; Svedova et al, 2017). Με ενδιαφέρο,νεφρώνΤα CD169 plus μακροφάγα έχουν συσχετιστεί με ανοσορύθμιση, είτε προς την εξέλιξη της ανοσοπαθολογίας είτε προς την ανοσολογική λύση, ανάλογα με τα μοντέλα ασθένειας/τραυματισμού (Chavez-Galan et al, 2015). Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τον in vivo λειτουργικό ρόλο των CD169 συν μακροφάγων στη συστηματική ανοσία Candida. Εδώ, το δείχνουμενεφρώνΤα CD169 plus μακροφάγα είναι σημαντικοί ανοσορυθμιστές στην οξεία συστηματική λοίμωξη από Candida. Η απουσία CD169 plus μακροφάγων μειώνει την απόκριση της IFN και την παραγωγή ουδετερόφιλων ROS στονεφρά.Ως αποτέλεσμα, τα ποντίκια που δεν έχουν CD169 συν μακροφάγα υποκύπτουν σε χαμηλή δόση λοίμωξης Candida, παρουσιάζοντας εξαιρετικά υψηλή μυκητιακή επιβάρυνση και σοβαρήνεφρώνανοσοπαθολογία.

Αποτελέσματα

Τα μακροφάγα CD169 plus plus είναι ένας υποπληθυσμός νεφρικών TRMsΓια τη διερεύνηση των νεφρικών TRMs, εκμεταλλευτήκαμε ένα μοντέλο διαγονιδιακού ποντικού CD169-DTR που αφαιρεί ειδικά τα TRM κατά τη θεραπεία με τοξίνη διφθερίτιδας (DT) λόγω των εκφράσεών τους CD169 (Purnama et al, 2014; Gupta et al, 2016; Chen & Ruedl , 2020). Εκτός από το CD169, ένα υψηλό επίπεδο έκφρασης F4/80 και ένα ενδιάμεσο επίπεδο του CD11b χρησιμοποιήθηκε στην κυτταρομετρική ανάλυση των συναδέλφων μας για τη διάκριση των TRM από άλλους υποπληθυσμούς μακροφάγων (Sheng et al, 2015) (Εικόνα 1Α). Είναι ενδιαφέρον ότι μόνο ένας μερικός πληθυσμός τωννεφρώνΤα μακροφάγα F4/80hi CD11bint αφαιρέθηκαν στα διαγονιδιακά ποντίκια CD169-DTR που έλαβαν θεραπεία με DT (Εικ. 1Α και Β), υποδηλώνοντας την ετερογένεια του πληθυσμού μακροφάγων CD11bint F4/80hi στονεφρό.Παράλληλα με την παρατήρησή μας, οι Karasawa et al (2015) επεσήμαναν επίσης ότι μόνο ένα υποσύνολο τουνεφρώνΤο TRMs εκφράζει το CD169 (Karasawa et al, 2015). Συγκεκριμένα, έδειξαν ότι τα CD169 plus TRM εντοπίζονται κυρίως στονεφρώνμυελική περιοχή, που επιβεβαιώνεται με τις χρώσεις μας με ανοσοφθορισμό (Εικ. 1C).

Εδώ, σημειώσαμε ότι τα καταργημένα CD169 plus TRM εκφράζουν μετρίως χαμηλότερα επίπεδα F4/80 και CD11b (F4/80 συν συν CD11b plus), ενώ τα μη μειωμένα TRM εκφράζουν συγκριτικά υψηλότερα επίπεδα F4/80 και CD11b (F4/80 plus plus συν CD11b συν συν ). Ωστόσο, αυτοί οι δύο πληθυσμοί TRM δεν διακρίνονται σε ποντίκια WT (Εικ. 1Α). Ως εκ τούτου, με βάση τα καταργημένα και μη μειωμένα TRM, τα υποκατηγοριοποιήσαμε σε Κλάσμα I (Fr I) (CD169 συν F4/80 συν συν CD11b συν ) και Κλάσμα II (Fr II) (CD169 συν F4/80 συν συν CD11b συν συν ) πληθυσμούς (Σχήμα 1Α και Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι η αξιοσημείωτη, αλλά ασήμαντη μείωση του πληθυσμού Fr II σε ποντίκια CD169-DTR υποδηλώνει επίσης ότι μέρος του πληθυσμού Fr II εκφράζει CD169. Το προφίλ κατάλυσης TRM σε ποντίκι CD169-DTR είναι σύμφωνο με την έκφραση μεταγραφής CD169, όπου ο πληθυσμός FrI εκφράζει σημαντικά υψηλότερο επίπεδο CD169 σε σύγκριση με τον πληθυσμό Fr II (Εικόνα 1D). Αντίστοιχα, υψηλότερα επίπεδα ανθρώπινου αυξητικού παράγοντα τύπου EGF που δεσμεύει την ηπαρίνη (HB-EGF), του υποδοχέα για DT, παρατηρήθηκαν στο Fr I σε σύγκριση με τα Fr II TRM, εξηγώντας την ευαισθησία τους στη θεραπεία με DT (Σχήμα 1Ε).

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ

Η απουσία νεφρικού CD169 συν μακροφάγων μείωσε σε μεγάλο βαθμό την αντίσταση του ξενιστή έναντι της διάχυτης καντιντίασηςΓια να εκτιμηθεί η σημασία των μακροφάγων CD169 plus plus, τα ποντίκια CD169-DTR και WT προκλήθηκαν ενδοφλεβίως με χαμηλή δόση 5 × 104 cfu C. Albicans και η επιβίωσή τους παρακολουθήθηκε για 18 ημέρες. Κατά τη διάρκεια της μόλυνσης, τα ποντίκια υποβλήθηκαν συνεχώς σε θεραπεία με DT για να εξασφαλιστεί η συνεχής αφαίρεση του πληθυσμού FrI σε ποντικούς CD169-DTR (Εικόνα S1). Μερική μείωση των μακροφάγων Fr I παρατηρήθηκε επίσης σε μολυσμένα ποντίκια WT την ημέρα 3 μετά τη μόλυνση (pi) (Εικ. 1F), η οποία θα μπορούσε να είναι αποτέλεσμα νεκρόπτωσης μακροφάγων, ένα συμβάν που έχει αναφερθεί ότι συμβαίνει κατά τη διάρκεια παθογόνων λοιμώξεων (Lai et al. , 2018, Cao et al, 2019). Αντίθετα, η πλήρης αφαίρεση των μακροφάγων FrI σε ποντίκια CD169-DTR οφειλόταν κυρίως στην απόπτωση που προκλήθηκε από τη θεραπεία με DT. Ωστόσο, ο αριθμός των μακροφάγων Fr I σε ποντίκια CD169-DTR ήταν σταθερά και σημαντικά χαμηλότερος από εκείνους στα ποντίκια WT καθ' όλη τη διάρκεια της μόλυνσης. Από την άλλη πλευρά, ο συνολικός αριθμός των μακροφάγων Fr II ήταν συγκρίσιμος μεταξύ μολυσμένων ποντικών WT και CD{13}}DTR (Εικ. 1F, δεξιό πλαίσιο). Συνεπώς, τα ποντίκια CD169-DTR, τα οποία στερούνται FrI TRMs, ήταν σαφώς πιο ευάλωτα από τα ποντίκια WT όταν προσβλήθηκαν με συστηματική μόλυνση από Candida (Εικ. 1G).

