Η πατρική νικοτίνη ενισχύει τη μνήμη του φόβου, μειώνει τη χορήγηση νικοτίνης και μεταβάλλει τη γενετική και νευρική λειτουργία του ιππόκαμπου στους απογόνους

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Lisa R. Goldberg1*|Dana Zeid1*|Munir Gunes Kutlu2|Robert D. Cole3|Valeria Lallai4|Aswathy Sebastian5|Istvan Albert5|Christie D. Fowler4|Vinay Parikh6|Thomas J. Gould1

1 Τμήμα Βιοσυμπεριφορικής Υγείας, Πανεπιστήμιο Penn State, University Park, Πενσυλβάνια

2 Τμήμα Φαρμακολογίας, Ιατρική Σχολή Vanderbilt, Νάσβιλ, Τενεσί

3 Κολλέγιο Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι, Λέξινγκτον, Κεντάκι

4 Τμήμα Νευροβιολογίας και Συμπεριφοράς, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια Irvine, Irvine, Καλιφόρνια

5Βιοπληροφορική, Βιοχημεία και Μοριακή Βιολογία, Πανεπιστήμιο Penn State, University Park, PA

6 Τμήμα Ψυχολογίας, Πανεπιστήμιο Temple, Φιλαδέλφεια, Πενσυλβάνια

Αφηρημένη

Η χρήση νικοτίνης παραμένει ιδιαίτερα διαδεδομένη με τον καπνό και τα προϊόντα ηλεκτρονικών τσιγάρων που καταναλώνονται παγκοσμίως. Ωστόσο, αυξανόμενες ενδείξεις διαγενεακής επιγενετικής κληρονομικότητας υποδηλώνουν ότι η χρήση νικοτίνης μπορεί να αλλάξει τη συμπεριφορά και τη νευροβιολογία στις επόμενες γενιές. Δοκιμάσαμε τα αποτελέσματα της χρόνιας πατρικής έκθεσης στη νικοτίνη σε ποντίκια C57BL6/J στη ρύθμιση του φόβου στους απογόνους F1 και F2, καθώς και στην εξαφάνιση του φόβου και την αυθόρμητη ανάκαμψη, την αυτοχορήγηση νικοτίνης, τη χολινεργική λειτουργία του ιππόκαμπου, την έκφραση RNA και τη μεθυλίωση του DNA στο F1 απόγονος. Η πατρική έκθεση στη νικοτίνη συσχετίστηκε με βελτιωμένη προσαρμογή του φόβου και την αυθόρμητη ανάκτηση των σβησμένων αναμνήσεων φόβου. Περαιτέρω, η ενίσχυση νικοτίνης μειώθηκε σε ποντίκια που έλαβαν νικοτίνη, όπως αξιολογήθηκε σε ένα παράδειγμα αυτοχορήγησης. Αυτοί οι συμπεριφορικοί φαινότυποι συνδυάστηκαν με αλλοιωμένη απόκριση στη νικοτίνη, ρυθμισμένη προς τα πάνω δέσμευση νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης του ιππόκαμπου, μειωμένα προκλητά χολινεργικά ρεύματα ιππόκαμπου και αλλαγμένη μεθυλίωση και έκφραση των γονιδίων του ιππόκαμπου που σχετίζονται με τη νευρική ανάπτυξη και πλαστικότητα. Η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης υποδηλώνει επιδράσεις πολλών γενεών σε ευρύτερα δίκτυα γονιδίων που πιθανώς εμπλέκονται στη νευροπλαστικότητα και τις ψυχικές διαταραχές. Οι αλλαγές στην προετοιμασία του φόβου υποδηλώνουν ομοίως φαινοτύπους ανάλογους με αγχώδεις διαταραχές παρόμοιους με το μετατραυματικό στρες.

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: χολινεργικός, ιππόκαμπος, μάθηση, πολλαπλών γενεών, νικοτίνη, διαγενεακή

επιδράσεις του cistanche

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Τα συσσωρευμένα στοιχεία υποδηλώνουν ότι ο αντίκτυπος της έκθεσης σε ναρκωτικά κατάχρησης εκτείνεται πέρα ​​από το άτομο και επηρεάζει τους φυσιολογικούς και συμπεριφορικούς φαινοτύπους σε μη εκτεθειμένους απογόνους.1-3 Ο χαρακτηρισμός των επιδράσεων της νικοτίνης ανά γενεές είναι κρίσιμος λαμβάνοντας υπόψη την επικράτηση της χρήσης προϊόντων καπνού4 και τη δραματική αύξηση της χρήσης ηλεκτρονικού τσιγάρου.5 Μέσω των επιπτώσεών της στα χολινεργικά συστήματα του εγκεφάλου, η έκθεση στη νικοτίνη προκαλεί σημαντικές αλλαγές στη λειτουργία του εγκεφάλου που μπορεί να αποτελούν τη βάση του εθισμού στη νικοτίνη και να συμβάλλουν σε αυξημένο κίνδυνο για ψυχιατρικές διαταραχές, συμπεριλαμβανομένης της κατάθλιψης6 και του άγχους.7 Επιγενετικές τροποποιήσεις κατάντη της χολινεργικής ενεργοποίησης μπορεί επιτρέπουν επίμονες επιδράσεις στην κυτταρική λειτουργία και τη λειτουργία του κυκλώματος.8,9 Μέχρι πρόσφατα, πιστευόταν ότι αυτές οι επιγενετικές τροποποιήσεις διαγράφηκαν κατά τη δημιουργία της βλαστικής σειράς και έτσι απομονώθηκαν από τις επόμενες γενιές. Ωστόσο, οι επιγενετικές τροποποιήσεις, συμπεριλαμβανομένης της μεθυλίωσης του DNA, των μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων ιστόνης και των μη κωδικοποιημένων RNA, που αποκτώνται σε μία γενιά, μπορούν να κληρονομηθούν στην επόμενη γενιά. .

Μελέτες τρωκτικών από πολλαπλά, ανεξάρτητα εργαστήρια έχουν αρχίσει να εντοπίζουν πολλαπλές και διαγενεακές συνέπειες της γονικής έκθεσης στη νικοτίνη. Αυτή η εργασία έχει μέχρι στιγμής εντοπίσει τις επιπτώσεις της γονικής έκθεσης στη νικοτίνη σε καταθλιπτικούς και αγχώδεις φαινοτύπους, 1 γνωστική ευελιξία, 2 συμπεριφορές όπως η διαταραχή ελλειμματικής προσοχής και υπερκινητικότητα (ADHD), 3 και γονιδιακή έκφραση.1,2 Οι πολλαπλές και διαγενεακές συνέπειες Η έκθεση στη νικοτίνη μπορεί να επηρεάσει τους ενδοφαινότυπους που εμπλέκονται στον εθισμό στη νικοτίνη και στην ψυχική υγεία. Για παράδειγμα, δείξαμε ότι η έκθεση στη νικοτίνη ρυθμίζει τη συνθήκη φόβου, ένα μοντέλο μάθησης φόβου εξαρτώμενης από τον ιππόκαμπο που σχετίζεται με την ευαλωτότητα σε διαταραχές ψυχικής υγείας όπως η διαταραχή μετατραυματικού στρες (PTSD) και ο εθισμός.12-14 Νικοτίνη. Οι επιδράσεις στη μάθηση του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα ρυθμίζονται από τον ιππόκαμπο.15,16 Βρήκαμε ότι η οξεία έκθεση στη νικοτίνη ενισχύει την εξαρτώμενη από τον ιππόκαμπο μάθηση φόβου, 15,17 βλάπτει την εξάλειψη του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα,18,19 και αυξάνει την αυθόρμητη ανάκτηση του φόβου που ακολουθεί εξαφάνιση.18 Ωστόσο, οι πολλαπλές και διαγενεακές επιδράσεις της πατρικής έκθεσης στη νικοτίνη σε αυτούς τους φαινοτύπους δεν έχουν μελετηθεί. Επιπλέον, καμία προηγούμενη μελέτη δεν έχει χαρακτηρίσει τις πολλαπλές γενεές επιδράσεις της νικοτίνης στη χολινεργική λειτουργία. Η κληρονομικότητα πολλών γενεών αναφέρεται σε φαινοτύπους που προκύπτουν στη γενιά αμέσως μετά τα εκτεθειμένα άτομα, ενώ η διαγενεακή κληρονομικότητα συνίσταται σε κληρονομικότητα επιγενετικής πληροφορίας με τη μεσολάβηση της βλαστικής γραμμής μεταξύ των γενεών απουσία άμεσων περιβαλλοντικών επιρροών που οδηγούν σε φαινοτυπική διαφοροποίηση.11 Εδώ, εξετάσαμε και τις δύο πολλαπλές γενεές και διαγενεακές επιδράσεις της πατρικής έκθεσης στη νικοτίνη στη μάθηση του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα και την υποδηλωμένη μάθηση του φόβου στη γενιά F1 και F2 καθώς και στην αυτοχορήγηση νικοτίνης, τη δέσμευση του υποδοχέα νικοτινικής ακετυλοχολίνης του ιππόκαμπου (nAChR), τη χολινεργική λειτουργία του ιππόκαμπου, την έκφραση του γονιδίου του ιππόκαμπου και τη μεθυλίωση του DNA του ιππόκαμπου η γενιά της F1. Υποθέτουμε ότι η πατρική έκθεση στη νικοτίνη θα επηρεάσει την προετοιμασία του φόβου, την έκφραση του γονιδίου του ιππόκαμπου και τη λειτουργία στους απογόνους και τους απογόνους.

