Παρασκευή ενός συμπλέγματος φερουλικού οξέος-φωσφολιπιδίου για τη βελτίωση της διαλυτότητας, της διάλυσης και της δραστηριότητας αναστολής της κυτταρικής μελανογένεσης B16F10

Αφηρημένη

Ιστορικό

Φερουλικό οξύ(FA; 4-υδροξυ-3-μεθοξυ κινναμωμικό οξύ) υπάρχει σε πολλά τρόφιμα, όπως το σιτάρι, το ρύζι, το κριθάρι, η βρώμη, τα εσπεριδοειδή και οι ντομάτες [1]. Το FA έχει αποδειχθεί ότι παρέχει σημαντική προστασία του δέρματος από το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία [2]. Επαναφέρει τη χρόνια οξειδωτική βλάβη που προκαλείται από την UVB σε όγκους δέρματος ποντικών ρυθμίζοντας την έκφραση του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), της επαγώγιμης συνθάσης του μονοξειδίου του αζώτου (iNOS), του παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF)- και της ιντερλευκίνης (IL){{7} } [3]. Ρυθμίζει επίσης την έκφραση του μεταλλαγμένου p53, Bcl-2 και Bax σε όγκους δέρματος ποντικών που προκαλούνται από την UVB [4]. Αρκετές μελέτες έχουν αποδείξει ότι η FA αναστέλλει την έκφραση των κυτταροτοξικών και σχετιζόμενων με τη φλεγμονή ενζύμων [5] και των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs) και εξασθενεί την αποικοδόμηση των ινών κολλαγόνου [6].

Σύμφωνα με σχετικές μελέτες,κιστανάκιείναι ένα κοινό βότανο που είναι γνωστό ως «το θαυματουργό βότανο που παρατείνει τη ζωή». Το κύριο συστατικό του είναισιστανοζίτη, το οποίο έχει διάφορα αποτελέσματα όπως αντιοξειδωτικά, αντιφλεγμονώδη και προαγωγή της ανοσοποιητικής λειτουργίας. Ο μηχανισμός μεταξύκιστανάκικαιλεύκανση δέρματοςέγκειται στην αντιοξειδωτική δράση των γλυκοσιδών της κιστάνχης. Η μελανίνη στο ανθρώπινο δέρμα παράγεται από την οξείδωση της τυροσίνης που καταλύεται από την τυροσινάση και η αντίδραση οξείδωσης απαιτεί τη συμμετοχή οξυγόνου, έτσι οι ρίζες ελεύθερες από οξυγόνο στο σώμα γίνονται ένας σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει την παραγωγή μελανίνης.Cistancheπεριέχει σιστανοσίδη, η οποία είναι ένα αντιοξειδωτικό και μπορεί να μειώσει τη δημιουργία ελεύθερων ριζών στο σώμα, αναστέλλοντας έτσι την παραγωγή μελανίνης.

Επιπλέον, το cistanche έχει επίσης τη λειτουργία της προώθησης της παραγωγής κολλαγόνου, το οποίο μπορεί να αυξήσει την ελαστικότητα και τη λάμψη του δέρματος και να βοηθήσει στην αποκατάσταση των κατεστραμμένων κυττάρων του δέρματος. Οι γλυκοζίτες φαινυλαιθανόλης Cistanche έχουν σημαντική ρυθμιστική επίδραση στη δραστηριότητα της τυροσινάσης και η επίδραση στην τυροσινάση αποδεικνύεται ότι είναι ανταγωνιστική και αναστρέψιμη αναστολή, η οποία μπορεί να προσφέρει μια επιστημονική βάση για την ανάπτυξη και τη χρήση των λευκαντικών συστατικών στο Cistanche. Ως εκ τούτου, το κιστανάκι έχει βασικό ρόλο στη λεύκανση του δέρματος. Μπορεί να αναστείλει την παραγωγή μελανίνης για να μειώσει τον αποχρωματισμό και τη θαμπάδα. και προωθεί την παραγωγή κολλαγόνου για τη βελτίωση της ελαστικότητας και της λάμψης του δέρματος. Λόγω της ευρείας αναγνώρισης αυτών των επιδράσεων του cistanche, πολλά προϊόντα λεύκανσης δέρματος έχουν αρχίσει να εγχύουν φυτικά συστατικά όπως το Cistanche για να καλύψουν τη ζήτηση των καταναλωτών, αυξάνοντας έτσι την εμπορική αξία του Cistanche στοπροϊόντα λεύκανσης δέρματος. Συνοπτικά, ο ρόλος του cistanche στολεύκανση δέρματοςείναι κρίσιμο. Η αντιοξειδωτική του δράση και η επίδραση που παράγει κολλαγόνο μπορεί να μειώσει τον αποχρωματισμό και τη θαμπάδα, να βελτιώσει την ελαστικότητα και τη λάμψη του δέρματος και έτσι να επιτύχει λεύκανση. Επίσης, η ευρεία εφαρμογή του Cistanche σε προϊόντα λεύκανσης δέρματος αποδεικνύει ότι ο ρόλος του στην εμπορική αξία δεν μπορεί να υποτιμηθεί.

