Προμιτοτική δράση του Oenothera Biennis σε γηρασμένους ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες Μέρος 2

3. Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την επίδραση ενός υδρόφιλου εκχυλίσματος κυττάρων Oenothera biennis (ObHEx) στην κυτταρική γήρανση, καθώς έδειξε ιδιότητες αντιγήρανσης του δέρματος όταν δοκιμάστηκε σε μοντέλα in vitro και ex vivo [18]. Χρησιμοποιήσαμε ένα παρόμοιο γηρασμένο μοντέλο NHDF που υποβλήθηκε σε SIPS για θεραπεία με H2O2 [21,22].

Το γλυκοσίδιο του cistanche μπορεί επίσης να αυξήσει τη δραστηριότητα του SOD στους ιστούς της καρδιάς και του ήπατος και να μειώσει σημαντικά την περιεκτικότητα σε λιποφουσκίνη και MDA σε κάθε ιστό, καθαρίζοντας αποτελεσματικά διάφορες δραστικές ρίζες οξυγόνου (OH-, H2O2, κ.λπ.) και προστατεύοντας από βλάβη του DNA που προκαλείται από ρίζες ΟΗ. Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες του Cistanche έχουν ισχυρή ικανότητα σάρωσης των ελεύθερων ριζών, υψηλότερη αναγωγική ικανότητα από τη βιταμίνη C, βελτιώνουν τη δραστηριότητα του SOD στο εναιώρημα σπέρματος, μειώνουν την περιεκτικότητα σε MDA και έχουν μια ορισμένη προστατευτική δράση στη λειτουργία της σπερματικής μεμβράνης. Οι πολυσακχαρίτες Cistanche μπορούν να ενισχύσουν τη δραστηριότητα των SOD και GSH-Px σε ερυθροκύτταρα και ιστούς πνευμόνων πειραματικά γηρασμένων ποντικών που προκαλούνται από D-γαλακτόζη, καθώς και να μειώσουν την περιεκτικότητα σε MDA και κολλαγόνο στους πνεύμονες και στο πλάσμα και να αυξήσουν την περιεκτικότητα σε ελαστίνη. ένα καλό αποτέλεσμα σάρωσης στο DPPH, παρατείνει το χρόνο της υποξίας σε γηρασμένα ποντίκια, βελτιώνει τη δραστηριότητα του SOD στον ορό και καθυστερεί τον φυσιολογικό εκφυλισμό του πνεύμονα σε πειραματικά γηρασμένα ποντίκια Με τον κυτταρικό μορφολογικό εκφυλισμό, τα πειράματα έχουν δείξει ότι το Cistanche έχει την καλή αντιοξειδωτική ικανότητα και έχει τη δυνατότητα να είναι φάρμακο για την πρόληψη και τη θεραπεία ασθενειών της γήρανσης του δέρματος. Ταυτόχρονα, η εχινακοσίδη στο Cistanche έχει σημαντική ικανότητα να δεσμεύει τις ελεύθερες ρίζες DPPH και την ικανότητα να καθαρίζει δραστικά είδη οξυγόνου και να αποτρέπει τις ελεύθερες ρίζες.

προκάλεσε την αποικοδόμηση του κολλαγόνου και έχει επίσης μια καλή επίδραση επιδιόρθωσης στη βλάβη των ανιόντων από τις ελεύθερες ρίζες θυμίνης.

Κάντε κλικ στο Πού μπορώ να αγοράσω το Cistanche

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Για να κατανοήσουμε τον μηχανισμό δράσης του ObHEx σε γηρασμένους ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες, με την αποκάλυψη των βιολογικών οδών που αλλοιώθηκαν από το εκχύλισμα, πραγματοποιήσαμε μια εξαιρετικά βαθιά πρωτεωμική προσέγγιση φασματομετρίας μάζας ανεξάρτητη από δεδομένα. Μας επέτρεψε να αποκτήσουμε την πληρέστερη ανάλυση πρωτεώματος γηρασμένων κυττάρων μέχρι σήμερα και, για πρώτη φορά, την ταυτόχρονη ποσοτικοποίηση πολλών δεικτών γήρανσης.

Πρώτα απ 'όλα, για να αξιολογήσουμε την επαγωγή γήρανσης με θεραπεία με H2O2 σε κύτταρα NHFD, ποσοτικοποιήσαμε τους γνωστούς δείκτες γήρανσης. Τα πρωτεομικά δεδομένα μας επιβεβαίωσαν την επαγωγή γήρανσης από το οξειδωτικό στρες: πράγματι, παρατηρήσαμε αλλοιωμένα επίπεδα ήδη γνωστών δεικτών γήρανσης που σχετίζονται με την αυξημένη περιεκτικότητα σε λυσοσωμικό (GLB1 και FUCA1), τη βλάβη του DNA (ATR, ATM, MACROH2A1 και MACRO2A2) και τον κυτταρικό κύκλο φάσης G2 σύλληψη (CDK1NA και MKI67). Επιπλέον, η ανάλυση εμπλουτισμού της οδού των πρωτεϊνών με τη μεγαλύτερη μείωση της ρύθμισης των πρωτεϊνών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με H2O2 έναντι των κυττάρων ελέγχου δείχνει τη μίτωση, αντανακλώντας τη διακοπή του πολλαπλασιασμού στη γήρανση.