επιδράσεις του εκχυλίσματος κιστάνι

2 ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ

2.1 Θέματα

Τα άτομα ήταν αρσενικά και θηλυκά ποντίκια C57BL/6J (ηλικίας 8-20 εβδομάδων, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Με εξαίρεση τη στέγαση για αναπαραγωγή χαρεμιού, όλα τα ζώα στεγάστηκαν σε ομάδες με κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών και ad libitum πρόσβαση σε τροφή και νερό. Κατά τη διάρκεια της αυτοχορήγησης, τα άτομα περιορίστηκαν σε τροφή στο 85 τοις εκατό έως 90 τοις εκατό του σωματικού τους βάρους που τρέφονταν ελεύθερα και χορηγήθηκε νερό κατά βούληση. Όλες οι δοκιμές συμπεριφοράς πραγματοποιήθηκαν μεταξύ 9:00 π.μ. και 6:00 μ.μ. Όλες οι διαδικασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με τον Οδηγό NIH για τη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων και εγκρίθηκαν από τις επιτροπές IACUC του Πανεπιστημίου Penn State, του Πανεπιστημίου Temple ή του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια Irvine.

2.2 Η πατρική έκθεση στη νικοτίνη

Οι άνδρες (8 εβδομάδων) έλαβαν 0,9 τοις εκατό στείρο αλατούχο ορό ή άλας όξινης τρυγικής νικοτίνης (12,6 mg/kg/ημέρα, ελεύθερο βάρος βάσης—Fisher Scientific, Waltham, MA ή MP Biomedical, Santa Ana, CA) διαλυμένο σε 0,9 τοις εκατό στείρος ορός, χορηγούμενος υποδόρια μέσω οσμωτικών μίνι αντλιών (Alzet, Model 1004, Durect, Cupertino, CA) για 28 ημέρες. Αυτή η δόση παράγει επίπεδα νικοτίνης και κοτινίνης στο πλάσμα συγκρίσιμα με αυτά που παρατηρούνται σε μέτρια άτομα καπνιστές.20,21

2.3 Γενιά ποντικών F1 και F2

Ο χρόνος ημιζωής της νικοτίνης στα ποντίκια είναι περίπου 6 λεπτά.22 Έχει αποδειχθεί προηγουμένως ότι οι επιπτώσεις της στέρησης της νικοτίνης εξαφανίζονται 4 ημέρες μετά την αφαίρεση της νικοτίνης.23-25 Επομένως, μια καθυστέρηση 4 ημερών μεταξύ της θεραπείας με νικοτίνη και της νικοτίνης. Η αναπαραγωγή εφαρμόστηκε για να εξασφαλιστεί η συστηματική αποβολή της νικοτίνης πριν από την αναπαραγωγή. Αρσενικά ποντίκια τοποθετήθηκαν σε κλουβιά με δύο παρθένα θηλυκά C57BL/6 J (ηλικίας 8-20 εβδομάδων) για 2 εβδομάδες για να δημιουργήσουν απογόνους F1. Τα ποντίκια F2 δημιουργήθηκαν με ζευγάρωμα παρελθοντικών αρσενικών ποντικών F1 με θηλυκά θηλυκά.

2.4 Προετοιμασία φόβου

Οι διαδικασίες προετοιμασίας του φόβου και εξαφάνισης έχουν περιγραφεί λεπτομερώς προηγουμένως.19 Εν συντομία, τα ποντίκια εκπαιδεύτηκαν και δοκιμάστηκαν σε θαλάμους εξασθένησης του θορύβου (18,8 × 20 × 18,3 cm, 65 dB θόρυβος περιβάλλοντος· MED Associates, St. Albans, VT). Τα ποντίκια F1 και F2 υποβλήθηκαν σε συνθήκες φόβου με δύο εξαρτημένα ερεθίσματα (CS, 3{17}} s, 85-dB λευκό θόρυβο) - ζεύγη άνευ όρων ερεθίσματος (οι ΗΠΑ, 2 s, 0,57-mA ποδοπατήματα) που χωρίστηκαν κατά 120 δευτερόλεπτα. Για να εξεταστούν οι οξείες επιδράσεις της νικοτίνης στη ρύθμιση του φόβου σε ποντίκια F1 και F2, οι απόγονοι έλαβαν οξεία νικοτίνη (0,09 mg/kg, βάρος ελεύθερης βάσης NIC, ip· άλας οξίνου τρυγικού νικοτίνης, Fisher Scientific) ή φυσιολογικό ορό (SAL) 2 έως 4 λεπτά πριν σε συνεδρίες εκπαίδευσης και δοκιμών. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την εκπαίδευση, τα ποντίκια επέστρεψαν στο εκπαιδευτικό πλαίσιο για 5 λεπτά για να αξιολογηθεί η κατάψυξη των συμφραζομένων. Μετά από δοκιμές με βάση τα συμφραζόμενα, τα ποντίκια τοποθετήθηκαν σε ξεχωριστούς θαλάμους για να αξιολογήσουν την εκμάθηση του φόβου. Οι πειραματιστές τυφλοί σε συνθήκες αξιολόγησαν την κατάψυξη, που ορίζεται ως η απουσία εκούσιας κίνησης εκτός από την αναπνοή, μέσω μιας μεθόδου αμερόληπτης δειγματοληψίας χρόνου.19 Για να εξεταστούν πιθανές επιδράσεις οροφής κατά τη διάρκεια δοκιμών, μια ξεχωριστή ομάδα ποντικών F1 έλαβε την ίδια εκπαίδευση με μόνο ένα CS‐US Η σύζευξη και η εξάλειψη του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα και η αυθόρμητη ανάκαμψη εξετάστηκαν επίσης. Η εξάλειψη του φόβου συνέβη σε πέντε διαδοχικές συνεδρίες, ξεκινώντας την επόμενη ημέρα μετά από τη δοκιμή με βάση τα συμφραζόμενα και τον υπόδειξη φόβου. Μετά την τελευταία συνεδρία εξαφάνισης, τα ποντίκια αφέθηκαν ανενόχλητα στα κλουβιά τους για 7 ημέρες και στη συνέχεια δοκιμάστηκαν ξανά στο πλαίσιο εκπαίδευσης για αυθόρμητη ανάκαμψη. Για να προσδιοριστεί εάν τυχόν παρατηρηθείσες διαφορές στην προετοιμασία του φόβου οφείλονταν σε διαφορές στην ευαισθησία στο σοκ, στο άγχος ή σε ευρύτερα ελλείμματα μάθησης, τα αρσενικά και θηλυκά ζώα NIC- και SAL-Sired δοκιμάστηκαν επιπλέον σε ανοιχτό πεδίο, ευαισθησία σε κραδασμούς, ανυψωμένο συν λαβύρινθο. EPM) και νέα παραδείγματα αναγνώρισης αντικειμένων (δείτε Υποστηρικτικές πληροφορίες για πλήρεις μεθόδους και αποτελέσματα).

