Η φλορετίνη καταστέλλει τη νευροφλεγμονή με την ενεργοποίηση Nrf2 που προκαλείται από αυτοφαγία σε μακροφάγα

Επικοινωνία:tina.xiang@wecistanche.com

Αφηρημένη

Ιστορικό: Τα μακροφάγα παίζουν διπλό ρόλο σε νευροφλεγμονώδεις διαταραχές όπως η σκλήρυνση κατά πλάκας (ΣΚΠ). Συμμετέχουν στην έναρξη και την εξέλιξη της βλάβης, αλλά μπορούν επίσης να προάγουν την επίλυση τηςφλεγμονήκαι αποκατάσταση κατεστραμμένου ιστού. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνούμε εάν και πώςφλορετίνη, ένα φλαβονοειδές που υπάρχει σε αφθονία στα μήλα και τις φράουλες, μειώνει τον φλεγμονώδη φαινότυπο των μακροφάγων και καταστέλλεινευροφλεγμονή.

Μέθοδοι: Οι μεταγραφικές αλλαγές σε μακροφάγα που προέρχονται από μυελό των οστών ποντικού κατά την έκθεση σε φλορετίνη αξιολογήθηκαν με προσδιορισμό αλληλουχίας RNA όγκου. Οι υποκείμενες οδοί που σχετίζονται με τη φλεγμονή, την απόκριση στο οξειδωτικό στρες και την αυτοφαγία επικυρώθηκαν με ποσοτική PCR, φθορισμό και απορρόφηση, ποντίκια νοκ-άουτ σχετιζόμενα με τον πυρηνικό παράγοντα 2 (Nrf2), western blot και ανοσοφθορισμό. Το πειραματικό μοντέλο αυτοάνοσης εγκεφαλομυελίτιδας (ΕΑΕ) χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη της επίδρασης της φλορετίνης στη νευροφλεγμονή in vivo και για την επιβεβαίωση των υποκείμενων μηχανισμών.

Αποτελέσματα: Δείχνουμε ότι η φλορετίνη μειώνει τον φλεγμονώδη φαινότυπο των μακροφάγων και καταστέλλει σημαντικά τη νευροφλεγμονή στην ΕΑΕ. Η φλορετίνη μεσολαβεί στην επίδρασή της ενεργοποιώντας τη οδό σηματοδότησης Nr2. Η ενεργοποίηση Nrf2 αποδόθηκε στην εξαρτώμενη από 5'AMP ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση (AMPK) ενεργοποίηση της αυτοφαγίας και στην επακόλουθη αποικοδόμηση της πρωτεΐνης 1 (Keap1) που σχετίζεται με την ECH-όπως kelch.

Συμπεράσματα: Αυτή η μελέτη ανοίγει μελλοντικές προοπτικές για τη φλορετίνη ως θεραπευτική στρατηγική για νευροφλεγμονώδεις διαταραχές όπως η ΣΚΠ.

Δοκιμαστική εγγραφή: Δεν εφαρμόζεται.

Λέξεις-κλειδιά: Φλορετίνη, Μακροφάγα, Νευροφλεγμονή, Σκλήρυνση κατά Πλάκας, Αυτοάνοση

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερες πληροφορίες

Ιστορικό

Οι βλάβες της ενεργού πολλαπλής σκλήρυνσης (ΠΣ) χαρακτηρίζονται από την παρουσία πολυάριθμωνμακροφάγα[1-5]. Πρώιμες μελέτες έδειξαν ότι τα μακροφάγα υιοθετούν έναν προφλεγμονώδη φαινότυπο στις βλάβες της ΣΚΠ, προάγοντας έτσινευροφλεγμονή, απομυελίνωση και νευροεκφυλισμό. Οι δραστικές λειτουργίες που προάγουν τη νόσο περιλαμβάνουν την παρουσίαση αντιγόνων που προέρχονται από το κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) σε αυτοαντιδραστικά Τ κύτταρα και την παραγωγή φλεγμονωδών μεσολαβητών όπως οι προφλεγμονώδεις κυτοκίνες, τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και το μονοξείδιο του αζώτου (NO)[ 6,7]. Πιο πρόσφατα, βρέθηκε ότι τα μακροφάγα έχουν επίσης ευεργετικές λειτουργίες στις βλάβες της ΣΚΠ, καθώς μπορούν να αναδιαμορφώσουν τον φαινότυπο τους σε έναν που συνήθως σχετίζεται με την ανοσοκαταστολή και την επιδιόρθωση του ΚΝΣ. Αυτός ο προστατευτικός φαινότυπος χαρακτηρίζεται από μειωμένη παραγωγή προφλεγμονωδών μεσολαβητών, παραγωγή αντιφλεγμονωδών μεσολαβητών και αυξητικών παραγόντων και ενεργοποίηση αντιοξειδωτικών οδών όπως η οδός που σχετίζεται με τον πυρηνικό παράγοντα ερυθροειδούς 2-παράγοντα 2 (Nrf2) [8-14]. Δεδομένου ότι η φλεγμονώδης κατάσταση των μακροφάγων έχει συνδεθεί με την εξέλιξη της ΣΚΠ και την ανάπτυξη χρόνιων ενεργών βλαβών, η οδήγηση των μακροφάγων σε έναν ευεργετικό φαινότυπο θεωρείται μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για τον περιορισμό της εξέλιξης της ΣΚΠ [15].

Τα διατροφικά συστατικά οδηγούν τη λειτουργία των μακροφάγων και τη νευροφλεγμονή [16]. Συγκεκριμένα, η οικογένεια των φλαβονοειδών αναγνωρίζεται όλο και περισσότερο ότι περιέχει πολλά υποσχόμενες ενώσεις που επηρεάζουν τα παθογόνα μονοπάτια και ρυθμίζουν τον φαινότυπο των ανοσοκυττάρων όπως τα μακροφάγα[17,18]. Τα φλαβονοειδή αποτελούν μια από τις μεγαλύτερες οικογένειες φυτοθρεπτικών συστατικών που περιέχει περισσότερες από 8000 φαινολικές ενώσεις με ποικίλη βιοδραστικότητα. Αρκετά μέλη της οικογένειας των φλαβονοειδών εμφανίζουν αντιφλεγμονώδη και αντιοξειδωτική δράση στα μακροφάγα [19-21]. Το φλαβονοειδές φλορετίνη είναι μέλος των διυδροχαλκόνων και υπάρχει σε φρούτα που καταναλώνονται ευρέως όπως τα μήλα και οι φράουλες. Η φλορετίνη είναι γνωστό ότι ασκεί ανοσοτροποποιητικά χαρακτηριστικά και χρησιμοποιείται ευρέως για τη φροντίδα του δέρματος λόγω των αντιοξειδωτικών χαρακτηριστικών της [22-24]. Επιπλέον, η φλορετίνη είναι ένας αναστολέας του μεταφορέα γλυκόζης (GLUT), ένα χαρακτηριστικό που επηρεάζει τον φαινότυπο των μακροφάγων, καθώς η ενεργοποίηση των μακροφάγων τροφοδοτείται από την GLUT [25, 26]. Συνολικά, αυτά τα χαρακτηριστικά καθιστούν τη φλορετίνη μια πολλά υποσχόμενη ένωση για τη ρύθμιση του φαινοτύπου των μακροφάγων και της νευροφλεγμονής. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η φλορετίνη οδηγεί τα μακροφάγα προς έναν λιγότερο φλεγμονώδη φαινότυπο και ανακουφίζει τη νευροφλεγμονή στο πειραματικό μοντέλο αυτοάνοσης εγκεφαλομυελίτιδας (ΕΑΕ). Η αλληλουχία RNA και τα λειτουργικά πειράματα αναγνώρισαν το μονοπάτι Nrf2 ως κόμβο και οδηγό αυτού του προστατευτικού φαινοτύπου μακροφάγου που επάγεται από τη φλορετίνη. Η εξαρτώμενη από την AMPK ενεργοποίηση του μηχανήματος αυτοφαγίας και η επακόλουθη SQSTMl/p62-αποδόμηση (εφεξής p62) του Keapl, ενός προσαρμογέα που διευκολύνει την αποικοδόμηση του πρωτεασωμικού Nrf2, βρέθηκε να αποτελεί τη βάση της ενεργοποίησης του Nrf2 σε μακροφάγους. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η φλορετίνη έχει τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθεί σε θεραπευτικές στρατηγικές για νευροφλεγμονώδεις διαταραχές.