Συγκρίνοντας το πρωτεϊνό των κυττάρων SIPS NHDF που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ObHEx έναντι αυτών που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία με το εκχύλισμα ήταν σε θέση να αποκαταστήσει εν μέρει τα επίπεδα πρωτεϊνών και συμπλεγμάτων που παίζουν κρίσιμους ρόλους σε διάφορα στάδια της μίτωσης. Η επώαση ObHEx αύξησε τα επίπεδα της CDK1, μιας βασικής μιτωτικής πρωτεΐνης που ενεργοποιεί την είσοδο στη μίτωση σχηματίζοντας ένα σύμπλοκο με την κυκλίνη Β [34]. Επιπλέον, και οι πέντε υπομονάδες του συμπλέγματος συμπυκνώσεως Ι ρυθμίστηκαν προς τα πάνω. Αυτό το σύμπλεγμα αποτελείται από δύο υπομονάδες δομικής συντήρησης χρωμοσωμάτων (SMC), SMC2 και SMC4, και τρεις μη SMC υπομονάδες, NCAPD2, NCAPH και NCAPG. Στην προμεταφάση, η λειτουργία του συμπλέγματος συμπύκνωσης Ι είναι να προάγει τη συμπύκνωση τύπου των χρωμοσωμάτων με την εισαγωγή θετικών υπερπηνίων στο DNA με τρόπο που εξαρτάται από το ΑΤΡ [35]. Επιπλέον, το εκχύλισμα ρυθμίζει προς τα πάνω τα KNTC1, NUF2 και TRIP13, οι οποίες είναι τρεις πρωτεΐνες που σχετίζονται με την κινετοχόρη, ένα μεγάλο σύμπλεγμα που, κατά τη διάρκεια της προμεταφάσης, συνδέει την κεντρομερή χρωματίνη με τους μικροσωληνίσκους από τους αντίθετους πόλους της ατράκτου για να ευνοήσει τον διαχωρισμό των αδελφών χρωματιδών. 36,37]. Μερική αποκατάσταση των επιπέδων των πρωτεϊνών MCM έχει επίσης ανιχνευθεί. Αυτές οι πρωτεΐνες βρίσκονται στον πυρήνα του συμπλέγματος αντιγραφής ελικάσης που ξετυλίγει το δίκλωνο DNA για να παρέχει μονόκλωνα ως εκμαγεία για την πολυμεράση DNA. Το σύμπλεγμα MCM μετατρέπεται σε ενεργή ελικάση κατά τη φάση S, αλλά φορτώνεται ήδη στη χρωματίνη κατά τη διάρκεια της τελοφάσης [38,39]. Το εκχύλισμα αύξησε επίσης τα επίπεδα IQGAP3, PBK και DHFR. Το πρώτο, το IQGAP3, είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της μιτωτικής εξέλιξης επειδή προάγει τη δραστηριότητα cdk7, απαραίτητη για την ενεργοποίηση του Cdc2 [40,41]. Η PBK είναι μια κινάση ενεργή μόνο στη μίτωση. Όταν φωσφορυλιώνεται, αλληλεπιδρά με την p53, αποσταθεροποιώντας την και εξασθενώντας την οδό βλάβης του DNA [42]. και το DHFR είναι ένα βασικό ένζυμο στη βιοσύνθεση του DNA του οποίου τα επίπεδα είναι σημαντικά εξασθενημένα σε γηρασμένους ανθρώπινους ινοβλάστες [43].

Οι βιο-ορθογωνικές δοκιμασίες έδειξαν επίσης την ικανότητα του ObHEx να επαναφέρει εν μέρει τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα της γήρανσης, δηλαδή τη λυσοσωμική δραστηριότητα και τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Πράγματι, για να επαληθεύσουμε εάν η αποκατάσταση της έκφρασης μιτωτικής πρωτεΐνης από το ObHEx μεταφράζεται σε επανενεργοποίηση του κυτταρικού κύκλου, πραγματοποιήσαμε πειράματα FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) σε κύτταρα SIPS NHDF που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ή όχι με το εκχύλισμα. Έδειξαν ότι το ObHEx ήταν σε θέση να μειώσει το κλάσμα των κυττάρων που είχαν αποκλειστεί στη φάση G2 και να προωθήσει την επανείσοδό τους στον κυτταρικό κύκλο των γηρασμένων κυττάρων.

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1. Κυτταρικής καλλιέργειας

Οι φυσιολογικοί ανθρώπινοι δερματικοί ινοβλάστες (NHDF, Promocell) καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκού ορού βοοειδών (FBS, Gibco) και 500 U/mL πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης (Gibco) σε 95 τοις εκατό , 5 τοις εκατό CO2 και υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ◦C.

4.2. Επαγωγή Πρόωρης Γήρανσης που προκαλείται από Στρες (SIPS)

Συνολικά 10 1200 000 κύτταρα NHDF σπάρθηκαν σε καθένα από τα τρυβλία κυτταροκαλλιέργειας 60 mm, μία ημέρα πριν από την επώασή τους με 100 μΜ H2O2 στους 37 ◦C για 2 ώρες [21,22]. Στη συνέχεια, το Η2Ο2 πλύθηκε με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS, Gibco) για να τερματιστεί η θεραπεία και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε κανονικό μέσο για 4 ημέρες. Για τα μη γηρασμένα κύτταρα, που χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος, 2240 000 κύτταρα NHDF σπάρθηκαν σε καθένα από τα τρυβλία κυτταροκαλλιέργειας 60 mm. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε σε 5 βιολογικά αντίγραφα.