Τα ποντίκια CX3CR1gfp/gfp έχουν χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν για την ανάκριση της λειτουργίας τουνεφρόTRM λόγω της συνολικής απώλειαςνεφρώνF4/80 συν CD11b συν πληθυσμός (Lionakis et al, 2013). Η σύγκριση μεταξύ ποντικών CX3CR1gfp/gfp και CD169-DTR, επομένως, μας επιτρέπει να κατανοήσουμε τις λειτουργικές συνέπειες μεταξύ της μερικής και της ολικής απώλειας του πληθυσμού των νεφρικών TRMs. Για να το πετύχουμε αυτό, μολύναμε ποντίκια CD169-DTR, CX3CR1gfp/gfp και WT με 5 × 104 cfu C. Albicans. Παρόμοια με ό,τι αναφέρθηκε προηγουμένως, τα ποντίκια CX3CR1gfp/gfp εμφάνισαν πλήρη απουσία νεφρικών TRMs (πληθυσμοί τόσο Fr I όσο και II), ενώ τα ποντίκια CD{14}}DTR εμφάνισαν μια πιο χαρακτηριστική απώλεια πληθυσμού Fr I (Εικ. S2A και B ). Αντίστοιχα, η έλλειψη και των δύο μακροφάγων Fr I και II κατέστησε τα ποντίκια CX3CR1gfp/gfp πολύ ευαίσθητα στη συστηματική καντιντίαση (Εικ S2C), με εξαιρετικά υψηλή νεφρική μυκητιακή επιβάρυνση ήδη από την ημέρα 1 pi σε σύγκριση με μολυσμένα WT και CD{20 }}Ποντίκια DTR (Εικ S2D). Αντίθετα, τα ποντίκια CD169-DTR εμφάνισαν χαμηλότερη θνησιμότητα από τα ποντίκια CX3CR1gfp/gfp (Εικ. 1G και S2C) καινεφρώνΤο μυκητιακό φορτίο ήταν μόνο σημαντικά υψηλότερο από τα μολυσμένα ποντίκια WT την ημέρα 10 (Εικ. 2Α και Β). Εφόσον τα ποντίκια CD169-DTR και CX3CR1gfp/gfp που υποβλήθηκαν σε αγωγή με DT στερούνται TRMs σε άλλα όργανα (Hochheiser et al, 2013; Gupta et al, 2016; Lee et al, 2018), αξιολογήσαμε τα μυκητιακά φορτία σε πολλαπλά περιφερειακά όργανα , αυτό είναι,νεφρό,εγκέφαλος, καρδιά, πνεύμονας, ήπαρ και σπλήνα, σε μολυσμένα ποντίκια WT, CD{{0}DTR και CX3CR1gfp/gfp την ημέρα 1 π. Περιέργως, και στα δύο ποντίκια CD{{4}DTR και CX3CR1gfp/gfp, νεφροί ήταν τα μόνα όργανα που εμφάνιζαν σαφώς υψηλότερη μυκητιακή επιβάρυνση από τα υπόλοιπα όργανα που ερευνήθηκαν (Εικ. S2D). Η αυξημένη ποσότητα επιβάρυνσης Candida στους νεφρούς CX3CR1gfp/gfp την ημέρα 1 επιβεβαιώνει τα ευρήματα που αναφέρθηκαν από τους Lionakis et al (2013), όπουνεφρώνΤα TRM είναι ζωτικής σημασίας γιανεφρώνάμυνα πρώτης γραμμής έναντι της συστηματικής λοίμωξης από Candida (Lionakis et al, 2013).

Από την άλλη πλευρά, τονεφρώνη μυκητιακή επιβάρυνση στα ποντίκια CD169-DTR ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνα στα ποντίκια CX3CR1gfp/gfp αλλά όχι σαφώς υψηλότερη από τα μολυσμένα WTνεφράτην ημέρα 1 pi (Εικ S2D). Επειδή ο πληθυσμός Fr II παραμένει σχετικά άθικτος σε ποντίκια CD169-DTR (Εικ S2A και B), αμφισβητήσαμε εάν η αυξημένη αντίσταση που παρατηρήθηκε σε ποντίκια CD169-DTR, σε σύγκριση με τα ποντίκια CX3CR1gfp/gfp, ήταν κυρίως λόγω των εναπομεινάντων μακροφάγων του νεφρού Fr II που παραμένουν αμείωτοι που λειτουργούν για να εμποδίζουν τους περισσότερους C. Albicans να εισβάλουν στα νεφρικά σωληνάρια, μια περιοχή όπου ανιχνεύθηκαν πολύ λίγα ανοσοκύτταρα κατά τη διάρκεια της σταθερής κατάστασης. Για το σκοπό αυτό, παρακολουθήσαμε το μυκητιακό φορτίο διαφόρων οργάνων σε ποντίκια WT και CD169-DTR στις ημέρες 1, 3, 6 και 10 pi (Εικόνα 2). Εδώ, τα δεδομένα μας έδειξαν την περιορισμένη από τους νεφρούς εξάρτηση του CD169 συν μακροφάγων στην κάθαρση των μυκήτων καθώς όλα τα όργανα που ερευνήθηκαν, εκτός από τους νεφρούς, σε ποντίκια CD{16}}DTR καθαρίστηκαν από το C. Albicans την ημέρα 10 pi (Εικόνα 2Α) . Είναι ενδιαφέρον ότι, παρά την απώλεια του υποσυνόλου Fr I, το μυκητιακό φορτίο στα ποντίκια CD{19}} DTR συσσωρεύτηκε παρόμοια με τα μολυσμένα ποντίκια WT (ημέρα 0-6) (Εικ. 2Α και Β), υποδηλώνοντας ελάχιστους ρόλους του νεφρικού CD169 συν συν μακροφάγων για την πρόκληση άμυνας πρώτης γραμμής έναντι αυτής της μόλυνσης. Η διαφορά στο φορτίο μυκήτων των νεφρών μεταξύ ποντικών CD{169-DTR και WT ανιχνεύθηκε μόνο την ημέρα 10 pi, όπου το μυκητιακό φορτίο των νεφρών που είχαν εξαντληθεί από CD{27}}συνέχισε να κλιμακώνεται, ενώ εκείνα στα ποντίκια WT φαινόταν να είναι περιορίστηκε ή καθαρίστηκε (Εικ. 2Β). Επομένως, τα δεδομένα μας καταδεικνύουν τον απαραίτητο ρόλο των μακροφάγων CD169 plus plus στη νεφρική ανοσία Candida, αλλά πιθανότατα με μικρή συμβολή στη νεφρική άμυνα πρώτης γραμμής έναντι μιας τέτοιας λοίμωξης. Εντυπωσιακά, δεδομένου ότι τα ποντίκια CX3CR1gfp/gfp δεν είχαν μακροφάγα Fr I και Fr II και εμφάνισαν αυξημένη ευαισθησία ήδη από την 1η ημέρα pi (Εικόνα S2), υποθέσαμε ότι το Fr II CD169 συν τα μακροφάγα είναι κυρίως υπεύθυνοι για τον κρίσιμο έμφυτο μηχανισμό των πρώιμων νεφρικών μυκήτων έλεγχος.