Μέθοδοι

Αντισώματα και χημικά αντιδραστήρια

Φλορετίνη(Sigma Aldrich) διαλύθηκε σε 50 mM ΚΟΗ σε μητρικό διάλυμα 15 mM και αποθηκεύτηκε σε-20 βαθμό . Περαιτέρω αραιώσεις έγιναν σε μέσο RPMI1640 (Gibco). Για in vivo επεξεργασία, η φλορετίνη διαλύθηκε σε 1 Ν ΝαΟΗ, και στη συνέχεια το ρΗ επαναρυθμίστηκε στο 7,2 με 1 Ν HCL, και το διάλυμα αραιώθηκε περαιτέρω σε φυσιολογικό νερό για να ληφθεί συγκέντρωση 50 mg/kg. BML-275(1 μΜ, Santa Cruz Biotechnology) προστέθηκε 1 ώρα πριν από την επεξεργασία με φλορετίνη για να αναστείλει την ενεργοποίηση της AMPK. Η βαφιλομυκίνη A1 (BAF, 0,1 μΜ, InvivoGen) προστέθηκε 2 ώρες πριν από τη συλλογή για να εμποδίσει τη σύντηξη αυτοφαγοσωμάτων και λυσοσωμάτων. Λιποπολυσακχαρίτης (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκε για τη διέγερση των κυττάρων για φλεγμονώδη φαινότυπο. Οξική 12-μυριστική 13-φορβόλη (PMA, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκε για την πρόκληση παραγωγής ROS. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για το western blot: αντι- -ακτίνη ποντικού (1:10,{000;sc{-47778, Santa Cruz Biotechnology), ποντίκι anti-GAPDH (1:{{29 }};AB_2537659, Invitrogen), αντι-AMPK κουνελιού (1:1000;5831S, τεχνολογία σηματοδότησης κυττάρων), αντιφωσφορυλιωμένο AMPK κουνελιού (1:1000; 2535S, Τεχνολογία σηματοδότησης κυττάρων), αντι-LC3 κουνελιού (1:1000; L7543, Sigma-Aldrich), rabbit anti-p62 (1:1000; 23214, Cell Signaling Technology). Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοφθορισμό: αντι-CD3 αρουραίου (1:150; MCA500G, Bio-Rad), αντι-F4/80 επίμυος (1:100; MCA497G, Bio-Rad), αντι-LC3 κουνελιού (1:1000 ;L7543, Sigma-Aldrich), rabbit anti-p62 (1:500;23214, Cell Signaling Technology), rabbit anti-Keap1(1:500;60027-1-Ig,Proteintech Europa), rabbit anti-TMEM119(1 :100, ab209064, Abcam). Τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα αγοράστηκαν από την Invitrogen.

Ποντίκια

Ποντίκια άγριου τύπου (WT) C57BL/6JOlaHsd αγοράστηκαν από την Envigo. Τα ζώα τρέφονταν με κανονική δίαιτα και στεγάζονταν στις εγκαταστάσεις ζώων του Ινστιτούτου Βιοϊατρικής Έρευνας του Πανεπιστημίου Hasselt. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες του ιδρύματος και εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας για πειράματα σε ζώα του Πανεπιστημίου Hasselt.

Κυτταρικής καλλιέργειας

Προερχόμενο από μυελό των οστώνμακροφάγα(BMDMs) απομονώθηκαν από ποντίκια WT και Nrf2 knockout (KO) C57BL/6JOlaHsd, που αγοράστηκαν από την Envigo και παρασχέθηκαν από το RIEN BRC σύμφωνα με ένα MTA στον καθηγητή S. Kerdine-Römer αντίστοιχα [27,28]. Τα BMDM ελήφθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Συνοπτικά κύτταρα κνημιαίου και μηριαίου μυελού των οστών από ποντίκια 12-εβδομάδων WT και Nrf2 KO C57BL/6JOlaHsd καλλιεργήθηκαν σε 10-cm τρυβλία Petri σε συγκέντρωση 10×106 κύτταρα/ πλάκα, σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό ορό εμβρύου μόσχου (FCS, Gibco), 50 U/ml πενικιλλίνη (Invitro-gen), 50 U/ml στρεπτομυκίνες (Invitrogen) και 15 τοις εκατό L929-ρυθμισμένο μέσο (LCM ). Μετά τη διαφοροποίηση, τα BMDMs αποκολλήθηκαν στους 37 βαθμούς με 10 mM EDTA σε PBS (Gibco) και καλλιεργήθηκαν (0,5 × 10 μοίρες κύτταρα/ml) σε RPM1640 συμπληρωμένα με 10 τοις εκατό FCS, 50 U/ml πενικιλλίνη, 50 U/ml στρεπτομυκίνη και 5 τοις εκατό LCM ( 37 βαθμοί C, 5 τοις εκατό CO2). Καλλιέργειες μικρογλοίας απομονώθηκαν από εγκεφάλους μεταγεννητικών P1-3 C57BL/6/OlaHsd νεογνών. Αφού αφαιρέθηκαν το εγκεφαλικό στέλεχος, το χοριοειδές πλέγμα και οι μήνιγγες, οι εγκέφαλοι διαχωρίστηκαν μηχανικά και υποβλήθηκαν σε ενζυμική πέψη για 15 λεπτά με 1× θρυψίνη (Gibco) στους 37 βαθμούς. Στη συνέχεια, το κυτταρικό εναιώρημα σπάρθηκε σε DMEM ένα μέσο υψηλής γλυκόζης (Sigma) συμπληρωμένο με 30 τοις εκατό LCM, 10 τοις εκατό FCS, 50 U/ml πενικιλλίνη και 50 U/ml στρεπτομυκίνη σε φιάλες καλλιέργειας Τ75. Δύο έως 3 ημέρες αργότερα, πραγματοποιήθηκε μια πλήρης αλλαγή του μέσου. Οι μικτές γλοιακές καλλιέργειες ανακινήθηκαν (230 rpm, 3h, 37 μοίρες) μετά από 6-7 ημέρες για να ληφθούν καθαρές καλλιέργειες μικρογλοίας.

