Προστατευτικές επιδράσεις των μικροκυστικών ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων στον τραυματισμό των νεφρικών κυττάρων αρουραίων που προκαλείται από το Ang II

edmund.chen@wecistanche.com

Αφηρημένος.Η χρόνια υπέρταση μπορεί να οδηγήσει σενεφρική βλάβη,γνωστή ως υπερτασική νεφροπάθεια ή υπερτασική νεφροσκλήρωση. Η περαιτέρω κατανόηση των μοριακών μηχανισμών μέσω των οποίων αναπτύσσεται η υπερτασική νεφροπάθεια είναι απαραίτητη για την αποτελεσματική διάγνωση και θεραπεία. Η παρούσα μελέτη διερεύνησε τους μηχανισμούς με τους οποίους τα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (EPCs) επιδιορθώνουν τους πρωτοπαθείς αρουραίουςνεφρόςκύτταρα (PRK). Οι δοκιμασίες ELISA, Cell Counting Kit-8 και κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των επιδράσεων των EPCs ή EPC-MVs στο οξειδωτικό στρες, τη φλεγμονή, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση και τον κύκλο των PRKs που προκαλούνται από το AngII. Ένα μοντέλο τραυματισμού PRK δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας αγγειοτενσίνη II (Ang II). Μετά την επαγωγή του Ang II, ο πολλαπλασιασμός της PRK μειώθηκε, η απόπτωση αυξήθηκε και ο κυτταρικός κύκλος αποκλείστηκε στη φάση G1 πριν εισέλθει στη φάση S. Διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και της μαλωνδιαλδεΰδης αυξήθηκαν, ενώ τα επίπεδα της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης και της δισμουτάσης του υπεροξειδίου μειώθηκαν. Επιπλέον, τα επίπεδα των φλεγμονωδών κυτοκινών IL-1β, IL-6 και TNF-α αυξήθηκαν σημαντικά. Έτσι, το Ang II κατέστρεψε τα PRKs διεγείροντας το οξειδωτικό στρες και προωθώντας τη φλεγμονώδη απόκριση. Ωστόσο, όταν τα PRK συν-καλλιεργήθηκαν με EPCs, η ζημιά που προκλήθηκε από το Ang II μειώθηκε σημαντικά. Η τρέχουσα μελέτη συνέλεξε τις μικροβέστρες (MVs) που εκκρίθηκαν από τα EPCs και τις συν-καλλιεργούσε με PRKs που προκαλούνται από το Ang II και διαπίστωσε ότι τα EPC-MVs διατήρησαν την προστατευτική τους επίδραση στα PRKs. Συμπερασματικά, τα EPCs προστατεύουν τα PRK από ζημιές που προκαλούνται από το Ang II μέσω εκκρινόμενων MVs.

ΤΟ CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΏΣΕΙ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΉ/ΝΕΦΡΙΚΉ ΝΌΣΟ

Εισαγωγή

Η υπέρταση αποτελεί παράγοντα κινδύνου για τη συχνότητα εμφάνισης καρδιαγγειακών και εγκεφαλοαγγειακών παθήσεων και τη σχετική θνησιμότητα (1). ΟΝεφράμπορεί να προκαλέσει υπέρταση και είναι ένα από τα όργανα-στόχους της βλάβης της υπέρτασης (2). Χρόνιοςνεφρική νόσο(ΧΝΝ) υπήρξε μία από τις σημαντικότερες αιτίες αυξημένης θνησιμότητας μεταξύ των ατόμων με υψηλή αρτηριακή πίεση παγκοσμίως τις τελευταίες δύο δεκαετίες (3,4). Έτσι, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να προωθηθεί η θεραπεία της υπερτασικής νεφροπάθειας και να μελετηθεί ο παθολογικός μηχανισμός της. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η αγγειοτενσίνη ΙΙ (Ang II) προκάλεσε αγγειακή βλάβη και έπαιξε βασικό ρόλο στις αγγειακές παθήσεις μέσω διαφόρων μηχανισμών, όπως η πρόκληση απόπτωσης (5), η διακοπή του κυτταρικού κύκλου (6), η αύξηση των επιπέδων των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) (7), η προώθηση της οξειδωτικής απόκρισης στο στρες αυξάνοντας την έκκριση της μαλονοδιαλδεΰδης (MDA) και η μείωση της έκκρισης της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GSH-Px) και της δισμουτάσης υπεροξειδίου (SOD) (8,9). Το Ang II προάγει επίσης την παραγωγή παραγόντων που σχετίζονται με τη φλεγμονή, όπως η IL-6, η IL-1β και η TNF-α (10-12). Ως εκ τούτου, η βλάβη που προκαλείται από το Ang II έχει χρησιμοποιηθεί για τη μοντελοποίηση της υπέρτασης in vitro, συμπεριλαμβανομένων των πρωτοπαθών αρουραίωννεφρόςκύτταρα (PRKs) (13,14).

