Going Micro στη νεφρική νόσο λεπτοσπείρωσης Ⅱ

4. Αποκρίσεις ανοσίας ξενιστή στο Leptospira spp.

Η κύρια οδός του Leptospira είναι η άμεση διείσδυση στους βλεννογόνους ή στο ανοιχτό δέρμα μέσω αίματος, ιστών, ούρων ή μολυσμένου νερού, το οποίο εξαπλώνεται σε όλη τη συστηματική κυκλοφορία και διαχέεται σε πολλά όργανα, όπως τοσυκώτι, πνεύμονα και εγγύς σωληνάριο τουνεφρών στα νεφρά, όπου μπορεί να πολλαπλασιαστεί και να επιβιώσει για ένα μήνα [51]. Στην αρχική φάση της μόλυνσης, ηέμφυτη ανοσοαπόκρισηπαίζει θεμελιώδη ρόλο ως η πρώτη γραμμή άμυνας στη λεπτοσπείρωση, επηρεάζοντας την απόκριση τουυποδοχείς αναγνώρισης προτύπων, φαγοκυττάρωση μακροφάγων, επαγωγή εξωκυττάριαςσυσσώρευση ουδετερόφιλων, καιπαρέμβαση του συστήματος συμπληρώματος [52].

οανοσολογική απόκρισηστους ανθρώπους παίζει ουσιαστικό ρόλο στηνανάπτυξη κλινικών σημείων, όπως και οι λοιμογόνοι παράγοντες ορισμένων παθογόνων στελεχών. Η πλειονότητα της ανθρώπινης λεπτοσπείρωσης είναι ασυμπτωματική ή ήπια και μόνο το 10% των περιπτώσεων αναπτύσσει σοβαρές μορφές με πολυοργανική ανεπάρκεια και αυξημένα ποσοστά θνησιμότητας που σχετίζονται μεκαταιγίδα κυτοκινώνκαι κατάσταση ανοσοπαράλυσης. Τα παθογόνα είδη διεγείρουν μια χυμική απόκριση στη φάση της βακτηριαιμίας, αν και η επακόλουθη συμπεριφορά τουανοσολογική απόκρισηείναι ασαφές. Σε μελέτες ασθενών με πολλαπλές κλινικές εκδηλώσεις λεπτοσπείρωσης, η σοβαρότητα της κλινικής εικόνας έχει συσχετιστεί με διάφορα επίπεδα κυτοκινών ορού, όπως TNF-, IL-10 και IL-6 [53], αλλά Αυτό το συμπέρασμα παραμένει αμφιλεγόμενο [54]. Αυτές οι καταστάσεις έχουν οδηγήσει σε αυξημένο ενδιαφέρον για την κατανόηση της ανοσολογικής απόκρισης γενικά και των βιολογικών γεγονότων που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια της μόλυνσης.

ΠΟΣΟ ΧΡΕΙΑΖΕΤΑΙ ΓΙΑ ΝΑ ΔΟΥΛΕΨΕΙ ΤΟ CISTANCHE;