4.3. Παρασκεύασμα Oenothera Biennis Hydrophilic Extract (ObHEx).

Το εκχύλισμα παρασκευάστηκε στα εργαστήρια της Arterra Bioscience SpA [18]. Οι κυτταρικές καλλιέργειες ελήφθησαν από τα φύλλα των φυτών Oenothera biennis (που παρέχονται από την GEEL Floricultura ss) προκαλώντας τον πολλαπλασιασμό των μεριστωματικών κυττάρων σε στερεά τρυβλία άγαρ έως ότου προκύψουν οι κάλλοι. Τα κύτταρα μεταφέρθηκαν στο υγρό μέσο ανάπτυξης (Gamborg B5, συμπληρωμένο με 2,4 διχλωροφαινοξυοξικό οξύ (1 mg/L), αδενίνη (1 mg/L) και κινετίνη (0.01 mg/L )) και αναπτύσσονται ως καλλιέργειες εναιωρήματος υπό τροχιακή ανακίνηση. Μόλις ελήφθησαν καλλιέργειες περίπου 150 g/L, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε PBS σε ρΗ 7,4 για να παρασκευαστεί ένα υδατοδιαλυτό εκχύλισμα. Μετά τη λυοφιλοποίηση, η ληφθείσα σκόνη διαλύθηκε σε νερό ή μέσα κυτταροκαλλιέργειας στις κατάλληλες συγκεντρώσεις για δοκιμή.

4.4. Θεραπεία Oenothera Biennis Hydrophilic Extract (ObHEx).

Τα κύτταρα NHDF επωάστηκαν για 24 ώρες με 0.01 τοις εκατό (p/v) ObHEx σε ένα πλήρες μέσο. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για επιπλέον 24 ώρες με 0,01 τοις εκατό (ρ/ν) ObHEx σε ένα μέσο χωρίς ορό. Στη συνέχεια, αποσπάστηκαν με θρυψίνη, φυγοκεντρήθηκαν στα 500 g για 10 λεπτά στους 4 ◦C και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν στις ίδιες επωάσεις χωρίς ObHEx.

4.5. Προετοιμασία δείγματος για πρωτεομική ανάλυση

Τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 60μL ρυθμιστικού προσδιορισμού Ραδιοανοσοκαθίζησης (RIPA) και λύθηκαν με υπερήχους. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης κυτταρικών λυμάτων ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης DC™ (Biorad, #5000112). Η πέψη της στήλης micro spin S-TrapTM (Protifi, Huntington, CA, USA) πραγματοποιήθηκε σε 50 μg κυτταρολυμάτων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα δείγματα ανήχθησαν με 20 mM τρις(2- καρβοξυαιθυλ)φωσφίνη (TCEP) και αλκυλιώθηκαν με 50 mM θειοακεταμίδιο (CAA) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια προστέθηκε υδατικό φωσφορικό οξύ σε τελική συγκέντρωση 2,5 τοις εκατό που ακολουθήθηκε από την προσθήκη ενός ρυθμιστικού δεσμευτικού S-Trap (90 τοις εκατό υδατική μεθανόλη, 100 mM TEAB, ρΗ 7,1). Τα μίγματα στη συνέχεια φορτώθηκαν σε στήλες S-Trap. Πραγματοποιήθηκαν πέντε επιπλέον βήματα πλύσης για πλήρη εξάλειψη του SDS. Στη συνέχεια, τα κυτταρολύματα χωνεύτηκαν με 2,5 μg τρυψίνης (Promega) στους 47 ◦C για 1 ώρα. Μετά την έκλουση, τα πεπτίδια ξηράνθηκαν υπό κενό, επαναιωρήθηκαν σε 2 τοις εκατό ACN, 0,1 τοις εκατό FA και ποσοτικοποιήθηκαν με Nanodrop.

4.6. NanoLC-MS/MS Protein Identification and Quantification

Συνολικά 400 ng από κάθε δείγμα εγχύθηκαν σε ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) (Bruker Daltonics, Bremen, Γερμανία) σε νανοπλάκα (Bruker Daltonics, Bremen) σε συνδυασμό με ένα timsTOF Pro (Bruker Daltonics, Bremen , Γερμανία) φασματόμετρο μάζας. Διαχωρισμός HPLC (Διαλύτης Α: {{30}}.1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ σε νερό· Διαλύτης Β: 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ σε ακετονιτρίλιο) διεξήχθη στα 250 λίτρα/λεπτό χρησιμοποιώντας μια στήλη γεμάτη εκπομπού (C18, 25 cm × 75 μm 1,6 μm) (Ion Optics, Fitzroy, Αυστραλία) χρησιμοποιώντας βαθμιδωτή έκλουση (2 έως 13 τοις εκατό διαλύτη Β κατά τη διάρκεια 41 λεπτών, 13 έως 20 τοις εκατό κατά τη διάρκεια 23 λεπτών, 20 τοις εκατό έως 30 τοις εκατό κατά τη διάρκεια 5 λεπτών, 30 τοις εκατό έως 85 τοις εκατό για 5 λεπτά και, τέλος, 85 τοις εκατό για 5 λεπτά για το πλύσιμο της στήλης). Τα φασματομετρικά δεδομένα μάζας αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο απόκτησης παράλληλης συσσώρευσης σειριακού κατακερματισμού (diaPASEF) ανεξάρτητα από τα δεδομένα. Οι ρυθμίσεις της πάνας ήταν: εύρος μάζας από 400 έως 1200 Da, εύρος κινητικότητας από 0,60 έως 1.{33}}/k0, αριθμός παραθύρου κινητικότητας 1, εκτίμηση χρόνου κύκλου 1,79 δευτερόλεπτα, βήματα μάζας ανά κύκλο 32.