Για ασθενείς μενεφρική λειτουργίαη δυσλειτουργία, η βλάβη των ενδοθηλιακών κυττάρων και η μειωμένη αναγέννηση και επιδιόρθωση είναι οι κύριες αιτίες της απώλειας των περισωλήνιων μικροκυστικών (MVs) (15). Τα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (EPCs) που προέρχονται από το μυελό των οστών μπορούν να προωθήσουν την ενδοθηλιακή επιδιόρθωση (16,17). Προηγούμενες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι τα EPCs μπορούν να βελτιώσουν την καρδιαγγειακή αναγέννηση (18) και να ρυθμίσουν την αγγειογένεση (19), καθώς και να ασκήσουν θεραπευτικές επιδράσεις στην οξείαΝεφρικήκάκωση ισχαιμίας-επαναιμάτωσης (20) και σε ασθενείς μεμεταμόσχευση νεφρού(21). Ωστόσο, εξ όσων γνωρίζουμε, η επίδραση των EPCs στην υπερτασική νεφροπάθεια δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως.  Υποθέσαμε ότι τα EPCs μπορεί να έχουν προστατευτική επίδραση έναντι της υπερτασικής νεφροπάθειας σεΝεφρικήΚύτταρα. Τα MVs εκκρίνονται συνεχώς από μια ποικιλία κυττάρων του σώματος, όπως επιθηλιακά κύτταρα, καρκινικά κύτταρα και βλαστοκύτταρα, και υπάρχουν σε διάφορα σωματικά υγρά, όπως το αίμα, τα ούρα και το γάλα, όπου μεσολαβούν σε βιολογικές λειτουργίες (22). Τα συσσωρευμένα στοιχεία έδειξαν ότι η προστατευτική επίδραση των EPCs συνδέεται στενά με την απελευθέρωση MVs (23,24) Στην παρούσα μελέτη, η πιθανή εφαρμογή των EPC-MVs για τη θεραπεία της υπερτασικής νεφροπάθειας εξετάστηκε με τη διερεύνηση των προστατευτικών επιδράσεων και μηχανισμών μέσω των οποίων τα EPC-MVs προστατεύουν από τον τραυματισμό PRK που προκαλείται από το Ang II, για να παρέχουν μια βιολογική θεωρητική βάση για τη θεραπεία της υπερτασικής νεφροπάθειας.

Λέξεις κλειδιά:EPC-MVs, υπερτασική νεφροπάθεια, Ang II, ROS, MVs, φλεγμονή, νεφρό, νεφρική

Υλικά και μέθοδοι

Ζωα.Συνολικά 12 αρσενικοί αρουραίοι Wistar-Kyoto (WKY) ηλικίας 8 εβδομάδων (WKY) χωρίς ειδικά παθογόνα (βάρος, 80-120 g) ελήφθησαν από την Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (αρ. άδειας. SCXK, Γκουανγκντόνγκ, 2015-0063). Οι αρουραίοι τοποθετήθηκαν σε ένα δωμάτιο με σταθερή θερμοκρασία και υγρασία (θερμοκρασία, 23±2°C, υγρασία, 50±10%), κάτω από έναν κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών με ad libitum πρόσβαση σε τυπική τροφή αρουραίων και νερό σε κλουβί πολυστερίνης. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης ζώων του Ιατρικού Πανεπιστημίου Hainan (Haikou, Κίνα, αριθμός έγκρισης. HYLL-2021-053), και πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (25).

ΤΟ CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΏΣΕΙ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΉ/ΝΕΦΡΙΚΉ ΛΕΙΤΟΥΡΓΊΑ