2.5 Τροφή και ενδοφλέβια αυτοχορήγηση νικοτίνης

A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>25 σφαιρίδια ανά συνεδρία σε τρεις επόμενες συνεδρίες), τα άτομα υποβλήθηκαν σε καθετηριασμό της σφαγίτιδας φλέβας υπό αναισθησία με ισοφλουράνιο (1 τοις εκατό -3 τοις εκατό)/ατμό οξυγόνου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. να απαντήσει ξανά για ανταμοιβή φαγητού. Η αποκατάσταση της ανταπόκρισης της τροφής διασφαλίζει ότι τα ποντίκια έχουν αναρρώσει επαρκώς μετά την ενδοφλέβια χειρουργική επέμβαση και παρουσιάζουν φυσιολογική ανταπόκριση του χειρουργού μετά από καθυστέρηση στην πρόσβαση στους θαλάμους χειρουργείου. Στη συνέχεια επετράπη στα ποντίκια να λάβουν ενδοφλέβια (IV) αυτοχορήγηση νικοτίνης κατά τη διάρκεια ημερήσιων συνεδριών 1 ώρας, 6 έως 7 ημέρες την εβδομάδα (όξινο τρυγικό άλας νικοτίνης διαλυμένο σε 0.9 τοις εκατό στείρο ορό, {{1{ {12}}}}.03 mg/kg/έγχυση, ελεύθερο βάρος βάσης· MP Biomedical, Santa Ana, CA). Η νικοτίνη IV χορηγήθηκε με αντλία σύριγγας Razel (Med Associates). Κάθε συνεδρία είχε δύο ανασυρόμενους μοχλούς (ένας ενεργός, ένας ανενεργός). Η ολοκλήρωση των κριτηρίων απόκρισης στον ενεργό μοχλό είχε ως αποτέλεσμα τη χορήγηση ενδοφλέβιας έγχυσης νικοτίνης (0.{{20}}3 ml όγκος έγχυσης· πρόγραμμα FR5TO20 sec). Οι απαντήσεις στον ανενεργό μοχλό καταγράφηκαν αλλά δεν είχαν προγραμματισμένες συνέπειες. Μετά από οκτώ συνεδρίες λήψης στα 0,03 mg/kg/έγχυση, η δόση έγχυσης άλλαξε σε 0,1 mg/kg/έγχυση για έξι συνεδρίες. Για κάθε δόση, χρησιμοποιήθηκε η μέση πρόσληψη των τριών τελευταίων συνεδριών για στατιστικές αναλύσεις. Οι καθετήρες ξεπλύθηκαν καθημερινά με φυσιολογικό στείρο ορό (0,9 τοις εκατό w/v) που περιείχε ηπαρίνη (100 μονάδες USP/ml). Η βατότητα του καθετήρα επαληθεύτηκε με Brevital (μεθοεξιταλικό νάτριο, Eli Lilly, Indianapolis, IN) μετά τη φάση αυτοχορήγησης νικοτίνης. Για την αξιολόγηση της συμπεριφοράς που σχετίζεται με την υποτροπή, τα ποντίκια δοκιμάστηκαν για επώαση της λαχτάρας μετά τη συνεδρία αμέσως μετά την τελευταία δόση 0,1 mg/kg/έγχυση της ενδοφλέβιας αυτοχορήγησης νικοτίνης. Σε αυτή τη διαδικασία, τα ποντίκια επιτρέπεται να ανταποκρίνονται στον ενεργό μοχλό αλλά δεν λαμβάνουν εγχύσεις νικοτίνης. Στην πρώτη συνεδρία επώασης γραμμής βάσης (ημέρα 1), τα ποντίκια τοποθετήθηκαν σε θαλάμους χειριστή σύμφωνα με το πρόγραμμα FR5TO20 sec με ενδεχόμενη ενεργοποίηση φωτός υπόδειξης. Στη συνέχεια, τα ποντίκια στεγάστηκαν σε κλουβιά για 20 ημέρες. Την 21η ημέρα της αποχής, τα ποντίκια εξετάστηκαν ως προς την επώαση της λαχτάρας, με το ενεργό υπόδειξη μοχλού να χορηγείται σύμφωνα με το πρόγραμμα FR5TO20 sec. Οι μελέτες διεξήχθησαν από πειραματιστές τυφλούς σε συνθήκες ομάδας και οι αποκρίσεις συμπεριφοράς καταγράφηκαν αυτόματα από το λογισμικό MedAssociates.

2.6 Σύνδεση με υποδοχέα νικοτινικής ακετυλοχολίνης

Πραγματοποιήθηκε μια δοκιμασία δέσμευσης ραδιοσυνδέτη16 χρησιμοποιώντας ιππόκαμπο από ποντίκια F1 NIC-Sired (5 M και 10F) και SAL-Sired (9 M και 6F) ηλικίας 8 εβδομάδων. Τα δείγματα ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό λύσης (5 mM Tris συν 5 mM EDTA συν 5 mM EGTA), φυγοκεντρήθηκαν στα 100 000 g για 30 λεπτά στους 4 βαθμούς, επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης και φυγοκεντρήθηκαν ξανά. Τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε Tris/10 τοις εκατό ρυθμιστικό διάλυμα σακχαρόζης και επωάστηκαν με [3Η] Επιμπατιδίνη ([3Η]ΕΒ) (~2 nM με βάση 27,28) (ειδική δραστικότητα 54,1 Ci/mmol, PerkinElmer, Boston, ΜΑ) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Το [3H]EB επιλέχθηκε για τη δέσμευση nAChR, καθώς τα προηγούμενα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα ετερομερή 4 2 nAChR του ιππόκαμπου μεσολαβούν στις επιδράσεις της νικοτίνης στην προετοιμασία του φόβου.17 Η μη ειδική δέσμευση αξιολογήθηκε παρουσία 300 μM νικοτίνης (οξινοτρυγικό άλας νικοτίνης διαλυμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris, συγκέντρωση ελεύθερης βάσης). [3 Η]ΕΒ δεσμευμένα nAChR διηθήθηκαν (συγκομιστής κυττάρων 24 φρεατίων, Brandel Co, Gaithersburg, MD) και ένας μετρητής υγρού σπινθηρισμού (Tri‐Carb 2810 TR, Perkin Elmer, Boston, MA) μέτρησε τη ραδιενέργεια φίλτρου. Η ειδική δέσμευση που εκφράζεται ως fmol/mg ιστού υπολογίστηκε ως η διαφορά μεταξύ ολικής και μη ειδικής δέσμευσης.16

2.7 Αμπερομετρικές χολινεργικές καταγραφές in vivo

Μια ξεχωριστή κοόρτη από παρελθόντες ποντίκια NIC-Sired και SAL-Sired F1 ηλικίας 10- ηλικίας 20 εβδομάδων χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση αλλαγών στη χολινεργική μετάδοση του ιππόκαμπου χρησιμοποιώντας αμπερομετρία. Μικροηλεκτρόδια με βάση κεραμικά (Center for Microelectrode Technology, Lexington, KY), με 4 (15 × 333 μm) θέσεις εγγραφής πλατίνας διατεταγμένες σε ζεύγη (πάνω και κάτω), επικαλύφθηκαν με την οξειδάση χολίνης (Αριθμός EC 1.1.3.17, Sigma‐ Aldrich, St. Louis, MO), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως.29 Τα ηλεκτρόδια ηλεκτροπολυμερίστηκαν με μετα-φαινυλενοδιαμίνη (m‐PD, Sigma‐Aldrich, St. Louis, MO) για να ενισχυθεί η επιλεκτικότητα για την ανίχνευση ρευμάτων χολίνης. Μικροηλεκτρόδια με ευαισθησία μεγαλύτερη ή ίση με 3pA/μM και όριο ανίχνευσης μικρότερο ή ίσο με 400 nM για τη χολίνη χρησιμοποιήθηκαν για την παροχή ενός ευαίσθητου δείκτη απελευθέρωσης ακετυλοχολίνης (ACh).30 Τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν με ουρεθάνη (1,2-1,5 g/kg, ip) και τα επικαλυμμένα με ένζυμο μικροηλεκτρόδια στερεοταξικά χαμηλώθηκαν σε ραχιαία (A/P -1,7 mm, M/L ± 1,5 mm, D/V ‐2,3 mm) ή κοιλιακά (A/P -3,1 mm, M /L ± 3,0 mm, D/V −4,3 mm) ιππόκαμπος. Ο κοιλιακός και ο ραχιαίος ιππόκαμπος αξιολογήθηκαν χωριστά, καθώς συνεισφέρουν διαφορικά στην προσαρμογή του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα: ο κοιλιακός ιππόκαμπος (vHPC) έχει πιο σημαντικό ρόλο στη συσχέτιση και την έκφραση του φόβου, ενώ ο ραχιαίος ιππόκαμπος (DHCP) είναι κρίσιμος για τη μνήμη των συμφραζομένων.31 Ag/ Τα ηλεκτρόδια αναφοράς AgCl εμφυτεύθηκαν στον ετερόπλευρο νωτιαίο φλοιό.

