Ποσοτικοποίηση του εκφυλισμού νευρίτη με βελτιωμένη ακρίβεια και αποτελεσματικότητα σε ένα μοντέλο in vitro της νόσου του Πάρκινσον Μέρος 2

Αποτελέσματα

Καθιέρωση μοντέλου κυτταροκαλλιέργειας εκφυλισμού νευριτών που σχετίζεται με PD

Για να αναπτύξουμε μια μέθοδο για τη διερεύνηση του εκφυλισμού νευρίτη σε ένα μοντέλο κυτταροκαλλιέργειας PD, χρησιμοποιήσαμε καλλιεργημένα κύτταρα LUHMES, έναν πληθυσμό αθανατοποιημένων υπό όρους, ανθρώπινων μεσεεγκεφαλικών κυττάρων. Κατά τη διαφοροποίηση, τα κύτταρα LUHMES γίνονται μεταμιτωτικά, υιοθετούν ένα προφίλ γονιδιακής έκφρασης χαρακτηριστικό των ώριμων ντοπαμινεργικών νευρώνων και αναπτύσσουν μια νευρωνική μορφολογία με νευρίτες που εκτείνονται έως και 500 mm σε μήκος (Εικ. 1Α; Lotharius et al., 2005; Scholz et al. , 2011, Kraemer et al., 2021).

Ο νευροεκφυλισμός, μια κατάσταση κατά την οποία τα νευρικά κύτταρα μεταλλάσσονται ή πεθαίνουν, σχετίζεται στενά με τη μνήμη. Σε μοντέλα κυτταροκαλλιέργειας, μπορούμε να ελέγξουμε τις συνθήκες καλλιέργειας για να ανακουφίσουμε την έκφραση του νευροεκφυλισμού και έτσι να βελτιώσουμε την απόδοση της μνήμης.

Μελέτες έχουν δείξει ότι η ομοιόσταση των νευρικών κυττάρων παίζει σημαντικό ρόλο στην επιβίωση των κυττάρων και στη λειτουργία του συστήματος. Μπορούμε να βελτιώσουμε τη σταθερότητα των κυττάρων ελέγχοντας παράγοντες όπως τα θρεπτικά συστατικά και οι αυξητικοί παράγοντες στο μέσο καλλιέργειας. Ταυτόχρονα, δώστε προσοχή στη διατήρηση της καθαριότητας και του ελέγχου της θερμοκρασίας του περιβάλλοντος καλλιέργειας για να αποτρέψετε την ενόχληση και την καταστροφή των κυττάρων από το περιβάλλον.

Επιπλέον, στο μοντέλο κυτταροκαλλιέργειας, μπορούμε επίσης να εγχύσουμε ορισμένες ενώσεις ή φάρμακα στα κύτταρα για να μειώσουμε την έκφραση της νευροτροποποίησης, βελτιώνοντας έτσι το ποσοστό επιβίωσης και την απόδοση μνήμης των κυττάρων. Αυτή η τεχνική χρησιμοποιείται επίσης ευρέως στη μελέτη νευροεκφυλιστικών ασθενειών.

Εν ολίγοις, ο νευροεκφυλισμός έχει σημαντικό αντίκτυπο στη σταθερότητα των κυττάρων και στη λειτουργία του συστήματος και η τεχνολογία κυτταροκαλλιέργειας είναι μια καλή μέθοδος έρευνας μοντέλου, η οποία μπορεί να διεξαγάγει σε βάθος εξερεύνηση και έρευνα για τη σχέση μεταξύ νευροεκφυλισμού και μνήμης. Μπορούμε να ανακουφίσουμε την απόδοση της νευροτροποποίησης καλλιεργώντας περιβαλλοντικό έλεγχο, ενέσιμα φάρμακα σε κύτταρα κ.λπ., για να βελτιώσουμε την κυτταρική επιβίωση και την απόδοση της μνήμης και να παρέχουμε μια πιο ολοκληρωμένη βάση για τη μελέτη των νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη μας. Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη μας, επειδή το Cistanche μπορεί επίσης να ρυθμίσει την ισορροπία των νευροδιαβιβαστών, όπως η αύξηση του επιπέδου της ακετυλοχολίνης και των αυξητικών παραγόντων, που είναι πολύ σημαντικοί για τη μνήμη και τη μάθηση. Επιπλέον, το κρέας μπορεί επίσης να βελτιώσει τη ροή του αίματος και να προωθήσει την παροχή οξυγόνου, η οποία μπορεί να εξασφαλίσει ότι ο εγκέφαλος λαμβάνει επαρκή διατροφή και ενέργεια, βελτιώνοντας έτσι τη ζωτικότητα και την αντοχή του εγκεφάλου.

Κάντε κλικ στα συμπληρώματα γνώσης για να βελτιώσετε τη μνήμη

Λόγω των ανώτερων οπτικών ιδιοτήτων του γυαλιού σε σύγκριση με το πλαστικό, οι καλλιέργειες εγκαταστάθηκαν σε γυάλινες πλάκες που περιείχαν οκτώ θαλάμους μέσων. Με βάση προηγούμενες αναφορές (Lotharius et al., 2005; Scholz et al., 2011; Kurowska et al., 2014), αρχικά επιχειρήσαμε να καθιερώσουμε καλλιέργειες σε πλάκες θαλάμου επικαλυμμένες με PLO και φιμπρονεκτίνη. Ωστόσο, τέτοιες καλλιέργειες εμφάνισαν ελλείμματα προσκόλλησης και χαμηλή βιωσιμότητα. Ως αποτέλεσμα, δοκιμάσαμε εάν η επικάλυψη με πρόσθετα υποστρώματα θα βελτίωνε τη βιωσιμότητα των κυτταροκαλλιεργειών LUHMES που έχουν εγκατασταθεί σε γυάλινες επιφάνειες.

Οι κυτταροκαλλιέργειες LUHMES δημιουργήθηκαν σε πλακίδια που είτε ήταν μη επικαλυμμένα είτε επικαλυμμένα με PLO και φιμπρονεκτίνη, PDL και λαμινίνη, ή συνδυασμό και των τεσσάρων υποστρωμάτων. Η ανάλυση βιώσιμων πυρήνων με μικροσκόπιο φθορισμού αποκάλυψε ότι η επικάλυψη πλακών επηρέασε σημαντικά τη βιωσιμότητα των καλλιεργειών [Friedman x2 (3)=18, p, 0.0001], με αναλύσεις πολλαπλής σύγκρισης post hoc που αποκαλύπτουν ότι οι διαφάνειες επικαλυμμένα με συνδυασμό και των τεσσάρων προαναφερθέντων υποστρωμάτων αποδίδουν σημαντικά υψηλότερο ποσοστό βιώσιμων κυττάρων σε σύγκριση με πλακίδια που είναι επικαλυμμένα μόνο με PLO και φιμπρονεκτίνη (ρ= 0.0437; Εικ. 1Β, C).

Μετά τον εντοπισμό των βέλτιστων υποστρωμάτων επικάλυψης για την καλλιέργεια κυττάρων LUHMES σε γυάλινες πλάκες, αξιολογήσαμε τις επιδράσεις της κυτταρικής πυκνότητας στην καταλληλότητα των καλλιεργειών για μετρήσεις εκφυλισμού νευρίτη. Τα κύτταρα LUHMES καλλιεργήθηκαν σε ένα μέσο διαφοροποίησης με πυκνότητες επιμετάλλωσης 57.500 κύτταρα ανά φρεάτιο, 115,{3}} κύτταρα ανά φρεάτιο ή 230,000 κύτταρα ανά φρεάτιο, και την πέμπτη ημέρα διαφοροποίησής τους, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA και απεικονίστηκαν με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης.

Μια πυκνότητα 57.500 κυττάρων ανά φρεάτιο οδήγησε σε καλλιέργειες με κακώς δικτυωμένους νευρίτες και ακανόνιστη μορφολογία νευριτών, ενώ καλλιέργειες με πυκνότητα επιμετάλλωσης 230,000 κύτταρα, αν και βιώσιμα, περιείχαν πολύ υψηλές πυκνότητες νευρίτη για ακριβή μέτρηση νευρίτη. Η ενδιάμεση κυτταρική πυκνότητα των 115,000 κυττάρων ανά φρεάτιο παρείχε υψηλή βιωσιμότητα και καλά διαχωρισμένες οδούς άξονα που ευνοούν τις ακριβείς μετρήσεις εκφυλισμού νευρίτη (Εικ. 1D).