Αλληλουχία RNA

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με φλορετίνη (50 μΜ) για 20 ώρες και διεγερμένα με LPS (100 ng/ml) για 6 ώρες. Η κυτταρική λύση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Qiazol Lysis (Qiagen). Το RNA εκχυλίστηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy mini (Qiagen). Στη συνέχεια, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία από το Genomics Core Leuven (Βέλγιο). Η προετοιμασία της βιβλιοθήκης πραγματοποιήθηκε με το κιτ QuantSeq της Lexogen για τη δημιουργία βιβλιοθηκών συμβατών με το Illumina. Η αλληλουχία των βιβλιοθηκών έγινε στο σύστημα αλληλουχίας Illumina HiSeq4000. Η ευθυγράμμιση με επίγνωση ματίσματος πραγματοποιήθηκε με το STAR v2.6.1b[30]. Η ποσοτικοποίηση των αναγνώσεων ανά γονίδιο πραγματοποιήθηκε με HT-seq Count v2.7.14. Η ανάλυση διαφορικής έκφρασης βάσει μετρήσεων έγινε με το πακέτο DESeq2 Bioconductor που βασίζεται στο R (The R Foundation for Statistical Computing, Βιέννη, Αυστρία). Ένας κατάλογος διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων επιλέχθηκε στο ap<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

Ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με φλορετίνη (50 μΜ) για 20 ώρες και διεγέρθηκαν με LPS (100 ng/ml) για 6 ώρες. Η λύση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντιδραστηρίου Qiazol Lysis (Qiagen). Το RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy mini kit (Qiagen). Η συγκέντρωση και η ποιότητα του RNA προσδιορίστηκαν με φασματοφωτόμετρο Nano-drop (Isogen Life Science). Η σύνθεση cDNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας το Quanta qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η qPCR πραγματοποιήθηκε σε ένα σύστημα PCR πραγματικού χρόνου StepOne-Plus (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας ένα πράσινο μείγμα SYBR που περιέχει 1× SYBR πράσινο (Applied Biosystems), 0,3 μM εκκινητές (Ολοκληρωμένες Τεχνολογίες DNA), 12,5 ng cDNA χωρίς πυρήνα Χρησιμοποιήθηκε η συγκριτική μέθοδος Ct για τον ποσοτικό προσδιορισμό της γονιδιακής έκφρασης Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν στα πιο σταθερά γονίδια αναφοράς κυκλίνη Α και φωσφοριβοσυλτρανσφεράση υποξανθίνης 1. Οι αλληλουχίες εκκινητών είναι διαθέσιμες κατόπιν αιτήματος.

Προσδιορισμός δραστικών ειδών οξυγόνου

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με φλορετίνη (50 μΜ) για 2 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με PMA (15 λεπτά, 100 ng/ml) και η παραγωγή ROS μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον φθορίζοντα ανιχνευτή 2',7'-διχλωροδιϋδροφθοροσκεΐνη διοξική στα 10 μΜ σε PBS για 30 λεπτά. Ο φθορισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη μικροπλακών φθορισμού FLUOstar optima (BMG Labtech, Ortenberg, Γερμανία) (διέγερση: 495 nm, εκπομπή: 529 nm).

Μετρήσεις μονοξειδίου του αζώτου

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με φλορετίνη (50 μΜ) για 2 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με LPS (24 ώρες, 100 ng/ml). Το ΝΟ παρακολουθήθηκε έμμεσα χρησιμοποιώντας το κιτ μέτρησης νιτρωδών αντιδραστηρίων Griess (Abcam). Εν συντομία, το νιτρικό αντιδρά με σουλφανιλαμίδιο και διυδροχλωρική Ν-(1-ναφθυλ)αιθυλενο-διαμίνη για να παράγει μια ροζ αζωχρωστική. Η απορρόφηση αυτού του αζωπαραγώγου στη συνέχεια μετρήθηκε στα 540 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (iMark, Bio-Rad).

Western blot

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φλορετίνη (5{{10}} μΜ) και LPS (100 ng/ml) για 1 ώρα ή 24 ώρες για να προσδιοριστεί η ενεργοποίηση της AMPK ή τα επίπεδα πρωτεΐνης p62, LC3 και Keapl αντίστοιχα. Τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (150 mM NaCl, 1 τοις εκατό Triton Χ-100, 0,5 τοις εκατό δεοξυχολικό νάτριο, 1 τοις εκατό SDS, 50 mM Tris) και διαχωρίστηκαν μέσω ηλεκτροφόρησης γέλης πολυακρυλαμιδίου δωδεκυλοθειικού νατρίου. Τα πηκτώματα μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη PVDF (VWR) και οι κηλίδες αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε 5 τοις εκατό αλβουμίνη βόειου ορού σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με Tris που περιείχε 0,1 τοις εκατό Tween-20 (TBS-T). Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 "C, πλύθηκαν με TBS-T και επωάστηκαν με το αντίστοιχο δευτερεύον επισημασμένο με υπεροξειδάση χρένου αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Ανοσοαντιδραστικά σήματα ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL Plus, Thermo Fisher) χρησιμοποιώντας το Amersham Imager 680 (GE Healthcare Life Sciences) Οι πυκνότητες των ζωνών προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το ImageJ.

Ανοσοφθορισμός

Οι κρυοτομές του νωτιαίου μυελού ξηράνθηκαν στον αέρα και σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένη ακετόνη για 10 λεπτά σε - 20 βαθμό . Τα BMDM ποντικών καλλιεργήθηκαν σε γυάλινες πλάκες καλύμματος και σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένη μεθανόλη για 10 λεπτά σε -20 βαθμό . Οι τομές και τα BMDM αποκλείστηκαν για 30 λεπτά χρησιμοποιώντας μπλοκ πρωτεΐνης Dako (Agi-lent). Στη συνέχεια, επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4"C με πρωτεύοντα αντισώματα, πλύθηκαν και επωάστηκαν με τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα για 1 ώρα σε RT. Οι εικόνες του ιστού του νωτιαίου μυελού λήφθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Nikon Eclipse 80i (10× αντικειμενικό) και NIS Λογισμικό Elements BR 3.10 (Nikon). Εικόνες BMDM που χρωματίστηκαν για p62, LC3 και Keapl λήφθηκαν χρησιμοποιώντας το συνεστιακό μικροσκόπιο Zeiss LSM 880 και διορθώθηκαν με Airyscan (63× αντικειμενικός). P{19}}και LC3- Τα θετικά σημεία προσδιορίστηκαν με ημι-αυτόματη ανάλυση puncta imageJ. Εν ολίγοις, αφού η εικόνα έγινε δυαδική και τα κύτταρα επιλέχθηκαν με το χέρι, τα σημεία σημεία αναλύθηκαν ανά κύτταρο. Ο συνεντοπισμός P62 και Keapl πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια διοχέτευση συντοπισμού στο λογισμικό CellProfiler [31 ] Οι εικόνες που εμφανίζονται στα σχήματα έχουν βελτιωθεί ψηφιακά.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, θεραπευτική διάταξη). Τα ποντίκια ζυγίζονταν και βαθμολογούνταν καθημερινά για νευρολογικά σημεία της νόσου σύμφωνα με τον οδηγό βαθμολόγησης EAE ποντικιού του κατασκευαστή:0:κανένα κλινικό σύμπτωμα,0.5:το άκρο της ουράς είναι χαλαρό, 1:το άκρο της ουράς είναι χωλό , 1.5: αναστολή χωλής ουράς και οπίσθιου ποδιού 2: χλιαρή ουρά και αδυναμία των οπίσθιων ποδιών, 2.5: χαλαρή ουρά και σύρσιμο των οπίσθιων ποδιών, 3: χαλαρή ουρά και πλήρης παράλυση των οπίσθιων ποδιών, 3.5: χαλαρή ουρά και πλήρης παράλυση των πίσω ποδιών τα πόδια και το ποντίκι δεν μπορούν να διορθωθούν όταν τοποθετηθούν στο πλάι,4: παράλυση στο διάφραγμα, 5: θάνατος από ΕΑΕ.