Κάντε κλικ στο Cistanche για λεύκανση

Ζήτα περισσότερα:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Τα σύμπλοκα φωσφολιπιδίων χρησιμοποιούνται ευρέως στη φαρμακευτική βιομηχανία. Έχουν καλή διαπερατότητα και ασφάλεια και τυγχάνουν αυξανόμενης προσοχής για εφαρμογή στα καλλυντικά. Επειδή τα φωσφολιπίδια είναι βιολειτουργικά τασιενεργά με καλές διαλυτοποιητικές ιδιότητες, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως συστήματα φορείς για λιγότερο διαλυτά φάρμακα [7], βελτιώνοντας τη διαδερμική διείσδυση και τον αθροιστικό ρυθμό διείσδυσης των τοπικών φαρμάκων [8]. Η διαδερμική διείσδυση των φαρμάκων περιλαμβάνει διάλυση, διανομή και διάχυση στο δέρμα. Οι φυσικές και χημικές ιδιότητες, ειδικά ο συντελεστής κατανομής ελαίου-νερού του φαρμάκου που πρόκειται να χορηγηθεί, επηρεάζουν αυτή τη διαδικασία [9].

Μέθοδοι

Υλικά

Κυτταρικής καλλιέργειας

Παρασκευή FA–PC με εξάτμιση διαλύτη

Έλεγχος για τη βέλτιστη αναλογία φερουλικού οξέος και φωσφολιπιδίων

FA και φωσφολιπίδια σε μοριακές αναλογίες 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 και 1:4 προστέθηκαν σε φιάλες με στρογγυλό πυθμένα 100 mL και διαλύθηκαν σε άνυδρη αιθανόλη (FA, 2,0 mg/mL). Τα μίγματα αναδεύτηκαν συνεχώς στους 40 βαθμούς για 1 ώρα, και στη συνέχεια η άνυδρη αιθανόλη απομακρύνθηκε με περιστροφική εξάτμιση. Τα αποξηραμένα σύμπλοκα FA-PC τοποθετήθηκαν σε ξηραντήρα για 24 ώρες.

Έλεγχος για βέλτιστη θερμοκρασία αντίδρασης για προετοιμασία FA–PC

Έλεγχος για βέλτιστο χρόνο αντίδρασης για προετοιμασία FA–PC

Έλεγχος για βέλτιστη συγκέντρωση FA

Χαρακτηρισμός FA–PC

Διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (DSC)

Διαλυτότητα και συντελεστής κατανομής λαδιού-νερού

Διαλυτότητα

Οι διαλυτότητες του κονιοποιημένου FA και FA–PC προσδιορίστηκαν προσθέτοντας περίσσεια δειγμάτων σε 10.0 mL [10] νερού ή n-οκτανόλης και στη συνέχεια ανακινώντας σε μια περιστρεφόμενη κλίνη για 3 ώρες. στους 37 βαθμούς. Τα μίγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 15,000 rpm για 10 λεπτά για να απομακρυνθεί το αδιάλυτο FA. Στη συνέχεια, τα υπερκείμενα διηθήθηκαν μέσω μεμβρανών 0,45 μm. Στη συνέχεια, τα διηθήματα αραιώθηκαν δεκαπλάσια με μεθανόλη και η περιεκτικότητα σε FA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο UV (UV-3150· Shimadzu· Ιαπωνία).