4.7. MS Data Processing and Bioinformatics Analysis

Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό DIA-NN (έκδοση 1.8) [44]. Πραγματοποιήθηκε αναζήτηση σε σχέση με την ανθρώπινη βάση δεδομένων UniProtKB/Swiss-Prot Homo sapiens (έκδοση Φεβρουάριος 2021, 20.408 καταχωρήσεις) χρησιμοποιώντας μια ροή εργασίας χωρίς βιβλιοθήκη. Για το σκοπό αυτό, οι επιλογές "FASTA digest για δωρεάν αναζήτηση βιβλιοθήκης/δημιουργία βιβλιοθήκης" και "Deep Learning Spectra, RTs, and IMs prediction" ελέγχθηκαν για δημιουργία προδρόμου ιόντων. Επιτράπηκαν το πολύ 2 χαμένες διασπάσεις θρυψίνης και η μέγιστη μεταβλητή τροποποίηση ορίστηκε σε 5. Η καρβαμιδομεθυλίωση (Cys) ορίστηκε ως σταθερή τροποποίηση, ενώ η εκτομή της Ν-τελικής μεθειονίνης πρωτεΐνης, η οξείδωση μεθειονίνης και η Ν-τερματική ακετυλίωση ορίστηκαν ως μεταβλητές τροποποιήσεις. Το εύρος μήκους πεπτιδίου ορίστηκε σε 7-30 αμινοξέα, εύρος φόρτισης πρόδρομων ουσιών 2-4, εύρος προδρόμου m/z 300-1800 και εύρος θραυσμάτων ιόντων m/z 200-1800. Για την αναζήτηση της μητρικής μάζας και των ιόντων θραυσμάτων, η ακρίβεια συνήχθη αυτόματα από το DIA-NN και ορίστηκε γύρω στα 13 ppm για κάθε ανάλυση. Τα ποσοστά ψευδούς ανακάλυψης (FDRs) στα επίπεδα πρωτεΐνης και πεπτιδίου ορίστηκαν στο 1 τοις εκατό. Επιτρεπόταν ο αγώνας μεταξύ των δρομολογίων. Για τη στρατηγική ποσοτικοποίησης, χρησιμοποιήθηκε το Robust LC (υψηλής ακρίβειας) όπως υποδείχθηκε στην τεκμηρίωση του λογισμικού, ενώ οι προεπιλεγμένες ρυθμίσεις διατηρήθηκαν για τις άλλες παραμέτρους αλγορίθμου.

Πραγματοποιήθηκε στατιστική και βιοπληροφορική ανάλυση με το λογισμικό Perseus (έκδοση 1.6.15) ελεύθερα διαθέσιμο στον ιστότοπο (πρόσβαση στις 22 Ιουνίου 2021) [45] και R/R Studio και RStudio έκδοση 20 21.09.1 30 (πρόσβαση στις 12 Νοεμβρίου 2021). Όλες οι στατιστικές αναλύσεις R πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο R stats. Χρησιμοποιήθηκε η έξοδος του πίνακα αναφοράς pg από το DIA-NN και οι εντάσεις μετασχηματίστηκαν log2 για στατιστική ανάλυση. Για τη στατιστική σύγκριση, ορίσαμε τέσσερις ομάδες, η καθεμία από τις οποίες περιέχει 5 βιολογικά αντίγραφα. Στη συνέχεια φιλτράραμε τα δεδομένα για να διατηρήσουμε μόνο πρωτεΐνες με τουλάχιστον 3 έγκυρες τιμές σε τουλάχιστον μία ομάδα. Στη συνέχεια, τα δεδομένα καταλογίστηκαν για την πλήρωση σημείων δεδομένων που λείπουν δημιουργώντας μια Gaussian κατανομή τυχαίων αριθμών με τυπική απόκλιση 33 τοις εκατό σε σχέση με την τυπική απόκλιση των μετρούμενων τιμών και 1,8 τυπική απόκλιση καθοδική μετατόπιση του μέσου όρου για προσομοίωση της κατανομής των χαμηλών τιμές σήματος. Το Student's t-test πραγματοποιήθηκε μεταξύ SEN και CTRL FDR < 0,05, S0=0.1 για να επιβεβαιωθεί η παρουσία δεικτών ειδικών για τη γήρανση. Στη συνέχεια, για να διερευνηθεί εάν η διαφορά στο μέγεθος του αποτελέσματος μεταξύ της απουσίας ή της παρουσίας της θεραπείας είναι η ίδια για κύτταρα στα οποία προκλήθηκε ή όχι γήρανση, η αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο παραγόντων (δηλαδή, Επαγωγή και Θεραπεία) διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας αμφίδρομη ANOVA στο R. Στη συνέχεια, οι τιμές p που ελήφθησαν για την αλληλεπίδραση και των δύο παραγόντων προσαρμόστηκαν για πολλαπλές δοκιμές χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Benjamini–Hochberg [46] για τον έλεγχο του False Discovery Rate (FDR). Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση Tukey HSD post hoc σε πρωτεΐνες που έδειξαν τιμή q < 0,05. Τα δεδομένα πρωτεϊνικής φασματομετρίας μάζας έχουν κατατεθεί στην Κοινοπραξία ProteomeXchange μέσω του αποθετηρίου συνεργατών PRIDE [47] με το αναγνωριστικό δεδομένων PXD034222.