Απομόνωση και κουλτούρα των PRK.Οι αρουραίοι WKY με ελεύθερη πρόσβαση στο νερό έχουν νηστέψει για 12 ώρες πριν από το πείραμα. Τα ποντίκια WKY υποβλήθηκαν σε ευθανασία χρησιμοποιώντας μια ενδοπεριτοναϊκή ένεση νατρίου πεντοβαρβιτάλης (200 mg/kg σωματικού βάρους), κατόπιν ηΝεφράαφαιρέθηκαν άσηπτα και το φλοιώδες τμήμα τουνεφρόςαποκόπηκε και μεταμοσχεύθηκε σε ένα μικρό ποτήρι ζέσεως. ΟΝεφρικήφλοιός κόπηκε σε θραύσματα ιστών ~ 1 mm3 , πλύθηκε τρεις φορές με PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), φυγοκεντρήθηκε στα 1.000 x g στους 25°C για 5 λεπτά και το υπερκείμενο υγρό απορρίφθηκε. Τα θραύσματα ιστού προστέθηκαν στην κολλαγενάση τύπου Ι (Gibco; Θέρμο Φίσερ Επιστημονική, Inc.) σε τελική συγκέντρωση 1 g/l, και τα θραύσματα ιστού ταλαντώθηκαν και χωνεύτηκαν στους 37°C για 30 λεπτά. Μετά τη διήθηση μέσω μιας οθόνης από ανοξείδωτο χάλυβα 200 ματιών (0,075 mm), τα κελιά διαχωρίστηκαν από τον Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) φυγοκέντρηση κλίσης πυκνότητας (26). Μετά από φυγοκέντρηση στα 1.000 x g στους 25°C επί 2 λεπτά, το ενδιάμεσο εναιώρημα συλλέχθηκε και αναμειγνύεται με μέσο MEM/F12 (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), εμβολιάζεται σε πλάκα 6 φρεατίων και καλλιεργείται στους 37 °C κάτω από 5% CO2. Μετά από 24 ώρες, το μέσο αφαιρέθηκε και αντικαταστάθηκε με ένα φρέσκο μέσο και το μη συνδεδεμένοΝεφρικήτα κύτταρα και οι ιστοί απορρίφθηκαν. Μετά από 48 ώρες, το μέσο αφαιρέθηκε ξανά, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και δηλώθηκαν ως PRKs (27,28). η κύρια σύσταση ήταν τα σπειραματικά μεσαγγιακά κύτταρα αρουραίων. Τα PRK καλλιεργήθηκαν για τρεις γενιές και υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Ang II (1 μM; Σίγμα-Άλντριχ; Merck KGaA) στους 37°C για 24 ώρες για τον καθορισμό της PRKνεφρική βλάβηυπόδειγμα. Η φλεγμονή που προκαλείται από το Ang II σε αρουραίουςΝεφρικήσωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα εκτελέστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως από τους Nair et al (29).

Τα PRKs εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία ανοσοφθορισμού (IF).Μετά το ξέπλυμα τρεις φορές με PBS και τον καθορισμό με 4% παραφορμαλδεΰδη στους 25 °C για 1 ώρα, τα κύτταρα επωάστηκαν (25 ° C) με το Triton X-100 για 2 ώρες, ακολουθούμενο από 5% BSA (Beijing Solar Science &Technology Co., Ltd.) στους 25 ° C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα PRKs επωάστηκαν κατά τη διάρκεια της νύχτας στο σκοτάδι με ακτίνη α-λείου μυός (α-SMA, 1 μg/ml, cat. no. ab7817; Abcam) και vimentin (1:250, κατ. αρ. ab92547; Abcam) στους 4°C. Μετά το ξέπλυμα τρεις φορές με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με Alexa Fluor® 488- (1:100, cat. no. ab150077; Abcam) ή 647-ετικέτα (1:200;  γάτα. Όχι. ab150075; Abcam) δευτερογενή αντισώματα στους 37°C για 1 ώρα.  Στη συνέχεια, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με DAPI (0,5 μg/ml; Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας) στους 25°C για 5 λεπτά. Τέλος, οι εικόνες τραβήχτηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού (μεγέθυνση, x400; Leica Μικροσυστήματα GmbH).

Πολιτισμός και προσδιορισμός των ΠΕΑ.Το μηριαίο οστό αρουραίων και η κνήμη τεμαχίστηκαν και κάθε σωλήνας μυελού των οστών ξεπλύθηκε με αποστειρωμένο PBS. Το προκύπτον μείγμα φυγοκεντρήθηκε (1.000 x g·  25°C; 15 λεπτά) και τα σωματίδια αναρτήθηκαν εκ νέου σε μέσο MEM/F12. Τα κύτταρα απομονώθηκαν από τον Ficoll (Σίγμα-Άλντριχ; Merck KGaA) φυγοκέντρηση κλίσης πυκνότητας (1.000 x g, 25°C;  20 λεπτά) και τοποθετείται σε φιάλη καλλιέργειας 25 cm2 επικαλυμμένη με ινονεκτίνη (BD Biosciences). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ένα πλήρες μέσο υπό κανονικές συνθήκες (37°C, 5% CO2). Το μέσο καλλιέργειας άλλαξε μετά από 4 ημέρες και τα προσκολλημένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για επιπλέον 3 ημέρες (30). Η χρώση της ακετυλωμένης λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας χαμηλής πυκνότητας (Dil-Ac-LDL) (Beijing Solar Science && Technology Co., Ltd.) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των EPCs. Για το σύστημα συν-καλλιέργειας, prks (1x104 ) προστέθηκαν στον κάτω θάλαμο μιας πλάκας συν-καλλιέργειας (Corning, Inc.) για 24 ώρες και στη συνέχεια Ang II (1 μM) ή 200 μl PBS και EPCs (3x104 ) προστέθηκαν στον άνω θάλαμο και επωάστηκαν στους 37 °C για 24 ώρες πριν πραγματοποιηθεί περαιτέρω ανάλυση της κυτταρικής λειτουργίας. Κατά τον έλεγχο των PRK και του καλύτερου ποσοστού των EPCs, οι αναλογίες του αριθμού κυττάρων ήταν 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 και 1:7.