Παρασκευάστηκαν δείγματα (10 mL) FA και FA-PC σε κορεσμένη με νερό n-οκτανόλη και ανακινήθηκαν. Σε κάθε δείγμα προστέθηκε νερό κορεσμένο με n-οκτανόλη (10 mL) και το αναμίξιμο υγρό αναδεύτηκε για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα δείγματα αφέθηκαν να παραμείνουν για στρώση. Η συγκέντρωση FA σε κάθε φάση προσδιορίστηκε με φασματοφωτομετρία UV (UV-3150· Shimadzu· Ιαπωνία). Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Διάχυση in vitro

Πραγματοποιήθηκαν in vitro μελέτες διάχυσης χρησιμοποιώντας κύτταρα διάχυσης Franz (TK-20A; Shanghai Xie Kai Financial Information Service Co., Ltd.; Κίνα). Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε μεμβράνες Strat-M®, οι οποίες είναι συνθετικές μεμβράνες με χαρακτηριστικά διάχυσης που σχετίζονται πιο στενά με το ανθρώπινο δέρμα από τα μοντέλα δέρματος ζώων [11]. Οι μεμβράνες σφίχτηκαν μεταξύ των θαλάμων δότη και δέκτη των κυττάρων κατακόρυφης διάχυσης και οι θάλαμοι δέκτη γεμίστηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS, pH 7,4) για να διαλυτοποιηθεί η FA ή η FA-PC και να διασφαλιστούν οι συνθήκες βύθισης.

Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα σύστημα σειράς Agilent 1260LC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) εξοπλισμένο με ηλεκτρονικό απαερωτή κενού, τεταρτοταγή αντλία, αυτόματο δειγματολήπτη, διαμέρισμα στήλης με θερμοστάτη και ανίχνευση διάταξης διόδων (DAD ). Χρησιμοποιήθηκε λογισμικό Agilent Technologies ChemStation για υγρή χρωματογραφία (LC; B.02.01) και ο διαχωρισμός HPLC πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας στήλη Eclipse plus-C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm). Το μήκος κύματος ανίχνευσης ήταν 0,05 τοις εκατό οξικό οξύ (Α) και μεθανόλη (Β) (40:60, ο/ο). Ο ρυθμός ροής ήταν 1,0 mL/min. Η θερμοκρασία της στήλης ρυθμίστηκε στους 30 βαθμούς. Έγιναν σωρευτικές διορθώσεις για να εξακριβωθεί η ποσότητα FA που απελευθερώνεται σε κάθε χρονικό διάστημα. Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και το ποσοστό της σωρευτικής FA που διείσδυσε μέσω της μεμβράνης (ποσοστό Q) σχεδιάστηκε ως συνάρτηση του χρόνου.

Αναστολή της μελανογένεσης

Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων B16F10

Η κυτταρική βιωσιμότητα και ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα βρωμιούχο {{0}}(4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2,5-διφαινυλτετραζόλιο (MTT) δοκιμασία [2]. Τα κύτταρα B16F10 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 και 4.0 mg/mL συγκεντρώσεις FA και FA–PC. Μετά από επώαση για 48 ώρες, προστέθηκε διάλυμα ΜΤΤ (τελική συγκέντρωση: 5 mg/mL) και τα κύτταρα επωάστηκαν για 3 ώρες στους 37 βαθμούς. Τέλος, η απορρόφηση κάθε δείγματος μετρήθηκε σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας στα 570 nm για να ληφθεί το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων.