Οι αμπερομετρικές εγγραφές πραγματοποιήθηκαν στα 2 Hz εφαρμόζοντας ένα σταθερό δυναμικό συν 0,7 V και τα δεδομένα ψηφιοποιήθηκαν (ποτενσιοστάτης FAST-16, Quainton, Nicholasville, KY). Τα ρεύματα υποβάθρου σταθεροποιήθηκαν για 60 λεπτά και στη συνέχεια τα φάρμακα εφαρμόστηκαν στον ιππόκαμπο χρησιμοποιώντας ένα γυάλινο τριχοειδές (διάμετρος άκρου: 15 μm) συνδεδεμένο στο ηλεκτρόδιο. Η απελευθέρωση ACh που προκαλείται από την εκπόλωση μετρήθηκε με την εφαρμογή είτε σύντομων παλμών καλίου (KCl 70 mM, 100 NL) είτε NIC (1 mM ελεύθερη βάση, τρυγική νικοτίνη, 100 NL) στα 2 έως 10 psi κάθε 2 λεπτά. Οι καταγραφές αντισταθμίστηκαν για την περιοχή του ιππόκαμπου (ραχιαία ή κοιλιακή) και το φάρμακο (κάλιο ή NIC). Τα πλάτη του σήματος χολίνης μετρήθηκαν με τη μεταβολή του ρεύματος στο επικαλυμμένο με ένζυμο κανάλι από το βασικό ρεύμα και μετατράπηκαν σε μΜ ισοδύναμα χολίνης με βάση τη βαθμονόμηση in vitro. Η αυτοαναφορά υιοθετήθηκε για την εξάλειψη των τεχνουργημάτων αφαιρώντας τα ρεύματα από τα κανάλια φρουρού.29 Η τοποθέτηση μικροηλεκτροδίων επαληθεύτηκε με χρώση Nissl των στεφανιαίων τομών του ιππόκαμπου (Εικόνα S1). Για στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν μέσοι όροι δύο αποκρίσεων ανά χειρισμό φαρμάκου ανά ζώο.

2.8 Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές συγκρίσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας SPSS (IBM, Armonk, NY) ή GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA). Οι ακραίες τιμές προσδιορίστηκαν με τιμές 2 τυπικές αποκλίσεις πάνω από τη μέση τιμή. Εάν εντοπίστηκε ακραία τιμή, οι πληροφορίες περιλαμβάνονται στην ενότητα αποτελεσμάτων. Το κριτήριο για τη σημασία ορίστηκε σε=.05. Αρχικά διενεργήθηκε στατιστική ανάλυση συμπεριλαμβανομένου του φύλου ως παράγοντα για όλα τα πειράματα που δοκιμάζουν τόσο αρσενικούς όσο και θηλυκούς απογόνους. Οι αναλύσεις κατέρρευσαν στο φύλο όταν δεν ανιχνεύθηκαν τριμερείς ή αμφίδρομες αλληλεπιδράσεις με το σεξ (P > 0,05). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με t-test, 1-way, ή 2-way ANOVA, ανάλογα με την περίπτωση. Σημαντικά κύρια αποτελέσματα ή επιδράσεις αλληλεπίδρασης ακολουθήθηκαν από συγκρίσεις LSD post hoc. Οι επαναλαμβανόμενες μετρήσεις ANOVA ακολουθήθηκαν από Bonferroni post hoc σύγκριση με διόρθωση για πολλαπλές συγκρίσεις. Εάν ανιχνεύονταν άνισες διακυμάνσεις, χρησιμοποιήθηκε το t-test Welch για άνισες διακυμάνσεις και οι βαθμοί ελευθερίας στρογγυλοποιήθηκαν προς τα κάτω.

2.9 Απομόνωση RNA/DNA

Ενήλικα ποντίκια F1 (ηλικίας 8 εβδομάδων, n=3 M και 3 F ανά ομάδα) υποβλήθηκαν σε ευθανασία μέσω εξάρθρωσης του τραχήλου της μήτρας. Ο ιππόκαμπος διαχωρίστηκε γρήγορα σε κοιλιακά και ραχιαία τμήματα (σε αναλογία 1:1), συγκεντρώθηκαν από την αριστερή και τη δεξιά πλευρά και καταψύχθηκαν με φλας σε ξηρό πάγο. DNA και RNA συν-απομονώθηκαν και καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Η συγκέντρωση και η ποιότητα του RNA και του DNA αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας NanoDrop2000 (NanoDrop, Wilmington, DE) και Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). Για τις εκχυλίσεις RNA, ο ελάχιστος αριθμός ακεραιότητας RNA (RIN) ήταν 8,5.

2.10 Ανάλυση μεταγραφών μέσω

Οι βιβλιοθήκες αλληλουχίας RNA προετοιμάστηκαν από τα Ινστιτούτα Huck του Life Sciences Genomics Core Facility (Πανεπιστήμιο Penn State) για αναγνώσεις μονής άκρης 150 bp χρησιμοποιώντας το κιτ προετοιμασίας βιβλιοθήκης Illumina TruSeq Stranded mRNA (Illumina, San Diego, CA) και έγινε αλληλουχία στο Illumina HiSeq 2500 σε λειτουργία ταχείας εκτέλεσης (τρεις διαδοχικές εκτελέσεις με περίπου 10 εκατομμύριο αναγνώσεις ανά δείγμα). Τα αρχεία FASTQ υποβλήθηκαν σε έλεγχο ποιότητας μέσω FASTQC και κατείχαν μέση βαθμολογία ποιότητας Phred ανά ανάγνωση μεγαλύτερη από 30 (δηλαδή, λιγότερο από 0,1 τοις εκατό σφάλμα αλληλουχίας). Τα αρχεία FASTQ ευθυγραμμίστηκαν με ένα γονιδίωμα αναφοράς ποντικιού (mm10, UCSC Genome Browser) χρησιμοποιώντας το TopHat (v2.1.0)32 στο Galaxy Project33. Τα μανικετόκουμπα και το Cuffmerge (v2.2.1.0)34 χρησιμοποιήθηκαν για τη συναρμολόγηση μεταγραφών από χαρτογραφημένες αναγνώσεις και τη συγχώνευση αρχείων μεταγραφής για την τελική συναρμολόγηση μεταγραφήματος. Προσαρμοσμένες τιμές P False Discovery Rate (FDR) υπολογίστηκαν για τη διαφορική γονιδιακή έκφραση από δείγματα NIC-Sired και SAL-Sired χρησιμοποιώντας Cuffdiff (v2.2.1.3),34 με τυπική αποκοπή FDR 0,05,35 κατατέθηκαν σύνολα δεδομένων Transcriptome στο Gene Expression Omnibus.

2.11 Ανάλυση εμπλουτισμού

Τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση διαδρομής εφευρετικότητας (IPA, που κυκλοφόρησε τον Δεκέμβριο του 2018, www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen, Redwood City, CA, ΗΠΑ)36 προκειμένου να αποκαλυφθεί ο πιθανός εμπλουτισμός των συνειρμικών βιολογικών δικτύων. Οι παράμετροι εκτέλεσης καθόρισαν το μέγιστο 35 μόρια ανά γονιδιακό δίκτυο και περιόρισαν την ανάλυση σε ιστούς ή κυτταρικές σειρές ΚΝΣ θηλαστικών. Η στατιστική σημασία για τον εμπλουτισμό προσδιορίστηκε με τη χρήση μιας δεξιάς ουράς ακριβούς δοκιμής Fisher που διορθώθηκε για πολλαπλές δοκιμές.