Προετοιμασία EPC-MVs. Τα EPCs καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες όπως περιγράφηκε προηγουμένως (30), πλύθηκαν δύο φορές με PBS και λιμοκτονούσαν από ορό για 12 ώρες. Στη συνέχεια, το μέσο MEM/F12 που περιείχε καλλιεργημένα EPCs συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε στους 4°C (1.000 x g, 15 min) και το υπερκείμενο υγρό εξήχθη στους 4°C (100.000 x g, 60 min) για τη συλλογή των εκκρινόμενων EPC-MVs. Μετά την ενσωμάτωση στην εποξειδική ρητίνη Pon 812 (Structure Probe, Inc.), τοποθετήθηκε στους 37 ° C κατά τη διάρκεια της νύχτας. Στη συνέχεια, προστέθηκε διάλυμα στερέωσης ηλεκτρονικού μικροσκοπίου (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) για 4 ώρες και οξικό ουράνιο (2%; Γουχάν Υπηρεσία Τεχνολογίας Co, Ε.Π.Ε.) και ο κιτρικός μόλυβδος (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) χρωματίστηκαν στους 25 °C για 15 λεπτά. Τα MVs επιβεβαιώθηκαν μέσω ηλεκτρονικής μικροσκοπίας μετάδοσης. Στο σύστημα συνκαλλιέργειας, 50 μg/ml EPC-MVs (31) προστέθηκαν στον άνω θάλαμο μιας πλάκας δοκιμασίας Transwell και προστέθηκαν πάρκα στον κάτω θάλαμο όπως περιγράφηκε προηγουμένως και επωάστηκαν για 24 ώρες.

Δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού.Τα PRKs χωνεύτηκαν με θρυψίνη, εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 κοιλοτήτων σε πυκνότητα 3x103 κυττάρων/φρεατίου και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Η οπτική πυκνότητα στα 450 nm μετρήθηκε με τη χρήση αντιδραστηρίου 10 μl Cell Counting Kit-8 (CCK-8;  Πεκίνο Ηλιακή Επιστήμη & Τεχνολογία Co, Ε.Π.Ε.) στους 37°C για 60 λεπτά, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, για την αξιολόγηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

ΤΟ CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΏΣΕΙ ΤΟΝ ΠΌΝΟ ΣΤΑ ΝΕΦΡΆ / ΝΕΦΡΌ

Δοκιμασία κυτταρικής απόπτωσης.Μια δοκιμασία κυτταρικής απόπτωσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Annexin V-FITC (BD Biosciences), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα PRK συγκομίστηκαν, πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS (Gibco; Θέρμο Φίσερ Επιστημονική, Inc.) και επαναιωρείται σε ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης των 500 μl. Στη συνέχεια, τα επαναιωρούμενα PRK επωάστηκαν με 5 μl annexin V-FITC και 5 μl PI στο σκοτάδι για 15 λεπτά στους 23±2°C. Η κυτταρική απόπτωση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (FCM; FACSCanto II; Λογισμικό BD FACSChorus™, έκδοση: 1.0; BD Βιοεπιστήμες).

Σύντηξη EPC-MV και PRK.Για να παρατηρηθεί εάν τα EPC-MVs ήταν συγχωνευμένα με PRK, τα EPC-MVs επισημάνθηκαν με μια φθορίζουσα βαφή ενσωματωμένη σε μεμβράνη λιπιδίων (PKH26) πριν από τη συν-επώαση. Εν συντομία, 50 μg/ml EPC-MVs συνδυάστηκαν με 2 ml PKH26 (2x10-6 M; Σίγμα-Άλντριχ; Merck KGaA) και αναμιγνύεται στους 23±2°C για 5 λεπτά. Το επισημασμένο μείγμα προστέθηκε σε 2 ml 1% BSA (v) και φυγοκεντρήθηκε στα 100.000 x g στους 4°C για 60 λεπτά, στη συνέχεια ξεπλύθηκε με κρύο PBS. Το ίζημα εναιωρήθηκε σε μέσο MEM/F12 του 1 ml, προστέθηκε σε PRK και επωάστηκε στους 37 °C για 24 ώρες. Τέλος, προστέθηκε 1 μg/ml DAPI για πυρηνική χρώση στους 25°C για 15 λεπτά. Οι εικόνες κυττάρων αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (μεγέθυνση, x400; Leica Μικροσυστήματα GmbH).