Τα ποντίκια CD169-DTR υπέφεραν από μη αναστρέψιμη, προοδευτική νεφρική βλάβη κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από CandidaΕπειδή οι νεφροί ήταν τα μόνα όργανα στα οποία συσσωρεύτηκε το C. Albicans κατά τη διάρκεια της μόλυνσης (Εικ. 2Α), στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε μια ιστοπαθολογική εξέταση των τομέων που βάφτηκαν με περιοδικό οξύ – Schiff (PAS) (Εικ. 2C) – και H&E (Εικ. 3Α και S3). από μολυσμένους νεφρούς WT και CD169-DTR την ημέρα 3, 6 και 10 pi Την ημέρα 3, παρατηρήθηκαν σημεία νεφρικής βλάβης και αιμορραγίες στους νεφρούς CD169-DTR (Εικ. S3A). Την ημέρα 6, οι μολυσμένοι νεφροί WT εμφάνισαν μικρές ενδείξεις σωληναριακής και ενδοθηλιακής βλάβης, ενώ οι μολυσμένοι νεφροί CD{12}}DTR εμφάνισαν πιο σοβαρές αιμορραγίες και σωληναριακή νέκρωση (Εικ. S3B). Και στους μολυσμένους νεφρούς WT και CD169-DTR, το μεγαλύτερο μέρος του C. Albicans φάνηκε να συσσωρεύεται στη νεφρική πύελο (Εικ. 2C). Αξίζει να σημειωθεί ότι υπήρξε συσσώρευση λευκοκυττάρων in situ τόσο σε WT όσο και σε

Νεφροί CD169-DTR, υποδηλώνοντας ότι η ανεξέλεγκτη ανάπτυξη του C. Albicans στους νεφρούς CD169-DTR δεν οφείλεται στην έλλειψη στρατολόγησης λευκοκυττάρων (Εικ. 2Γ και 4Α). Την ημέρα 10, η δομική ακεραιότητα των νεφρών CD169-DTR επιδεινώθηκε, συνοδευόμενη από την εμφάνιση ινωτικών ιστών (Εικ. 3Α και S3C). Συγκεκριμένα, η διεύρυνση του χώρου του Bowman και η εμφανής απόρριψη των σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων και των συστάδων λευκοκυττάρων εντός του αυλού ορισμένων νεφρικών σωληναρίων των νεφρών CD169-DTR ήταν καθαρά ορατή (Εικ. 3Α). Αντίθετα, μέχρι την ημέρα 10, οι περισσότερες νεφρικές περιοχές στους νεφρούς WT φαινόταν να παραμένουν ανέπαφες, υποδεικνύοντας ανάκαμψη από πρώιμη μόλυνση (Εικ. 3A και S3C). Παράλληλα με τις ιστολογικές αναλύσεις των νεφρών, αξιολογήσαμε το επίπεδο του μορίου νεφρικής βλάβης-1 (Kim{-1) σε μολυσμένο νεφρό WT και CD{169- DTR, έναν τύπο-1 διαμεμβρανικής πρωτεΐνης όπου η έκφρασή του αυξάνεται μόνο με τραυματισμό στα νεφρικά σωληνάρια (Ichimura et al,

1998; Han et al, 2002; Bonventre, 2009). Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η έκφραση του Kim-1 στους νεφρούς των μολυσμένων ποντικών CD169-DTR ήταν δραστικά υψηλότερη από ό,τι στο μολυσμένο WT την ημέρα 10 pi (Εικόνα 3Β). Επιπλέον, η ακεραιότητα της ενδοθηλιακής επένδυσης στους νεφρούς των ποντικών CD169-DTR ήταν σημαντικά εξασθενημένη, όπως αποδεικνύεται από μεγαλύτερη ποσότητα Evan's Blue που διατηρήθηκε στους νεφρούς CD169-DTR (Εικόνα 3C). Τα μακροφάγα CD169 plus έχουν προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι αντιφλεγμονώδη, όπου η απουσία αυτών των μακροφάγων οδήγησε σε υπερφλεγμονή σε βακτηριακή λοίμωξη ή τραυματισμό ισχαιμίας-επαναιμάτωσης (Karasawa et al, 2015; Svedova et al, 2017). Σύμφωνα με αυτά τα μοντέλα, οι νεφροί ποντικών CD169-DTR συσχετίστηκαν με υψηλότερα επίπεδα φλεγμονής (δηλαδή, TNF- , G-CSF και M-CSF) και η νεφρική λειτουργία βρέθηκε να διακυβεύεται δραματικά όταν

Η απουσία νεφρικού CD169 συν μακροφάγων δεν επηρέασε τη στρατολόγηση των τελεστικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από CandidaΕπειδή η αναποτελεσματική κάθαρση του Candida στους νεφρούς CD{{0}}DTR θα μπορούσε να οφείλεται στην έλλειψη στρατολόγησης τελεστικών κυττάρων, παρακολουθήσαμε την ουδετερόφιλη και μονοκυτταρική διήθηση στους νεφρούς των ποντικών WT και CD169-DTR την ημέρα 0, 1, 3, 6 και 10 pi Παρόμοια με τις ιστολογικές μας παρατηρήσεις (Εικ. 2C), η απουσία μακροφάγων νεφρικού CD169 συν συν Fr I δεν επηρέασε τη στρατολόγηση λευκοκυττάρων κατά τη διάρκεια της μόλυνσης (Εικ. 4Α). Αντίθετα, οι νεφροί CD{10}}DTR συσχετίστηκαν με υψηλότερη έκφραση χημειοκινών που προσελκύουν ουδετερόφιλα και μονοκύτταρα (π.χ. CXCL1, CXCL2 και CCL2) και μορίων κυτταρικής προσκόλλησης (π.χ. ICAM-1) (Εικ. 4Β και Γ). Το αυξημένο επίπεδο χημειοκινών στον νεφρό CD169-DTR, πιθανώς λόγω της απεριόριστης ανάπτυξης του C. Albicans, συσχετίζεται με αυξημένη ποσότητα διήθησης ανοσοκυττάρων από την ημέρα 6 έως την 10η ημέρα. Αντίθετα, υπήρχαν ελάχιστα σημάδια C. Albicans στους νεφρούς WT και τα ανοσοκύτταρα καθαρίστηκαν σε μεγάλο βαθμό την ημέρα 10 pi (Σχήματα 2Β και 4Α). Έτσι, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι τα νεφρικά CD169 συν τα μακροφάγα δεν ήταν οι κύριοι παράγοντες στη στρατολόγηση τελεστικών κυττάρων, ιδιαίτερα των ουδετερόφιλων, κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από Candida.

Τα ουδετερόφιλα στους νεφρούς CD169-DTR δημιουργούν χαμηλότερη παραγωγή ROSΣτη συνέχεια, προχωρήσαμε στην ανάκριση κατά πόσον η έλλειψη CD169 συν μακροφάγων επηρεάζει αρνητικά την κανδιοκτόνο απόκριση του ξενιστή στους νεφρούς. Για το σκοπό αυτό, αξιολογήσαμε την ποσότητα των ουδετερόφιλων και μονοκυττάρων που παράγουν ROS σε μολυσμένους νεφρούς WT και CD169-DTR την ημέρα 6 pi—την ημέρα που και οι νεφροί WT και CD169-DTR εμφάνισαν παρόμοια μυκητιακή επιβάρυνση και κυτταρική διήθηση (Εικ. 2Β και 4Α). Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήσαμε χαμηλότερη ποσότητα ουδετερόφιλων που παράγουν ROS, αλλά όχι μονοκυττάρων, στους νεφρούς CD169-DTR σε σύγκριση με το WT (Εικ. 5Α και Β). Αντίστοιχα, αυτά τα ουδετερόφιλα στους νεφρούς CD{10}}DTR δημιούργησαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα ROS από εκείνα του WT, υποδηλώνοντας χαμηλότερη ικανότητα θανάτωσης ουδετερόφιλων (Εικ. 5C και D).