2.12 Στοχευμένη αλληλουχία διθειώδους

DNA που συν-απομονώθηκε με RNA (βλ. Ενότητα 2.9) χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση μεθυλίωσης DNA. Το RNA‐seq εντόπισε 952 και 162 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια σε vHPC και DHCP, αντίστοιχα. Τα 1010 μοναδικά γονίδια από αυτές τις συνδυασμένες λίστες επιλέχθηκαν για εμπλουτισμό σε διθειώδες-seq χρησιμοποιώντας ένα προσαρμοσμένο σύστημα εμπλουτισμού SeqCap Epi (Roche, Pleasanton, CA, ΗΠΑ, Πίνακας S1).38 Στοχευμένο όξινο θειώδες Η αλληλουχία πραγματοποιήθηκε στο Penn State Huck Institute of the Life Sciences Genomics Core Facility. Οι βιβλιοθήκες κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ KAPA Hyper Prep (Kapa Biosystems, Wilmington, ΜΑ). Οι βιβλιοθήκες που έχουν μετατραπεί από όξινο θειώδες νάτριο ενισχύθηκαν και εμπλουτίστηκαν με PCR για επιλεγμένες γονιδιωματικές περιοχές χρησιμοποιώντας ένα προσαρμοσμένο σύνολο ανιχνευτών σύλληψης (SeqCap Epi Choice Probes; Roche, Pleasanton, CA, USA). Η αλληλουχία του συλληφθέντος DNA έγινε στο Illumina HiSeq 2500 χρησιμοποιώντας αναγνώσεις ζευγών άκρων 100 nt. Τα αρχεία FASTQ ελέγχθηκαν ποιοτικά μέσω FASTQC. Οι ακολουθίες προσαρμογέων Illumina αφαιρέθηκαν και οι βάσεις χαμηλής ποιότητας περικόπηκαν χρησιμοποιώντας το Trimmomatic.39 Το κόψιμο βάσης χαμηλής ποιότητας πραγματοποιήθηκε με προσέγγιση συρόμενου παραθύρου, περικοπή όταν η μέση ποιότητα σε ένα παράθυρο τεσσάρων ζευγών βάσεων έπεσε κάτω από το όριο 20, με ελάχιστο μήκος ανάγνωσης 35. Μετά την περικοπή, τα αρχεία FASTQ είχαν μέση βαθμολογία ποιότητας Phred ανά ανάγνωση μεγαλύτερη από 30 (δηλ. λιγότερο από 0,1 τοις εκατό σφάλμα αλληλουχίας). Οι περικομμένες αναγνώσεις χαρτογραφήθηκαν στο γονιδίωμα αναφοράς του ποντικιού (mm10) χρησιμοποιώντας Bowtie240 που υλοποιήθηκε στο Bismark. Το 41 μεθυλ_εκχύλισμα εντός του Bismark χρησιμοποιήθηκε για την εξαγωγή πληροφοριών μεθυλίωσης CpG και για τη δημιουργία αναφορών μεθυλίωσης. Το MethylKit42 χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση διαφορικά μεθυλιωμένων περιοχών (DMRs). Η κατάσταση μεθυλίωσης συνοψίστηκε σε μη επικαλυπτόμενα παράθυρα των 500 ζευγών βάσεων και πραγματοποιήθηκε ανάλυση διαφορικής μεθυλίωσης, με τυπικό FDR 0,05,35 Τα σύνολα δεδομένων έχουν κατατεθεί στο Gene Expression Omnibus.

Οφέλη από το εκχύλισμα κιστάνς

3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

3.1 Η πατρική νικοτίνη ενισχύει την προετοιμασία του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα και αναστρέφει την οξεία ενίσχυση της νικοτίνης της συνθήκης φόβου σε ποντίκια γενιάς F1 και F2

NIC-Sired και SAL-Sired F1 αρσενικά και θηλυκά ποντίκια ήταν υπό συνθήκες φόβου μετά από οξεία χορήγηση SAL ή NIC (0.09 mg/kg ip, Εικόνα 1Α). Η πλήρης ανάλυση της βασικής γραμμής, του προ-CS και του παγώματος CS περιλαμβάνεται στις Υποστηρικτικές Πληροφορίες. Μια 3-way ANOVA του παγώματος των συμφραζομένων με την αγωγή με τους γονείς, την οξεία φαρμακευτική αγωγή και το φύλο ως παράγοντες αποκάλυψε μια σημαντική αλληλεπίδραση ως προς τον πατέρα × την οξεία φαρμακευτική αγωγή (F(1,36)=32.75, P <.{{27 }}01).="" επειδή="" δεν="" υπήρχε="" σημαντική="" αλληλεπίδραση="" μεταξύ="" του="" φύλου="" και="" του="" αδελφού="" ή="" της="" οξείας="" φαρμακευτικής="" αγωγής,="" πραγματοποιήθηκε="" μια="" αμφίδρομη="" anova="" που="" κατέρρευσε="" κατά="" τη="" διάρκεια="" του="" φύλου="" και="" αποκάλυψε="" μια="" σημαντική="" αλληλεπίδραση="" με="" την="" οξεία="" φαρμακευτική="" αγωγή="" (f(1,40)="20.96" ,="" ρ="">< .001).="" οι="" εκ="" των="" υστέρων="" συγκρίσεις="" έδειξαν="" ότι="" τα="" ποντίκια="" nic-sired="" f1="" που="" έλαβαν="" αγωγή="" με="" αλατόνερο="" εμφάνισαν="" αυξημένη="" προσαρμογή="" φόβου="" σε="" σχέση="" με="" τα="" ποντίκια="" sal-sired="" f1="" που="" έλαβαν="" φυσιολογικό="" ορό="" (t20="2.73," p=""><.05). σύμφωνα="" με="" τα="" προηγούμενα="" ευρήματα,43="" οξεία="" nic="" στα="" 0,09="" mg/kg="" παρήγαγαν="" ενισχυμένη="" συνθήκη="" φόβου="" σε="" ποντίκια="" sal-sired="" (t22="2.99," p=""><.01). ωστόσο,="" η="" οξεία="" nic="" στα="" 0,09="" mg/kg="" μείωσε="" τη="" συνθήκη="" του="" φόβου="" με="" βάση="" τα="" συμφραζόμενα="" σε="" ποντίκια="" με="" nic="" (t18="3.36," p="">< .01).="" συνολικά,="" τα="" επίπεδα="" κατάψυξης="" περιβάλλοντος="" σε="" ποντίκια="" nic-sired="" nic="" ήταν="" συγκρίσιμα="" με="" αυτά="" που="" παρατηρήθηκαν="" σε="" ποντίκια="" sal-sired="" sal="" και="" στα="" δύο="" 0,09="" mg/kg="" (p=""> 0,05).

Επιπλέον, αρσενικά και θηλυκά ζώα NIC- και SAL-Sired δοκιμάστηκαν σε ευαισθησία κραδασμών (Εικόνα S2), ανυψωμένο συν λαβύρινθο (EPM, Εικόνα S3), ανοιχτό πεδίο και νέα παραδείγματα αναγνώρισης αντικειμένων (Εικόνα S4, βλ. Υποστηρικτικές Πληροφορίες για πλήρεις μεθόδους και αποτελέσματα). Με εξαίρεση τα θηλυκά NIC-Sired στο EPM (που έδειξαν αυξημένες συμπεριφορές άγχους) και τα ζώα NIC-Sired σε ευαισθησία σοκ (που έδειξαν μειωμένη φωνητική αντιδραστικότητα στο σοκ, που δεν θα μπέρδευε τον ενισχυμένο φαινότυπο εκμάθησης φόβου πολλών γενεών), δεν υπάρχουν διαφορές ανιχνεύθηκαν μεταξύ ποντικών NIC- και SAL-Sired.