Δοκιμασία κυτταρικού κύκλου.Η δοκιμασία του κυτταρικού κύκλου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης κυτταρικού κύκλου (BD Biosciences). Τα EPCs ή PRKs (1x106 ) συλλέχθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές με PBS και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 500 μl 70% παγωμένη αιθανόλη για 2 ώρες στους 25 °C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και επωάστηκαν σε PI (400 μl) και RNase (100 μl) για 30 λεπτά στους 37°C στο σκοτάδι. Το σήμα PI ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας FCM (FACSCanto II). Τα ποσοστά των κυττάρων στη φάση G1, S και G2 μετρήθηκαν και συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo (έκδοση 10.0.6; ΡοήJo LLC).

Μέτρηση ROS από την FCM.Τα PRKs καλλιεργήθηκαν σε 60-70% συρροή και συγκομίστηκαν μέσω θρυψινοποίησης. Όλα τα κύτταρα επωάστηκαν με 1,0 μM 2',7'-διχλωροδιυδροφθορορεσκεΐνης διακετατική για 15 λεπτά στους 37°C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και αναλύθηκαν μέσω FCM για την ανίχνευση ROS χρησιμοποιώντας ένα λέιζερ 488 nm για διέγερση και ένα λέιζερ 535 nm για ανίχνευση.

ΕΛΙΣΣΑ.Μετά τη φυγοκέντρηση (1.000 x g, 25°C, 5 min), το υπερκείμενο υγρό κυττάρων κάθε υποομάδας συλλέχθηκε για να αναλύσει τα επίπεδα των MDA, GSH-Px, SOD και των φλεγμονωδών παραγόντων IL-6, IL-1β και TNF-α. Τα ακόλουθα κιτ χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή: Κιτ δοκιμής Micro MDA (γάτα.  Όχι. π.Χ.0020· Πεκίνο Solarbio Επιστήμη &Τεχνολογία Co, Ltd.), GSH-Px κιτ ανάλυσης (κατ. αρ. π.Χ.1195; Πεκίνο Solarbio Επιστήμη &Technology Co, Ε.Π.Ε.), SOD κιτ ανίχνευσης δραστηριότητας (κατ. αρ. π.Χ.0170; Πεκίνο Solarbio Επιστήμη & Τεχνολογία Co, Ε.Π.Ε.), αρουραίος IL-1β ELISA κιτ (κατ. αρ. RLB00; Συστήματα Ε & Α, Inc.), αρουραίος IL-6 Quantikine ELISA κιτ (κατ. αρ. R6000B; Συστήματα Ε & Α, Inc.) και αρουραίος TNFα Quantikine ELISA kit (γάτα.  Όχι. RTA00; Συστήματα Ε & Α, Inc.).

Στατιστική ανάλυση.Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως ο μέσος όρος ± SD. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την έκδοση λογισμικού SPSS 21.0 (IBM Corp.). Οι διαφορές μεταξύ πολλαπλών ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομο ANOVA και το post hoc τεστ της Dunnett. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Αποτελέσματα

Προσδιορισμός απομονωμένων ΠΕΑ και PRK. Τα απομονωμένα EPCs ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας χρώση Dil-Ac-LDL (Εικ. 1Α).  Η μικροσκοπική καταμέτρηση αποκάλυψε ότι ο βαθμός σύμπτωσης μεταξύ του ερυθρού (Χρώση Dil-Ac-LDL) και του μπλε (πυρηνική χρώση με DAPI) φθορισμού ήταν >90%, επιβεβαιώνοντας ότι τα EPCs απομονώθηκαν με επιτυχία. Μεμονωμένα PRKs αναλύθηκαν μέσω IF (vimentin/α-SMA). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το επίπεδο έκφρασης του vimentin/α-SMA στα PRK ήταν υψηλό και θετικό, υποδηλώνοντας την επιτυχή απομόνωση των PRK (Εικ. 1B).

Η βέλτιστη αναλογία των EPCs προς τα PRK.Εξετάστηκε η επίδραση του συνδυασμού διαφορετικών ποσοστών PRK/EPCs σε ένα σύστημα συν-καλλιέργειας και διαπιστώθηκε ότι τα PRK που αναπτύχθηκαν σε αναλογία 1:3 PRKs/EPCs δεν είχαν αυξημένα ποσοστά διάδοσης σε σύγκριση με τα PRK που αναπτύχθηκαν με αναλογία 2:1, 1:1 ή 1:2 PRKs/EPCs (Εικ. 1C). Επιπλέον, τα αυξανόμενα ποσοστά των ΠΕΑ (1:4, 1:5, 1:6 και 1:7) είχαν ως αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση του πολλαπλασιασμού των PRK σε σύγκριση με εκείνη των ΠΕΑ (1:3).  Ως εκ τούτου, επιλέχθηκε μια αναλογία 1:3 PRKs/EPCs για περαιτέρω μελέτες για την πρόληψη πιθανών παρεμβολών από υπερβολικά EPCs σε επόμενα πειράματα.