4.8. Χρώση β-γαλακτοσιδάσης που σχετίζεται με γήρανση

Η δραστηριότητα β-γαλακτοσιδάσης (SA-ß-gal) που σχετίζεται με τη γήρανση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ χρώσης Τεχνολογίας Κυττάρου Σηματοδότησης (#9860). Συνολικά 1250 000 κύτταρα NHDF/φρεάτιο σπάρθηκαν σε 6-πλάκα φρεατίου μία ημέρα πριν από το SIPS. ενώ, ως στοιχείο ελέγχου, 250 000 κελιά/πηγάδι. Μετά από 4 ημέρες σε ένα κανονικό μέσο, ​​τα κύτταρα επωάστηκαν ή όχι με 0,01 τοις εκατό (p/v) ObHEx για 48 ώρες. Στη συνέχεια, πλύθηκαν με PBS και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το διάλυμα στερέωσης για 15 λεπτά. Μετά από δύο πλύσεις με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με το διάλυμα χρώσης ß-gal (τελικό pH 6,0) που περιέχει 5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολύλιο- -D-γαλακτο -πυρανοσίδη (X-Gal) στους 37 ◦C σε ξηρό επωαστήρα για 20 ώρες. Τα θετικά κύτταρα είναι μπλε. Το χρώμα οφείλεται στη διάσπαση του X-Gal σε γαλακτόζη και 5-Βρώμο-4-χλωρο-3-ινδοξύλιο (X) από SA-ß-gal. Το ινδοξύλιο οξειδώνεται σε 5,50 -διβρωμο-4,40 -διχλωρο-λουλακί που σχηματίζει ένα έντονο μπλε ίζημα. Το ποσοστό των θετικών κυττάρων στα συνολικά κύτταρα αξιολογήθηκε μετρώντας 100-150 κύτταρα σε 5 τυχαία επιλεγμένες εικόνες που καταγράφηκαν από το μικροσκόπιο, για κάθε κατάσταση. Τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

4.9. Ανάλυση ταξινόμησης κυττάρων ενεργοποιημένης με φθορισμό

Συνολικά {{0}} κύτταρα NHDF/πηγάδι σπάρθηκαν σε 6-πλάκα φρεατίου μία ημέρα πριν από το SIPS. ενώ, ως στοιχείο ελέγχου, 50 000 κελιά/πηγάδι. Μετά από 4 ημέρες σε ένα κανονικό μέσο, ​​τα κύτταρα ελέγχου και τα γηρασμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ή όχι με 0,01 τοις εκατό (ρ/ν) ObHEx για 72 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν παρουσία 5 μg/mL Hoechst 33342 για 30 λεπτά στους 37°C. Μετά από θρυψίνη και φυγοκέντρηση στα 500 g για 2 λεπτά, επαναιωρήθηκαν σε 200 μL PBS. Τέλος, ο κυτταρικός φθορισμός μετρήθηκε με έναν αναλυτή κυττάρων BD LSRFortessa. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo v10.8.1. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

5. Συμπεράσματα

Το παγκόσμιο προφίλ πρωτεώματος που σχετίζεται με τη βαθιά γήρανση που λαμβάνεται εδώ παρέχει εκατοντάδες πρωτεΐνες απορυθμισμένες από το SIPS που μπορούν να αξιοποιηθούν από την επιστημονική κοινότητα για την περαιτέρω κατανόηση της γήρανσης και την αξιολόγηση των επιπτώσεων νέων πιθανών ρυθμιστών. Επιπλέον, η εργασία μας αποδεικνύει έναν προμιτωτικό μηχανισμό δράσης του ObHEx σε γηρασμένους ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες: μέσω της αύξησης της έκφρασης της μιτωτικής πρωτεΐνης, προάγει την αποκατάσταση του πολλαπλασιασμού των γηρασμένων κυττάρων. Έτσι, με βάση αυτά τα αποτελέσματα, προτείνουμε το ObHEx ως ένα ισχυρό ανοσοενισχυτικό κατά της γήρανσης που σχετίζεται με τη γήρανση του δέρματος.

Συνεισφορές συγγραφέα:Conceptualization, SC, MCM και ICG. μεθοδολογία, SC, KR, IM, CC (Cerina Chhuon) και ICG. λογισμικό, KR; έρευνα, SC, IM, CC (Cerina Chhuon), KT, SF, ADL, IP και CC (Corinne Cordier)· πόρους, MCM και ICG· σύνταξη — προετοιμασία πρωτοτύπου σχεδίου, SC και ICG. συγγραφή—αναθεώρηση και επεξεργασία, SC, MCM και ICG Όλοι οι συγγραφείς έχουν διαβάσει και έχουν συμφωνήσει με τη δημοσιευμένη έκδοση του χειρογράφου.

Δήλωση διαθεσιμότητας δεδομένων:Τα δεδομένα πρωτεϊνικής φασματομετρίας μάζας έχουν κατατεθεί στην Κοινοπραξία ProteomeXchange μέσω του αποθετηρίου συνεργατών PRIDE [47] με το αναγνωριστικό δεδομένων PXD034222 (Λεπτομέρειες λογαριασμού αναθεωρητή: Όνομα χρήστη: reviewer_pxd034222@ebi.ac.uk; Κωδικός πρόσβασης 9Pj9: .