ΣΧΗΜΑ 1 Η πατρική νικοτίνη ενισχύει την προετοιμασία του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα και μειώνει την οξεία ενίσχυση της νικοτίνης της προετοιμασίας του φόβου. Η κατάψυξη με βάση τα συμφραζόμενα ήταν σημαντικά υψηλότερη στους ελέγχους NIC-Sired plus SAL σε σύγκριση με τους ελέγχους SAL-Sired plus SAL. Η οξεία νικοτίνη στα 0,09 mg/kg ενίσχυσε τη συνθήκη φόβου με βάση τα συμφραζόμενα σε SAL-Sired, αλλά μείωσε σημαντικά τη συνθήκη φόβου με βάση τα συμφραζόμενα σε ζώα με NIC-Sired (n=10-12 ανά ομάδα). Β, η κατάψυξη με βάση τα συμφραζόμενα ήταν σημαντικά υψηλότερη στους ελέγχους NIC-grandsire συν SAL σε σύγκριση με τους ελέγχους SAL-grandsire συν SAL (n=9-11 ανά ομάδα). Οι γραμμές σφαλμάτων υποδεικνύουν τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM), *P <>

Για να προσδιοριστεί εάν η εξασθενημένη προσαρμογή του φόβου με τα συμφραζόμενα συνεχίστηκε στην επόμενη γενιά (F2), τα αρσενικά και θηλυκά F2 ποντίκια NIC-grandsire και SAL-grandsire εκτράφηκαν από αφελή αρσενικά ποντίκια F1. Η πλήρης ανάλυση της βασικής γραμμής, του προ-CS και του παγώματος CS περιλαμβάνεται στις Υποστηρικτικές Πληροφορίες. Πραγματοποιήθηκε μια 3-way ANOVA παγώματος των συμφραζομένων με τη θεραπεία grandsire, την οξεία φαρμακευτική θεραπεία και το φύλο ως ανεξάρτητους παράγοντες (Εικόνα 1Β). Επειδή δεν υπήρχε σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ του φύλου και του πατέρα ή της οξείας φαρμακευτικής αγωγής, πραγματοποιήθηκε μια αμφίδρομη ANOVA κατάρρευση κατά τη διάρκεια του φύλου. Βρέθηκε μια σημαντική κύρια επίδραση του sire (F(1,37)=9.88, P <.{13}}1) και="" οι="" εκ="" των="" υστέρων="" συγκρίσεις="" έδειξαν="" ότι="" τα="" ποντίκια="" nic-grandsire="" εμφάνισαν="" επαυξημένη="" συνθήκη="" φόβου="" σε="" σύγκριση="" με="" με="" ποντίκια="" sal-grandsire="" (t39="3.04," p=""><0.01). επιπλέον,="" τα="" ποντίκια="" sal-grandsire="" στα="" οποία="" χορηγήθηκε="" οξεία="" nic="" είχαν="" ενισχυμένη="" συνθήκη="" φόβου="" με="" βάση="" τα="" συμφραζόμενα="" (t19="2.41," p="0.026)" αλλά="" η="" οξεία="" nic="" δεν="" ενίσχυσε="" τη="" συνθήκη="" φόβου="" με="" βάση="" τα="" συμφραζόμενα="" σε="" ποντίκια="">

ΕΙΚΟΝΑ 2 Η πατρική νικοτίνη ενισχύει τη συντηρητική προετοιμασία του φόβου και την αυθόρμητη ανάκτηση της μνήμης του φόβου. Για να εξεταστούν πιθανές επιδράσεις οροφής κατά τη διάρκεια των δοκιμών, μια ξεχωριστή κοόρτη ποντικών F1 έλαβε την ίδια εκπαίδευση με μόνο ένα ζεύγος CS-US. Τόσο η συνθήκη φόβου με βάση τα συμφραζόμενα όσο και η υπόδειξη φόβου αυξήθηκαν σε ποντίκια NIC-Sired σε σύγκριση με ποντίκια SAL-Sired που εκπαιδεύτηκαν με 1 ζεύγος CS-US (n=8-10 ανά ομάδα). Β, η έκθεση της πατρικής νικοτίνης δεν επηρέασε την εξάλειψη του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα, αλλά ενίσχυσε την αυθόρμητη ανάκτηση της μνήμης φόβου 7 ημέρες μετά την τελική συνεδρία εξαφάνισης (n=8-10 ανά ομάδα). Οι γραμμές σφαλμάτων υποδεικνύουν τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM), *P <>

3.2 Η πατρική νικοτίνη ενισχύει την προειδοποίηση του φόβου σε ποντίκια γενιάς F1

Για να εξεταστεί εάν ένα εφέ οροφής απέκλειε την ανίχνευση των διαφορών της ομάδας για τον υπόδειξη φόβου προετοιμασίας (βλ. Υποστηρικτικές πληροφορίες), μια ξεχωριστή ομάδα ποντικών F1 εκπαιδεύτηκε με ένα ζεύγος CS-US. Σε αυτήν την κοόρτη, η βελτίωση της συνθήκης φόβου με βάση τα συμφραζόμενα (t7=3.21, P < .05)="" καθώς="" και="" της="" συνθήκης="" συναγερμού="" φόβου="" βρέθηκε="" σε="" ποντίκια="" nic-sired="" (t6="2.41," p="">< .="" 05·="" εικόνα="">

3.3 Η πατρική νικοτίνη ενισχύει την αυθόρμητη ανάκτηση της μνήμης φόβου με βάση τα συμφραζόμενα σε ποντίκια γενιάς F1

Η κοόρτη των ποντικών F1 που έλαβαν ένα ζεύγος CS-US δοκιμάστηκε στη συνέχεια για εξαφάνιση και αυθόρμητη ανάκτηση της μνήμης φόβου με βάση τα συμφραζόμενα. Τα ποντίκια F1 NIC-Sired εμφάνισαν κανονική εξάλειψη φόβου, αλλά εμφάνισαν βελτιωμένη αυθόρμητη ανάκτηση της μνήμης φόβου με βάση τα συμφραζόμενα σε σχέση με τα ποντίκια SAL-Sired (t7=3.38, P < 0.05;="" εικόνα="">

3.4 Η πατρική νικοτίνη μειώνει την αυτοχορήγηση νικοτίνης

Πριν από την εκπαίδευση για αυτοχορήγηση νικοτίνης, τα άτομα αναλύθηκαν ως προς την ικανότητά τους να μάθουν μια λειτουργική εργασία για να λάβουν ανταμοιβή τροφής και δεν παρατηρήθηκαν διαφορές (Υποστηρικτικές πληροφορίες, Εικόνα S5). Για να ελεγχθούν οι πιθανές επιδράσεις της έκθεσης της μητέρας στη νικοτίνη στην ενίσχυση της νικοτίνης σε απογόνους F1, η απόκτηση ενδοφλέβιας αυτοχορήγησης νικοτίνης (0.03 mg/kg/έγχυση) αξιολογήθηκε σε μια αμφίδρομη ANOVA μικτού σχεδιασμού, η οποία ταυτοποιήθηκε ένα κύριο αποτέλεσμα της συνεδρίας (F(7.119)=13.60, P < .001)="" και="" μια="" αλληλεπίδραση="" θεραπείας="" συνεδρίας="" ×="" συνεδρίας="" (f(7.119)="5.00," p="">< .001).="" ωστόσο,="" οι="" δοκιμές="" post="" hoc="" δεν="" αποκάλυψαν="" στατιστικά="" σημαντικές="" διαφορές="" μεταξύ="" των="" ομάδων="" σε="" καθεμία="" από="" τις="" οκτώ="" συνεδρίες="" απόκτησης="" (εικόνα="" 3α).="" στη="" συνέχεια,="" ο="" αριθμός="" των="" ενεργών="" και="" ανενεργών="" πιέσεων="" μοχλού="" αναλύθηκε="" για="" να="" προσδιοριστεί="" εάν="" οι="" ομάδες="" διατήρησαν="" μια="" προτίμηση="" κατά="" τη="" διάρκεια="" της="" περιόδου="" σύνδεσης="" για="" τον="" ενεργό="" μοχλό="" κατά="" την="" απόκτηση="" (εικόνα="" 3β),="" η="" οποία="" εντόπισε="" ένα="" κύριο="" αποτέλεσμα="" της="" συνεδρίας="" (f(7,238)="" {{20}="" }.18,="" p="">< .001)="" και="" μια="" συνεδρία="" ×="" αλληλεπίδραση="" με="" τη="" θεραπεία="" (f(21,238)="11.40," p="">< .001).="" η="" post="" hoc="" ανάλυση="" αποκάλυψε="" ότι="" οι="" ομάδες="" διέφεραν="" την="" πρώτη="" ημέρα="" της="" αυτοχορήγησης="" νικοτίνης.="" η="" ομάδα="" nic-sired="" παρουσίασε="" μεγαλύτερη="" ενεργή="" πίεση="" μοχλού="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" sal-sired.="" αυτό="" το="" αποτέλεσμα="" μπορεί="" είτε="" να="" αντιπροσωπεύει="" μεγαλύτερο="" επίπεδο="" συμπεριφοράς="" αναζήτησης="" ναρκωτικών="" την="" πρώτη="" ημέρα="" έκθεσης,="" επιμονή="" στην="" ανταπόκριση="" για="" ανταμοιβή="" τροφής="" και/ή="" μειωμένη="" γνωστική="" ευελιξία="" κατά="" τη="" μετάβαση="" απόκρισης="" από="" τροφή="" σε="" φάρμακο.="" ωστόσο,="" αυτή="" η="" διαφορά="" δεν="" παρέμεινε="" σε="" περαιτέρω="" συνεδρίες.="" τα="" ποντίκια="" sal-sired="" εμφάνισαν="" σταθερή="" στατιστικά="" σημαντική="" προτίμηση="" για="" τον="" ενεργό="" μοχλό="" έναντι="" του="" ανενεργού="" μοχλού="" τους="" (post="" hoc="" p=""><.01), αλλά="" τα="" ποντίκια="" nic-sired="" δεν="" εμφάνισαν="" αυτή="" τη="" διατηρούμενη="" προτίμηση="" για="" τις="" συνεδρίες="" 3="" έως="">