Στατιστική ανάλυση

Το GraphPad Prism χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων, τα οποία αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος±sem D'Agostino και η δοκιμή κανονικότητας Pear-son omnibus χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο της κανονικής κατανομής. Για κανονικά κατανεμημένα δεδομένα χρησιμοποιήθηκε το μη ζευγαρωμένο Student's t-test (με διόρθωση του Welch εάν ήταν απαραίτητο). Η ανάλυση Mann-Whitney χρησιμοποιήθηκε για δεδομένα που δεν πέρασαν το τεστ κανονικότητας.p-values<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Αποτελέσματα

Μεταγραφικές αλλαγές που σχετίζονται με τη θεραπεία με φλορετίνη των μακροφάγων

Για να καθορίσουμε πιθανές αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις και να αναγνωρίσουμε τους υποκείμενους μηχανισμούς θεραπείας με φλορετίνη σε μακροφάγα, πραγματοποιήσαμε αλληλουχία μαζικού RNA (συμπληρωματική Εικ. 1). Η ανάλυση μονοπατιού των ενεργοποιημένων μακροφάγων που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με φλορετίνη έδειξε ότι τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια υπερεκπροσωπούνταν σε κανονικές οδούς που σχετίζονται μεφλεγμονή, όπως iNOS(z-score:-2.449), toll-like receptor(z-score:-2.236), σηματοδότηση ιντερφερόνης (z-score:- 2), και μονοπάτι απόκρισης οξείας φάσης (z-score:- 1.633)(Εικ.1A, B). Παρόμοια με την ανάλυση της κανονικής οδού, η ανάντη ανάλυση των δεδομένων RNA-seq προέβλεψε ότι η φλορετίνη μείωσε την ενεργοποίηση βασικών προφλεγμονωδών ρυθμιστών μεταγραφής όπως τα IRF7 (z-score:2.229), IRF1(z-score:-2. 025)και STAT1(z-score:-2.022)(Εικ. 1D). Δίπλα στην υπορρύθμιση των προφλεγμονωδών οδών των μακροφάγων, η ανάλυση RNA-seq των μακροφάγων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με φλορετίνη έδειξε ότι, μεταξύ άλλων οδών, η φλορετίνη ενεργοποίησε δυναμικά την οδό Nrf2 (z-score: 1,897), που αποδεικνύεται από την ανοδική ρύθμιση του Nrf{35}}που σχετίζεται γονίδια όπως mafG και proxy (Εικ. 1A, C). Ακόμη περισσότερο, ο Nrf2(NFE2L2) αναγνωρίστηκε ως ο πιο ενεργοποιημένος μεταγραφικός ρυθμιστής ανάντη (z-score: 2,801) και η ρύθμιση των επιπέδων ROS αναγνωρίστηκε ως μία από τις πιο ρυθμιζόμενες βιολογικές λειτουργίες σε BMDM που έχουν υποστεί επεξεργασία με φλορετίνη (z-score: 2,008 )(Εικ. 1Δ, Ε). Συλλογικά, τα ευρήματα δείχνουν ότι η φλορετίνη ενεργοποιεί το Nrf2 και καταστέλλει τον φλεγμονώδη φαινότυπο των μακροφάγων.

Η οδός Nrf2 ελέγχει τον φαινότυπο των μακροφάγων που έχουν υποστεί αγωγή με φλωρετίνη

Στη συνέχεια, επικυρώσαμε την αντιφλεγμονώδη δράση της φλορετίνης και προσδιορίσαμε εάν ρυθμίζει τον φλεγμονώδη φαινότυπο των μακροφάγων δρώντας στο Nrf2. Μειωμένα επίπεδα ROS παρατηρήθηκαν σε WT BMDM που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φλορετίνη που διεγείρονται με PMA (Εικ. 2Α). Επιπλέον, μειωμένη παραγωγή ΝΟ και επίπεδα mRNA των προφλεγμονωδών γονιδίων NOS2, I-6, COX2 και I-12 παρατηρήθηκαν σε WT BMDM που υποβλήθηκαν σε αγωγή με φλορετίνη που διεγέρθηκαν με LPS (Εικ. 2B, C). Σε σχέση με τον κρίσιμο ρόλο του Nrf2 στην πρόκληση ενός λιγότερο φλεγμονώδους φαινοτύπου, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η φλορετίνη ενεργοποιεί τα γονίδια απόκρισης Nrf2-HO1 και NQO1 σε WT αλλά όχι Nrf2 KO BMDM που διεγείρονται με LPS (Εικ. 2D). Επιπλέον, η επεξεργασία με φλορετίνη μείωσε την παραγωγή ROS σε WT αλλά όχι σε BMDM Nrf2 KO (Εικ. 2Ε). Εκτός από τον έλεγχο των αντιοξειδωτικών αποκρίσεων, το Nrf2 αναφέρεται ότι καταστέλλει τον φλεγμονώδη φαινότυπο των μακροφάγων [12]. Προς υποστήριξη του τελευταίου, η φλορετίνη δεν μπόρεσε να μειώσει την έκφραση των προφλεγμονωδών γονιδίων NOS2, IL-6, COX2 , και IL-12 σε ενεργοποιημένα BMDM με έλλειψη Nrf{2- (Εικ. 2F). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το Nrf2 οδηγεί τη μετατόπιση του φλεγμονώδους φαινοτύπου με τη μεσολάβηση της φλορετίνης των μακροφάγων.