Ευχαριστίες: Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Programma Operativo Complementare Ricerca e Innovazione 2014–2020, Asse I "Capitale Umano", Azione I.1 "Dottorati Innovativi con caratterizzazione Industriale". Ευχαριστούμε τα άλλα μέλη της πλατφόρμας Proteomics Necker Vincent Jung και την Joanna Lipecka για την ανεκτίμητη επιστημονική υποστήριξη και τις γόνιμες προτάσεις τους.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Di Micco, R.; Krizhanovsky, V.; Baker, D.; d'Adda di Fagagna, F. Cellular Senescence in Ageing: From Mechanisms to Therapeutic Opportunities. Nat. Rev. ΜοΙ. Cell Biol. 2021, 22, 75–95. [CrossRef] [PubMed]

2. González-Gualda, E.; Baker, AG; Fruk, L.; Muñoz-Espín, D. A Guide to Assessing Cellular Senescence in Vitro και in Vivo. FEBS J. 2021, 288, 56–80. [CrossRef] [PubMed]

3. Sikora, Ε.; Bielak- ˙Zmijewska, A.; Mosieniak, G. Τι είναι και τι δεν είναι κυτταρική γήρανση. Postepy Biochem. 2018, 64, 110–118. [CrossRef] [PubMed]

4. Choi, E.-J.; Kil, IS; Cho, E.-G. Τα εξωκυτταρικά κυστίδια που προέρχονται από γηρασμένους ινοβλάστες εξασθενούν τη δερματική επίδραση στη διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2020, 21, 1022. [CrossRef] [PubMed]

5. Krtolica, Α.; Parrinello, S.; Lockett, S.; Desprez, PY; Campisi, J. Οι γηραστικοί ινοβλάστες προάγουν την ανάπτυξη και την ογκογένεση των επιθηλιακών κυττάρων: Μια σύνδεση μεταξύ καρκίνου και γήρανσης. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ 2001, 98, 12072–12077. [CrossRef]

6. Wlaschek, Μ.; Maity, Ρ.; Μακραντωνάκη, Ε.; Scharffetter-Kochanek, K. Connective Tissue and Fibroblast Senescence in Skin Aging. J. Invest. Dermatol. 2021, 141, 985–992. [CrossRef]

7. Paez-Ribes, Μ.; González-Gualda, Ε.; Doherty, GJ; Muñoz-Espín, D. Targeting Senescent Cells in Translational Medicine. ΕΜΒΟ ΜοΙ. Med. 2019, 11, e10234. [CrossRef]

8. Soto-Gamez, Α.; Demaria, M. Therapeutic Interventions for Aging: The Case of Cellular Senescence. Drug Discov. Σήμερα 2017, 22, 786–795. [CrossRef]

9. Latorre, Ε.; Biar, VC; Sheerin, AN; Jeynes, JCC; Hooper, Α.; Dawe, HR; Melzer, D.; Cox, LS; Faragher, RGA; Ostler, EL; et al. Η Διαμόρφωση Μικρού Μορίου της Έκφρασης Παράγοντα Συνδέσεως σχετίζεται με τη Διάσωση από την Κυτταρική Γήρανση. BMC Cell Biol. 2017, 18, 31. [CrossRef]

10. Munir, R.; Semmar, Ν.; Farman, Μ.; Ahmad, NS Μια ενημερωμένη ανασκόπηση σχετικά με τις φαρμακολογικές δραστηριότητες και τα φυτοχημικά συστατικά του νυχτολούλουδου (γένος Oenothera). Asian Pac. J. Trop. Biomed. 2017, 7, 1046–1054. [CrossRef]

11. Timoszuk, Μ.; Bielawska, Κ.; Skrzydlewska, E. Evening Primrose (Oenothera biennis) Βιολογική δραστηριότητα που εξαρτάται από τη χημική σύνθεση. Αντιοξειδωτικά 2018, 7, 108. [CrossRef]

12. Lee, SY; Kim, CH; Hwang, BS; Choi, Κ.-Μ.; Yang, I.-J.; Kim, G.-Y.; Choi, YH; Park, C.; Jeong, J.-W. Προστατευτικές επιδράσεις του Oenothera Biennis έναντι του οξειδωτικού στρες που προκαλείται από το υπεροξείδιο του υδρογόνου και του κυτταρικού θανάτου στα κερατινοκύτταρα του δέρματος. Life 2020, 10, 255. [CrossRef]

13. Granica, S.; Czerwi 'nska, ME; Piwowarski, JP; Ziaja, Μ.; Kiss, AK χημική σύνθεση, αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδης δράση εκχυλισμάτων που παρασκευάστηκαν από εναέρια μέρη των Oenothera Biennis L. και Oenothera Paradoxa Hudziok που ελήφθησαν μετά την καλλιέργεια σπόρων. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 801–810. [CrossRef]

14. Fecker, R.; Buda, V.; Alexa, Ε.; Avram, S.; Pavel, IZ; Muntean, D.; Cocan, Ι.; Watz, C.; Minda, D.; Dehelean, CA; et al. Φυτοχημικός και Βιολογικός Έλεγχος Oenothera Biennis L. Υδροαλκοολικό Εκχύλισμα. Biomolecules 2020, 10, 818. [CrossRef]

15. Schäfer, L.; Kragballe, K. Συμπλήρωμα με έλαιο νυχτολούλουδου στην ατοπική δερματίτιδα: Επίδραση στα λιπαρά οξέα στα ουδετερόφιλα και την επιδερμίδα. Lipids 1991, 26, 557-560. [CrossRef]