Για να μοντελοποιήσουμε τον εκφυλισμό νευρίτη που σχετίζεται με PD in vitro, εκθέσαμε διαφοροποιημένα κύτταρα LUHMES σε 6-OHDA, μια ευρέως χρησιμοποιούμενη νευροτοξίνη που προάγει το οξειδωτικό στρες και τον εκφυλισμό των κατεχολαμινεργικών νευρώνων (Bové and Perier, 2012). Η έκθεση των διαφοροποιημένων κυττάρων LUHMES σε 6-OHDA προήγαγε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στον εκφυλισμό νευρίτη, με 5,0 mM 6-OHDA και 7,5 mM 6-OHDA να προκαλούν μέτριο και σοβαρό εκφυλισμό νευρίτη, αντίστοιχα (Εικ. . 2F). Για να ποσοτικοποιήσουμε τον εκφυλισμό νευρίτη σε καλλιέργειες κυττάρων LUHMES που εκτέθηκαν σε 6-OHDA, χρησιμοποιήσαμε μια ευρέως αναφερόμενη μέθοδο στην οποία οι εικόνες αντίθεσης φάσης των καλλιεργειών δυαδοποιούνται, τα κυτταρικά σώματα στις εικόνες αφαιρούνται ψηφιακά και ο αλγόριθμος αναλυτών σωματιδίων Το ImageJ εφαρμόζεται για τη μέτρηση της περιοχής των θραυσμάτων νευρίτη. Οι κατακερματισμένες περιοχές νευριτών στη συνέχεια αθροίζονται και διαιρούνται με τη συνολική περιοχή νευρίτη για να προσδιοριστεί ένα DI (Εικ. 2A–E, Sasaki et al., 2009; Kraemer et al., 2014; Di Stefano et al., 2015; Hill et al. ., 2018· Geisler et al., 2019).

Όπως αναμενόταν, η έκθεση των διαφοροποιημένων κυττάρων LUHMES σε 6- OHDA προκάλεσε δοσοεξαρτώμενη αύξηση στο DI (F(3,24)= 119.8, p=0.0001, R{ {8}}.9374· Εικ. 2G). Ωστόσο, κατά τη διάρκεια των αναλύσεων των κυττάρων που εκτέθηκαν σε 6-OHDA, παρατηρήσαμε αρκετά ζητήματα που φάνηκε να επηρεάζουν αρνητικά την ακρίβεια και την αποτελεσματικότητα των μετρήσεων DI. Έτσι, επιδιώξαμε να βελτιστοποιήσουμε αυτήν την κοινή μέθοδο για την εκτέλεση μετρήσεων DI, την οποία στο εξής θα αναφέρουμε ως η παραδοσιακή μέθοδος DI, για να δημιουργήσουμε ένα πρωτόκολλο που θα διευκολύνει την αποτελεσματικότερη μέτρηση του κατακερματισμού του νευρίτη.

Μείωση του τεχνητού κατακερματισμού που σχετίζεται με τη δυαδοποίηση μικρογραφιών

Κατά τη χρήση της παραδοσιακής μεθόδου DI, παρατηρήσαμε συχνά ένα ζήτημα στο οποίο ανέπαφοι νευρίτες σε εικόνες αντίθεσης φάσης εμφανίζονταν κατακερματισμένοι στην αντίστοιχη δυαδοποιημένη εικόνα τους (Εικ. 3Α). Αυτός ο τεχνητός κατακερματισμός επηρέασε κυρίως νευρίτες με χαμηλή προβολή. Έτσι, διερευνήσαμε εάν το πρόβλημα θα μπορούσε να μειωθεί με διαδικασίες που ενισχύουν την αντίθεση της εικόνας. Για να βελτιώσουμε την αντίθεση της εικόνας, καταγράψαμε πρώτα εικόνες νευριτών χρησιμοποιώντας μια ποικιλία εντάσεων φωτός για να προσδιορίσουμε το επίπεδο φωτεινότητας της εικόνας που θα παρήγαγε τη βέλτιστη αντίθεση.

Οι εικόνες που τραβήχτηκαν με τη βέλτιστη ένταση φωτός υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε περαιτέρω βελτίωση της αντίθεσης χρησιμοποιώντας το ImageJ για την εφαρμογή ενός LUT με ελάχιστες και μέγιστες τιμές έντασης 90 και 205, αντίστοιχα. Η ενσωμάτωση αυτών των βελτιώσεων αντίθεσης παρείχε μια μετρίως πιο ακριβή αναπαράσταση των νευριτών σε δυαδικές εικόνες που παράγονται από εικόνες αντίθεσης φάσης (Εικ. 3Β). Ωστόσο, η ποσοτική ανάλυση δυαδοποιημένων εικόνων υγιών νευριτών έδειξε ότι οι βελτιώσεις αντίθεσης δεν μείωσαν σημαντικά τον τεχνητό κατακερματισμό (ρ=0.9999; Εικ. 3D). Έτσι, στη συνέχεια διερευνήσαμε εάν η χρήση απεικόνισης ανοσοφθορισμού θα παρήγαγε εικόνες με ανώτερη αντίθεση και ως εκ τούτου θα διευκόλυνε την παραγωγή πιο ακριβών δυαδοποιημένων εικόνων νευρίτη με μειωμένο τεχνητό κατακερματισμό.

Οι διαφάνειες που περιγράφονται στο Σχήμα 2, που παρουσιάζουν σταθερά κύτταρα LUHMES εκτεθειμένα σε διάφορες συγκεντρώσεις 6- OHDA, ανοσοχρωματίστηκαν για την κυτταροσκελετική πρωτεΐνη b III-τουμπουλίνη, απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού και αναλύθηκαν από έναν τυφλό ερευνητή για τεχνητό κατακερματισμό (Εικ. 3C). Η ποσοτική ανάλυση δυαδικών εικόνων που ελήφθησαν από μικρογραφίες φθορισμού και αντίστοιχες μικρογραφίες αντίθεσης φάσης αποκάλυψε ότι ο τύπος της μικροσκοπίας επηρέασε τα επίπεδα τεχνητού κατακερματισμού [Friedman x2 (3)=15.44, p, 0.0001] . Συγκεκριμένα, οι μικρογραφίες φθορισμού παρήγαγαν δυαδικές εικόνες με σημαντικά μειωμένο τεχνητό κατακερματισμό σε σύγκριση με εκείνες από μικρογραφίες αντίθεσης φάσης (ρ=0.0016; Εικ. 3D).

Ως αποτέλεσμα, οι εικόνες υγιών καλλιεργειών απέδωσαν σημαντικά χαμηλότερες βαθμολογίες DI όταν χρησιμοποιήθηκαν μικρογραφίες φθορισμού αντί για μικρογραφίες αντίθεσης φάσης (F(1,8)= 131.4, p=0.{{12} }001, R2=0.1442· Εικ. 3Ε). Επιπλέον, μια αξιοσημείωτη γενική τάση είναι ότι η πολλαπλάσια αλλαγή μεταξύ των μέσων τιμών DI που σχετίζονται με υγιείς καλλιέργειες (που υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα) και καλλιέργειες που εμφάνιζαν εκφυλισμό νευρίτη (5,0 ή 7,5 mM 6-με αγωγή με OHDA) ήταν μεγαλύτερες όταν μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μικρογραφίες φθορισμού παρά όταν λαμβάνονται από μικρογραφίες αντίθεσης φάσης (Εικ. 3Ε). Αυτό συνέβη παρά τις μικρογραφίες φθορισμού καλλιεργειών με μέτριο εκφυλισμό νευρίτη (που προκαλείται από έκθεση σε 5 mM 6-OHDA) που είχαν σημαντικά χαμηλότερα σκορ DI από τις αντίστοιχες εικόνες φάσης λόγω της μείωσης του τεχνητού κατακερματισμού (p=0).0001 , d=0.6312).

Βελτιστοποίηση παραμέτρων για κατακερματισμένο νευρίτη και ανίχνευση ολικού νευρίτη
Η παραδοσιακή μέθοδος για την εκτέλεση μετρήσεων DI περιλαμβάνει τη χρήση της προσθήκης Analyze Particles για το ImageJ με παραμέτρους μεγέθους 20 10,000 pixel για την ανίχνευση θραυσμάτων νευρίτη. Ωστόσο, παρατηρήσαμε ότι ένα μεγάλο ποσοστό θραυσμάτων νευρίτη δεν ανιχνεύτηκε από τον αναλυτή σωματιδίων όταν χρησιμοποιήθηκαν αυτές οι ευρέως αναφερόμενες παραμέτρους (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al. , 2020· Shin and Cho, 2020) για τη μέτρηση του εκφυλισμού νευρίτη σε μικρογραφίες αντίθεσης φάσης κυττάρων LUHMES που εκτέθηκαν σε 6-OHDA, που δημιουργήθηκαν όπως περιγράφεται στο Σχήμα 2.