Στη συνέχεια, προσπαθήσαμε να προσδιορίσουμε εάν η μειωμένη κανδιοκτόνος λειτουργία στους νεφρούς CD169-DTR συνέβαλε στη μειωμένη βιωσιμότητα των ουδετερόφιλων. Παραδόξως, και οι μολυσμένοι νεφροί WT και CD169-DTR έδειξαν παρόμοια αναλογία PIneg αννεξίνης V συν αποπτωτική και PI συν αννεξίνη V συν νεκρά ουδετερόφιλα (Εικόνα 5Ε και ΣΤ). Αυτό υποδηλώνει ότι η βιωσιμότητα των ουδετερόφιλων δεν είναι ένας από τους παράγοντες που συμβάλλουν στην εξασθενημένη κανδιοκτόνο λειτουργία τους στους νεφρούς CD{3}}DTR Η νεφρική έκφραση IFN ήταν σημαντικά χαμηλότερη απουσία CD169 συν συν μακροφάγων. επίπεδα στα ουδετερόφιλα των νεφρών CD169-DTR μας ώθησαν να διερευνήσουμε το επίπεδο έκφρασης της IFN σε μολυσμένους νεφρούς WT και CD169- DTR την ημέρα 6 π. Αυτή η κυτοκίνη είναι γνωστό ότι είναι προστατευτική έναντι της διεισδυτικής καντιντίασης ενισχύοντας την κανδιοκτόνο ικανότητα των ουδετερόφιλων (Diamond et al, 1991; Kullberg et al, 1993; Stevenhagen & van Furth, 1993; Nader-Djalal & Zadeii, 1998). Περιέργως, παρατηρήσαμε μειωμένη νεφρική έκφραση IFN σε μολυσμένους νεφρούς CD169-DTR με qPCR (Εικ. 6Α), καθώς και με ανάλυση κυτταρομετρίας συναδέλφων (Εικ. 6Β).

Τα κύτταρα που παράγουν IFN περιορίζονται σε μια CD19int κάπα-ελαφριά αλυσίδα συν κυτταρικό πληθυσμόΣτη συνέχεια, προσπαθήσαμε να οριοθετήσουμε τον τύπο των ανοσοκυττάρων που παράγουν IFN την ημέρα 6 pi (Εικ. 7Α). Προς έκπληξή μας, αυτά τα κύτταρα που παράγουν IFN είναι τα Ly6CintLy6Glo, F4/80loCD11blo, MHCII συν CD11clo, CD49bnegCD3neg και CD8negCD4neg, πράγμα που δείχνει ότι δεν είναι Τ λεμφοκύτταρα, κλασικά APC και κοκκιοκύτταρα. Αντίθετα, αυτά τα κύτταρα που παράγουν IFN, τα οποία μειώνονται ευδιάκριτα σε μολυσμένους νεφρούς CD169-DTR (Εικ. 7Β), εκφράζουν MHCII, ελαφριά αλυσίδα κάππα και CD19int, υποδηλώνοντας πληθυσμό που μοιάζει με Β-κύτταρο (Εικ. 7Α) . Επειδή τα κύτταρα ΝΚ είναι σημαντικοί ρυθμιστές για την ενίσχυση των αντιμυκητιασικών μηχανισμών των φαγοκυττάρων μέσω της έκκρισης IFN σε λοιμώξεις από Candida (Bhatnagar et al, 2010; Costantini et al, 2010; Bar et al, 2014; Voigt et al, 2014), επιβεβαιώσαμε ξανά το if Τα κύτταρα ΝΚ απαιτούνται για τη ρύθμιση της παραγωγής IFN σε αυτή τη μόλυνση. Για το σκοπό αυτό, ανοσοεξαντλήσαμε κύτταρα ΝΚ in vivo και αξιολογήσαμε το επίπεδο έκφρασης της IFN σε μολυσμένους νεφρούς την ημέρα 2 και 6 pi Τα δεδομένα μας αποκάλυψαν ότι η εξάντληση των κυττάρων ΝΚ δεν επηρέασε την παραγωγή της IFN ούτε την ποσότητα των κυττάρων που παράγουν IFN ( Σχήμα S4A–C).

Συζήτηση

Τα TRM μεσολαβούν σε σημαντικές έμφυτες αποκρίσεις σε διάφορες μολυσματικές ασθένειες και γενικά αναγνωρίζονται ως πληθυσμοί F4/80hi και CD11b συν. Η σιαλοθεσίνη, επίσης γνωστή ως CD169, τονίστηκε ότι εκφράζεται μόνο από ένα υποσύνολο TRM στο νεφρό (Karasawa et al, 2015). Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία μεταγενέστερη αναφορά για το νεφρικό CD169 συν TRM. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν πρόσφατα ευρήματα ότι τα νεφρικά TRM δεν είναι ομοιογενή και μπορούν να υποκατηγοριοποιηθούν σε δύο υποκατηγορίες, συγκεκριμένα, F4/80 plus plus

CD11b plus (CD169 plus plus ) TRM και F4/80 plus plus CD11b plus plus (CD169 plus ) TRM. Χρησιμοποιώντας ποντίκια CX3CR1gfp/gfp και CD169-DTR, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι και τα CD169 plus TRM και CD169 plus TRM είναι απαραίτητα για τη συστηματική ανοσία Candida, όπου κάθε υποσύνολο εμφανίζει διαφορικές λειτουργίες στη νεφρική ανοσία Candida. Συγκεκριμένα, το CD169 plus TRM φαίνεται να είναι ζωτικής σημασίας για τον έλεγχο της νεφρικής ανάπτυξης C. albicans στο μεταγενέστερο στάδιο της λοίμωξης, ενώ το CD169 plus TRM φαίνεται να είναι κρίσιμο για την άμυνα πρώτης γραμμής των νεφρών περιορίζοντας την ανάπτυξη των μυκήτων στο αρχικό στάδιο της μόλυνσης. Αντίστοιχα, η έλλειψη CD169 συν TRM είχε ως αποτέλεσμα μια σαφή μείωση της παραγωγής ROS σε ουδετερόφιλα και νεφρική IFN. Απαιτούνται περαιτέρω έρευνες για την κατανόηση των μηχανισμών στη λειτουργία του νεφρικού CD169 συν TRM στον έλεγχο της μυκητιακής ανάπτυξης και της παραγωγής IFN.

Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι ο νεφρός είναι το κύριο όργανο-στόχος όπου το C. albicans επιμένει και αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές που υποδεικνύουν τη σημασία της νεφρικής ανοσίας στην πειραματική διάχυτη καντιντίαση και την επακόλουθη θνησιμότητα ποντικών (Spellberg