Επίδραση της συν-καλλιέργειας EPC στη βλάβη που προκαλείται από το Ang II.Τα PRKs (1x104 ) εμβολιάστηκαν 24 ώρες εκ των προτέρων στο κάτω διαμέρισμα μιας πλάκας Transwell. Ο άνω θάλαμος περιείχε 200 μl PBS στην ομάδα ελέγχου και 200 μl EPCs (3x104 ) στην πειραματική ομάδα. Για να μοντελοποιήσετενεφρική βλάβη,Προστέθηκε 1 μM Ang II στο κάτω διαμέρισμα. Μετά από 24 ώρες, πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες CCK-8 και FCM για τη μέτρηση του ποσοστού πολλαπλασιασμού των PRK. Τα PRK που έλαβαν Ang II απουσία EPCs είχαν σημαντικά μειωθεί (PFc)<0.05) proliferation="" rate="" (fig.="" 1d),="" and="" increased="" apoptosis="" rate="" (fig.="" 1e)="" and="" cell="" cycle="" arrest="" in="" the=""  g1="" phase="" (fig.="" 1f)="" compared="" with="" the="" control="" group,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" receiving="" ang="" ii="" showed="" the="" reverse="" effects.="" these="" results="" indicated="" that="" co‑culture="" with="" epcs="" can="" reduce="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" a="" rat="">νεφρόςμοντέλο κυττάρων.

Τα EPCs προστατεύουν τα PRKs από βλάβες που προκαλούνται από το Ang II, εξετάστηκαν τα επίπεδα οξειδωτικού στρες που προκαλούνται από το Ang II σε PRKs που έχουν συν-καλλιεργηθεί με EPCs. Τα αποτελέσματα από τη δοκιμασία FCM αποκάλυψαν ότι το Ang II αυξήθηκε σημαντικά (P<0.05) the="" levels="" of="" ros="" in="" prks="" in="" the="" absence="" of="" epcs,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" had="" comparatively="" lower="" ros="" levels="" (fig.="" 2a).=""  similarly,="" the="" elisa="" results="" indicated="" that="" the="" levels="" of="" secreted=""  mda="" (fig.="" 2b)="" were="" increased="" and="" gsh="" and="" sod="" (fig.="" 2c=""  and="" d)="" levels="" were="" decreased="" in="" prks="" receiving="" ang="" ii,="" while=""  prks="" receiving="" ang="" ii="" and="" co‑cultured="" with="" epcs="">

Σχήμα 1. Ανάκτηση των PRK από συμπαραγωγή με EPCs μετά από τραυματισμό που προκλήθηκε από το Ang II. (Α) Επιβεβαίωση της απομόνωσης των EPCs μέσω χρώσης Dil-Ac-LDL. Μεγέθυνση, x100. (Β) Επιβεβαίωση της απομόνωσης των PRK με τη χρήση δοκιμασίας ανοσοφθορισμού. Μεγέθυνση, x400. (Γ) ανάλυση CCK-8 των επιπτώσεων των διαφόρων ποσοστών των συγχρηματοδοτούμενων ΠΕΑ στον πολλαπλασιασμό των PRK. NS P>0,05 έναντι PRK:EPCs, ομάδα 2:1· * Π<0.05 vs.="" prks:epcs,="" 2:1="" group.=""  (d)="" cck‑8="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" proliferation="" rate="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" fcm="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" (e)="" apoptosis="" and="" (f)="" cell="" cycle="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" *=""><0.05 vs.="" control;="" #=""><0.05 vs.="" ang="" ii.="" ang="" ii,="" angiotensin="" ii;="" epcs,="" endothelial="" progenitor="" cells;=""  prks,="" primary="" rat="">νεφρόςκύτταρα· FCM, κυτταρομετρία ροής. CCK-8, κιτ μέτρησης κυττάρων-8; Dil-Ac-LDL, Dil σύμπλοκο ακετυλιωμένη λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας. OD, οπτική πυκνότητα. α-SMA, ακτίνη α λείων μυών. NS, δεν είναι σημαντικό. αντίθετα αποτελέσματα όσον αφορά την έκκριση αυτών των ενζύμων. Η δημιουργία του ROS μπορεί επομένως να εμπλέκεται στην κυτταρική βλάβη που προκαλείται από το Ang II και μπορεί να βελτιωθεί με συν-καλλιέργεια με EPCs.