Έτσι, αναλύσαμε ξανά εικόνες από αυτό το σύνολο δεδομένων χρησιμοποιώντας διαφορετικά όρια ελάχιστου μεγέθους για την ανίχνευση σωματιδίων για να προσδιορίσουμε τις βέλτιστες παραμέτρους για την αναγνώριση θραυσμάτων νευρίτη. Από την ποιοτική αξιολόγηση των δυαδικών εικόνων που δημιουργήθηκαν από μικρογραφίες αντίθεσης φάσης, οι παράμετροι μεγέθους 5–10,000 pixel ενίσχυσαν την ανίχνευση θραυσμάτων νευρίτη, αλλά συσχετίστηκαν επίσης με εσφαλμένη αναγνώριση θορύβου φόντου, τεχνουργήματα εικόνας ή άλλα μικρά μη νευριτικό υλικό ως θραύσματα νευρίτη. Σε σύγκριση με τις ευρέως χρησιμοποιούμενες παραμέτρους των 20–10,000 εικονοστοιχείων, ωστόσο, οι παράμετροι των 10–10,000 εικονοστοιχείων ενίσχυσαν την ανίχνευση θραυσμάτων νευρίτη χωρίς αξιοσημείωτη μεγάλη αύξηση στα ψευδώς θετικά (Εικ. 4Α , αριστερά).

Παρόμοιες αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν επίσης με δυαδικές εικόνες που ελήφθησαν από μικρογραφίες φθορισμού κυττάρων LUHMES ανοσοεπισημασμένων για b III-τουμπουλίνη. Οι παράμετροι μεγέθους του αναλυτή σωματιδίων 5–10,000 εικονοστοιχείων διευκόλυναν την πιο ευαίσθητη ανίχνευση θραυσμάτων νευρίτη και, δεδομένου ότι οι μικρογραφίες φθορισμού παρουσίαζαν λιγότερα μικρά συντρίμμια, τέτοιες παράμετροι δεν αύξησαν αισθητά την εσφαλμένη αναγνώριση του μη νευριτικού υλικού ως θραυσμάτων νευρίτη (Εικ. 4Α, δεξιά).

Η παραδοσιακή μέθοδος για την εκτέλεση μετρήσεων DI, χρησιμοποιώντας παραμέτρους μεγέθους αναλυτή σωματιδίων 20–10,000 pixel, εξαιρεί αντικείμενα μικρότερα από 20 pixel από μετρήσεις θραυσμάτων νευρίτη.

Ωστόσο, τέτοια μικρά αντικείμενα συνήθως συμπεριλαμβάνονται εσφαλμένα στις μετρήσεις της συνολικής περιοχής νευρίτη, καθώς η παραδοσιακή μέθοδος μέτρησης DI περιλαμβάνει τον υπολογισμό της συνολικής περιοχής νευρίτη αθροίζοντας όλα τα μαύρα εικονοστοιχεία στις δυαδικές εικόνες. Για να ξεπεράσουμε αυτό το ζήτημα, χρησιμοποιήσαμε το πρόσθετο Particle Remover για το ImageJ, γραμμένο από τον προγραμματιστή του ImageJ Wayne Rasband, για να αφαιρέσουμε μικρά, μη νευριτικά αντικείμενα από δυαδικές εικόνες. Η εφαρμογή αυτής της προσθήκης κατά την εκτέλεση μετρήσεων DI χρησιμοποιώντας μικρογραφίες αντίθεσης φάσης κυττάρων LUHMES που εκτέθηκαν σε 6-OHDA, που δημιουργήθηκε όπως περιγράφεται στο σχήμα 2, οδήγησε σε σημαντική αύξηση στις μετρήσεις DI σε όλες τις συγκεντρώσεις έκθεσης σε νευροτοξίνες (F(1 ,8)=83.43, p=0.0001, R2=0.0416).
Επιπλέον, μια σημαντική αλληλεπίδραση έδειξε ότι η αύξηση του DI που προκλήθηκε από τη χρήση του αφαίρεσης σωματιδίων έγινε ισχυρότερη σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (F(1.881,15.05)=59.97, p=0.0001, R{ {8}}.0094· Εικ. 4Β, Γ). Απεικονίσαμε επίσης τις ίδιες διαφάνειες κυττάρων με μικροσκοπία φθορισμού και αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα της αφαίρεσης μικρών σωματιδίων στις μετρήσεις DI που ελήφθησαν από μικρογραφίες φθορισμού. Ενώ η αφαίρεση μικρών σωματιδίων παρέχει τιμές DI που είναι θεωρητικά πιο ακριβείς, αυτές οι τιμές κατά μέσο όρο δεν διέφεραν σημαντικά από αυτές που ελήφθησαν χωρίς τη χρήση του πρόσθετου αφαίρεσης σωματιδίων όταν μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μικρογραφίες φθορισμού (F(1,8)=2. 613, p=0.1446, R2=0.0013· Εικ. 4D).

Αυτοματοποίηση μετρήσεων DI από μικρογραφίες φθορισμού

Η εκτέλεση μετρήσεων DI χρησιμοποιώντας την παραδοσιακή μέθοδο απαιτεί κουραστική και χρονοβόρα επεξεργασία εικόνας, χρήση του εργαλείου ελεύθερου για την ψηφιακή αφαίρεση μεμονωμένων κυτταρικών σωμάτων και μέτρηση κατακερματισμένου νευρίτη και συνολικών περιοχών νευρίτη από κάθε εικόνα. Έτσι, επιδιώξαμε να βελτιώσουμε την αποτελεσματικότητα της μεθόδου γράφοντας μια μακροεντολή που αυτοματοποιεί πλήρως τις αναλύσεις DI. Για την αυτοματοποίηση της αφαίρεσης σώματος, η μακροεντολή, με τίτλο ANDI, εκτελεί τη δυαδοποίηση εικόνων κυτταρικών πυρήνων, που επισημαίνονται μέσω της πυρηνικής χρώσης DAPI, ακολουθούμενη από τροποποίηση της δυαδοποιημένης εικόνας έτσι ώστε οι κατώφλι πυρηνικές περιοχές να μεγεθύνονται για να καλύπτουν ολόκληρη την περιοχή του σώματος. Τέτοιες εικόνες με δυαδοποιημένους και μεγεθυνμένους πυρήνες στη συνέχεια αφαιρούνται από τις αντίστοιχες μικρογραφίες φθορισμού νευρώνων που έχουν ανοσοσημανθεί για b III-τουμπουλίνη, δημιουργώντας μια εικόνα αποκλειστικά με νευρίτες (Εικ. 5Α, Β).

Για προσαρμογή για μεταβλητά πυρηνικά μεγέθη που προκαλούνται από πυρηνική συρρίκνωση ή κατακερματισμό που σχετίζεται με νευροεκφυλισμό, οι δυαδικές εικόνες των πυρήνων μεγεθύνονται μέσω ενός συνδυασμού διαστολών και διαβρώσεων που συνδυάζουν πυρηνικά θραύσματα και επεκτείνουν τις δυαδικές περιοχές για να καταλάβουν μια περιοχή μεγαλύτερη από τις σώμες των διαφοροποιημένων κυττάρων LUHMES . Οι εικόνες που περιέχουν αποκλειστικά νευρίτες στη συνέχεια δυαδοποιούνται και υποβάλλονται σε ανάλυση DI μέσω μιας σειράς αυτοματοποιημένων λειτουργιών (Εικ. 5C, D). Για να αξιολογήσουμε την ακρίβεια των μακροεργασιών που σχετίζονται με την αφαίρεση σώματος από εικόνες, συγκρίναμε τις βαθμολογίες DI που λήφθηκαν μετά τη χειροκίνητη αφαίρεση κυτταρικών σωμάτων από μικρογραφίες φθορισμού χρησιμοποιώντας το ελεύθερο εργαλείο του ImageJ (όπως απεικονίστηκε προηγουμένως στο Σχ. 4D), με τις βαθμολογίες DI που δημιουργείται από αναλύσεις πανομοιότυπων εικόνων μετά από αυτοματοποιημένη αφαίρεση κυτταρικού σώματος χρησιμοποιώντας τις λειτουργίες αφαίρεσης σώματος που εμφανίζονται στο ANDI Macro. Οι αναλύσεις μας αποκάλυψαν ότι οι βαθμολογίες DI που υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας αυτοματοποιημένη αφαίρεση σώματος κυττάρων συσχετίστηκαν σχεδόν πανομοιότυπα με τις μετρήσεις DI που ελήφθησαν από εικόνες που υποβλήθηκαν σε χειροκίνητη αφαίρεση σώματος (r(34)=0.980, p, 0.0001· Εικ. 5Ε).