et al, 2003; MacCallum & Odds, 2005; Lionakis et al, 2011; Navarathna et al, 2012, 2019; Hebecker et al, 2016). Ειδικότερα, παρά την κατάλυση των TRMs σε όλα τα περιφερειακά όργανα σε ποντικούς CD169-DTR, οι νεφροί παρέμειναν ως το μόνο όργανο με επίμονο C. Albicans, υπογραμμίζοντας έτσι τον διακριτικό ρόλο των νεφρικών TRMs στη συστηματική ανοσία Candida. Αν και ο νεφρός είναι το κύριο όργανο-στόχος μπορεί να μην αντανακλάται σταθερά σε ανθρώπινους ομολόγους, η νεφρική ανοσία εξακολουθεί να πιστεύεται ότι αποτελεί αναπόσπαστο μέρος της αντίστασης του ξενιστή έναντι αυτής της λοίμωξης, επειδή έχει παρατηρηθεί σοβαρή νεφρική λοίμωξη από Candida σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς (Lionakis, 2014; Xu & Shinohara, 2017). Η ανεξέλεγκτη ανάπτυξη του C. albicans στους νεφρούς έχει προηγουμένως αιτιολογηθεί ότι αποδίδεται στην αργή ή καθυστερημένη στρατολόγηση έμφυτων μυελοειδών κυττάρων (Lionakis et al, 2011). Ωστόσο, στο μοντέλο μόλυνσης μας, παρατηρήσαμε λειτουργική διήθηση ανοσοκυττάρων στους νεφρούς ποντικών WT. Επιπλέον, τα CXCL1 και CCL2 σε μολυσμένους νεφρούς WT περιγράφηκαν ότι ήταν ανιχνεύσιμα ήδη 12 ώρες μετά τη μόλυνση, υποστηρίζοντας την ταχεία στρατολόγηση εγγενών μυελοειδών κυττάρων (MacCallum et al, 2009). Η στρατολόγηση των ανοσοκυττάρων έχει επίσης αναφερθεί ότι ρυθμίζεται από μακροφάγα, DCs, επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα (Netea et al, 2002; Tuite et al, 2004; Tran et al, 2015). Συγκεκριμένα, τα μακροφάγα έχει αποδειχθεί ότι στρατολογούν ουδετερόφιλα στο πρώιμο στάδιο της μόλυνσης μέσω της έκφρασης CXCL2 (Kanayama et al, 2015; Xu & Shinohara, 2017). Παρόλα αυτά, τα ποντίκια CD169-DTR εμφάνισαν παρόμοια κυτταρική στρατολόγηση στους νεφρούς με αυτή των ποντικών WT, υποδηλώνοντας ότι η ενορχήστρωση της κυτταρικής διήθησης δεν ξεκινά ούτε υποβοηθάται από CD169 συν TRM.

Πρόσφατα, οι Karasawa et al (2015) ανέφεραν ένα μικρό υποσύνολο νεφρικών μονοκυττάρων Ly6Clo που κατοικούν στο αγγείο που εκφράζει το CD169 (Karasawa et al, 2015) και μαζί με τα CD169 συν μακροφάγα, προκαλούν έναν κρίσιμο ρόλο στην πρόληψη της υπερβολικής φλεγμονής στη νεφρική ισχαιμία- τραυματισμός επαναιμάτωσης. Οι TRM που σχετίζονται με τα αγγεία έχουν επίσης περιγραφεί σε άλλα όργανα όπως το έντερο (Honda et al, 2020) και ο λιπώδης ιστός (Silva et al, 2019), όπου υποστηρίζουν τον αγγειακό τόνο και ακεραιότητα (μη δημοσιευμένα δεδομένα). Ως εκ τούτου, τα μονοκύτταρα/TRM που σχετίζονται με τα αγγεία θα μπορούσαν ενδεχομένως να έχουν παρόμοιο ρόλο στο νεφρό και να συμβάλλουν στην εξέλιξη της συστηματικής καντιντίασης. Η κατανόηση των νεφρικών μακροφάγων έχει περιοριστεί λόγω της έλλειψης διαθέσιμων εργαλείων και φαινοτυπικών δεικτών για την οριοθέτηση αυτών των μονοπύρηνων φαγοκυττάρων (Gottschalk & Kurts, 2015; Kurts et al, 2020). Παρά τις προσπάθειες κατανόησης των νεφρικών μακροφάγων μέσω μελετών ιχνηλάτησης και μεταγραφής (Hochheiser et al, 2013; Cao et al, 2015; Munoz et al, 2019; Liu et al, 2020; Salei et al, 2020), πολύ λιγότερο γνωστό για τις λειτουργίες των νεφρικών υποομάδων TRM σε περιβάλλοντα μολυσματικών ασθενειών. Παρόλο που τα νεφρικά μακροφάγα έχουν προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι ικανά να περιορίζουν άμεσα την ανάπτυξη και την εισβολή του C. albicans στα νεφρικά σωληνάρια, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι το υποσύνολο CD169 plus TRM δεν συμμετέχει σε αυτούς τους πρώιμους προστατευτικούς μηχανισμούς (Marcil et al, 2002, Lionakis et al, 2013· Munoz et al, 2019). Αντίθετα, δεδομένα από ποντίκια CX3CR1gfp/gfp υποδηλώνουν ότι το υποσύνολο CD169 συν TRM είναι ο κύριος πληθυσμός τελεστών για την παροχή αρχικής νεφρικής άμυνας έναντι της επίθεσης του C. Albicans.

Τα ουδετερόφιλα είναι τα αναπόσπαστα έμφυτα τελεστικά κύτταρα στην ανοσία Candida (Fulurija et al, 1996; Aratani et al, 1999; Netea et al, 2015) και οι ασθενείς που πάσχουν από ουδετεροπενία και ελαττώματα ουδετερόφιλων διατρέχουν υψηλότερο κίνδυνο για διηθητική καντιντίαση (L, 2013). Η σημασία της οδού οξειδωτικού τελεστή θανάτωσης υπογραμμίζεται από τα ευρήματα ότι η χρόνια κοκκιωματώδης νόσος και η ανεπάρκεια μυελοϋπεροξειδάσης, όπου η παραγωγή ROS είναι ελαττωματική στα ουδετερόφιλα, επηρεάζει τη θανάτωση του C. albicans τόσο σε ασθενείς όσο και σε ποντίκια (Aratani et al, 1999, 2002, Lehrer & Cline, 1969). Αντίστοιχα, η απουσία CD169 plus TRMs που οδήγησε σε σημαντική μείωση των ROS συν ουδετερόφιλων, και παραδόξως όχι των μονοκυττάρων, υποδηλώνει ότι η ανεξέλεγκτη ανάπτυξη του νεφρού C. Albicans πιθανότατα οφειλόταν στη μειωμένη ικανότητα θανάτωσης μυκήτων των ουδετερόφιλων

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΟΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΟ ΠΟΝΟ

Η σημασία της IFN στη συστηματική καντιντίαση έχει απεικονιστεί καλά σε ένα πειραματικό μοντέλο ποντικού, όπου η ανεπάρκεια IFN σε ποντίκια νοκ-άουτ αυξάνει την ευαισθησία τους σε αυτή τη μόλυνση (Balish et al, 1998; Cenci et al, 1998; Kaposzta et al, 1998). Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η χορήγηση IFN αυξάνει τη φαγοκυτταρική και μυκητιακή ικανότητα των ουδετερόφιλων και των μακροφάγων, η οποία με τη σειρά της βελτιώνει την αντίσταση των ασθενών έναντι της επεμβατικής καντιντίασης (Djeu et al, 1986; Malmvall & Follin, 1993; Marodi et al, 199 ). Στο μοντέλο ποντικιού που καταστρέφει το TRM, παρατηρήσαμε σταθερά μείωση της νεφρικής IFN απουσία CD169 συν συν TRM, γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή του CD169 συν συν TRM είτε στην έναρξη είτε στη διατήρηση της έκφρασης της IFN. Ενώ ο προστατευτικός ρόλος της IFN στη διάχυτη καντιντίαση είναι προφανής, η προστατευτική απόκριση με τη μεσολάβηση της IL σε αυτό το μοντέλο ήταν ως επί το πλείστον αμφιλεγόμενη (Balish et al, 1998; Lavigne et al, 1998; MacCallum, 2009; Kashem et al, 2015 Mengesha & Conti, 2017). Ωστόσο, η ανοσία που προκαλείται από την IL{14}}είναι γνωστό ότι είναι απαραίτητη για την στοματική και δερματική καντιντίαση (Conti & Gaffen, 2010; Netea et al, 2015; Mengesha & Conti, 2017). Στο μοντέλο μας, η κατάλυση του CD169 συν TRM δεν επηρέασε το επίπεδο έκφρασης της IL17. Στην πραγματικότητα, δεν παρατηρήσαμε μεγάλη έκφραση της IL17 σε μολυσμένους νεφρούς WT (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Παρόμοια με τις παρατηρήσεις μας, οι LeibundGut-Landmann et al (2007) ανέφεραν σημαντικά υψηλότερη ποσότητα IFN από την IL17 σε μολυσμένα WT ποντίκια (LeibundGut-Landmann et al, 2007), υποδεικνύοντας ότι η μεσολαβούμενη από IFN ανοσία είναι πιο έντονη στη συστηματική καντιντίαση. Μια άλλη μελέτη που επιβεβαίωσε τον ευεργετικό ρόλο της IFN στην ανοσία Candida ήταν η προστασία που προκλήθηκε από τη μεταβίβαση των κυττάρων Th1 που παράγουν IFN, αλλά όχι των κυττάρων Th17 που παράγουν IL{29}, έναντι της συστηματικής καντιντίασης (Kashem et al, 2015).