4.1. Η Λεπτοσπείρα και το Σύστημα Συμπληρώματος

Η πρωτεολυτική δράση των Leptospiral πρωτεασών έναντι της εξωκυτταρικής μήτρας επιτρέπει στη μόλυνση να εισέλθει στο κυκλοφορικό ρεύμα. Το σύστημα συμπληρώματος στο κυκλοφορικό σύστημα είναι ένας από τους κύριους μηχανισμούς της έμφυτης ανοσοαπόκρισης στην παθογόνο Λεπτοσπείρα. Ωστόσο, η Leptospira έχει αναπτύξει στρατηγικές για να ξεφύγει από την επίθεση του συστήματος συμπληρώματος δεσμεύοντας πρωτεΐνες σε μόρια συμπληρώματος και παράγοντας πρωτεάσες, όπως η θερμολυσίνη, ένα θερμοσταθερό ένζυμο ουδέτερης μεταλλοπρωτεϊνάσης που επηρεάζει την αλυσίδα της πρωτεΐνης C3. Τα παθογόνα στελέχη δεσμεύουν τον παράγοντα H (FH), την πρωτεΐνη 1 που σχετίζεται με τον παράγοντα H του συμπληρώματος (FHR-1), την πρωτεΐνη 1 παρόμοια με τον παράγοντα Η (FHL-1) και την πρωτεΐνη δέσμευσης C4b (C4BP), όλα εκ των οποίων είναι υπεύθυνες για την αναστολή του συστήματος συμπληρώματος [55]. Υπάρχουν τρεις κύριες στρατηγικές για την αποφυγή συμπληρώματος της παθογόνου Λεπτοσπείρας [55,56] μέσω της παρέμβασης των ρυθμιστών του συμπληρώματος ξενιστή, της πρωτεάσης του ξενιστή και της βακτηριακής πρωτεάσης. Για ρυθμιστές συμπληρώματος, το Leptospira χρησιμοποιεί παράγοντα H (FH, ρυθμιστής εναλλακτικής οδού συμπληρώματος) και πρωτεΐνη δέσμευσης C4 (C4BP, ρυθμιστής των οδών του κλασικού συμπληρώματος και του συμπληρώματος λεκτίνης) για να επιταχύνει τη διάσπαση των κονβερτάσης C3 και επίσης να ενεργεί ως συμπαράγοντες για τον Παράγοντα I για τη διάσπαση των C3b και C4b [57,58]. Η λεπτοσπειρική πρωτεΐνη (LcpA), μαζί με τη βιτρονεκτίνη (Vn, ένας τερματικός ρυθμιστής οδού) δεσμεύει το C9 και αναστέλλει τον πολυμερισμό του [59], εμποδίζοντας έτσι πιθανώς το σχηματισμό συμπλόκου ενεργοποίησης μεμβράνης (MAC) [60]. Επιπλέον, η παθογόνος Leptospira δεσμεύει αρκετές πρωτεάσες ξενιστές, όπως ο ενεργοποιητής πλασμινογόνου τύπου Ουροκινάσης (uPA), που επάγει την ενεργή πλασμίνη [61] (μια πρωτεάση σερίνης) για την πέψη των C3b, C4b και C5 στην επιφάνεια της Λεπτοσπείρας [62]. Επιπλέον, οι μεταλλοπρωτεάσες και η θερμολυσίνη, η ενδογενής πρωτεάση Leptospira, μπορούν να διασπάσουν και να απενεργοποιήσουν αρκετές πρωτεΐνες του συμπληρώματος (C2, C3, C4 και Παράγοντα Β) [60]. Ο συνδυασμός ρυθμιστών συμπληρώματος, από τον ξενιστή και την παθογόνο Λεπτοσπείρα, διευκολύνει τον βακτηριακό αποικισμό στα όργανα στόχους του ξενιστή [63].

4.2. Λεπτοσπείρα και ουδετερόφιλα

Κατά τη διάρκεια της μόλυνσης, το παθογόνο είδος Leptospira πυροδοτεί την ισχυρή ενεργοποίηση των ουδετερόφιλων και μια προφλεγμονώδη απόκριση. Τα ουδετερόφιλα είναι σημαντικά για τον έλεγχο των μικροοργανισμών, αλλά συμβάλλουν επίσης στη βλάβη των ιστών στον ξενιστή. Έχει αποδειχθεί ότι τα χαμηλά επίπεδα εξωκυττάριας συσσώρευσης ουδετερόφιλων λόγω της χαμηλής δραστηριότητας ουδετερόφιλων στην κυκλοφορία αυξάνουν τη λεπτοσπειραιμία, υποδεικνύοντας ότι ο ενδοαγγειακός σχηματισμός ουδετερόφιλων μπορεί να είναι κρίσιμος για την πρόληψη της πρώιμης εξάπλωσης της παθογόνου Λεπτοσπείρας [64].