Για να αυξήσουμε την ακρίβεια των αναλύσεων, ενσωματώσαμε αρκετές από τις ρυθμίσεις που περιγράφηκαν προηγουμένως που ενισχύουν τις μετρήσεις DI στο ANDI. Η μακροεντολή διαθέτει λειτουργίες βελτίωσης αντίθεσης, χρήση του πρόσθετου Particle Remover για την αφαίρεση μη νευριτικής ύλης από εικόνες νευρίτη και μη πυρηνικής ύλης από εικόνες πυρήνων και ανίχνευση θραυσμάτων νευρίτη χρησιμοποιώντας παραμέτρους μεγέθους 5-10,000 για την προσθήκη Analyze Particles.

Υποθέσαμε ότι, συλλογικά, η χρήση μικροσκοπίου φθορισμού, λειτουργιών ενίσχυσης αντίθεσης, αφαίρεσης μικρών αντικειμένων με το εργαλείο αφαίρεσης σωματιδίων και βελτιστοποιημένων παραμέτρων για την ανίχνευση σωματιδίων θα συνέβαλαν σε πιο ακριβείς μετρήσεις του εκφυλισμού νευρίτη. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, οι εικόνες αντίθεσης φάσης κυττάρων LUHMES που εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις 6-OHDA, που δημιουργήθηκαν όπως περιγράφεται στο Σχήμα 2, αναλύθηκαν με τυφλή και υποκειμενική βαθμολόγηση χρησιμοποιώντας ένα εύρος τιμών μεταξύ 0. 0 και 1.0, με τιμές που αντιπροσωπεύουν το εμφανές ποσοστό της κατακερματισμένης περιοχής νευρίτη. Στη συνέχεια αξιολογήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ των υποκειμενικών βαθμολογιών και των μετρήσεων DI που ελήφθησαν μέσω της παραδοσιακής μεθόδου, καθώς και τη συσχέτιση μεταξύ των υποκειμενικών βαθμολογιών και των μετρήσεων DI που ελήφθησαν χρησιμοποιώντας τη μακροεντολή ANDI.

Ενώ οι μετρήσεις DI που ελήφθησαν χρησιμοποιώντας την παραδοσιακή μέθοδο συσχετίστηκαν με υποκειμενικές βαθμολογίες (r {{0}}.7850, p,0.0001; Εικ. 5F), η μακροεντολή ANDI απέδωσε μετρήσεις που συσχετίστηκαν πολύ πιο έντονα με υποκειμενικές αξιολογήσεις (r 2=0.978, p, 0.0001; Εικ. 5G). Οι άμεσες στατιστικές συγκρίσεις αποκάλυψαν ότι οι βαθμολογίες που λήφθηκαν μέσω της μακροεντολής ANDI συσχετίστηκαν σημαντικά ισχυρότερα με τις υποκειμενικές αξιολογήσεις από τις βαθμολογίες που ελήφθησαν μέσω της παραδοσιακής μεθόδου (z=6.626, p, 0,0001; Εικ. 5F, G). Περαιτέρω αναλύσεις αποκάλυψαν ότι η μακροεντολή διευκολύνει την απόδοση των μετρήσεων DI με ισχυρή και σημαντική βελτίωση στην απόδοση χρόνου. Οι αναλύσεις DI που πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μακροεντολή ANDI απαιτούσαν μέσο χρόνο 12,75 s ανά εικόνα που αναλύθηκε, σε σύγκριση με μέσο χρόνο 5,27 λεπτών ανά εικόνα που αναλύθηκε μέσω της παραδοσιακής μεθόδου [Friedman x2 (1)=9, p {{22} }.0027]. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το ANDI αποδίδει ταχεία παραγωγή μετρήσεων DI που, σε σύγκριση με τις βαθμολογίες που λαμβάνονται μέσω της παραδοσιακής μεθόδου, προσεγγίζουν περισσότερο τον εκφυλισμό που αντιλαμβάνονται οι ερευνητές από την ποιοτική ανάλυση των εικόνων νευρίτη.

Αφού προσδιορίσαμε την ακρίβεια και την αποτελεσματικότητα της μακροεντολής ANDI για τη μέτρηση του εκφυλισμού νευρίτη σε διαφοροποιημένα κύτταρα LUHMES που εκτέθηκαν σε 6-OHDA, αξιολογήσαμε την καταλληλότητα της μακροεντολής για πειράματα που περιλαμβάνουν άλλα μοντέλα κυτταροκαλλιέργειας. Διεξήχθη για πρώτη φορά μια πιλοτική μελέτη για την αξιολόγηση της ακρίβειας του ANDI κατά την εκτέλεση μετρήσεων DI χρησιμοποιώντας μικρογραφίες πρωτογενών συμπαθητικών καλλιεργειών ανοσοεπισημασμένων για b III-τουμπουλίνη και DAPI. Είναι ενδιαφέρον, ωστόσο, ότι τα κυτταρικά σώματα των συμπαθητικών νευρώνων είναι μεγαλύτερα από αυτά των διαφοροποιημένων κυττάρων LUHMES, και έτσι οι λειτουργίες στο ANDI που σχετίζονται με την αυτοματοποιημένη αφαίρεση σώματος δεν αφαίρεσαν το σύνολο του σώματος (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται).

Για να ξεπεραστεί αυτό το ζήτημα, αναθεωρήσαμε το ANDI για να παρουσιάσουμε ένα πλαίσιο διαλόγου που επιτρέπει στους χρήστες να επιλέγουν το μέγεθος της αφαίρεσης σώματος ελέγχοντας τον αριθμό των φορών που διαστέλλονται οι δυαδικές μικρογραφίες των πυρήνων. Αυτή η έκδοση του ANDI, έκδοση 1.1, χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για την εκτέλεση μετρήσεων DI από μικρογραφίες που απεικονίζουν υγιείς συμπαθητικούς νευρώνες που έχουν υποστεί αγωγή με όχημα ή εκφυλισμένους συμπαθητικούς νευρώνες που εκτίθενται σε υπεροξείδιο του υδρογόνου. Οι εικόνες νευρώνων που εκτέθηκαν σε υπεροξείδιο του υδρογόνου απέδωσαν σημαντικά υψηλότερες βαθμολογίες DI σε σύγκριση με τις εικόνες νευρώνων που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα (F(1,3)=71.2, p=0.0035, R2=0 .9301· Εικ. 6Α, C). Επιπλέον, συγκρίναμε αυτές τις βαθμολογίες DI που ελήφθησαν χρησιμοποιώντας μετρήσεις ANDI με μετρήσεις DI που λήφθηκαν από το ίδιο σύνολο εικόνων μετά από χειροκίνητη αφαίρεση κυτταρικών σωμάτων από μικρογραφίες φθορισμού χρησιμοποιώντας το ελεύθερο εργαλείο του ImageJ. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στις βαθμολογίες DI που υπολογίστηκαν μετά από χειροκίνητη αφαίρεση σώματος σε σύγκριση με τις βαθμολογίες που ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ANDI (F(1,3)=0.1082, p=0.7639, R2=0. 0000· Εικ. 6A–C). Οι δοκιμές post hoc επιβεβαίωσαν επίσης ότι οι βαθμολογίες DI που λήφθηκαν με τη χρήση ANDI δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές τόσο στην περίπτωση νευρώνων που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία (ρ=0.0972) όσο και στην περίπτωση νευρώνων που εκτέθηκαν σε υπεροξείδιο του υδρογόνου (ρ=0). 9986).

Επιπλέον, οι βαθμολογίες DI που παράγονται από το ANDI συσχετίστηκαν σχεδόν πανομοιότυπα με τις βαθμολογίες DI που λήφθηκαν μετά τη μη αυτόματη αφαίρεση κυτταρικών σωμάτων από αντίστοιχες μικρογραφίες (r(34)=0.991, p, 0.0001). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι το ANDI είναι κατάλληλο για τη μέτρηση του εκφυλισμού νευρίτη σε καλλιέργειες πρωτογενών νευρώνων, με λειτουργίες αφαίρεσης σωμάτων που ο χρήστης μπορεί να προσαρμόσει ώστε να ταιριάζει με διαφορετικούς τύπους νευρώνων. Επιπλέον, η ανίχνευση θραυσμάτων νευρίτη σε καλλιέργειες που εκτέθηκαν σε υπεροξείδιο του υδρογόνου καταδεικνύει τη δυνατότητα εφαρμογής της μακροεντολής για χρήση σε πειράματα που περιλαμβάνουν εκφυλισμό νευρίτη που προκαλείται από πηγές άλλες από το 6-OHDA. Για να επαληθεύσουμε περαιτέρω τη χρήση του ANDI στην ανίχνευση εκφυλισμού νευρίτη που σχετίζεται με διάφορες αιτίες, χρησιμοποιήσαμε επίσης τη μακροεντολή για τη μέτρηση του εκφυλισμού νευρίτη σε μικρογραφίες υγιών συμπαθητικών καλλιεργειών ή καλλιεργειών που υποβλήθηκαν σε απόσυρση NGF. Όπως αναμενόταν, οι εικόνες των καλλιεργειών που υποβλήθηκαν σε απόσυρση NGF απέδωσαν σημαντικά υψηλότερες τιμές DI σε σύγκριση με τις εικόνες υγιών καλλιεργειών (F(1,2)= 287, p= 0.0035, R2=0. 958· Εικ. 6D, Ε). Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι το ANDI μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του εκφυλισμού νευρίτη που σχετίζεται με μια ποικιλία βιολογικών πλαισίων.