Ως πρώτο βήμα προς την αποκάλυψη της ενδιαφέρουσας συσχέτισης μεταξύ CD169 συν TRM, IFN και ουδετερόφιλων, το πιλοτικό μας πείραμα προσπάθησε να αποκαλύψει την κυτταρική πηγή της IFN στο μοντέλο μας. Τα κύτταρα NK, που είναι πρώιμα παραγωγοί IFN -, έχει αποδειχθεί ότι είναι ικανά να αναγνωρίζουν το C. Albicans και να ενισχύουν τη μυκητιακή θανάτωση των ουδετερόφιλων μέσω της έκκρισης IFN και GM-CSF (Bhatnagar et al, 2010; Bar et al, 2014; Voigt et. al, 2014· Whitney et al, 2014· Dom´ınguez-Andres et al, 2017 ´). Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι το 5-10 τοις εκατό των ΝΚ κυττάρων παράγουν IFN σε νεφρούς που έχουν μολυνθεί από Candida (Whitney et al, 2014). Προς έκπληξή μας, δεν παρατηρήσαμε κύτταρα IFN συν NK ούτε παρατηρήσαμε μείωση της IFN απουσία κυττάρων ΝΚ στο μοντέλο μας. Αυτή η παρατηρούμενη απόκλιση θα μπορούσε να οφείλεται στην αξιολόγηση των κυττάρων που παράγουν IFN σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Συγκεκριμένα, αξιολογήσαμε την παραγωγή IFN την ημέρα 6 pi, ένα χρονικό σημείο που ήταν πολύ μεταγενέστερο σε σύγκριση με την ομάδα του Whitney, δηλαδή 16 h pi. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα ΝΚ μπορεί να μην εμπλέκονται στη διατήρηση της παραγωγής IFN για αυτή τη μόλυνση. Είναι ενδιαφέρον ότι οι Murciano et al ανέφεραν ότι οι νεκροί ζυμομύκητες C. Albicans αναστέλλουν την απελευθέρωση IFN από κύτταρα ΝΚ (Murciano et al, 2006). Ένας άλλος πιθανός λόγος για την απόκλιση θα μπορούσε να είναι η πειραματική μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση της έκκρισης IFN. Σε αυτό το άρθρο, η μονεσίνη, ένας αναστολέας έκκρισης πρωτεΐνης, χορηγήθηκε απευθείας στα ποντίκια και η κυτταρική παραγωγή IFN στη συνέχεια αξιολογήθηκε χωρίς επώαση κυττάρων ex vivo. Από την άλλη, στη μελέτη των Whitney et al (2014), πριν από την IFN

αναλύσεις, τα νεφρικά κύτταρα παρασκευάστηκαν πρώτα και επωάστηκαν σε καλλιέργεια με έναν αναστολέα έκκρισης πρωτεΐνης για 7 ώρες (Whitney et al, 2014). Παραδόξως, άλλα λεμφοειδή και μυελοειδή υποσύνολα που διερευνήθηκαν στη μελέτη μας, ιδιαίτερα το CD169 συν TRM, επίσης δεν φαίνεται να εκφράζουν IFN, παρά τις μελέτες που αναφέρουν άμεση έκκριση IFN από μακροφάγους (Bogdan & Schleicher, 2006). Αντίθετα, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι οι κύριοι παραγωγοί IFN περιορίζονται σε πληθυσμό κυττάρων τύπου Β. Είναι ενδιαφέρον ότι ένας παρόμοιος υποπληθυσμός έμφυτων Β κυττάρων που παράγουν IFN έχει αναφερθεί ότι είναι ζωτικής σημασίας για τη ρύθμιση και την έναρξη της πρώιμης έμφυτης ανοσολογικής απόκρισης των ενδοκυτταρικών βακτηριακών λοιμώξεων (Bao et al, 2014; Krocova et al, 2020). Επιπλέον, άλλες προηγούμενες εργασίες αποκάλυψαν ότι τα ώριμα Β κύτταρα, όταν εκκινούνται από Τ κύτταρα και διεγείρονται από παθογόνα ή συνδέτες TLR, μπορούν να εκκρίνουν IFN (Gray et al, 2007; Lund & Randall, 2010). Αν και δεν είναι ασυνήθιστο ο άξονας Β κυττάρων-IFN σε μικροβιακές λοιμώξεις, απαιτούνται επειγόντως μελλοντικές μελέτες για τη συνολική περιγραφή αυτού του πληθυσμού που μοιάζει με νεφρική IFN συν Β-λεμφοκύτταρα και τον εντοπισμό της σχέσης του με το CD169 συν TRM στον νεφρό. Συνοπτικά, συμπεραίνουμε ότι τα νεφρικά TRMs μπορούν να υποταξινομηθούν σε δύο κύριους πληθυσμούς με βάση την έκφραση CD169. Το πιο σημαντικό, αυτά τα δύο υποσύνολα διαθέτουν μη περιττές προστατευτικές λειτουργίες στη διάχυτη καντιντίαση, οι οποίες παρέχουν πληροφορίες για την κυτταρική βάση της προστατευτικής έμφυτης ανοσίας του ξενιστή έναντι του C. Albicans. Αυτές οι αποκαλύψεις θα πρέπει να είναι χρήσιμες στο μελλοντικό σχεδιασμό θεραπευτικών παρεμβάσεων.

Υλικά και μέθοδοι

ΠοντίκιαΤα διαγονιδιακά ποντίκια CD{0}}DTR δημιουργήθηκαν στο εργαστήριό μας σε γενετικό υπόβαθρο BALB/c όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Purnama et al, 2014) και στη συνέχεια διασταυρώθηκαν με το C57BL/6 για 10 γενιές. Τα ποντίκια CX3CR1gfp/gfp αγοράστηκαν από το The Jackson Laboratory. Τα διαγονιδιακά ποντίκια CD169-DTR C57BL/6, μαζί με το WT C57BL/6, εκτράφηκαν και διατηρήθηκαν κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες απαλλαγμένες από παθογόνα στις εγκαταστάσεις ζώων Nanyang Technological University (NTU). Αρσενικά ποντίκια (ηλικίας 7-10 εβδομάδων) χρησιμοποιήθηκαν για μόλυνση από Candida. Όλα τα πειράματα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων με τον αριθμό ARF-SBS/NIE A-0380AZ.