ΕΙΚΟΝΑ 3 Η πατρική νικοτίνη μειώνει την αυτοχορήγηση νικοτίνης. Αρσενικά ποντίκια NIC- και SAL-Sired (n=9-10 ανά ομάδα) δεν διέφεραν στον συνολικό αριθμό εγχύσεων που κερδήθηκαν για κάθε συνεδρία κατά τη διάρκεια της περιόδου απόκτησης στις 0 .03 mg/kg/δόση έγχυσης. B, Κατά τη διάρκεια της απόκτησης, ο αριθμός των ενεργών και ανενεργών πιεστηρίων μοχλού διέφερε σημαντικά κατά την πρώτη συνεδρία, με τα ποντίκια NIC-Sired να παρουσιάζουν μεγαλύτερο αριθμό ενεργών πιεστηρίων μοχλού σε σύγκριση με τα ποντίκια SAL-Sired. Ωστόσο, κατά τις επόμενες συνεδρίες, τα ποντίκια NIC-Sired μείωσαν την ανταπόκριση, με αποτέλεσμα να μην υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ του ενεργού και του ανενεργού αριθμού πιέσεων μοχλού στις συνεδρίες 3 έως 8. Αντίθετα, τα ζώα SAL-Sired εμφάνισαν σταθερή στατιστικά σημαντική προτίμηση για τον ενεργό μοχλό πάνω από τον ανενεργό μοχλό τους. C, ο μέσος αριθμός εγχύσεων νικοτίνης στις τρεις τελευταίες συνεδρίες λήψης δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ των ποντικών NIC- και SAL-Sired. D, Σε μέτρια δόση 0,1 mg/kg/έγχυση, τα ποντίκια NIC-Sired αυτοχορηγήθηκαν σημαντικά μικρότερος αριθμός εγχύσεων νικοτίνης. Ε, η αξιολόγηση της επώασης της λαχτάρας αποκάλυψε σημαντική αύξηση στην ανταπόκριση στον προηγουμένως ενεργό μοχλό μετά από 21 ημέρες αποχής μόνο για ποντίκια SAL-Sired. Οι γραμμές σφαλμάτων υποδεικνύουν τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM), *P <>

Για να εξεταστούν περαιτέρω οι πιθανές διαφορές της ομάδας ενώ ελέγχεται η μεταβλητότητα κατά την αρχική φάση λήψης, εξετάστηκε ο μέσος αριθμός εγχύσεων νικοτίνης για τις τελευταίες τρεις συνεδρίες, μια στιγμή κατά την οποία τα άτομα εμφάνισαν πιο σταθερές αποκρίσεις για τη νικοτίνη (Εικόνα 3Γ). Οι ομάδες δεν διέφεραν σημαντικά στον μέσο αριθμό εγχύσεων νικοτίνης (P > .05). Στη συνέχεια, τα ποντίκια μετατράπηκαν σε δόση νικοτίνης 0,1 mg/kg/έγχυση, που προηγουμένως είχε αποδειχθεί ότι προτιμούνταν σε ενήλικα ποντίκια C57BL6/J.44 Σε αυτή τη δόση, τα ποντίκια NIC-Sired χορηγούσαν μόνοι τους μικρότερο αριθμό εγχύσεων (t{ {7}}.20, P < .05·="" εικόνα="" 3d).="" για="" την="" επώαση="" της="" συμπεριφοράς="" της="" λαχτάρας,="" η="" οποία="" θεωρείται="" μέτρο="" αυξημένης="" αναζήτησης="" ναρκωτικών="" κατά="" τη="" διάρκεια="" της="" αποχής,="" μια="" αμφίδρομη="" anova="" μικτού="" σχεδιασμού="" με="" θεραπεία="" συνεδρίας="" και="" συνεδρίας="" προσδιόρισε="" το="" κύριο="" αποτέλεσμα="" της="" συνεδρίας="" (f(1,17)="" {{16}="" },90,="" p="">< ,001).="" ενώ="" τα="" ζώα="" sal-sired="" εμφάνισαν="" αποτέλεσμα="" επώασης="" με="" μεγαλύτερες="" αποκρίσεις="" την="" 21η="" ημέρα="" της="" αποχής="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ημέρα="" 1,="" τα="" ποντίκια="" nic-sired="" δεν="" εμφάνισαν="" αύξηση="" στη="" συμπεριφορά="" αναζήτησης="" νικοτίνης="" (p=""><>

3.5 Η πατρική έκθεση στη νικοτίνη μεταβάλλει τη χολινεργική δέσμευση και τη λειτουργία του ιππόκαμπου

Η δέσμευση ετερομερούς nAChR του ιππόκαμπου υψηλής συγγένειας ρυθμίστηκε προς τα πάνω σε ποντίκια NIC-Sired F1 (t28=2.14, P <.05; sal-sired="1.21" ±="" {{10}="" }.043,="" nic‐sired="1.34" ±="" 0.044).="" ένα="" άτομο="" (nic-sired)="" αφαιρέθηκε="" επειδή="" οι="" τιμές="" δέσμευσης="" ήταν="" δύο="" τυπικές="" αποκλίσεις="" πάνω="" από="" τον="" μέσο="">

Οι αμπερομετρικές καταγραφές των ρευμάτων ACh που προκαλούνται από κάλιο και νικοτίνη αξιολογήθηκαν σε F1 dHPC και vHPC. Λόγω των άνισων μεγεθών δειγμάτων ανά φύλο, το φύλο δεν συμπεριλήφθηκε ως προκαταρκτικός παράγοντας σε αυτές τις αναλύσεις. Τα χολινεργικά σήματα που προκαλούνται από αποπόλωση KCl δεν διέφεραν μεταξύ των ποντικών SAL- και NIC-Sired σε dHPC (P > .05; Εικόνα 4Α). Ωστόσο, η τοπική εφαρμογή νικοτίνης οδήγησε σε σημαντική μείωση των εύρους χολινεργικού σήματος σε ποντίκια NIC-Sired (t8=2.33, P <.05; εικόνα="" 4c).="" στο="" vhpc,="" η="" απελευθέρωση="" ach="" μειώθηκε="" σε="" ποντίκια="" nic-sired="" μετά="" από="" εφαρμογή="" kcl="" (t8="2.60," p=""><.05; εικόνα="" 4β)="" ή="" νικοτίνης="" (t8="2.98," p="">< .05="" ;="" εικόνα="">

ΕΙΚΟΝΑ 4 Η πατρική νικοτίνη μειώνει τη χολινεργική σηματοδότηση στον ιππόκαμπο. Ένας πληθυσμός dHPC σήματα χολίνης που προκαλούνται από την επαγόμενη από KCl τερματική εκπόλωση. Δεν εντοπίστηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ ζώων NIC- και SAL-Sired (n=5 ανά ομάδα). B, τα σήματα χολίνης πληθυσμού vHPC που προκαλούνται από την επαγόμενη από KCl τερματική εκπόλωση μειώθηκαν σε ποντίκια NIC-Sired. C, τα σήματα χολίνης dHPC πληθυσμού που προκαλείται από νικοτίνη μειώθηκαν σε ποντίκια NIC-Sired. D, τα σήματα χολίνης vHPC πληθυσμού που προκαλείται από νικοτίνη μειώθηκαν σε ποντίκια NIC-Sired. Δεν παρατηρήθηκαν επιδράσεις του σεξ στη χολινεργική σηματοδότηση. Οι γραμμές σφαλμάτων υποδεικνύουν τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM), *P <>