Δεδομένου ότι η χρώση για ΤΗ χρησιμοποιείται συνήθως για την οπτικοποίηση κατεχολαμινεργικών νευρώνων, αξιολογήσαμε επίσης την καταλληλότητα των μικρογραφιών που απεικονίζουν τη χρώση ΤΗ για τη μέτρηση του εκφυλισμού νευρίτη χρησιμοποιώντας ANDI. Καλλιέργειες υγιών συμπαθητικών νευρώνων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάλυμα φορέα ή εκφυλιστικούς συμπαθητικούς νευρώνες που εκτέθηκαν σε υπεροξείδιο του υδρογόνου σταθεροποιήθηκαν και υποβλήθηκαν σε επισήμανση ανοσοφθορισμού για ΤΗ και b III-τουμπουλίνη, καθώς και αντιχρώση για DAPI. Εικόνες νευρίτη που απεικονίζουν χρώση για TH ή b III-τουμπουλίνη, και αντίστοιχες εικόνες πυρήνων με σήμανση DAPI, καταγράφηκαν στη συνέχεια σε παρόμοια οπτικά πεδία. Εκτελέστηκε ANDI και οι εικόνες που εμφάνιζαν χρώση TH ή χρώση β III-τουμπουλίνης επιλέχθηκαν ως εικόνες νευρίτη. Οι αναλύσεις μας αποκάλυψαν ότι οι βαθμολογίες DI που λήφθηκαν χρησιμοποιώντας εικόνες χρώσης TH συσχετίστηκαν πολύ ισχυρά με τις βαθμολογίες που προέκυψαν από εικόνες χρώσης b III-τουμπουλίνης (r(28)= 0.962, p, 0.0001· Εικ. 6F, G). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ακριβείς μετρήσεις DI μπορούν να ληφθούν με ANDI χρησιμοποιώντας εναλλακτικές διαδικασίες χρώσης που επισημαίνουν το σύνολο των νευριτών, όπως η ανοσοσήμανση για TH.

Για να δείξουμε τη χρησιμότητα της βελτιωμένης μεθόδου για την εκτέλεση μετρήσεων DI σε ένα επιστημονικό πείραμα, χρησιμοποιήσαμε τη νέα μέθοδο για να αξιολογήσουμε τον ρόλο του JNK στον εκφυλισμό νευρίτη που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες σε ανθρώπινα μεσεεγκεφαλικά κύτταρα. Τα διαφοροποιημένα κύτταρα LUHMES υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία για 1 ώρα με τον αναστολέα JNK SP600125 ή διάλυμα φορέα. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 24 ώρες με 6- OHDA για να προκληθεί οξειδωτικό στρες ή με διάλυμα φορέα. Τα σταθεροποιημένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανοσοσήμανση για χρώση b III-τουμπουλίνης και DAPI και χρησιμοποιήθηκε ANDI για να ληφθούν μετρήσεις DI από μικρογραφίες φθορισμού. Ενώ οι καλλιέργειες που δεν είχαν προκαταρκτική θεραπεία με τον αναστολέα JNK εμφάνισαν εκφύλιση νευρίτη μετά από έκθεση σε 6-OHDA, η αναστολή JNK είχε ως αποτέλεσμα αξιοσημείωτη και σημαντική μείωση του εκφυλισμού νευρίτη που προκαλείται από 6- OHDA (p{9}}.0001 , d= 2.0209· Εικ. 7). Αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν έναν βασικό ρόλο για τη σηματοδότηση JNK στον εκφυλισμό νευρίτη που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες στα ανθρώπινα μεσεεγκεφαλικά κύτταρα και, κυρίως, καταδεικνύουν τη χρησιμότητα της νέας μας μεθόδου για τη δημιουργία επιστημονικών ανακαλύψεων διευκολύνοντας την ταχεία και ακριβή μέτρηση του εκφυλισμού νευρίτη.

Συζήτηση

Ο εκφυλισμός των νευριτών σχετίζεται με μια ποικιλία νευροπαθολογικών καταστάσεων, ωστόσο οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν την αποδόμηση των νευριτών παραμένουν ατελώς κατανοητοί. Οι μέθοδοι που διευκολύνουν την ακριβή και αποτελεσματική ανάλυση του εκφυλισμού νευρίτη είναι απαραίτητες για την επιτυχή αναγνώριση νέων παραγόντων που ρυθμίζουν αυτό το σημαντικό κυτταρικό συμβάν. Στην παρούσα μελέτη, αποκαλύπτουμε πολλαπλές πηγές σφάλματος που σχετίζονται με μια συνήθως χρησιμοποιούμενη μέθοδο για τον ποσοτικό προσδιορισμό του εκφυλισμού νευρίτη. Αναφέρουμε πειραματικά δεδομένα που υποστηρίζουν διαδικαστικές τροποποιήσεις που μπορούν να εφαρμοστούν για τη μείωση του σφάλματος ανάλυσης DI και τέτοιες τροποποιήσεις ενσωματώνονται σε μια νέα μακροεντολή ImageJ για να παρέχουν ένα εργαλείο για γρήγορες, ακριβείς και αντικειμενικές αναλύσεις DI χρησιμοποιώντας ανοιχτού κώδικα και ελεύθερο λογισμικό. Επιπλέον, δείχνουμε πώς μπορεί να εφαρμοστεί η βελτιωμένη μέθοδος για τη μέτρηση του εκφυλισμού νευρίτη σε ένα μοντέλο κυτταροκαλλιέργειας PD, μια διαταραχή στην οποία ο αξονικός κατακερματισμός στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες είναι ένα γεγονός πρώιμου σταδίου που προηγείται της ενδεχόμενης νευρωνικής απώλειας (Tagliaferro and Burke, 2016). .

Στην παρούσα μελέτη, καταδεικνύουμε τη χρησιμότητα της μακροεντολής ANDI στη μέτρηση του εκφυλισμού νευριτών σε ένα μοντέλο κυτταροκαλλιέργειας PD που αποτελείται από διαφοροποιημένα κύτταρα LUHMES που εκτίθενται σε 6-OHDA.

Αναφέρουμε πειραματικά ευρήματα που υποστηρίζουν τα βέλτιστα υποστρώματα στα οποία θα πρέπει να δημιουργηθούν οι καλλιέργειες, καθώς και καταδεικνύουμε την πυκνότητα επιμετάλλωσης που είναι πιο κατάλληλη για αναλύσεις εκφυλισμού νευριτών. Η χρήση αυτού του μοντέλου συστήματος για τη μελέτη του εκφυλισμού των νευριτών έχει πολλά πλεονεκτήματα. Τα κύτταρα αναπτύσσουν νευρίτες που είναι καλά δικτυωμένοι και τυπικά μήκους 0,500 mm και οι καλλιέργειες είναι ευαίσθητες σε νευροεκφυλισμό που προκαλείται από κλασικά μοντέλα νευροτοξίνης της PD όπως 6-OHDA, 1-μεθυλ{{4 }}ιόν φαινυλοπυριδινίου (MPP1) και ροτενόνη (Lotharius et al., 2005· Zhang et al., 2014· Smirnova et al., 2016· Kraemer et al., 2021). Επιπλέον, η ανθρώπινη προέλευση των κυττάρων LUHMES αυξάνει τη μεταφρασιμότητα των ευρημάτων που σχετίζονται με το μοντέλο και η υπό όρους αθανατοποίηση διευκολύνει την ταχεία δημιουργία και διάδοση των καλλιεργειών (Scholz et al., 2011). Έτσι, σε συνδυασμό με αυτοματοποιημένες αναλύσεις που εκτελούνται χρησιμοποιώντας ANDI, τα κύτταρα LUHMES μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να γίνουν νέες ανακαλύψεις που σχετίζονται με τον εκφυλισμό νευρίτη που σχετίζεται με PD, ενώ διευκολύνουν σημαντικά υψηλότερη απόδοση σε σύγκριση με μη αυτοματοποιημένες αναλύσεις που πραγματοποιούνται με πρωτογενείς καλλιέργειες νευρώνων.