Η φλορετίνη προάγει την ενεργοποίηση της AMPK

Η φλορετίνη είναι ένας καλά καθορισμένος αναστολέας της GLUT και πρόσφατες μελέτες υπογραμμίζουν τη σημασία της πρόσληψης γλυκόζης με τη μεσολάβηση της GLUT για την ενεργοποίηση των μακροφάγων [26,32]. Ως εκ τούτου, προσδιορίσαμε εάν η φλορετίνη θα μπορούσε να ενεργοποιήσει τον αισθητήρα ενέργειας AMPK, ο οποίος ενεργοποιείται σε χαμηλά επίπεδα ενέργειας/γλυκόζης. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η επεξεργασία με φλορετίνη οδηγεί σε φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της AMPK (Εικ. 3Α, Β). Επιπλέον, η προσθήκη του αναστολέα AMPK BML-275 αποτρέπει σε μεγάλο βαθμό την ενεργοποίηση της AMPK σε BMDM που έχουν υποστεί επεξεργασία με φλορετίνη (Εικ. 3Α, Β). Ακόμη περισσότερο, τα ευρήματά μας καταδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση της AMPK είναι απαραίτητη για την καταστολή της παραγωγής ROS για τη φλορετίνη, όπως φαίνεται από τα υψηλότερα επίπεδα ROS σε BMDM που έλαβαν θεραπεία τόσο με φλορετίνη όσο και με αναστολέα AMPK σε σύγκριση με τα BMDM που έλαβαν θεραπεία μόνο με φλορετίνη (Εικ. 3C). Συνολικά, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η επαγόμενη από τη φλορετίνη ενεργοποίηση AMPK είναι ζωτικής σημασίας για την οδήγηση των μακροφάγων προς έναν λιγότερο φλεγμονώδη φαινότυπο.

Η φλορετίνη διεγείρει την αυτοφαγία με τρόπο που εξαρτάται από την AMPK

Δεδομένου ότι η ενεργοποίηση της AMPK σχετίζεται με την ενεργοποίηση των καταβολικών διεργασιών ως απόκριση στη στέρηση θρεπτικών ουσιών [33], στη συνέχεια ερευνήσαμε εάν η φλορετίνη μπορεί να ενεργοποιήσει την αυτοφαγία. Η αυτοφαγία είναι μια διατηρημένη καταβολική διεργασία που προκαλείται από την πείνα και άλλες αποκρίσεις στρες, η οποία προάγει τη λυσοσωμική αποικοδόμηση του ενδοκυτταρικού φορτίου που έχει εγκλωβιστεί σε κυστίδια που ονομάζονται αυτοφαγοσώματα. Η ανάλυση RNA-seq προέβλεψε την αυτοφαγία ως μία από τις κατάντη βιολογικές διεργασίες που εμφανίζει αυξημένη δραστηριότητα σε BMDM που έχουν υποστεί επεξεργασία με φλορετίνη (z-score: 0.779) (Εικ. 4Α). Επιπλέον, η ανοσοκυτταροχημική ανάλυση των BMDM που υποβλήθηκαν σε αγωγή με φλορετίνη και τον αναστολέα αυτοφαγίας bafilomycin Al εμφάνισε αυξημένη συσσώρευση των δεικτών αυτοφαγίας MAP1LC3/LC3 (σχετιζόμενη με μικροσωληνίσκο πρωτεΐνη 1 ελαφριά αλυσίδα 3) και p62 σε σύγκριση με τη βαφιλομυκίνη A{14} 4B-D), υποδηλώνοντας αυξημένη αυτοφαγική ροή κατά τη θεραπεία με φλορετίνη [34]. Κατά την επαγωγή της αυτοφαγίας, η LC3 μετατρέπεται από τη μορφή LC3I στη λιπιδωμένη μορφή LC3I, η οποία συσχετίζεται με τον αριθμό των αυτοφαγοσωμάτων. Σε συμφωνία με αυτό, προσδιορίστηκαν υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης των LC3II και ρ62 σε διεγερμένα από φλορετίνη BMDM με στύπωμα western (Εικ. 4Ε, ΣΤ). Είναι ενδιαφέρον ότι αυτή η αύξηση του p62 και του LC3II από τη φλορετίνη αποφεύχθηκε με τη θεραπεία των BMDM με τον αναστολέα AMPK BML-275(Εικ. 4E-F). Συλλογικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η φλορετίνη διεγείρει την αυτοφαγία με τρόπο που εξαρτάται από την AMPK.

Η φλορετίνη ενεργοποιεί την οδό Nrf2 μέσω της αποικοδόμησης Keap1 που προκαλείται από αυτοφαγία

Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η φλορετίνη ενεργοποιεί το Nrf2 και διεγείρει την αυτοφαγία στα μακροφάγα. Είναι ενδιαφέρον ότι ο υποδοχέας αυτοφαγίας p62 μπορεί να ανταγωνιστεί τον Nrf2 για τη δέσμευση με το Keapl, τον προσαρμογέα που διευκολύνει την ουβικουϊτινοποίηση και την αποικοδόμηση του Nrf2 υπό κανονικές συνθήκες. Αυτή η διαμεσολαβούμενη από p{4}}διάσταση του Keap1/Nrf2 θα αποτρέψει επομένως την υποβάθμιση του Nrf2 και τελικά θα οδηγήσει σε ενεργοποίηση του Nrf2 [35]. Για το λόγο αυτό, προσδιορίσαμε εάν η φλορετίνη προάγει την αλληλεπίδραση p62/Keapl, ενεργοποιώντας έτσι την οδό Nrf2. Εδώ, δείχνουμε ότι η φλορετίνη ενεργοποιεί το μονοπάτι Nrf2 μέσω της αποικοδόμησης Keapl που προκαλείται από p{13} σε μακροφάγα. Χρησιμοποιώντας ομοεστιακή μικροσκοπία Airyscan υψηλής ανάλυσης σε συνδυασμό με ανάλυση εντοπισμού, δείχνουμε ότι η φλορετίνη διεγείρει την αλληλεπίδραση του p62 και του Keapl, όπως αποδεικνύεται από μια αυξημένη τιμή της παραμέτρου εντοπισμού (συντελεστής Pearson) σε BMDM που έχουν υποστεί επεξεργασία με φλορετίνη (Εικ. 5Α , Β). Επιπλέον, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι υπάρχουν χαμηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης του Keapl σε BMDM που έχουν υποστεί αγωγή με φλορετίνη, επιβεβαιώνοντας την αποικοδόμηση του Keapl (Εικ. 5C). Για να επιβεβαιώσουμε ότι η αποδόμηση εξαρτάται από την αυτοφαγία, προσθέσαμε τον αναστολέα αυτοφαγίας βαφιλομυκίνη Α1 σε θεραπεία με φλορετίνη BMDM. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτή η μείωση στο Keapl αντιστράφηκε με θεραπεία με Bafilomycin Al (Εικ. 5C). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με στύπωμα western, δείχνοντας μια μείωση στα επίπεδα πρωτεΐνης Keapl σε BMDM που είχαν υποστεί αγωγή με φλορετίνη, η οποία αποφεύχθηκε από τη βαφιλομυκίνη Α1 (Εικ. 5D, Ε).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), η φλορετίνη μείωσε τη σοβαρότητα της νόσου (Εικ. 6Β). Η μειωμένη σοβαρότητα της νόσου σε ζώα που έλαβαν φλορετίνη παραλληλίστηκε με μειωμένη έκφραση των φλεγμονωδών γονιδίων MHCI,