Το Ang II μπορεί επίσης να βλάψει τα κύτταρα προωθώντας την έκκριση φλεγμονωδών κυτοκινών, ενώ τα EPCs μπορούν να αποτρέψουν τη φλεγμονή (32). Στη συνέχεια, διερευνήθηκε εάν το Ang II προάγει την έκκριση φλεγμονωδών κυτοκινών σε PRKs και εάν τα EPCs θα μπορούσαν να ασκήσουν τον προστατευτικό τους ρόλο αναστέλλοντας την έκκριση φλεγμονωδών κυτοκινών.  Η έκκριση των IL-1β, IL-6 και TNF-α αυξήθηκε σημαντικά στα PRK με την προσθήκη του Ang II. Αντίθετα, στα PRK που συγχρηματοδοτήθηκαν με EPCs, τα επίπεδα των IL-1β, IL-6 και TNF-α (Σχήμα 2E-G) ήταν συγκριτικά χαμηλότερα (P<0.05) than="" those="" in="" prks="" cultured="" alone.="" therefore,="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" prks="" was="" also="" associated="" with="" pro‑inflammatory="" cytokines,="" and="" co‑culture="" with="" epcs="" exerted="" protective="" effects="" by="" reducing="" the="" secretion="" of="" these="">

Η προστατευτική επίδραση των EPCs ασκείται μέσω MVs.Οι μηχανισμοί μέσω των οποίων τα ΠΕΑ ασκούν προστατευτικές επιδράσεις στα επαγόμενα από το Ang IIνεφρόςκύτταρα αναλύθηκαν περαιτέρω απομονώνοντας MVs από EPCs (Εικ. 3Α). Τα EPC-MVs επισημάνθηκαν με PKH26 και προστέθηκαν στα PRK μαζί με το Ang II σε μια πλάκα Transwell, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Ο φθορισμός PKH26 ανιχνεύθηκε στο κυτταρόπλασμα των PRKs (Εικ. 3Β), υποδεικνύοντας ότι τα EPC-MVs είχαν συγχωνευθεί με PRKs. Στη συνέχεια, διαπιστώθηκε ότι ο μειωμένος ρυθμός πολλαπλασιασμού που προκλήθηκε από το Ang II, προώθησε την απόπτωση και τη διακοπή του κύκλου στη φάση G1, παρεμποδίστηκαν από τα EPC-MVs (Εικ. 3C-E). Παρόμοια με τα PRK που συν-καλλιεργήθηκαν με EPCs, τα PRKs που αναπτύχθηκαν παρουσία EPC-MVs και εκτέθηκαν σε Ang II είχαν μειωμένα επίπεδα ROS και MDA (Σχήμα 4A και B), αυξημένα επίπεδα GSH και SOD (Εικ. 4C και D) και μειωμένη έκκριση των φλεγμονωδών κυτοκινών IL-1β, IL-6 και TNF-α (Εικ. 4E-G), σε σύγκριση με την ομάδα Ang II.

Συζήτηση

Εξ όσων γνωρίζουμε, η παρούσα μελέτη απέδειξε για πρώτη φορά ότι τα EPCs μπορούν να προστατεύσουν τα PRK από την κυτταρική βλάβη που προκαλείται από το Ang II. Αυτό το προστατευτικό αποτέλεσμα διαμεσολαβείται, τουλάχιστον εν μέρει, από MVs που εκκρίνονται από EPCs και συγχωνεύονται με PRKs κατά τη διάρκεια της συν-καλλιέργειας. Με την προσθήκη εμπλουτισμένων MVs σε PRKs που εκτίθενται στο Ang II, διαπιστώθηκε ότι τα EPC-MVs από μόνα τους θα μπορούσαν να προστατεύσουν τα PRK από τη βλάβη που προκαλείται από το Ang II αναστέλλοντας το οξειδωτικό στρες και τη φλεγμονή. Οι MVs ορίζονται ως νανοδιαβρώσεις μεμβράνης (0,05-1 μm) (33) και αποβάλλονται από την κυτταρική επιφάνεια μετά από ενεργοποίηση, καταπόνηση ή απόπτωση. Επιπλέον, τα MVs μπορούν να προέρχονται από διάφορους τύπους κυττάρων, όπως αιμοπετάλια, ενδοθηλιακά κύτταρα, EPCs και λευκά αιμοσφαίρια (34,35). Οι MVs εκφράζουν συγκεκριμένους δείκτες κυτταρικής επιφάνειας, οι οποίοι ποικίλλουν ανάλογα με το κύτταρο προέλευσης και το σχηματισμό τους και μπορούν να ασκήσουν αντιφλεγμονώδη, αντιπηκτικά και αγγειογενή αποτελέσματα (36). Οι MVs που απελευθερώνονται από τα EPCs μπορούν να μεταφέρουν τις βιολογικές πληροφορίες του μητρικού τους κυττάρου και, ως εκ τούτου, να ασκούν παρόμοια λειτουργία στα κύτταρα-στόχους (33). Για παράδειγμα, τα EPC-MVs προστατεύουν τα καρδιομυοκύτταρα από την υπερτροφία και την απόπτωση που προκαλείται από το Ang II (28), βελτιώνουν την ενδοθηλιακή λειτουργία και την ικανότητα ρύθμισης της αγγειογένεσης (37) και ανακουφίζουν την ενδοθηλιακή δυσλειτουργία που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες (38). Ωστόσο, εξ όσων γνωρίζουμε, η επίδραση των EPC-MVs στην υπερτασική νεφροπάθεια δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει τις πιθανές προστατευτικές επιδράσεις των ΠΕΑ και των EPC-MVs σενεφρική βλάβη των κυττάρων.