Πολλές ερευνητικές ομάδες έχουν πραγματοποιήσει αναλύσεις DI χρησιμοποιώντας εικόνες αντίθεσης φάσης για να αποκτήσουν γνώση των παραγόντων που ρυθμίζουν τον εκφυλισμό των νευριτών (Press and Milbrandt, 20{{1{0}}9; Kraemer et al., 2014 Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Geisler et al., 2019). Εδώ, αναφέρουμε ένα σημαντικό μειονέκτημα που σχετίζεται με αυτήν την ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδο για τη μέτρηση του εκφυλισμού νευρίτη: η δυαδοποίηση των εικόνων αντίθεσης φάσης προκαλεί ένα σημαντικό ποσοστό ανέπαφων νευριτών να εμφανίζονται κατακερματισμένοι. Ενώ το επίπεδο αντίθεσης που μπορεί να επιτευχθεί κατά τη λήψη μικρογραφιών ποικίλλει ανάλογα με το σύστημα μικροσκοπίου που είναι διαθέσιμο στους ερευνητές, αυτό το ζήτημα είναι διάχυτο μεταξύ των διαφόρων ερευνητικών ομάδων, καθώς ένα DI 0,2 είναι κοινώς αποδεκτό ως όριο πάνω από το οποίο οι καλλιέργειες θεωρούνται ότι έχουν εκφυλιστεί οι άξονες και οι περισσότερες επιστημονικές αναφορές που παρουσιάζουν μετρήσεις DI από μικρογραφίες αντίθεσης φάσης έχουν αναφέρει σκορ DI για υγιείς νευρώνες μεταξύ 0,1 και 0,3 (Sasaki et al., 2009, 2016; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Loreto et al., 2020). Οι αναλύσεις μας DI που ελήφθησαν από μικρογραφίες φθορισμού, καθώς και υποκειμενικές βαθμολογίες από τυφλούς ερευνητές, υποδεικνύουν ότι 10-20% κατακερματισμός νευρίτη δεν είναι κοινός σε καλλιέργειες υγιών νευρώνων. Μάλλον, τέτοιες καλλιέργειες εμφανίζουν μόνο 2,5% κατακερματισμό νευρίτη κατά μέσο όρο. Έτσι, τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν την ανάγκη για μεθόδους που βελτιώνουν την ακρίβεια των αναλύσεων εκφυλισμού νευριτών μειώνοντας αυτήν την κοινή και σημαντική πηγή σφάλματος μέτρησης.

Ενώ η πλειονότητα των μελετών που περιελάμβαναν μετρήσεις DI έχουν χρησιμοποιήσει εικόνες αντίθεσης φάσης για να πραγματοποιήσουν τις αναλύσεις εκφυλισμού νευρίτη, αρκετές ερευνητικές ομάδες πραγματοποίησαν πρόσφατα μετρήσεις DI χρησιμοποιώντας εικόνες νευρώνων ανοσοεπισημασμένων για κυτταροσκελετικά νημάτια όπως πολυπεπτίδιο μέσου νευρικού νήματος ή β-β-τουμπουλίνη (Wakatsuki et al., 2011· Li et al., 2017· Pease-Raissi et al., 2017· Hernandez et al., 2018· Sundaramoorthy et al., 2020). Ωστόσο, ποια μορφή μικροσκοπίας είναι η καταλληλότερη για μετρήσεις εκφυλισμού νευρίτη παρέμεινε ασαφές, καθώς χρειάστηκαν έρευνες για να κατανοηθεί εάν οι αλλαγές στον εντοπισμό αυτών των κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια του εκφυλισμού νευρίτη μοντελοποιούν κατάλληλα τις συνολικές αλλαγές στη μορφολογία των νευριτών, καθώς και για την αξιολόγηση του βαθμός στον οποίο οι μετρήσεις DI που λαμβάνονται με μικρογραφίες φθορισμού συσχετίζονται με παρόμοιες μετρήσεις που λαμβάνονται από μικρογραφίες αντίθεσης φάσης. Εδώ, αποδεικνύουμε ότι οι μικρογραφίες φθορισμού που απεικονίζουν τη χρώση b III-τουμπουλίνης όχι μόνο αντιπροσωπεύουν με ακρίβεια τον κατακερματισμό του νευρίτη, αλλά διευκολύνουν επίσης πιο ακριβείς μετρήσεις DI λόγω της ανώτερης αντίθεσης τους και της μειωμένης ευαισθησίας στον τεχνητό κατακερματισμό κατά τη δυαδοποίηση. Έτσι, τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν τη χρησιμότητα της χρήσης χρώσης b III-τουμπουλίνης για τη μέτρηση του εκφυλισμού νευρίτη.

Μεταξύ των δημοσιευμένων μελετών που περιλαμβάνουν αναλύσεις DI για τη μέτρηση του εκφυλισμού νευρίτη, το αναφερόμενο μέγεθος και οι παράμετροι κυκλικότητας που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση θραυσμάτων νευρίτη ποικίλλουν σημαντικά. Για παράδειγμα, μια πρόσφατη μελέτη που περιελάμβανε την αξιολόγηση του εκφυλισμού νευρίτη σε καλλιεργημένους νευρώνες ιππόκαμπου χρησιμοποίησε παραμέτρους μεγέθους 4–9{3}}0 εικονοστοιχείων (Li et al., 2017), ενώ μια μελέτη που αφορούσε καλλιεργημένους νευρώνες DRG χρησιμοποίησε παραμέτρους ανίχνευσης 0–10,000 εικονοστοιχεία (Wakatsuki et al., 2011). Ένας πιθανός λόγος για μια τέτοια παραλλαγή είναι ότι η αποτελεσματικότητα των παραμέτρων μεγέθους ανάλυσης σωματιδίων στην ανίχνευση θραυσμάτων νευρίτη ποικίλλει ανάλογα με την ανάλυση της εικόνας αφού οι παράμετροι μεγέθους για την ανίχνευση σωματιδίων σχετίζονται με μονάδες εικονοστοιχείων. Δυστυχώς, οι περισσότερες δημοσιευμένες μελέτες που περιλαμβάνουν αναλύσεις DI δεν περιλαμβάνουν περιγραφή της ανάλυσης εικόνας που χρησιμοποιείται για τις αναλύσεις. Έτσι, χρειάστηκε η καθιέρωση τυπικών παραμέτρων ανάλυσης μέσω ενός πρωτοκόλλου που αποκαλύπτει πλήρως σημαντικές λεπτομέρειες όπως η συνιστώμενη ανάλυση εικόνας. Εδώ, αναφέρουμε ότι οι πιο συχνά αναφερόμενες παράμετροι για την ανίχνευση θραυσμάτων νευρίτη, 20– 10, 000 pixel (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al., al., 2020· Shin and Cho, 2020), έχουν ως αποτέλεσμα μεγάλες αναλογίες θραυσμάτων νευρώνων να μην ανιχνεύονται. Η μείωση του ελάχιστου κριτηρίου μεγέθους για την ανίχνευση θραυσμάτων νευρίτη ενισχύει την ευαισθησία της ανίχνευσης θραυσμάτων, ενώ ταυτόχρονα αυξάνει τον αριθμό των τεχνουργημάτων εικόνας και των υπολειμμάτων μη νευρίτη που ανιχνεύονται ψευδώς ως θραύσματα νευρίτη. Στην αναζήτηση παραμέτρων που θα εξισορροπούσαν καλύτερα την ευαισθησία ανίχνευσης και τα ποσοστά ψευδούς θετικότητας, εντοπίσαμε παραμέτρους ανάλυσης 10–10,000 που παρέχουν την πιο ακριβή ανίχνευση θραυσμάτων νευρίτη σε δυαδικές εικόνες που λαμβάνονται από μικρογραφίες αντίθεσης φάσης, ενώ παράμετροι 5–10,000 διευκολύνουν την ακριβέστερη ανίχνευση θραυσμάτων νευρίτη σε δυαδικές εικόνες που λαμβάνονται από μικρογραφίες φθορισμού. Ενώ αυτοί οι προσδιορισμοί έγιναν χρησιμοποιώντας ανάλυση εικόνας 1280 1024, αυτές οι παράμετροι θα πρέπει επίσης να επιτρέπουν την ακριβή ανίχνευση θραυσμάτων νευρίτη σε εικόνες που έχουν ληφθεί σε άλλες αναλύσεις που διαθέτουν κατακόρυφο μέγεθος 1024 pixel, όπως η κοινή ανάλυση πλήρους οθόνης {{ 27}}, καθώς οι νευρώνες που απεικονίζονται σε τέτοιες εικόνες θα έχουν παρόμοιο μέγεθος pixel.