16. Barbulova, Α.; Apone, F.; Colucci, G. Καλλιέργειες φυτικών κυττάρων ως πηγή καλλυντικών ενεργών συστατικών. Cosmetics 2014, 1, 94–104. [CrossRef]

17. Caesar, LK; Cech, NB Synergy and Antagonism in Natural Product Extracts: Όταν 1 συν 1 δεν ισούται με 2. Nat. Κέντρο. Rep. 2019, 36, 869–888. [CrossRef]

18. Ceccacci, S.; De Lucia, Α.; Tito, Α.; Tortora, Α.; Falanga, D.; Arciello, S.; Ausanio, G.; Di Cicco, C.; Monti, MC; Apone, F. Ένα εκχύλισμα κυτταρικών καλλιεργειών Oenothera Biennis προικισμένο με αντιγηραντική δράση του δέρματος βελτιώνει τις μηχανικές ιδιότητες των κυττάρων. Metabolites 2021, 11, 527. [CrossRef]

19. Farwick, Μ.; Köhler, Τ.; Schild, J.; Mentel, Μ.; Maczkiewitz, U.; Pagani, V.; Bonfigli, Α.; Rigano, L.; Bureik, D.; Τα Gauglitz, GG Pentacyclic Triterpenes από την Terminalia Arjuna παρουσιάζουν πολλαπλά οφέλη σε ηλικιωμένο και ξηρό δέρμα. Skin Pharmacol. Physiol. 2014, 27, 71–81. [CrossRef]

20. Bonte, F.; Dumas, Μ.; Chaudagne, C.; Meybeck, A. Influence of Asiatic Acid, Madecassic Acid, and Asiaticoside on Human Collagen I Synthesis. Planta Med. 1994, 60, 133-135. [CrossRef]

21. Chowdhary, S. The Effects of Oxidative Stress on Inducing Senescence in Human Fibroblasts. J. South Carol. Ακαδ. Sci. 2018, 16, 2.

22. Wang, Ζ.; Wei, D.; Xiao, H. Methods of Cellular Senescence Induction Using Oxidative Stress. Μέθοδοι ΜοΙ. Biol. 2013, 1048, 135–144. [PubMed]

23. Hildebrand, ΓΔ; Lehle, S.; Borst, Α.; Haferkamp, ​​S.; Essmann, F.; Schulze-Osthoff, K. -Φουκοζιδάση ως νέος βολικός βιοδείκτης για την κυτταρική γήρανση. Cell Cycle 2013, 12, 1922–1927. [CrossRef] [PubMed]

24. Lee, BY; Han, JA; Im, JS; Morrone, Α.; Johung, Κ.; Goodwin, EC; Kleijer, WJ; DiMaio, D.; Hwang, ES Senescence-Associated Beta-Galactosidase Is Lysosomal Beta-Galactosidase. Aging Cell 2006, 5, 187-195. [CrossRef] [PubMed]

25. Γοργούλης, Β.; Adams, PD; Αλιμόντη, Α.; Bennett, DC; Bischof, Ο.; Bishop, C.; Campisi, J.; Collado, Μ.; Ευαγγέλου, Κ.; Ferbeyre, G.; et al. Cellular Seescence: Καθορισμός μιας διαδρομής προς τα εμπρός. Cell 2019, 179, 813–827. [CrossRef]

26. Matsuoka, S.; Ballif, BA; Smogorzewska, Α.; McDonald, ER; Hurov, KE; Luo, J.; Bakalarski, CE; Zhao, Ζ.; Solimini, Ν.; Lerenthal, Υ.; et al. Η ανάλυση υποστρώματος ATM και ATR αποκαλύπτει εκτεταμένα πρωτεϊνικά δίκτυα που ανταποκρίνονται σε βλάβη στο DNA. Science 2007, 316, 1160–1166. [CrossRef]

27. Zhang, R.; Chen, W.; Adams, PD Molecular Dissection of Formation of Senescence-Associated Heterochromatin Foci. ΜοΙ. Cell Biol. 2007, 27, 2343–2358. [CrossRef]

28. LaBaer, ​​J.; Garrett, MD; Stevenson, LF; Slingerland, JM; Sandhu, C.; Chou, HS; Fattaey, Α.; Harlow, E. Νέες λειτουργικές δραστηριότητες για την οικογένεια αναστολέων CDK P21. Genes Dev. 1997, 11, 847-862. [CrossRef]

29. Scholzen, Τ.; Gerdes, J. The Ki-67 Protein: From the Known and the Unknown. J. Cell Physiol. 2000, 182, 311–322. [CrossRef]

30. Passos, JF; von Zglinicki, T. Methods for Cell Sorting of Young and Senescent Cells. Μέθοδοι ΜοΙ. Biol. 2007, 371, 33–44.