4.3. Λεπτοσπείρα και Μακροφάγα

Στην αρχική φάση της μόλυνσης από Leptospira, τα μακροφάγα παίζουν σημαντικό ρόλο στην αποβολή της σπειροχαίτης. Αυτός ο τελεστικός μηχανισμός μαζί με μια αποτελεσματική απόκριση κυτοκίνης σχετίζεται με τον φαγοκυτταρικό έλεγχο και την εξάπλωση της μόλυνσης, αν και το Leptospira spp. έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί απόπτωση σε μακροφάγα μέσω της οδού Fas/FasL-κασπάσης-8/-3 και διευκολύνει την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό τους στον ξενιστή λόγω της απελευθέρωσης απόπτωσης και ενδονουκλεάσης που επάγει τον μιτοχονδριακό παράγοντα σε μολυσμένους μακροφάγα [65]. Πρόσφατη έρευνα έχει διεξαχθεί για το μικρο-μεταγραφικό μακροφάγων που έχουν μολυνθεί με Λεπτοσπείρα για τον προσδιορισμό των επιγενετικών μηχανισμών, όπως η μετα-μεταγραφική ρύθμιση από το RNA. Μακροφάγοι που έχουν μολυνθεί με Leptospira έχουν δείξει ότι τα microRNA (miRNAs) ρυθμίζονται από μόλυνση με τη σπειροχαίτη, αποδεικνύοντας ότι αυτή η ρύθμιση είναι ζωτικής σημασίας για την απόκριση αυτών των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος στη μόλυνση από Leptospira [66]. Στα ανθρώπινα μακροφάγα, η ενεργοποίηση της φλεγμονής που προκαλείται από αντιδραστικά είδη οξυγόνου και λυσοσωμική καθεψίνη Β που δημιουργείται από λοίμωξη από Leptospira έχει σημαντικά επίπεδα NLRP3 και IL-18, ευνοώντας την παραγωγή IL-1 και οδηγώντας σε υψηλή πιθανότητα φαγοκυττάρωσης και η ταχεία μοντελοποίηση ορισμένων κυτοκινών που συσχετίζονται με την αντίσταση στη λεπτοσπείρωση [67].

4.4. Humoral Response to Leptospira

Η ειδική χυμική απόκριση έναντι της Leptospira χαρακτηρίζεται από την παραγωγή αντισωμάτων IgM και IgG την τρίτη ημέρα έναρξης των συμπτωμάτων. Επιπλέον, η παραγωγή IgA έχει αναφερθεί από την πρώτη ημέρα έως τον ένατο μήνα μετά τη μόλυνση. Στην πραγματικότητα, η αύξηση της IgM έχει χρησιμοποιηθεί ως εναλλακτικό μέτρο στην έγκαιρη διάγνωση της λεπτοσπείρωσης [68]. Η επίδραση της χυμικής απόκρισης σε ανθρώπους με λεπτοσπείρωση επιτρέπει την ορολογική διάγνωση να γίνει μετά από φυσική μόλυνση [69]. Η πιο σημαντική πτυχή της χυμικής απόκρισης στη μόλυνση από Leptospira μπορεί να είναι ο σχηματισμός προστατευτικών αντισωμάτων. Τα εμβόλια που είναι διαθέσιμα επί του παρόντος για τη λεπτοσπείρωση αποτελούνται από πλήρη κυτταρικά παρασκευάσματα και έχουν περιορισμούς, όπως χαμηλή αποτελεσματικότητα, πολλαπλές παρενέργειες, χαμηλή δημιουργία ανοσολογικής μνήμης και έλλειψη διασταυρούμενης προστασίας για διαφορές οροειδών. Έτσι, η ανάπτυξη νέων εμβολίων είναι απαραίτητη για τον έλεγχο της νόσου και επί του παρόντος διεξάγεται έρευνα για την παραγωγή εμβολίων από γενετική ανοσοποίηση [70]. Τα OMP της Leptospira έχουν θεωρηθεί αντιγόνο, με καλύτερη ανοσογονικότητα για τα Β λεμφοκύτταρα, τα οποία περιλαμβάνουν τους δομικούς επιτόπους OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ {9}} και LipL41263-282 [71]. Αυτοί οι επίτοποι είναι πολλά υποσχόμενοι υποψήφιοι για την ανάπτυξη ενός καθολικού εμβολίου.