Μέτρηση περιεκτικότητας σε μελανίνη

Η περιεκτικότητα σε μελανίνη μετρήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6] με ορισμένες τροποποιήσεις. Κύτταρα μελανώματος B16F10 σπάρθηκαν (2 χ 105 κύτταρα/φρεάτιο σε 3 mL μέσου) σε πλάκες καλλιέργειας έξι φρεατίων και επωάστηκαν όλη τη νύχτα για να επιτραπεί στα κύτταρα να προσκολληθούν. Στο τέλος της θεραπείας, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν με 1 Μ NaOH που περιέχει 10 τοις εκατό διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) για 30 λεπτά στους 80 βαθμούς. Η απορρόφηση (οπτική πυκνότητα, OD) μετρήθηκε στα 475 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Η περιεκτικότητα σε μελανίνη υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:

Ανάλυση δεδομένων

Η στατιστική σημασία των διαφορών μεταξύ των μέσων μετρήσεων κάθε ομάδας που υποβλήθηκε σε αγωγή και εκείνης της ομάδας ελέγχου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το τεστ t Dunnett. Τιμές P<0.05 were considered statistically significant.

Αποτελέσματα και συζήτηση

Βέλτιστη προετοιμασία FA–PC

Διαλυτότητα και συντελεστής κατανομής ελαίου-νερού FA-PC

Ο Πίνακας 1 δείχνει τη διαλυτότητα των FA, PM και FA–PC στο νερό και σε n-οκτανόλη. Το FA-PC παρουσίασε καλή διαλυτότητα σε νερό και n-οκτανόλη (1,68 και 7,77 mg/mL, αντίστοιχα) και η διαλυτότητα του FA-PC σε n-οκτανόλη βρέθηκε να είναι σημαντικά υψηλότερη από αυτή του FA (1,34 mg/mL) .

Η λιποφιλικότητα συνήθως μετράται ως συντελεστής κατανομής (P) μεταξύ δύο μη αναμίξιμων φάσεων. Συνήθως εκφράζεται ως log P. Προσδιορίστηκαν οι φαινομενικοί συντελεστές κατανομής FA και FA-PC στο σύστημα n-οκτανόλης/νερού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το log P ήταν υψηλότερο για FA–PC (1,21) από ότι για FA (0,99) όταν μετρήθηκε σε pH 5.0. Η ελαφρώς αυξημένη log P σχετιζόταν με τη σημαντικά βελτιωμένη διαλυτότητα n-οκτανόλης του FA–PC σε σύγκριση με αυτή του FA. Η αυξημένη διαλυτότητα του FA-PC σε n-οκτανόλη μπορεί να εξηγηθεί από τα άμορφα χαρακτηριστικά του FA-PC. Καθώς η λιποφιλικότητα και η διαπερατότητα συσχετίζονται καλά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η διαδερμική διαπερατότητα της FA μπορεί να βελτιωθεί με την εφαρμογή της ως φωσφολιπιδικού συμπλέγματος.

DSC 

Το DSC είναι μια αξιόπιστη μέθοδος για τον έλεγχο της συμβατότητας φαρμάκου-έκδοχου και παρέχει μέγιστες πληροφορίες σχετικά με πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των φαρμάκων και των εκδόχων [10]. Η παρουσία αλληλεπίδρασης μπορεί να συναχθεί από την εξάλειψη των ενδόθερμων κορυφών, την εμφάνιση νέων κορυφών, τις αλλαγές στο σχήμα και την έναρξη των κορυφών, τη θερμοκρασία αιχμής/σημείο τήξης και τη σχετική περιοχή ή ενθαλπία. Το σχήμα 1 δείχνει τα θερμογράμματα DSC των FA (Εικ. 1a), PC (Εικ. 1β), PM (Εικ. 1c) και FA–PC (Εικ. 1δ). Η θερμική καμπύλη για την καθαρή FA έχει μια τυπική απότομη ενδόθερμη τήξη στους περίπου 172,7 βαθμούς, ενδεικτική της άνυδρης και κρυσταλλικής κατάστασής της, ενώ αυτή των φωσφολιπιδίων εμφανίζει μια μικρή ενδόθερμη κορυφή στους 231,7-248,6 βαθμούς. Η καμπύλη DSC για PM, που αποτελείται από τα υπερτιθέμενα θερμικά προφίλ για FA και φωσφολιπίδια, δεν δείχνει σημαντικήαλλάζει εκτός από μια μικρή μετατόπιση σε υψηλότερη θερμοκρασία (175,9 βαθμοί ), υποδηλώνοντας ότι δεν υπάρχουν αλληλεπιδράσεις μεταξύ των εξαρτημάτων. Το FA–PC έχει μια σημαντική κορυφή στους 158,2 βαθμούς, η οποίαδιαφέρει από την κορυφή FA, υποδεικνύοντας μια αλληλεπίδραση μεταξύ FA και PC. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι διαφορετικοί βαθμοί αλληλεπίδρασης ή/και αμορφοποίησης σε διαφορετικάμίγματα ή σύμπλοκα μπορούν να ληφθούν ανάλογα με τη μέθοδο παρασκευής τους και αυτό σχετίζεται με τις διαφορές στη διαλυτότητα.