Λοίμωξη C. albicansΤο κλινικό προϊόν απομόνωσης C. Albicans στέλεχος SC5314 καλλιεργήθηκε σε πλάκα εκχυλίσματος ζυμομύκητα-πεπτόνη-δεξτρόζη (YPD) για 24 ώρες στους 30 βαθμούς, ακολουθούμενο από 16-18 ώρες σε μέσο YPD. Το εναιώρημα C. albicans φυγοκεντρήθηκε, πλύθηκε και μετρήθηκε. Για μόλυνση, 5 x 104 cfu C. albicans εγχύθηκαν ενδοφλεβίως σε κάθε ποντίκι. Για τη θεραπεία με rIFN, τα μολυσμένα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10,{8}} U ανασυνδυασμένη IFN (R&D Systems) καθημερινά. Τα ποντίκια παρακολουθούνταν και ζυγίζονταν καθημερινά κατά τη διάρκεια της μόλυνσης. Μεσολαβούμενη από τοξίνη διφθερίτιδας και μεσολάβηση αντισώματος κατάλυση DT (10 ng/g σωματικού βάρους) παρασκευάστηκε σε PBS συμπληρωμένο με 1 τοις εκατό ορό ποντικού. Τα ποντίκια CD169-DTR και WT χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με DT σύμφωνα με το σχήμα μόλυνσης (Εικόνα S1)

Για την εξάντληση των κυττάρων ΝΚ, τα ποντίκια χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς με 100 ug αντισωμάτων NK1.1 (PK136, Invivomab) αντιποντικού καθημερινά.

Αναλύσεις μυκητιακού φορτίουΟ εγκέφαλος, η καρδιά, οι πνεύμονες, το ήπαρ, τα νεφρά και ο σπλήνας συλλέχθηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία μόλυνσης, ζυγίστηκαν και ψιλοκόπηκαν πριν από την επώαση με 1 mg/ml κολλαγενάση D σε μέσο πέψης για 1 ώρα στους 37 βαθμούς. Τα δείγματα επαναιωρήθηκαν επανειλημμένα μέχρι να μην υπάρχουν ορατά συσσωματώματα. Διεξήχθη σειριακή αραίωση και απλώθηκε σε τρυβλία YPD. Οι πλάκες επωάστηκαν για 48 ώρες στους 30 βαθμούς. Η CFU προσδιορίστηκε με χειροκίνητη μέτρηση των αποικιών. Το μυκητιακό φορτίο εκφράστηκε ως CFU ανά γραμμάριο οργάνου.

Συλλογή ιστού, επεξεργασία και απομόνωση εναιωρήματος μονοκυττάρουΤα νεφρά συλλέχθηκαν, κομματιάστηκαν και επωάστηκαν με 1 mg/ml κολλαγενάσης D σε μέσο πέψης για 1 ώρα στους 37 βαθμούς. Οι κιμάς νεφρών μεταφέρθηκαν με σιφώνιο πάνω-κάτω επανειλημμένα έως ότου δεν υπήρχαν ορατά συσσωματώματα. Μετά από φυγοκέντρηση στα 330 g για 5 λεπτά, τα σφαιρίδια κυττάρων επαναιωρήθηκαν με 5 ml 35 τοις εκατό Percoll (GE Healthcare Life Science) και φυγοκεντρήθηκαν στα 600 g για 15 λεπτά. Τα υπερκείμενα απορρίφθηκαν και τα κυτταρικά σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν με 5-ml ρυθμιστικά διαλύματα λύσης RBC. Μετά τη λύση, τα κυτταρικά εναιωρήματα φυγοκεντρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν με IMDM 2 τοις εκατό. Τα εναιωρήματα ενός κυττάρου αποθηκεύτηκαν στους 4 βαθμούς μέχρι περαιτέρω χρήση. Για την μέτρηση των κυττάρων, μικρά δείγματα αιωρημάτων κυττάρων, προαναμεμιγμένα με μπλε τρυπάνης, μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αιμοκυτταρόμετρο. Για ταξινόμηση κυττάρων, εναιωρήματα μονοκυττάρου νεφρού επωάστηκαν με CD16/32 αντι-ποντικού αρουραίου (2,4G2, 1 mg/ml), ακολουθούμενα από φθορίζοντα αντισώματα FL έναντι επιφανειακών αντιγόνων ποντικού CD45 (30F11), F4/80 (BM8), και CD11b (Μ1/70). Τα χρωματισμένα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά και περνούν από ένα φίλτρο 40-μm πριν ταξινομηθούν σε 4-διαλογέα κυττάρων λέιζερ BD FACSAria II (BD Bioscience).

Αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής Εναιωρήματα μονοκυττάρων επωάστηκαν με CD16/32 (2,4G2, 1 mg/ml) αρουραίου στους 4 βαθμούς για 15 λεπτά (1:100) σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS (PBS συμπληρωμένο με 2 τοις εκατό FCS) για τον αποκλεισμό των υποδοχέων Fc. Για τη χρώση των επιφανειακών αντιγόνων, τα κύτταρα επωάστηκαν με συζευγμένα με φθόριο αντισώματα έναντι CD45 ποντικού (30F11), F4/80 (BM8), CD11b (M1/70), Ly6G (1A8) και Ly6C (HK1.4) στους 4°C βαθμό για 20 λεπτά. Τα χρωματισμένα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS για απόκτηση σε ένα BD LSRFortesssa X-20 με πέντε λέιζερ (BD Biosciences). Για την ανίχνευση της ενδοκυτταρικής κυτοκίνης IFN, παρασκευάστηκαν εναιωρήματα μονοκυττάρου νεφρού από ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με αναστολέα της έκκρισης πρωτεΐνης μονενσίνη σύμφωνα με το πρωτόκολλο (Sun et al, 2009). Εν συντομία, σε κάθε ποντίκι εγχύθηκε ενδοφλέβια 250 μΙ PBS που περιείχε 100 ug μονενσίνης (M5273, Sigma-Aldrich), 5 ώρες πριν από την απομόνωση οργάνου και την επακόλουθη παρασκευή νεφρικών μονοκυτταρικών εναιωρημάτων. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-ποντικού CD16/32 αρουραίου και ακολούθησε χρώση με φθορίζοντα αντισώματα έναντι επιφανειακού αντιγόνου ποντικού CD45 (30F11), CD11b (M1/70), F4/80 (BM8), Ly6G (1A8), Ly6C (HK1 .4), CD3ε (145-2C11), CD49b (HMa2), CD19 (1D3), CD4 (GK1.5), CD8 (53.6–7), CD11c (N418), MHCII (M5/114.15.2 ), και lg κ ελαφριά αλυσίδα (RMK-45). Τα χρωματισμένα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα FACS ακολουθούμενη από σταθεροποίηση (2 τοις εκατό PFA) και διαπερατότητα (0,05 τοις εκατό σαπωνίνη) πριν από την επώαση με αντίσωμα αντι-IFN (1:500, BioLegend) σε διάλυμα σαπωνίνης 0,05 τοις εκατό. Τα χρωματισμένα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS για απόκτηση σε BD LSRFortesssa X-20 με πέντε λέιζερ (BD Bioscience). Για την ανίχνευση του κυτταρικού θανάτου και της απόπτωσης, τα εναιωρήματα μονοκυττάρων νεφρών αρχικά επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-ποντικού CD16/32 αρουραίου και ακολούθησε χρώση με φθορίζοντα αντισώματα έναντι αντιγόνου επιφανείας ποντικού CD45 (30F11), CD49b (HMa2), CD3ε ({101 }}C11), CD11b (M1/70), Ly6G (1A8) και Ly6C (HK1.4). Τα χρωματισμένα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα FACS και 1χ ρυθμιστικό δέσμευσης αννεξίνης V (BioLegend) πριν από την επώαση με συζευγμένη αννεξίνη V FITC σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (BioLegend). Τα χρωματισμένα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα αννεξίνης V που περιέχει ιωδιούχο προπίδιο (PI, 1 ug/ml) πριν από τη λήψη σε BD LSRFortessa X{116}} με πέντε λέιζερ (BD Bioscience).