4.5. Προσαρμοστική Ανοσολογική Απόκριση στη Λεπτοσπείρα: Τ-κύτταρα και κυτοκίνες

Τα παθογόνα είδη Leptospira επάγουν μια ανοσοαπόκριση που μεσολαβείται από τα Τ και Β λεμφοκύτταρα, συνοδευόμενη από την έκφραση κυτοκινών που μπορεί να συσχετίζονται με χάρτες βαρύτητας. Η ενεργοποίηση των Τ κυττάρων κατά τη διάρκεια της μόλυνσης με Leptospira ξεκινά τη φλεγμονώδη απόκριση, κυρίως μέσω της παραγωγής κυτοκίνης. Αυτό είναι κρίσιμο για την πρώιμη εξάλειψη της λοίμωξης, αλλά η ανεξέλεγκτη παραγωγή προφλεγμονωδών κυτοκινών μπορεί επίσης να οδηγήσει σε υπερπαραγωγή κυτοκινών ακολουθούμενη από κατάσταση ανοσοπαράλυσης, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε σήψη και πολυοργανική ανεπάρκεια. Τα Τ λεμφοκύτταρα παράγουν IL-1, IL-6, IL-12, ιντερφερόνη (IFN)- και TNF-, τα οποία λειτουργούν ως χημειο-ελκυστικά για τη στρατολόγηση λευκοκυττάρων στο σημείο της μόλυνσης. Είναι ενδιαφέρον ότι in ex vivo, τα παρθένα δ Τ κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν σε καλλιέργειες μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος (PBMCs) που διεγείρονται με αντιγόνα Leptospira μαζί με την παραγωγή τόσο της IL-17 και της IFN [72]. Επιπλέον, ενώ τα μολυσμένα με λεπτοσπείρωση ποντίκια άγριου τύπου εμφάνισαν υψηλότερα επίπεδα αφθονίας κυτοκινών, συμπεριλαμβανομένων των IL-4, IL-10 και IL-13 σε σύγκριση με μη μολυσμένα ποντίκια, η χρόνια ποντίκια που προκλήθηκε από Leptospira νεφρίτιδα (Daf1-/- ποντίκια) εμφάνισαν υψηλότερη έκφραση ακτίνης λείου μυός, IL-10, IL-13, αλλά καμία διαφορά μεταξύ IL{-12 και IL{{21} } επίπεδα [73]. Ως εκ τούτου, το Daf1 και το IL-17 μπορεί να διαδραματίσουν κρίσιμο προστατευτικό ρόλο στην εξέλιξη της ΧΝΝ ως ο σύνδεσμος μεταξύ της ΧΝΝ ποντικού που προκαλείται από τη Λεπτοσπείρα με τη νεφρική ίνωση [72,73]. Ωστόσο, η υπόθεση της επιλεγμένης απόκρισης κυτοκίνης στην εξέλιξη της νόσου εξακολουθεί να είναι ασαφής στην ανθρώπινη λεπτοσπείρωση μέχρι στιγμής. Σε ασθενείς με σοβαρή λεπτοσπείρωση και πνευμονική προσβολή, ελήφθησαν αυξημένα επίπεδα IL-6, CXCL8 και IL-10 σε σύγκριση με ασθενείς με ήπια λεπτοσπείρωση [53]. Αυτές οι υψηλές συγκεντρώσεις κυτοκινών σε ασθενείς με λεπτοσπείρωση υπογραμμίζουν τον βασικό ρόλο τους στην ανάπτυξη σοβαρής λεπτοσπείρωσης.

Σε ασθενείς με σοβαρή λοίμωξη, CD{0}} Τ λεμφοκύτταρα με προφλεγμονώδες προφίλ και παραγωγοί IL-2 και IFN- εντοπίζονται ενώ CD4+ CD25 υψηλοί παραγωγοί IL-10 σχεδόν απουσιάζουν. Η ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης με τη μεσολάβηση των Τ λεμφοκυττάρων δεν φαίνεται να αποτρέπει τη βλάβη των ιστών που προκαλείται από τη φλεγμονώδη απόκριση στο Leptospira. Σε CD4+ Τ λεμφοκύτταρα ανθρώπων με σοβαρή λεπτοσπείρωση, η παραγωγή TNF- και άλλων προφλεγμονωδών κυτοκινών είναι υψηλότερη από ό,τι σε εκείνα με την ήπια μορφή της νόσου, γεγονός που υποδεικνύει ότι αυτές οι κυτοκίνες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες βαρύτητα στην ανοσολογική φάση της λοίμωξης [74]. Η παραγωγή IL-10 έχει συσχετιστεί με τον κίνδυνο θανάτου σε ανθρώπους με λεπτοσπείρωση. Ωστόσο, μια μελέτη που διεξήχθη σε εκτεθειμένους και ασυμπτωματικούς ανθρώπους συσχέτισε την παραγωγή αυτής της κυτοκίνης με τον έλεγχο της φλεγμονώδους απόκρισης και την επιβίωση [74]. Κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από Leptospira, οι φλεγμονώδεις μεσολαβητές και η δράση ορισμένων λευκοκυττάρων, όπως τα Τ λεμφοκύτταρα, ρυθμίζονται γρήγορα σε ανθεκτικά άτομα, σε αντίθεση με ό,τι συμβαίνει σε άτομα με σοβαρές μορφές λεπτοσπείρωσης [75].