Πολλές ερευνητικές ομάδες έχουν χρησιμοποιήσει ένα κριτήριο ελάχιστου μεγέθους κατά τη διαμόρφωση των παραμέτρων ανάλυσης σωματιδίων για να αποφευχθεί η συμπερίληψη μικρών, μη νευριτικών υπολειμμάτων στις μετρήσεις θραυσμάτων νευρίτη (Shin et al., 2012; Cosker et al., 2013; Di Stefano et al., 2015· Sasaki et al., 2016· Li et al., 2017· Loreto et al., 2020· Shin and Cho, 2020· Sundaramoorthy et al., 2020). Ωστόσο, τέτοιες μελέτες έχουν λανθασμένα συμπεριλάβει μικρή, μη θραυσματική ύλη στις μετρήσεις της συνολικής περιοχής νευρίτη, καθώς αυτές οι μετρήσεις λαμβάνονται αθροίζοντας την περιοχή όλων των μαύρων εικονοστοιχείων στην εικόνα. Εδώ, δείχνουμε τη χρησιμότητα της προσθήκης Particle Remover για την αφαίρεση μικρών υπολειμμάτων χωρίς θραύσματα από την εικόνα πριν από την ανάλυση DI. Η χρήση του πρόσθετου αύξησε σημαντικά την ευαισθησία των μετρήσεων εκφυλισμού νευριτών που ελήφθησαν από εικόνες αντίθεσης φάσης. Έτσι, τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν την αξία της προσθήκης Particle Remover για τους ερευνητές που εκτελούν αναλύσεις DI χρησιμοποιώντας μικρογραφίες αντίθεσης φάσης. Είναι ενδιαφέρον ότι οι μικρογραφίες φθορισμού εμφάνιζαν λιγότερο μικρά, μη νευριτικά συντρίμμια, και έτσι, ένα μικρότερο κριτήριο μεγέθους πέντε εικονοστοιχείων θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση θραυσμάτων. Ενώ η αφαίρεση σωματιδίων υπολειμμάτων μη νευριτών σε μέγεθος μικρότερο από πέντε εικονοστοιχεία δεν επηρέασε σημαντικά τις μετρήσεις DI που λαμβάνονται από μικρογραφίες φθορισμού, τέτοιες λειτουργίες παρέχουν τιμές που είναι θεωρητικά πιο ακριβείς και επομένως συμπεριλήφθηκαν στο ANDI.

Δεδομένου ότι οι αναλύσεις DI πρέπει να εκτελούνται χρησιμοποιώντας εικόνες αποκλειστικά με νευρίτες, η εφαρμογή της μεθόδου ανάλυσης έχει περιοριστεί κυρίως στη χρήση με συστήματα καλλιέργειας που επιδέχονται αφαίρεση κυτταρικών σωμάτων, όπως καλλιέργειες μοσχευμάτων στις οποίες τα κυτταρικά σώματα μπορούν να αποκοπούν φυσικά (Catenaccio et al. , 2017; Shin and Cho, 2020) ή καλλιέργειες σε μικρορευστικές συσκευές που διευκολύνουν τον διαχωρισμό των διαμερισμάτων σώματος και νευραξόνων (Cosker et al., 2013; Pease-Raissi et al., 2017; Tan et al., 2018). Εναλλακτικά, η εκτέλεση αναλύσεων DI με διαχωρισμένες καλλιέργειες μπορεί να επιτευχθεί μέσω κουραστικής και χρονοβόρας εργασίας που σχετίζεται με την ψηφιακή αφαίρεση κυτταρικών σωμάτων από μικρογραφίες (Kraemer et al., 2014). Στην παρούσα μελέτη, αποκαλύπτουμε ότι το ANDI επιτρέπει την εκτέλεση μετρήσεων DI από μικρογραφίες που παρουσιάζουν κύτταρα LUHMES που διαχωρίζονται και κατανέμονται μωσαϊκά σε ένα δισδιάστατο σύστημα καλλιέργειας. Τα ευρήματά μας καταδεικνύουν επίσης ότι το ANDI διευκολύνει μια 24-πλάσια μείωση του χρόνου που απαιτείται για την εκτέλεση των αναλύσεων και οι λειτουργίες στο ANDI που σχετίζονται με την αφαίρεση σώματος αποδίδουν αποτελέσματα ανάλυσης DI που συσχετίζονται κατά 98% με παρόμοιες αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν μετά από χειροκίνητη αφαίρεση σώματος χρησιμοποιώντας το ελεύθερο εργαλείο του ImageJ. Έτσι, η μακροεντολή αυξάνει σημαντικά την αποτελεσματικότητα των αναλύσεων εκτελώντας αυτοματοποιημένη αφαίρεση σώματος μέσω μιας διαδικασίας που δεν θυσιάζει την ακρίβεια, και τέτοιες λειτουργίες επεκτείνουν την καταλληλότητα της μεθόδου για την ανάλυση διαχωρισμένων καλλιεργειών με μωσαϊκά κατανεμημένα κυτταρικά σώματα.

Εκτός από τη διευκόλυνση της αυτοματοποιημένης αφαίρεσης του κυτταρικού σώματος από εικόνες, το ANDI διαθέτει αρκετές αναθεωρήσεις της παραδοσιακής μεθόδου για την εκτέλεση ανάλυσης DI, συμπεριλαμβανομένης της χρήσης μικρογραφιών φθορισμού, αναθεωρημένων παραμέτρων ανάλυσης σωματιδίων και χρήσης του εργαλείου αφαίρεσης σωματιδίων για την αφαίρεση μικρών, μη νευριτικών υπολειμμάτων από εικόνες. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι αυτές οι βελτιστοποιήσεις αποδίδουν συλλογικά τιμές DI που προσεγγίζουν περισσότερο τις τιμές που λαμβάνονται μέσω τυφλής και υποκειμενικής βαθμολόγησης. Έτσι, εκτός από τη σημαντική μείωση του χρόνου που απαιτείται για την εκτέλεση των αναλύσεων, το ANDI διευκολύνει τις μετρήσεις DI που, σε σύγκριση με την παραδοσιακή μέθοδο, αντικατοπτρίζουν με μεγαλύτερη ακρίβεια τον εκφυλισμό νευρίτη που σύμφωνα με πληροφορίες παρατηρούν οι ερευνητές από την ποιοτική ανάλυση εικόνας.

Ένα μειονέκτημα της παραδοσιακής μεθόδου για την εκτέλεση αναλύσεων DI είναι ότι τέτοιες αναλύσεις απαιτούν εκπαίδευση στη χρήση του ImageJ έτσι ώστε ο χρήστης να είναι εξοικειωμένος με ένα κουραστικό σύνολο λειτουργιών ImageJ. Επιπλέον, για την αποτελεσματική εκτέλεση των αναλύσεων, απαιτείται περαιτέρω εκπαίδευση για τον χρήστη ώστε να εκτελεί αναλύσεις κατά παρτίδες ή να γράφει σενάρια για ημι-αυτοματοποίηση της εκτέλεσης συγκεκριμένων βημάτων. Με την πλήρη αυτοματοποίηση της ανάλυσης, το ANDI διευκολύνει τις μετρήσεις DI σε λίγα μόνο βήματα που σχετίζονται με τη λήψη και την εκτέλεση της μακροεντολής. Για να αυξηθεί η φιλικότητα προς τον χρήστη, η μακροεντολή περιλαμβάνει κώδικα για να παρέχει μια διεπαφή για την επιλογή καταλόγων που περιέχουν εικόνες προς ανάλυση, καθώς και για να διευκολύνει την έξοδο εικόνων αποτελεσμάτων και πινάκων δεδομένων σε έναν κατάλογο της επιλογής του χρήστη. Επιπλέον, το σενάριο περιέχει πολυάριθμες δυνατότητες που έχουν σχεδιαστεί για να αποτρέπουν ανακρίβειες μέτρησης ή λάθη χρήστη, συμπεριλαμβανομένης της αυτόματης διαγραφής προηγούμενων αποτελεσμάτων ImageJ. αφαίρεση πληροφοριών κλίμακας εικόνας για να διασφαλιστεί ότι οι μετρήσεις εκτελούνται με ακρίβεια χρησιμοποιώντας μονάδες pixel. κατάλληλη διαμόρφωση των ρυθμίσεων χρώματος ImageJ, των ρυθμίσεων μέτρησης και των παραμέτρων του αναλυτή σωματιδίων. Παρουσίαση μηνύματος σφάλματος εάν οι χρήστες επιλέξουν λανθασμένα καταλόγους που περιέχουν άνισο αριθμό εικόνων που απεικονίζουν χρώση β III-τουμπουλίνης και χρώση DAPI. περιγραφές αρχείων καταγραφής που υποδεικνύουν την πρόοδο της ανάλυσης. και κωδικοποίηση για την αποφυγή σφαλμάτων που σχετίζονται με την αυτοματοποιημένη δημιουργία αρχείων .ini από τα Windows 10. Συνολικά, αυτές οι δυνατότητες κάνουν τις αναλύσεις DI πιο φιλικές προς το χρήστη, γεγονός που μπορεί να ενθαρρύνει το ενδιαφέρον για μελέτες που σχετίζονται με τον εκφυλισμό των νευριτών.