FTIR

Η φασματοσκοπία FTIR μπορεί να επιβεβαιώσει τον σχηματισμό FA–PC συγκρίνοντας το φάσμα FA–PC με αυτό της καθαρής FA. Το σχήμα 2 δείχνει τα φάσματα FTIR των FA, PC, PM και FA–PC. Το φάσμα FA (Εικ. 2α) δείχνει μια χαρακτηριστική ζώνη τάνυσης υδροξυλίου στα 3436 cm−1. Όλα γίνονται μια ευρεία μονή στα φάσματα FA–PC, PM και φωσφολιπίδιο (Εικ. 2b–d). Το φάσμα FA (Εικ. 2α) παρουσιάζει χαρακτηριστικές κορυφές στα 1620 cm−1 (C=C τέντωμα) και 1450 cm−1 (C=C τέντωμα αρωματικού δακτυλίου). Στο φάσμα FA–PC (Εικ. 2β), αυτές οι δύο κορυφές δεν είναι ορατές, πιθανώς λόγω αποδυνάμωσης ή αφαίρεσης ή θωράκισης από το μόριο φωσφολιπιδίου.

Το φάσμα FA (Εικ. 2α) παρουσιάζει χαρακτηριστικές κορυφές ακόρεστου καρβοξυλίου στα 1691 cm−1 (διάταση C=O) και 1664 cm−1 (διάταση C=C). Στο φάσμα FA–PC (Εικ. 2β), αυτές οι δύο κορυφές δεν είναι ορατές, πιθανώς λόγω των ελκτικών δυνάμεων μεταξύ του αρνητικού φορτίου καρβοξυλίου στο FA και του θετικού φορτίου αζώτου στα φωσφολιπίδια. Το φάσμα των φωσφολιπιδίων (Εικ. 2δ) έχει κορυφωθεί στα 1733 cm−1 (C=O τέντωμα), 1238 cm−1 (P=O τέντωμα) και 1087 cm−1 (P–O –Γ τέντωμα). ο

SEM

Οι επιφανειακές μορφολογίες των FA, PC, PM και FA-PC διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας SEM (Εικ. 3). Στο Σχ. 3γ, το FA εμφανίζεται κρυσταλλικό, σχεδόν ορθογώνιο, ενώ τα σωματίδια FA-PC (Εικ. 3α) φαίνονται ακανόνιστο σχήμα με λεία επιφάνεια. Το FA–PC έχει σημαντικά διαφορετικό σχήμα και τοπογραφία επιφάνειας σε σύγκριση με αυτό των FA και PC (Εικ. 3β). Αυτό πιθανότατα οφείλεται στην πλήρη αναμίξιμη του FA στον υπολογιστή. Στη σάρωση PM (Εικ. 3δ), τόσο η FA όσο και τα φωσφολιπίδια διακρίνονται εύκολα.