Συνοψίζοντας, η ανοσολογική απόκριση στη λοίμωξη από Leptospira δεν είναι πλήρως κατανοητή λόγω των κλινικών συμπεριφορών ασθενών με λεπτοσπείρωση, οι οποίοι αλληλεπιδρούν με τους διαφορετικούς παράγοντες λοιμογόνου δράσης του βακτηριακού γονιδιώματος, γεγονός που δίνει στη Leptospira μια σταθερή παθογόνο ικανότητα.

5. Κλινικές Εκδηλώσεις

Οι κλινικές εκδηλώσεις της λεπτοσπείρωσης είναι ποικίλες, που κυμαίνονται από ήπια, μη ειδικά συμπτώματα, όπως συμπτώματα γρίπης (πυρετός, μυαλγία και πονοκέφαλος), έως σοβαρά συμπτώματα μαζί με τραυματισμούς οργάνων τελικού σταδίου (π.χ. AKI, οξεία ηπατική ανεπάρκεια και αιμορραγική διάθεση, επίσης γνωστή ως σύνδρομο Weil), οξεία αιμόπτυση από πνευμονική αιμορραγία, οξεία σύγχυση από άσηπτη μηνιγγοεγκεφαλίτιδα και οξεία καρδιακή ανεπάρκεια από οξεία ή υποξεία μυοκαρδίτιδα [7]. Συνεπώς, οι τρεις δείκτες υποψίας λοίμωξης από λεπτοσπείρωση αποτελούνται από (i)οξεία εμπύρετη ασθένεια, (ii) ίκτερος και (iii)οξεία νεφρική βλάβη[12]. Οι προγνωστικοί παράγοντες μιας σοβαρής μορφής λεπτοσπείρωσης είναι η σοβαρή μυαλγία κατά την έναρξη, η σοβαρή αιμορραγική τάση και ο έντονος ίκτερος. Είναι ενδιαφέρον ότι η παρουσία είτε προϋπάρχουσαςχρόνια νεφρική νόσος(μικρό μέγεθος νεφρού) ή διευρυμένοι, συμφορημένοι νεφροί με ανουρία σχετίζεται με τη χειρότερη έκβαση [12]. Έτσι, οι ασθενείς με νεφρική νόσο που σχετίζεται με τη λεπτοσπείρωση θα πρέπει να αντιμετωπίζονται έγκαιρα.

6. Διάγνωση

6.1. Κλινική Διάγνωση

Η διάγνωση της λεπτοσπείρωσης βασίζεται στο ιστορικό έκθεσης, στους παράγοντες κινδύνου και στις κλινικές εκδηλώσεις. Ένας υψηλός δείκτης υποψίας μπορεί να παρακάμψει μεταγενέστερη βλάβη οργάνων. Ωστόσο, τα συμπτώματα της λεπτοσπείρωσης συχνά συγχέονται με άλλες αιτίες του οξέος εμπύρετου συνδρόμου, όπως η μόλυνση από τον δάγκειο πυρετό, η ελονοσία, η ηπατίτιδα και η ενεργή αυτοάνοση νόσο. Η έλλειψη παθογνωμονικών σημείων της λεπτοσπείρωσης σημαίνει ότι η διάγνωση βασίζεται προσωρινά στην αξιολόγηση του πυρετού και της μυαλγίας σε ασθενείς από ενδημική περιοχή. Για το λόγο αυτό, η εργαστηριακή διάγνωση της λεπτοσπείρωσης είναι απαραίτητη.