CD86,Nos2,TNFa,IL-6,CCL4, CCL5 και CXCL2 στον νωτιαίο μυελό (Εικ.6C). Επιπλέον, μια μειωμένη ποσότητα κυττάρων F4/80t βρέθηκε στο νωτιαίο μυελό ζώων που έλαβαν φλορετίνη (Εικ. 6Ε, ΣΤ). Δεδομένου ότι τόσο τα μακροφάγα F4/80*microglia όσο και τα F4/80* μακροφάγα συμβάλλουν στη νευροφλεγμονή, πιο εις βάθος ανάλυση απέδειξε ότι η φλορετίνη μείωσε σημαντικά την ποσότητα του F480 συν TMEMl19-

μακροφάγα σε ποντικούς EAE (συμπληρωματικό Σχήμα 2 DF) ενώ παρατηρήθηκε μια μη σημαντική τάση προς μείωση του F480 συν TMEMl19 συν μικρογλοία. Σύμφωνα με αυτό το εύρημα, η φλορετίνη κατέστειλε την παραγωγή φλεγμονωδών μεσολαβητών στη μικρογλοία, αλλά αυτή η καταστολή ήταν λιγότερο έντονη σε σύγκριση με τα μακροφάγα (συμπληρωματικό Σχήμα 2 AC). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η βελτίωση της ΕΑΕ από τη φλορετίνη καθοδηγείται κυρίως από μακροφάγους. Εκτός από τη μείωση της έκφρασης των φλεγμονωδών γονιδίων, η φλορετίνη αύξησε την έκφραση των αντιφλεγμονωδών και νευροτροφικών παραγόντων, π.χ. ). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν έντονα ότι η φλορετίνη μειώνει τη σοβαρότητα της νόσου της ΕΑΕ οδηγώντας τα μακροφάγα προς έναν φαινότυπο που επιλύει τη νόσο. Σύμφωνα με τα προηγούμενα in vitro ευρήματά μας, ανιχνεύσαμε επίσης αυξημένη σηματοδότηση Nrf2 στο ΚΝΣ ζώων ΕΑΕ που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με φλορετίνη, όπως υποδεικνύεται από την αυξημένη έκφραση mRNA του Nrf2 και των κατάντη στόχων του NQO1 και GPX1 (Εικ. 6G). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η φλορετίνη καταστέλλει τη νευροφλεγμονή τόσο σε προφυλακτικό όσο και σε θεραπευτικό πλαίσιο. Επιπλέον, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η φλορετίνη μπορεί να μειώσει τη νευροφλεγμονή καταστέλλοντας τα φλεγμονώδη χαρακτηριστικά των μακροφάγων μέσω της ενεργοποίησης του Nrf2.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, αποδεικνύουμε ότι η φλορετίνη οδηγεί τα μακροφάγα προς έναν λιγότερο φλεγμονώδη φαινότυπο με τρόπο που εξαρτάται από το Nrf2-. Η εξαρτώμενη από την AMPK ενεργοποίηση της αυτοφαγίας και η επακόλουθη αποικοδόμηση του Keapl βρέθηκε ότι αποτελούν τη βάση της ενεργοποίησης του Nrf2 από τη φλορετίνη. Επιπλέον, επιβεβαιώνουμε τις αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις της φλορετίνης σε ένα μοντέλο ΕΑΕ όπου μειώνει τη σοβαρότητα της νόσου και ανακουφίζει τα εξαρτώμενα από τα μακροφάγανευροφλεγμονή.

Δείχνουμε ότι η φλορετίνη καταστέλλει τον φλεγμονώδη φαινότυπο των μακροφάγων. Αυτό είναι σύμφωνο με τα ευρήματα των Wei-Tien Chang et al. που απέδειξε ότι η φλορετίνη έχει αντιφλεγμονώδη χαρακτηριστικά σε μια κυτταρική σειρά μακροφάγων [36]. Δείχνουμε ότι η επαγωγή αυτής της μετατόπισης φαινοτύπου εξαρτάται από το Nrf2. Το Nrf2 είναι ο κύριος ρυθμιστής των αντιοξειδωτικών αποκρίσεων και η ενεργοποίησή του είναι γνωστό ότι οδηγεί τα μακροφάγα προς έναν αντιφλεγμονώδη φαινότυπο [1l, 12, 37]. Επιπλέον, αρκετές μελέτες ορίζουν ότι η ενεργοποίηση του Nrf2 εξασθενεί τη νευροφλεγμονή και τον νευροεκφυλισμό σε διαταραχές του ΚΝΣ [{10 }}]. Ωστόσο, αν και τα ευρήματά μας δείχνουν ότι το Nrf2 αποτελεί τη βάση της μετατόπισης φαινοτύπου των μακροφάγων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με φλορετίνη, τα δεδομένα αλληλουχίας RNA έδειξαν ότι, μεταξύ της ενεργοποίησης Nrf2, άλλα μονοπάτια ρυθμίστηκαν προς τα πάνω. Ειδικότερα, η ανοδική ρύθμιση της οδού PPAR παρουσιάζει ενδιαφέρον λόγω των αντιφλεγμονωδών χαρακτηριστικών της και της αλληλεπίδρασης με το Nrf2 [41-45]. Επιπλέον, δεδομένου ότι η φλορετίνη είναι ένας καλά καθορισμένος αναστολέας GLUT και η μετάβαση στη γλυκόλυση είναι ένα κρίσιμο μεταβολικό γεγονός για την ενεργοποίηση των μακροφάγων, οι αλλαγές φαινοτύπου μπορεί επίσης να προκληθούν εν μέρει από τις άμεσες μεταβολικές επιδράσεις της φλορετίνης σε αυτούς τους μεταφορείς γλυκόζης [46,47]. Απαιτείται περισσότερη έρευνα για τον καθορισμό της συνάφειας του PPAR στην επαγόμενη από τη φλορετίνη ενεργοποίηση Nrf2 και σε ποιο βαθμό η επαγόμενη από τη φλορετίνη ανοσοτροποποίηση επηρεάζεται από άμεσες μεταβολικές αλλαγές. Συνολικά, τα ευρήματά μας καταδεικνύουν ξεκάθαρα ότι η ενεργοποίηση Nrf2 διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο στον διακόπτη φαινοτύπου που προκαλείται από τη φλορετίνη.

Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση Nrf2 από τη φλορετίνη προκαλείται από την ενεργοποίηση AMPK. Το AMPK διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην αποκατάσταση της ομοιόστασης της κυτταρικής ενέργειας στην περίπτωση καταπονήσεων που εξαντλούν το ATP με αποτέλεσμα την αύξηση της αναλογίας ADP: ATP, ενεργοποιώντας έτσι εναλλακτικές καταβολικές οδούς που παράγουν ATP, ενώ απενεργοποιούνται οι αναβολικές οδοί που καταναλώνουν ATP [48]. Αντίστοιχα, η φλορετίνη είναι ένας καλά εδραιωμένος αναστολέας της GLUT και μειώνει τα κυτταρικά επίπεδα γλυκόζης [49-51]. Αρκετές μελέτες έδειξαν ότι η ενεργοποίηση της AMPK σε μακροφάγους επάγει έναν ανοσοκατασταλτικό φαινότυπο, ο οποίος επιβεβαιώνει τα αποτελέσματά μας που δείχνουν ότι η ενεργοποίηση της AMPK είναι απαραίτητη για τη φλορετίνη για τη μείωση της φλεγμονής[52,53]. Τα δεδομένα μας είναι επίσης σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες όπου η φλορετίνη έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιεί την AMPK σε άλλους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των λιποκυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων [50, 54-56]. Η φλορετίνη μπορεί να ενεργοποιήσει την AMPK έμμεσα αυξάνοντας την AMP και μειώνοντας τα επίπεδα ATP, καθώς η AMP και η ATP αλλοστερικά διεγείρουν ή αναστέλλουν την ενεργοποίηση της AMPK, αντίστοιχα [48, 57]. Ωστόσο, η CaMKK, η οποία είναι μια κινάση ανάντη της AMPK, μπορεί να προάγει την ενεργοποίηση της AMPK ως απόκριση σε αυξημένα επίπεδα κυτταρικού Ca2 plus χωρίς καμία αλλαγή στα επίπεδα AMP/ATP [58]. Επιπλέον, δεδομένου του ευρέος δικτύου της αλληλεπίδρασης μεταξύ AMPK και ανοδικών και κατάντη οδών, απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να διαλευκανθεί ο υποκείμενος μηχανισμός της επαγόμενης από τη φλορετίνη ενεργοποίησης AMPK.

Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση AMPK με τη μεσολάβηση της φλορετίνης διεγείρει την αυτοφαγία σε μακροφάγα. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η ενεργοποίηση AMPK είναι μια αυτοπροστατευτική διαδικασία που στοχεύει στην αποκατάσταση της ενεργειακής ισορροπίας του κυττάρου [48]. Αν και καμία μελέτη δεν έδειξε ποτέ ότι η φλορετίνη ήταν σε θέση να διεγείρει τον φαινότυπο των μακροφάγων προάγοντας την αυτοφαγία, ορισμένες μελέτες έχουν δείξει ωστόσο μια επίδραση της φλωρετίνης στις οδούς αυτοφαγίας στα καρκινικά κύτταρα και στα ηπατοκύτταρα [59-61]. Επιπλέον, διάφορες μελέτες δείχνουν ότι οι κατάντη καταβολικές διεργασίες ενεργοποίησης AMPK μπορούν να ενεργοποιήσουν την αυτοφαγία [60, 62,63]. Είναι ενδιαφέρον ότι ως απόκριση στην πείνα με γλυκόζη, η αυτοφαγία με τη μεσολάβηση AMPK προκαλείται από φωσφορυλίωση του παράγοντα έναρξης αυτοφαγίας εισαγωγής, unc-51 όπως η κινάση που ενεργοποιεί την αυτοφαγία [64,65]. Σε σχέση με αυτό, υποθέτουμε ότι το AMPK διεγείρει την αυτοφαγία για να αποκαταστήσει το ATP από τα κυτταρικά συστατικά ως απόκριση στην εξάντληση της γλυκόζης που προκαλείται από τη φλωρετίνη. Ωστόσο, η πείνα με γλυκόζη μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει την αυτοφαγία με τρόπο ανεξάρτητο από την AMPK [66-68]. Ως εκ τούτου, απαιτείται περισσότερη έρευνα για να προσδιοριστεί εάν η ενεργοποίηση της αυτοφαγίας από τη φλορετίνη συμβαίνει επίσης εν μέρει ανεξάρτητα από την AMPK.

Πρόσφατες μελέτες έδειξαν τη σημασία της αυτοφαγίας για την καθοδήγηση του λειτουργικού φαινοτύπου των μακροφάγων. Σε αυτό το πλαίσιο, η απορρύθμιση της αυτοφαγίας στα μακροφάγα έχει συνδεθεί κυρίως με την εμφάνιση αθηροσκλήρωσης και νευρολογικών παθήσεων [69-72]. Εδώ, παρέχουμε μια σύνδεση μεταξύ της θεραπείας με φλορετίνη, της επαγωγής αυτοφαγίας και της ενεργοποίησης του Nrf2, δείχνοντας ότι η φλορετίνη προάγει την ενεργοποίηση του Nrf2 μέσω της διαμεσολαβούμενης από p{4}}αποδόμησης του Keap1. Μέχρι πρόσφατα, μια αύξηση στο p62 puncta θεωρούνταν ως σημάδι μειωμένης αυτοφαγίας καθώς η ρ62 αποικοδομείται στα αυτοφαγοσώματα κατά την ενεργοποίηση της αυτοφαγίας [34]. Σε σχέση με αυτό, η συσσώρευση του p62 έχει συνδεθεί με δυσλειτουργία αυτοφαγίας σε αθηροσκληρωτικές βλάβες [73]. Ωστόσο, αυτή η ιδέα αμφισβητήθηκε τα τελευταία χρόνια και τώρα πιστεύεται ότι η ρ62 είναι απαραίτητη για το σχηματισμό αυτοφαγοσωμάτων και ότι η αύξηση των επιπέδων της ρ62 παράλληλα με την αύξηση του σημείου LC3Il μπορεί να είναι σημάδι επαγωγής αυτοφαγίας [74]. Ως εκ τούτου, μαζί με την ικανότητα της φλορετίνης να ενεργοποιεί την AMPK και τον γνωστό ρόλο της στην ενεργοποίηση της αυτοφαγίας, τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι η συσσώρευση P62 και LC3 κατά τη θεραπεία με βαφυλομυκίνη Α1 σε μακροφάγους που διεγείρονται από φλορετίνη οφείλεται σε αυξημένη αυτοφαγική ροή και όχι σε εξασθενημένη αυτοφαγία. Είναι ενδιαφέρον ότι οι Lee Y et al. έδειξε πρόσφατα ότι, εκτός από την ενεργοποίηση του Nrf2, η δέσμευση του p62 με το Keapl εμπλέκεται επίσης στον σχηματισμό αυτοφαγοσωμάτων, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση της αυτοφαγίας με τη μεσολάβηση της φλωρετίνης συνδέεται άμεσα με την αυξημένη δραστηριότητα της p62 από τη μία πλευρά, αλλά και με την μεγαλύτερη αλληλεπίδραση Keapl-p62 από την άλλη. 75]. Το Keapl είναι ένας προσαρμογέας της λιγάσης ουβικιτίνης με βάση το Cullin-3- που σχηματίζει ένα ομοδιμερές με το Nrf2 σε ομοιοστατικές συνθήκες, προάγοντας έτσι την ουβικουϊτινοποίηση του Nrf2 και την πρωτεασωμική αποδόμηση [76]. Η διαταραχή του συμπλέγματος Keapl-Nrf2 οδηγεί σε σταθεροποίηση του Nrf2 και μετατόπιση στον πυρήνα [77, 78]. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η διαταραχή αυτού του συμπλέγματος συμβαίνει είτε μέσω τροποποίησης των υπολειμμάτων κυστεΐνης Keapl από ηλεκτροφιλικά μόρια, είτε μέσω της άμεσης αλληλεπίδρασης μικρών μορίων με το Keapl είτε μέσω της αποικοδόμησης Keapl που προκαλείται από p{36}} [35]. Οι Ying Y et al. προτείνουν μια άμεση αλληλεπίδραση της φλορετίνης και του Keapl με βάση τα πειράματα in silico, η οποία στη συνέχεια οδηγεί στην ενεργοποίηση της οδού Nrf2 σε μια κυτταρική σειρά καρδιομυοκυττάρων [79]. Εδώ, δημιουργήσαμε έναν πρόσθετο μηχανισμό που σχετίζεται με την αυτοφαγία με τον οποίο η φλορετίνη ενεργοποιεί το Nrf2.