Δοκιμασία ανίχνευσης ROSΤα εναιωρήματα ενός κυττάρου πλύθηκαν και επωάστηκαν με 2,5 μg/ml H2DFFDA, με ή χωρίς 100 μg/ml zymosan, για 60 λεπτά στους 4 βαθμούς ή 37 βαθμούς. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με IMDM 2 τοις εκατό και χρωματίστηκαν με επισημασμένα με φθόριο αντισώματα στους 4 βαθμούς για 20 λεπτά. Τα χρωματισμένα κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS που περιέχει PI για απόκτηση σε BD LSRFortessa X-20 με πέντε λέιζερ (BD Bioscience). Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με βάση τα αντίστοιχα κύτταρα που επωάστηκαν σε 4 βαθμούς.

Κρεατινίνη ορούΣυλλέχθηκαν οροί αίματος από ποντίκια την ημέρα 10 pi Τα επίπεδα κρεατινίνης ορού ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ELISA Cr (Κρεατινίνη) ποντικού (Elabscience), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή

Δοκιμασία μπλε EvansΗ διαπερατότητα των αιμοφόρων αγγείων αξιολογήθηκε σύμφωνα με τους Radu και Chernoff (2013). Εν συντομία, σε μη μολυσμένα και μολυσμένα ποντίκια WT και CD169-DTR έγινε ενδοφλέβια ένεση 200 μΙ 0,5 τοις εκατό Evans blue/PBS. 30 λεπτά αργότερα, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία και τα όργανά τους συλλέχθηκαν, ζυγίστηκαν και επωάστηκαν σε 100 τοις εκατό φορμαμίδιο σε σωλήνες μικροφυγοκέντρησης για 48 ώρες. Το φορμαμίδιο που εγχύθηκε με μπλε του Evans (0,5 ml) μεταφέρθηκε σε κυψελίδες πολυστυρενίου μιας χρήσης χωρίς να μεταφερθούν τεμάχια ιστού. Καταγράφηκαν απορροφήσεις στα 610 nm και αυτές οι τιμές κανονικοποιήθηκαν με βάση το βάρος των οργάνων.

Ιστολογικές αναλύσειςΓια χρώση με ανοσοφθορισμό, οι συγκομιδές νεφρών ενσωματώθηκαν στην ένωση βέλτιστης θερμοκρασίας κοπής (OCT Tissue Tek) και αποθηκεύτηκαν στους -80 βαθμούς. Τα τμήματα 6-μm κόπηκαν και στερεώθηκαν σε ακετόνη για 10-15 λεπτά. Οι τομές επωάστηκαν με Fc-block για 20 λεπτά, πλύθηκαν και επωάστηκαν με φθορίζοντα αντισώματα FL για 1 ώρα. Τα πλυμένα τμήματα στη συνέχεια τοποθετήθηκαν με μέσο στερέωσης φθορισμού DAKO FL. Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Nikon Eclipse 80i σε αντικειμενική μεγέθυνση 20×. Για χρώσεις H&E και PAS, τα θανατωμένα ποντίκια εγχύθηκαν με 4 τοις εκατό PFA (Sigma-Aldrich). Οι συλλεγμένοι νεφροί επωάστηκαν σε 4 τοις εκατό PFA για 24 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, αφυδατώθηκαν και ενσωματώθηκαν σε παραφίνη (Paraplast Plus, Leica). Στη συνέχεια, τα μπλοκ ενσωματωμένα σε παραφίνη τεμαχίστηκαν σε τμήματα 6-μm. Οι τομές αποπαραφινώθηκαν σε ξυλόλιο για 20 λεπτά και επανυδατώθηκαν. Για τη χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η&Ε), οι τομές χρωματίστηκαν με τροποποιημένο διάλυμα Mayer's αιματοξυλίνη (Abcam) και αντιχρωματίστηκαν με ηωσίνη (Sigma-Aldrich). Μετά τον καθαρισμό με ξυλόλιο, οι τομές τοποθετήθηκαν με DPX Mountant (SigmaAldrich). Για χρώση PAS, οι τομές επωάστηκαν με διάλυμα περιοδικού οξέος (Abcam), πλύθηκαν και χρωματίστηκαν με διάλυμα Schiff (Abcam). Μετά από αυτό, οι τομές αντιχρωματίστηκαν με τροποποιημένο διάλυμα Mayer's αιματοξυλίνη (Abcam). Μετά τον καθαρισμό με ξυλόλιο, οι τομές τοποθετήθηκαν με βάση στήριξης DPX (Sigma-Aldrich). Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το μικροσκόπιο Eclipse 80i (Nikon) με το λογισμικό Digital Sight DS-U3 (Nikon) και NIS-Elements D (Nikon) σε μεγεθύνσεις 4×10×, 20× και 100×.

Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνοΟι συλλεγμένοι νεφροί ομογενοποιήθηκαν αμέσως σε TRIZol (Thermo Fisher Scientific) χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή (CAT X360). Τα RNA εξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Κιτ RNAsimple Total RNA, Tiangen Biotech Ltd). Η σύνθεση μονόκλωνου cDNA από το καθαρισμένο RNA πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega M-MLV ανάστροφη μεταγραφάση). Η PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο Primerdesign Precision FAST (Primerdesign Ltd). Οι αλληλουχίες εκκινητών ήταν ως εξής: CXCL1; Fwd: ACTGCACCCAAACCGAAGTC, Αναθ.: TGGGGACACCTTTTAGCATCTT. CXCL2; Fwd: ACAGAAGTCATAGCCACTCTC, Αναθ.: CCTTGCCTTTGTTCAGTATC. CCL2; Fwd: CATCCACGTGTTGGCTCA, Αναθ.: GATCATCTTGCTGGTGAATGAGT. TNF- ; Fwd: TCTTCTCATTCCTGCTTGTGG, Αναθ.: GGTCTGGGCCATA GAACTGA. G-CSF; Fwd: GTGCTGCTGGAGCAGTTGT, Αναθ.: TCGGGATCCCCAGAGAGT. GM-CSF; Fwd: GCATGTAGAGGCCATCAAAGA, Αναθ.: CGGGTCTGCACACATGTTA. M-CSF; Fwd: GGTGGAACTGCCAGTA TAGAAAG, Αναθ.: TCCCATATGTCTCCTTCCATAAA. IL10; Fwd: CAGAGCCACATGCTCCTAGA, Αναθ.: TGTCCAGCTGGTCCTTTGTT. ICAM-1; Fwd: AGTCCGCTGTGCTTTGAG, Αναθ.: AGGTCTCAGCTCCACACT. VCAM-1; Fwd: TCTTACCTGTGCGCTGTGAC, Αναθ.: ACTGGATCTTCAGGGAAT GAGT. KIM-1; Fwd: AGATACCTGGAGTAATCACACTGAAG, Αναθ.: TGA TAGCCACGGTGCTCA. CD169; Fwd: GCTGATACTGGCTTCTACTTCT, Αναθ.: AGGTGGTCAGGTCTGGAGTAA. IFN- ; Fwd: CACGGCACAGTCATTGAAAG, Αναθ.: CCAGTTCCTCCAGATATCCAAG. -ακτίνη; Fwd: AAGGCAACCGTGAAAAGAT, Αναθ.: CTGTGGTACGACCAGAGGCATACA. hHB-EGF; Fwd: ATGACCACACAACCATCCTG, Αναθ.: CCAGCAGACACAGACAG ATGACA