6.2. Εργαστηριακή Διάγνωση

Η λεπτοσπείρωση είναι δύσκολο να διαγνωστεί στο εργαστήριο, ιδιαίτερα κατά την οξεία φάση. Μπορεί να πραγματοποιηθεί με άμεση ταυτοποίηση σπειροχαιτίδων ή συστατικών τους σε σωματικά υγρά ή ιστούς, απομόνωση λεπτοσπείρων σε καλλιέργεια ή ανίχνευση συγκεκριμένων αντισωμάτων σε διάφορες κλινικές φάσεις. Η λεπτοσπείρωση είναι δύσκολο να διακριθεί από ασθένειες, όπως η ελονοσία, ο δάγγειος πυρετός, η ρικέτσια, η γρίπη, η ηπατίτιδα και ο κίτρινος πυρετός λόγω της ασαφής κλινικής της εμφάνισης. Ως αποτέλεσμα, απαιτούνται εργαστηριακές εξετάσεις για να επιβεβαιωθεί η διάγνωση. Η ανίχνευση αντισωμάτων έναντι των λεπτοσπείρων, των ίδιων των λεπτοσπείρων ή του δεοξυριβονουκλεϊκού τους οξέος είναι η βάση για αυτές τις δοκιμές (DNA). Η τρέχουσα εργαστηριακή διάγνωση περιλαμβάνει τόσο άμεση ταυτοποίηση (ανίχνευση σπειροχαιτών ή DNA Leptospira στα δείγματα ή απομόνωση του οργανισμού από δείγματα) όσο και έμμεση ανίχνευση (ορολογική διάγνωση ή ορολογία για τον εντοπισμό λεπτοσπείρων λοίμωξης, η οποία βασίζεται στην ανίχνευση ειδικών αντισωμάτων έναντι διαφόρων Leptospiral antigens) (Πίνακας 1).

6.2.1. Άμεση μικροσκοπική εξέταση, καλλιέργεια και ανίχνευση αντιγόνου

Τα λεπτόσπειρα είναι λεπτές, φωτεινές, ενεργά κινητικές σπείρες με χαρακτηριστική ταχεία περιστροφή (κινητικότητα συσπάσεων) κάτω από το συμβατικό μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου (DFM) και περίπου 10 λεπτοσπείρες/mL απαιτούνται για την ανίχνευση ενός κυττάρου ανά πεδίο. Με μία εβδομάδα μεγαλύτερη στη διάρκεια της μόλυνσης, υπάρχει περίπου 10% νεκροί σε απόδοση DFM (από 100 έως 90%). Για την ενίσχυση της ευαισθησίας, διάφορες ειδικές μέθοδοι χρώσης. Χρώση Warthin– Starry silver [76] και ανοσοχρώση (ανοσοϊστοχημεία, ανοσοφθορισμός, σύλληψη ανοσομαγνητικού αντιγόνου και χρώση ανοσουπεροξειδάσης [77]) που απαιτούν πρωτεύοντα αντισώματα ειδικά για τον ορόοο (σε απομόνωση ή συνδυασμό).

Πίνακας 1. Εργαστηριακές εξετάσεις για τη διάγνωση της λεπτοσπείρωσης.

LAMP, ισοθερμική ενίσχυση με μεσολάβηση βρόχου. PCR, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης; NGS, αλληλουχία επόμενης γενιάς. IHA, έμμεση αιμοσυγκόλληση; ELISA, ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία. IgM, ανοσοσφαιρίνη Μ; ΜΑΤ, μακροσκοπική δοκιμή συγκόλλησης. MCAT, δοκιμή συγκόλλησης μικροκάψουλας. DNA, δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ; DFM, μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου

Παράλληλα, η καλλιέργεια Leptospira από αίμα, ούρα, εγκεφαλονωτιαίο υγρό και ιστό βιοψίας είναι δυνατή κατά τη διάρκεια των πρώτων ημερών έως 10 ημερών μετά την έναρξη των συμπτωμάτων της νόσου (στάδιο λεπτοσπείρωσης). Επειδή αναπτύσσονται αργά (χρόνος διπλασιασμού 6–8 ωρών), απαιτητικά και επιρρεπή σε μόλυνση, τα δείγματα καλλιέργειας πρέπει να διατηρούνται για τουλάχιστον 3–4 μήνες πριν απορριφθούν ως αρνητικά) με ευαισθησία μόνο 23%, αλλά είναι απαραίτητο για τη δοκιμή ευαισθησίας στα φάρμακα [6]. Ως εκ τούτου, τα μέσα EMJH (Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris) (σύμπλεγμα ελαϊκής λευκωματίνης) αποτελούνται από λευκωματίνη ορού βοοειδών (κλάσμα V), Tween 80, θειαμίνη χλωριούχο αμμώνιο, φωσφορικό μονοκάλιο, φωσφορικό δινάτριο και διάφορα θρεπτικά συστατικά [78] χρησιμοποιούνται συνήθως, ενώ τα πιο εξειδικευμένα μέσα T80/40/LH (πολυσορβικό 40, υδρόλυμα λακταλβουμίνης, υπεροξείδιο δισμουτάση και ορός κουνελιού), απαιτούνται για ορισμένους ορούς [79]. Για την πρωτογενή απομόνωση του μεγάλου και ποικίλου φάσματος ιδιότροπων παθογόνων λεπτοσπείρων, το Hornsby–Alt–Nally (HAN), φαίνεται να είναι ένα καλό μέσο [80].

Η ανίχνευση λεπτοσπείρων αντιγόνων με ανοσοϋπεροξειδάση, ανοσοφθορισμό ή ανοσομαγνητικό σύστημα σύλληψης αντιγόνου έχει αναπτυχθεί για δείγματα με χαμηλό βακτηριακό φορτίο ή μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί αλλά δεν εκτελείται τακτικά λόγω του περιορισμού του πρωτογενούς αντισώματος [77]. Αντίθετα, η αναγνώριση νουκλεϊκού οξέος με νέα ενίσχυση DNA. αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) (δηλαδή, ένθετη-PCR, ποσοτική PCR [qPCR]), ισοθερμική ενίσχυση με μεσολάβηση βρόχου (LAMP) και αλληλούχιση επόμενης γενιάς (NGS) είναι πολύτιμες για μια πρώιμη και ακριβή εργαστηριακή διάγνωση, ειδικά με Απομόνωση λεπτοσπείρας με ενοφθαλμισμό βιολογικών μέσων και υβριδισμό DNA (DNA probe) [81,82]. Μια ποικιλία Leptospiral στόχων (όπως το 16S ριβοσωμικό RNA) ή DNA μπορεί να ενισχυθεί για διάγνωση [83] και η PCR σε πραγματικό χρόνο (RT-PCR) είναι πιο ευαίσθητη και ειδική από την τυπική PCR [84]. Επειδή ορισμένοι εκκινητές RT-PCR μπορεί να συνδεθούν σε μια μη ειδική θέση, οδηγώντας σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα, οι πιο πρόσφατες δοκιμές multiplex PCR σε πραγματικό χρόνο έχουν αναπτυχθεί χρησιμοποιώντας δύο σετ εκκινητών [85]. Η Nested PCR βοηθά επίσης στον εντοπισμό πιο συγκεκριμένων και ευαίσθητων θέσεων DNA με πρόσθετα σετ εκκινητών [86,87]. Ωστόσο, οι τρέχουσες τάσεις για τη διάγνωση της λεπτοσπείρωσης είναι η χρήση ορολογικών και μοριακών τεχνικών, όπως η PCR και η ELISA (ευκολότερη από το χρυσό πρότυπο ορολογικό MAT), για χώρες με περιορισμένους πόρους [88,89]. Επιπλέον, η τεχνική LAMP [90] για την ανίχνευση ενός γονιδίου 16S rRNA (rrs), είναι μια οικονομικά αποδοτική, γρήγορη και υψηλής απόδοσης για την ανίχνευση των παθογόνων λεπτοσπείρων στα ούρα. Επί του παρόντος, το NGS είναι η πιο ακριβής βάση ανεξάρτητη από την καλλιέργεια μέθοδο για την ανάλυση του γονιδιώματος του πυρήνα στα σωματικά υγρά (αίμα και ούρα) [91] και η μελλοντική κατεύθυνση των δοκιμών λεπτοσπείρωσης θα ήταν η μετάβαση προς τη μοριακή ταξινόμηση των λεπτοσπείρων, η οποία ξεπερνά τον περιορισμό των καλλιέργεια λεπτοσπείρων από κλινικά δείγματα. Ως εκ τούτου, η αξία της PCR στην κλινική διάγνωση της λεπτοσπείρωσης είναι ιδιαίτερα καλή και πολλές σύγχρονες τεχνικές εμφανίζονται