Χρησιμοποιώντας το μοντέλο EAE, διαπιστώσαμε ότι η φλορετίνη ανακουφίζει τη νευροφλεγμονή in vivo. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν έντονα ότι η φλορετίνη βελτιώνει την ΕΑΕ καταστέλλοντας τη φλεγμονώδη απόκριση που προκαλείται από μακροφάγα και ενεργοποιώντας την οδό Nrf2. Σε άλλα μοντέλα ασθενειών, η φλορετίνη αναφέρθηκε επίσης ότι ασκεί νευροπροστατευτικά και ανοσοτροποποιητικά χαρακτηριστικά. Συγκεκριμένα, η φλορετίνη βρέθηκε ότι ενεργοποιεί την οδό Nrf2 στον εγκέφαλο κατά την εγκεφαλική ισχαιμία και μειώνει τη συσσώρευση βήτα αμυλοειδούς στο μοντέλο της νόσου του Alzheimer επίμυος [80-84]. Η φλορετίνη μπορεί επίσης να επηρεάσει άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος in vivo, καθώς αυτή η ένωση έχει βρεθεί ότι αναστέλλει την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων και των δενδριτικών κυττάρων in vitro [85, 86]. Δεδομένου ότι η νευροφλεγμονή στο μοντέλο ΕΑΕ δεν εξαρτάται αποκλειστικά από τα μακροφάγα, θα ήταν ενδιαφέρον να καθοριστεί σε ποιο βαθμό η μείωση της νευροφλεγμονής προκαλείται από άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού. Σε σχέση με αυτό, αν και τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η βελτίωση της ΕΑΕ καθοδηγείται κυρίως από τα μακροφάγα και εξαρτάται λιγότερο από τη διαμόρφωση της μικρογλοίας, απαιτούνται περαιτέρω πειράματα για να αποσαφηνιστεί σε ποιο βαθμό η φλορετίνη επηρεάζει τη μικρογλοία σε νευροφλεγμονώδεις νόσους. Συνολικά, τα ευρήματά μας καταδεικνύουν ότι η φλορετίνη μειώνει τη νευροφλεγμονή επηρεάζοντας τον φαινότυπο των μακροφάγων, δείχνοντας τη θεραπευτική δυνατότητα της φλορετίνης για νευροφλεγμονώδεις διαταραχές.

συμπεράσματα

Η μελέτη μας δείχνει ότι η φλορετίνη είναι ένας ισχυρός ανοσοτροποποιητικός παράγοντας που ρυθμίζει τις φλεγμονώδεις ιδιότητες των μακροφάγων σε νευροφλεγμονώδεις διαταραχές. Η ενεργοποίηση της οδού Nrf2, με τη μεσολάβηση της ενεργοποίησης της αυτοφαγίας που εξαρτάται από την AMPK και της επακόλουθης αποικοδόμησης Keapl, καθιερώθηκε για να οδηγήσει αυτήν τη μετατόπιση φαινοτύπου. Ως εκ τούτου, η φλορετίνη είναι ένας πολλά υποσχόμενος φυσικός παράγοντας που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μείωση του φλεγμονώδους φορτίου νευροφλεγμονωδών ασθενειών όπως η ΣΚΠ.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Zeng Y, Peng Y, Tang K, Wang YQ, Zhao ZY, Wei XY, et al. Η διυδρομυρικετίνη βελτιώνει τον σχηματισμό αφρωδών κυττάρων μέσω LXRalpha-ABCA1/ABCG1-εξαρτώμενης εκροής χοληστερόλης στα μακροφάγα. Biomed Pharmacother. 2018; 101:543–52. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.02.124.

2. Xia Μ, Hou M, Zhu Η, Ma J, Tang Ζ, Wang Q, et αϊ. Οι ανθοκυανίνες επάγουν εκροή χοληστερόλης από περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού: ο ρόλος του υποδοχέα που ενεργοποιείται από τον πολλαπλασιαστή υπεροξισώματος {γάμα}-υποδοχέας Χ του ήπατος {άλφα}- οδός ABCA1. J Biol Chem. 2005;280(44):36792–801. https://doi.org/10.1 074/jbc.M505047200.

3. Chang YC, Lee TS, Chiang AN. Η κερσετίνη ενισχύει την έκφραση του ABCA1 και την εκροή χοληστερόλης μέσω της εξαρτώμενης οδού απ38-στα μακροφάγα. J Lipid Res. 2012; 53 (9): 1840–50. https://doi.org/10.1194/jlr.M024471.

4. Grajchen E, Hendriks JJA, Bogie JFJ. Η φυσιολογία των αφρωδών φαγοκυττάρων στη σκλήρυνση κατά πλάκας. Acta Neuropathol Commun. 2018; 6 (1): 124. https://doi. org/10.1186/s40478-018-0628-8.

5. Bogie JF, Stinissen P, Hendriks JJ. Υποσύνολα μακροφάγων και μικρογλοία στη σκλήρυνση κατά πλάκας. Acta Neuropathol. 2014; 128 (2): 191–213. https://doi.org/1 0.1007/s00401-014-1310-2.

6. Baecher-Allan C, Kaskow BJ, Weiner HL. Σκλήρυνση κατά πλάκας: μηχανισμοί και ανοσοθεραπεία. Νευρώνας. 2018; 97 (4): 742–68. https://doi.org/10.1016/j. νευρώνα.2018.01.021.

7. Bogie JFJ, Grajchen Ε, Wouters Ε, Corrales AG, Dierckx Τ, Vanherle S, et al. Η δεσατουράση Stearoyl-CoA-1 βλάπτει τις επανορθωτικές ιδιότητες των μακροφάγων και των μικρογλοίων στον εγκέφαλο. J Εχρ Med. 2020; 217 (5).

8. Bogie JF, Stinissen P, Hellings N, Hendriks JJ. Τα μακροφάγα που φαγοκυτταρώνουν τη μυελίνη ρυθμίζουν τον αυτοαντιδραστικό πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων. J Νευροφλεγμονή. 2011; 8 (1): 85. https://doi.org/10.1186/1742-2094-8-85.

9. Bogie JF, Timmermans S, Huynh-Thu VA, Irrthum A, Smeets HJ, Gustafsson JA, et al. Τα λιπίδια που προέρχονται από τη μυελίνη ρυθμίζουν τη δραστηριότητα των μακροφάγων μέσω της ενεργοποίησης του υποδοχέα Χ του ήπατος. PLoS One. 2012; 7(9): e44998. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0044998.

10. Bogie JF, Jorissen W, Mailleux J, Nijland PG, Zelcer Ν, Vanmierlo Τ, et αϊ. Η μυελίνη μεταβάλλει τον φλεγμονώδη φαινότυπο των μακροφάγων ενεργοποιώντας τους PPARs. Acta Neuropathol Commun. 2013; 1 (1): 43. https://doi.org/10.1186/2 051-5960-1-43.