Στην παρούσα μελέτη, καθιερώθηκε ένα μοντέλο τραυματισμού PRK προκαλώντας βλάβη με το Ang II. Σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές (26,39), το Ang II μείωσε τον πολλαπλασιασμό της PRK, αύξησε την απόπτωση και ανέκοψε τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G1 πριν εισέλθει στη φάση S. Με βάση αυτούς τους δείκτες που σχετίζονται με την υπέρταση, συνήχθη το συμπέρασμα ότι το μοντέλο υπερ-τάσης PRK που προκαλείται από το Ang II καθιερώθηκε με επιτυχία. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η συν-καλλιέργεια με EPCs προστάτευε τα PRK από ζημιές που προκλήθηκαν από το Ang II. Μετά τη συν-επώαση των EPCs με PRKs + Ang II, τα επίπεδα των ενζύμων οξειδωτικού στρες και των φλεγμονωδών παραγόντων στα PRKs μειώθηκαν. Έτσι, οι πιθανοί μηχανισμοί μέσω των οποίων τα EPCs ασκούν τις προστατευτικές τους επιδράσεις στα PRKs μπορεί να περιλαμβάνουν τη ρύθμιση του οξειδωτικού στρες και της φλεγμονής. Εξ όσων γνωρίζουμε, η τρέχουσα μελέτη έδειξε για πρώτη φορά ότι τα EPCs μπορούν να βελτιώσουν την οξειδωτική απόκριση στρες που προκαλείται από το Ang II και τη φλεγμονή στα PRKs.

Τα ΠΕΑ προστατεύουν αποτελεσματικάνεφρική λειτουργίαστη ΧΝΝ (40) και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της αγγειακής ακεραιότητας και στην αποκατάσταση της ενδοθηλιακής κάκωσης (15), καθώς και στη μείωση της αγγειακής διαρροής, στη βελτίωση της λειτουργίας των οργάνων και στην αύξηση του ποσοστού επιβίωσης στη σήψη (41). Τα συσσωρευμένα στοιχεία υποδηλώνουν ότι τα ΠΕΑ μπορούν να ασκήσουν προστατευτικό ρόλο μέσω της έκκρισης MVs (37,42,43). Για να ελεγχθεί η προστατευτική επίδραση των EPC-MVs στα PRK, τα EPC-MVs απομονώθηκαν και επισημάνθηκαν με PKH26 και στη συνέχεια τα επισημασμένα MVs επωάστηκαν από κοινού με PRKs + Ang II.  Τα EPC-MVs συγχωνεύτηκαν με PRKs και ανέστειλαν σημαντικά την οξειδωτική απόκριση στο στρες και τη φλεγμονή που προκλήθηκαν από το Ang II, και αυτά τα αποτελέσματα είναι παρόμοια με αυτά των Fu et al (44).  Η ανασταλτική επίδραση των EPC-MVs στα επίπεδα των ενζύμων οξειδωτικού στρες ήταν μεγαλύτερη από αυτή των EPCs μόνο. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στο γεγονός ότι οι MVs είναι παρούσες σε υψηλότερη συγκέντρωση στα PRK που υποβάλλονται σε θεραπεία με EPC-MVs από ό,τι σε εκείνα που συν-καλλιεργούνται με EPCs. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η προστατευτική επίδραση των EPCs στα PRK έναντι της βλάβης των κυττάρων που προκαλείται από το Ang II μπορεί να εξαρτάται από τις εκκρινόμενες MVs. Ένας περιορισμός της παρούσας μελέτης είναι ότι οι πιθανοί μηχανισμοί μέσω των οποίων τα EPC-MVs ρυθμίζουν τους άξονες microRNAs/mRNAs/μεταγωγής σήματος δεν εξετάστηκαν πλήρως. Ο ρόλος και οι μηχανισμοί μέσω των οποίων τα EPC-MVs ασκούν προστασία έναντινεφρική βλάβηθα πρέπει να αξιολογηθεί σε ένα ζωικό μοντέλο υπερτασικής νεφροπάθειας, η οποία είναι μια πολλά υποσχόμενη κατεύθυνση για μελλοντική έρευνα. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι τα EPCs μπορούν να προστατεύσουν τα PRKs από το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από το Ang II και την αυξημένη φλεγμονή μέσω της έκκρισης MVs. Αυτό παρέχει μια νέα κατεύθυνση για τη θεραπεία της υπερτασικής νεφροπάθειας και καθιερώνει ένα in vitro μοντέλο για τη μελέτηνεφρική βλάβη.