Για να δείξουμε τη χρησιμότητά του σε ένα πείραμα, χρησιμοποιήσαμε το ANDI για να αξιολογήσουμε τη συμβολή του JNK στον εκφυλισμό νευριτών σε κυτταροκαλλιέργειες LUHMES που εκτέθηκαν σε 6-OHDA. Η JNK είναι μια κινάση που ενεργοποιείται από το στρες που έχει αναφερθεί ως κλειδί για τον εκφυλισμό νευρίτη σε περιφερειακούς νευρώνες μη πρωτεύοντος προέλευσης (Shin et al., 2012), αλλά απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να κατανοηθεί ο ρόλος της κινάσης στον εκφυλισμό νευρίτη σε μεσεγκεφαλικά ανθρώπινα κύτταρα . Εδώ, αποδεικνύουμε ότι η αναστολή της JNK προστατεύει σημαντικά τα ανθρώπινα μεσεεγκεφαλικά κύτταρα από τον εκφυλισμό νευρίτη που σχετίζεται με το οξειδωτικό στρες. Τέτοια ευρήματα όχι μόνο αποκαλύπτουν έναν σημαντικό ρόλο για το JNK στον εκφυλισμό νευρίτη που σχετίζεται με ένα μοντέλο ανθρώπινης νόσου, αλλά επίσης αποτελούν παράδειγμα της χρησιμότητας του ANDI για την εκτέλεση αυτοματοποιημένης και αντικειμενικής ανάλυσης εικόνας για νέες επιστημονικές ανακαλύψεις.

Ενώ το ANDI σχεδιάστηκε αρχικά για να διευκολύνει την ταχεία και ακριβή μέτρηση του εκφυλισμού νευρίτη σε καλλιέργειες διαφοροποιημένων κυττάρων LUHMES που εκτέθηκαν σε 6-OHDA, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν επίσης ότι η μακροεντολή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του εκφυλισμού νευρίτη που προκαλείται από άλλες αιτίες, όπως π.χ. έκθεση σε υπεροξείδιο του υδρογόνου ή απόσυρση νευροτροφίνης. Επιπλέον, η έκδοση 1.1 της μακροεντολής διαθέτει ένα πλαίσιο διαλόγου που επιτρέπει στους ερευνητές να προσαρμόσουν τις λειτουργίες αφαίρεσης σώματος για νευρώνες συγκεκριμένων μεγεθών. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν επίσης ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν μέθοδοι χρώσης άλλες από την ανοσοσήμανση για b III-τουμπουλίνη για την ακριβή μέτρηση του εκφυλισμού νευρίτη. Αν και συνιστούμε τη χρήση πιλοτικών μελετών για την επαλήθευση της ακρίβειας των μετρήσεων DI κατά τη χρήση ANDI με κυτταρικούς τύπους ή μεθόδους χρώσης που δεν έχουν δοκιμαστεί στο παρελθόν, αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν ότι η μακροεντολή είναι ένα γενικά ευέλικτο εργαλείο για τη μέτρηση του εκφυλισμού νευριτών σε καλλιεργημένους νευρώνες. Εφόσον το ANDI δεν έχει βελτιστοποιηθεί για τη μέτρηση του εκφυλισμού νευριτών στον ιστό, προς το παρόν προτείνουμε τη χρήση του μόνο για την ανάλυση του εκφυλισμού νευρίτη που σχετίζεται με καλλιεργημένα κύτταρα. Ωστόσο, ο κώδικας για το ANDI είναι διαθέσιμος στο κοινό και επομένως μπορεί επίσης να είναι χρήσιμος για ερευνητές που ενδιαφέρονται να τροποποιήσουν το σενάριο ώστε να ταιριάζει σε μελέτες in vivo ή σε άλλες εφαρμογές.

Συμπερασματικά, αυτό το άρθρο παρουσιάζει δεδομένα που αποκαλύπτουν κοινές πηγές σφάλματος που σχετίζονται με μια ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδο για τον ποσοτικό προσδιορισμό του εκφυλισμού νευρίτη. Χρησιμοποιήθηκαν πειραματικές προσεγγίσεις για τη βελτίωση της μεθόδου και τέτοιες βελτιώσεις ενσωματώθηκαν σε μια δωρεάν και ανοιχτού κώδικα μακροεντολή ImageJ που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτέλεση ταχείας, ακριβούς και αντικειμενικής ανάλυσης μικρογραφιών φθορισμού για εκφυλισμό νευρίτη. Τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν την αποτελεσματικότητα του ANDI για τον ποσοτικό προσδιορισμό του εκφυλισμού νευρίτη σε μικρογραφίες που απεικονίζουν ένα μοντέλο κυτταροκαλλιέργειας PD, καθώς και παρέχουν απόδειξη της αρχής ότι η μακροεντολή μπορεί να ανιχνεύσει τον εκφυλισμό νευρίτη που σχετίζεται με άλλα βιολογικά πλαίσια. Η φιλική προς τον χρήστη μακροεντολή θα μειώσει τον χρόνο που απαιτείται ώστε οι ερευνητές να μάθουν να ποσοτικοποιούν τον κατακερματισμό των νευριτών, αυξάνοντας παράλληλα την απόδοση και την ακρίβεια των μελετών που αξιολογούν τους παράγοντες που κρύβουν τον εκφυλισμό νευρίτη. Η μακροεντολή ANDI είναι διαθέσιμη στην ακόλουθη διεύθυνση URL: https:// github.com/kraemerb/kraemerlab.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Aarsland D, Creese B, Politis M, Chaudhuri KR, Ffytche DH, Weintraub D, Ballard C (2017) Γνωστική έκπτωση στη νόσο του Πάρκινσον. Nat Rev Neurol 13:217–231.

2. Adalbert R, Coleman MP (2013) Ανασκόπηση: παθολογία άξονα σε νευροεκφυλιστικές διαταραχές που σχετίζονται με την ηλικία. Neuropathol Appl Neurobiol 39:90-108.

3. Bové J, Perier C (2012) Μοντέλα της νόσου του Πάρκινσον που βασίζονται σε νευροτοξίνες. Neuroscience 211:51-76.

4. Catenaccio A, Llavero Hurtado M, Diaz P, Lamont DJ, Wishart TM, Court FA (2017) Μοριακή ανάλυση της αξονικής εγγενούς και σχετιζόμενης με τη γλοιακή συν-ρύθμιση της εκφύλισης του άξονα. Cell Death Dis 8: e3166.

5. Cosker KE, Pazyra-Murphy MF, Fenstermacher SJ, Segal RA (2013) Μεταγραφή συντεταγμένων νευροτροφινών προερχόμενων από στόχο.

6. Di Stefano M, Nascimento-Ferreira I, Orsomando G, Mori V, Gilley J, Brown R, Janeckova L, Vargas ME, Worrell LA, Loreto A, Tickle J, Patrick J, Webster JRM, Marangoni M, Carpi FM, Pucciarelli S, Rossi F, Meng W, Sagasti Α, Ribchester RR, et al. (2015) Μια αύξηση του πρόδρομου NAD μονονουκλεοτιδίου νικοτιναμιδίου (NMN) μετά από τραυματισμό προάγει τον εκφυλισμό του άξονα. Cell Death Differ 22:731–742.

7. Fukui K (2016) Τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου προκαλούν εκφυλισμό νευρίτη πριν από την επαγωγή κυτταρικού θανάτου. J Clin Biochem Nutr 59:155–159.

8. Geden MJ, Deshmukh M (2016) Εκφυλισμός άξονα: το πλαίσιο ορίζει διακριτές οδούς. Curr Opin Neurobiol 39:108–115.

9. Geisler S, Doan RA, Cheng GC, Cetinkaya-Fisgin A, Huang SX, Höke A, Milbrandt J, DiAntonio A (2019) Η βινκριστίνη και η βορτεζομίμπη χρησιμοποιούν διακριτούς μηχανισμούς ανάντη για να ενεργοποιήσουν έναν κοινό εκφυλισμό άξονα που εξαρτάται από SARM1- πρόγραμμα. JCI Insight 4:e129920.

10. Hernandez DE, Salvadores NA, Moya-Alvarado G, Catalan RJ, Bronfman FC, Court FA (2018) Ο αξονικός εκφυλισμός που προκαλείται από διεγερτική τοξικότητα γλουταμικού προκαλείται από νεκρόπτωση. J Cell Sci 131:jcs214684.

For more information:1950477648nn@gmail.com