6.2.2. Ανίχνευση Αντισωμάτων Anti-Leptospira

Χρησιμοποιούνται διάφορες ορολογικές διαγνώσεις. για παράδειγμα, ειδικές για το γένος δοκιμές αντισωμάτων (έμμεση αιμοσυγκόλληση [IHA], ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία [ELISA], Lepto Dri Dot [συγκόλληση λατέξ], συγκόλληση μικροκάψουλας [MCAT]) και δοκιμές αντισωμάτων ειδικών για οροπαραγωγούς (μικροσκοπική δοκιμή συγκόλλησης ΜΑΤ]) [92,93]. Ως εκ τούτου, τα κριτήρια MAT για τη διάγνωση είναι (i) τετραπλάσια αύξηση τίτλου σε ζευγαρωμένους ορούς (ορομετατροπή της τρέχουσας λοίμωξης) ή (ii) ένας μόνο υψηλός τίτλος (Μεγαλύτερος ή ίσος με 1:400 ή 1:800, υψηλότερος στην επιδημία περιοχές) (οροθετικότητα) (τα αντισώματα μπορεί να επιμείνουν για κάποιο χρονικό διάστημα μετά τη μόλυνση ή τη διασταυρούμενη αντίδραση με άλλες ασθένειες). Επιπρόσθετα, το MAT απαιτεί ένα ζωντανό πάνελ όλων των οροπαραγωγών Leptospira στην περιοχή, με ένα πάνελ τοπικά τυποποιημένων ορομέτρων [93,94] σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό για την Υγεία των Ζώων (19 αντιγόνα που αντιπροσωπεύουν 15 οροομάδες) [95]. Επειδή τα αντισώματα είναι ανιχνεύσιμα στις 5-7 ημέρες μετά τη μόλυνση, το τεστ ΜΑΤ μπορεί να είναι αρνητικό (τίτλος < 1:50) κατά τις πρώτες ημέρες της μόλυνσης. Η διάγνωση της λεπτοσπείρωσης μπορεί να πραγματοποιηθεί με δείγματα ούρων [96] χρησιμοποιώντας τόσο ορολογική όσο και μοριακή ανίχνευση (16S rRNA), ιδιαίτερα σε ασθενείς με πρόσφατη λοίμωξη (MAT Μεγαλύτερο ή ίσο με 1:800 ή ELISA θετικό για IgM ή και τα δύο) [97] .

Με περιορισμένους πόρους, μια βαθμολογία κλινικής πρόβλεψης [98] με βάση το σχετικό κλινικό ιστορικό και τις σχετικές εργαστηριακές εξετάσεις με βαθμολόγηση σε επτά πτυχές είναι η εξής: υπόταση (3), ίκτερος (2), μυϊκός πόνος (2), AKI (1,5) , χαμηλή αιμοσφαιρίνη (3), υποκαλιαιμία με υπονατριαιμία (3) και ουδετεροφιλία (1) προτείνεται (μια αποκοπή συνοπτική βαθμολογία 4 έχει την περιοχή κάτω από τη χαρακτηριστική καμπύλη λειτουργίας του δέκτη {{10}}.78 ( 95% CI 0.68–0,89) για διάγνωση λεπτοσπείρωσης [77]). Αυτή η βαθμολογία πιθανότητας Ταϊλάνδης-Λεπτο-κατά την εισαγωγή θα μπορούσε να είναι ένα διαγνωστικό εργαλείο για την έγκαιρη πιθανή διάγνωση της λεπτοσπείρωσης σε ασθενείς που παρουσιάζουν σοβαρή κλινική υποψία της νόσου.