31. Dai, Υ.; Tang, Η.; Pang, S. Οι κρίσιμοι ρόλοι των φωσφολιπιδίων στη ρύθμιση της γήρανσης και της διάρκειας ζωής. Εμπρός. Physiol. 2021, 12, 1998. [CrossRef]

32. Dashty, M. Hedgehog Signaling Pathway συνδέεται με ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία. J. Diabetes Metab. 2014, 5, 2. [CrossRef]

33. Wang, D.; Lu, Ρ.; Liu, Υ.; Chen, L.; Zhang, R.; Sui, W.; Dumitru, AG; Chen, Χ.; Wen, F.; Ouyang, H.-W.; et al. Απομόνωση ζωντανών πρόωρων γηρασμένων κυττάρων με χρήση τεχνολογίας FUCCI. Sci. Rep. 2016, 6, 30705. [CrossRef]

34. Qian, J.; Beullens, Μ.; Huang, J.; De Munter, S.; Lesage, Β.; Bollen, M. Cdk1 Παραγγέλνει μιτωτικά συμβάντα μέσω συντονισμού ενός διακόπτη φωσφατάσης που σχετίζεται με το χρωμόσωμα. Nat. Commun. 2015, 6, 10215. [CrossRef]

35. Kong, Μ.; Cutts, EE; Pan, D.; Beuron, F.; Kaliyappan, Τ.; Xue, C.; Morris, ΕΡ; Musacchio, Α.; Vannini, Α.; Οι Greene, EC Human Condensin I και II οδηγούν την εκτεταμένη εξαρτώμενη από ATP συμπίεση του δεσμευμένου σε νουκλεόσωμα DNA. ΜοΙ. Cell 2020, 79, 99–114.e9. [CrossRef]

36. Kops, GJPL; Gassmann, R. Crowning the Kinetochore: The Fibrous Corona in Chromosome Segregation. Trends Cell Biol. 2020, 30, 653–667. [CrossRef]

37. Ma, ΗΤ; Το Poon, RYC TRIP13 Λειτουργεί κατά τη δημιουργία του σημείου ελέγχου συναρμολόγησης άξονα με την αναπλήρωση του O-MAD2. Cell Rep. 2018, 22, 1439–1450. [CrossRef]

38. Kuipers, MA; Stasevich, TJ; Sasaki, Τ.; Wilson, ΚΑ; Hazelwood, KL; McNally, JG; Davidson, MW; Gilbert, DM Εξαιρετικά σταθερή φόρτωση πρωτεϊνών Mcm στη χρωματίνη σε ζωντανά κύτταρα Απαιτείται αναπαραγωγή για να ξεφορτωθεί. J. Cell ΒίοΙ. 2011, 192, 29–41. [CrossRef]

39. Meng, Q.; Gao, J.; Zhu, Η.; He, H.; Lu, Ζ.; Hong, Μ.; Zhou, H. The Proteomic Study of Serially Passaged Human Skin Fibroblast Cells Uncovers Down-Regulation of the Chromosome Condensin Complex Proteins Involved in Replicative Seescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2018, 505, 1112–1120. [CrossRef]

40. Larochelle, S.; Pandur, J.; Fisher, RP; Salz, HK; Suter, B. Το Cdk7 είναι απαραίτητο για τη μίτωση και για τη δραστηριότητα κινάσης που ενεργοποιεί την Cdk in Vivo. Genes Dev. 1998, 12, 370-381. [CrossRef]

41. Leone, Μ.; Cazorla-Vázquez, S.; Ferrazzi, F.; Wiederstein, JL; Gründl, Μ.; Weinstock, G.; Vergarajauregui, S.; Eckstein, Μ.; Krüger, Μ.; Gaubatz, S.; et al. Το IQGAP3, ένας στόχος YAP, απαιτείται για τη σωστή πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και τη σταθερότητα του γονιδιώματος. ΜοΙ. Cancer Res. 2021, 19, 1712–1726. [CrossRef] [PubMed]

42. Nandi, AK; Ford, Τ.; Fleksher, D.; Neuman, Β.; Rapoport, AP Attenuation of DNA Damage Checkpoint by PBK, μια νέα μιτωτική κινάση, περιλαμβάνει αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης με τον καταστολέα όγκου P53. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007, 358, 181–188. [CrossRef] [PubMed]

43. Good, L.; Dimri, GP; Campisi, J.; Chen, KY Ρύθμιση γονιδιακής έκφρασης αναγωγάσης διυδροφολικής και συστατικών E2F σε ανθρώπινους διπλοειδείς ινοβλάστες κατά την ανάπτυξη και τη γήρανση. J. Cell Physiol. 1996, 168, 580–588. [CrossRef]

44. Demichev, V.; Messner, CB; Vernardis, SI; Lilley, KS; Ralser, M. DIA-NN: Τα νευρωνικά δίκτυα και η διόρθωση παρεμβολών Ενεργοποιούν την κάλυψη βαθιάς πρωτεώματος σε υψηλή απόδοση. Nat. Μέθοδοι 2020, 17, 41–44. [CrossRef]

45. Tyanova, S.; Temu, Τ.; Sinitcyn, Ρ.; Carlson, Α.; Hein, MY; Geiger, Τ.; Mann, Μ.; Cox, J. The Perseus Computational Platform for Comprehensive Analysis of (Prote)Omics Data. Nat. Methods 2016, 13, 731–740. [CrossRef]

46. ​​Benjamini, Υ.; Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. JR Stat. Soc. Ser. B (Methodol.) 1995, 57, 289–300. [CrossRef]

47. Perez-Riverol, Υ.; Bai, J.; Bandla, C.; García-Seisdedos, D.; Hewapathirana, S.; Kamatchinathan, S.; Kundu, DJ; Prakash, Α.; Frericks-Zipper, Α.; Eisenacher, Μ.; et al. Οι πόροι της βάσης δεδομένων PRIDE το 2022: Ένας κόμβος για αποδεικτικά πρωτεομικής βασισμένης σε φασματομετρία μάζας. Nucleic Acids Res. 2021, 50, D543–D552. [CrossRef]

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】