Μελέτες διάχυσης in vitro

Πρόσφατα, η συνθετική μεμβράνη Strat-M® εισήχθη ως υποκατάστατο για μελέτες διάχυσης στο ανθρώπινο δέρμα in vitro [11]. Η μεμβράνη Strat-M® αποτελείται από δύο στρώματα πολυαιθεροσουλφόνης που είναι ανθεκτικά στη διάχυση. Τα στρώματα πολυαιθεροσουλφόνης βρίσκονται πάνω από ένα στρώμα πολυολεφίνης, το οποίο είναι πιο ανοιχτό και διαχυτικό. Αυτή η συνθετική μεμβράνη χαρακτηρίζεται από χαμηλή μεταβλητότητα από παρτίδα σε παρτίδα, παρέχοντας έτσι πιο συνεπή δεδομένα. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι τα δεδομένα διάχυσης για τις μεμβράνες Strat-M® συσχετίζονται καλά με αυτά του ανθρώπινου δέρματος [11].

Για να αξιολογηθεί η επίδραση του PC στις ιδιότητες διάχυσης in vitro του FA, το ποσοστό Q του FA και του FA-PC σχεδιάστηκε σε γραφική παράσταση με το χρόνο. Τα αποτελέσματα στην παρούσα εργασία έδειξαν μια τάση ότι τα φωσφολιπίδια αύξησαν σημαντικά τη διείσδυση FA στη μεμβράνη Strat-M®. Επιπλέον, το FA-PC παρέμεινε περισσότερο στη μεμβράνη Strat-M® από ότι το FA (Εικ. 4). Επομένως, η ενσωμάτωση φωσφολιπιδίων στο FA ίσως αυξάνει τον χρόνο παραμονής του στην κεράτινη στοιβάδα και το καθιστά πιο κατάλληλο για διείσδυση του δέρματος. Όσον αφορά τον χρόνο διείσδυσης, αν και η μεμβράνη Strat-M® έχει αναφερθεί ότι έχει καλή συσχέτιση με αυτές του ανθρώπινου δέρματος [11], έχει επίσης διαφορές στην υφή σε σύγκριση με το ανθρώπινο δέρμα. Οι παράγοντες επιρροής των χρόνων διείσδυσης μπορεί να περιλαμβάνουν διαλύτη, συγκέντρωση των ενώσεων, τιμή pH, et al. Θα πρέπει να γίνουν περισσότερα πειράματα σε μελλοντική ανάλυση.

Αναστολή της μελανογένεσης

Επίδραση του FA-PC στη σύνθεση μελανίνης

Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, η FA μπορεί να αναστείλει τη δραστηριότητα της κυτταρικής τυροσινάσης και τη μελανογένεση σε κύτταρα μελανώματος B16F10 μέσω της προς τα κάτω ρύθμισης των κυτταρικών πρωτεϊνών c-kit και ERK1/2 [12]. Στην παρούσα μελέτη, το FA-PC μείωσε την περιεκτικότητα σε μελανίνη στα κύτταρα B16F1{{1{0}} πιο προφανώς από το FA σε δοκιμασμένες συγκεντρώσεις 0,25, 0,5 και 1,0 mg/mL (Πίνακας 2). Έτσι, προσδιορίσαμε ότι το FA-PC είναι πιο αποτελεσματικό από το FA στην αναστολή της σύνθεσης μελανίνης στα κύτταρα B16F10.

συμπέρασμα

Συνεισφορές συγγραφέων

Η LL και η LY έχουν συνεισφέρει ουσιαστικά στη σύλληψη και το σχεδιασμό ή την απόκτηση δεδομένων ή την ανάλυση και ερμηνεία δεδομένων. Οι XY και WX συμμετείχαν στη σύνταξη του χειρογράφου ή στην κριτική αναθεώρησή του για σημαντικό πνευματικό περιεχόμενο. και οι ZJ και DY έχουν δώσει την τελική έγκριση της έκδοσης που θα δημοσιευτεί. Όλοι οι συγγραφείς διάβασαν και ενέκριναν το τελικό χειρόγραφο.

Ευχαριστίες

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ιδρύματα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (31501402).

Ανταγωνιστικά συμφέροντα

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν έχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Παραλαβή: 27 Δεκεμβρίου 2016 Αποδοχή: 14 Μαρτίου 2017

Δημοσιεύθηκε διαδικτυακά: 22 Μαρτίου 2017

βιβλιογραφικές αναφορές