3.6 Η πατρική έκθεση στη νικοτίνη μεταβάλλει διαφορικά τη ραχιαία και κοιλιακή γονιδιακή έκφραση του ιππόκαμπου

Η ανάλυση μεταγραφώματος του ιππόκαμπου F1 μέσω προσδιορισμού αλληλουχίας RNA αποκάλυψε 952 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια σε vHPC (FDR=0.05; Πίνακας S2). Από αυτά τα γονίδια, 612 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω και 340 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω σε ποντίκια NIC-Sired. Στο dHPC, μόνο 162 γονίδια εκφράστηκαν διαφορικά σε ποντίκια NIC-Sired σε σύγκριση με ποντίκια SAL-Sired (FDR=0.05). Από αυτά τα 162 γονίδια, τα 86 υπορυθμίστηκαν και τα 76 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω. Εκατόν τρία γονίδια με αλλοιωμένη γονιδιακή έκφραση επικαλύφθηκαν μεταξύ vHPC και dHPC.

3.7 Η πατρική έκθεση στη νικοτίνη μεταβάλλει τις μεταγραφικές οδούς που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος

Στο vHPC, η ανάλυση IPA εντόπισε το κορυφαίο δίκτυο "Neurological Disease, Organismal Injury and Abnormalities, Cell Death and Survival" (βαθμολογία=41, Πίνακας S3) και το δεύτερο κορυφαίο δίκτυο "Nervous System Development and Function, Tissue Morphology, Neurological Νόσος" (βαθμολογία=23). Οι πέντε κορυφαίες κατηγορίες Μοριακών και Κυτταρικών Λειτουργιών ήταν: "Μορφολογία Κυττάρου" (88 μόρια), "Κυτταρική Συναρμολόγηση και Οργάνωση" (79 μόρια), "Κυτταρική Ανάπτυξη" (96 μόρια), "Κυτταρική Λειτουργία και Συντήρηση" (79 μόρια), και "Cellular Growth and Proliferation" (87 μόρια). Οι κορυφαίες Λειτουργίες και Ανάπτυξη Φυσιολογικού Συστήματος ήταν "Ανάπτυξη και Λειτουργία Νευρικού Συστήματος" (175 μόρια) και μερικές από τις κορυφαίες Λειτουργίες Νοσημάτων και Διαταραχών περιλαμβάνουν "Νευρολογική Νόσος" (δεύτερη, 191 μόρια) και "Ψυχολογικές Διαταραχές" (τέταρτο, 90 μόρια ) (Πίνακας S4).

Συμπληρωματικά με τα αποτελέσματα του IPA, η ανάλυση εμπλουτισμού χρησιμοποιώντας το Enrichr παρείχε περαιτέρω στοιχεία για αλλαγές στην κυτταρική ανάπτυξη και ανάπτυξη σε vHPC, με κορυφαίους βιολογικούς όρους GO όπως "μάτισμα RNA", "απόκριση σε ξεδιπλωμένη πρωτεΐνη" και "ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης" και " σταθεροποίηση πρωτεΐνης» (Πίνακας S5). Αντίστοιχα, το "spliceosomal complex" αναγνωρίστηκε ως κορυφαίος κυτταρικός όρος GO. Η ανάλυση μονοπατιού KEGG μέσω του Enrichr έδειξε επιπλέον τη λειτουργία του ματίσματος και τη σηματοδότηση MAPK ως δυνητικά επηρεαζόμενες οδούς.

Παρά τον πολύ μικρότερο κατάλογο διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων στο dHPC σε σύγκριση με τον vHPC, ταυτοποιήθηκαν παρόμοια μονοπάτια και όροι εμπλουτισμένα με dHPC (Πίνακες S3 και S4). Η ανάλυση IPA προσδιόρισε το κορυφαίο δίκτυο "Συμπεριφορά, Νευρολογική νόσο, Οργανικό Τραυματισμό και Ανωμαλίες" (βαθμολογία=24) και το δεύτερο κορυφαίο δίκτυο "Νευρολογικές ασθένειες, οργανικοί τραυματισμοί και ανωμαλίες και ψυχολογικές διαταραχές (βαθμολογία=20) .

Οι πέντε κορυφαίες κατηγορίες Μοριακών και Κυτταρικών Λειτουργιών στο dHPC ήταν "Κυτταρική Ανάπτυξη" (29 μόρια), "Κυτταρική Ανάπτυξη και Πολλαπλασιασμός" (29 μόρια), "Μορφολογία Κυττάρου" (27 μόρια), "Κυτταρική Συναρμολόγηση και Οργάνωση" (23 μόρια) , και "Cellular Function and Maintenance" (25 molecules). Η "Ανάπτυξη και Λειτουργία Νευρικού Συστήματος" αναγνωρίστηκε και πάλι ως ο κορυφαίος εμπλουτισμένος όρος στην ταξινόμηση της Ανάπτυξης και της Λειτουργίας του Φυσιολογικού Συστήματος (δεύτερος, 44 μόρια). Οι κορυφαίοι εμπλουτισμένοι όροι στην ταξινόμηση της Λειτουργίας Νοσημάτων και Διαταραχών περιελάμβαναν "Νευρολογική νόσο" (1η, 51 μόρια) και "Ψυχολογικές Διαταραχές" (πέμπτη, 31 μόρια). Η ανάλυση εμπλουτισμού χρησιμοποιώντας το Enrichr εντόπισε πολλούς διαφορετικούς βιολογικούς όρους GO για το dHPC σε σύγκριση με το vHPC, συμπεριλαμβανομένης της "ρύθμισης του θανάτου νευρώνων" και της "ανάπτυξης του εγκεφάλου" (Πίνακας S5), η οποία είναι συμπληρωματική της μοριακής και κυτταρικής λειτουργίας IPA "Θάνατος και επιβίωση κυττάρων".

Για να διερευνηθεί περαιτέρω ο λειτουργικός ρόλος των διαφορικά εκφραζόμενων μεταγραφών που επικαλύπτονται μεταξύ των dHPC και vHPC, αξιολογήθηκαν διαφορικά εκφρασμένα γονίδια κοινά και στις δύο περιοχές (συνολικά 103). Τα επικαλυπτόμενα διαφορικά εκφρασμένα μεταγραφήματα μεταξύ των δύο περιοχών υπορυθμίστηκαν ή ρυθμίστηκαν προς τα πάνω προς την ίδια κατεύθυνση, υποδηλώνοντας κοινές αλλαγές στα μεταγραφικά μονοπάτια στις περιοχές του εγκεφάλου σε ποντίκια που είχαν υποστεί NIC. Οι πέντε κορυφαίες κατηγορίες Μοριακών και Κυτταρικών Λειτουργιών που προσδιορίστηκαν από το IPA ήταν «Κυτταρικός θάνατος και επιβίωση» (17 μόρια), «Κυτταρική κίνηση» (10 μόρια), «Σηματοδότηση και αλληλεπίδραση κυττάρου σε κύτταρο» (17 μόρια), «Κυτταρική ανάπτυξη and Proliferation" (18 μόρια) και "Cell Morphology" (17 molecules) (Πίνακας S4)

Τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια μοναδικά για τα dHPC και vHPC αναλύθηκαν στη συνέχεια χωριστά σε IPA προκειμένου να δοκιμαστούν για αποκλίνουσες νευροβιολογικές προσαρμογές μεταξύ των δύο περιοχών (Πίνακας S6). Καμία εμπλουτισμένη κανονική οδός δεν επικαλύπτεται μεταξύ των μοναδικών αναλύσεων μοναδικού dHPC vHPC. Τα κορυφαία εμπλουτισμένα κανονικά μονοπάτια μοναδικά για το vHPC (44 συνολικά) περιλάμβαναν "Σηματοδότηση ασβεστίου" και "Σηματοδότηση υποδοχέα γλυκοκορτικοειδών", ενώ τα κορυφαία κανονικά μονοπάτια dHPC (οκτώ συνολικά) περιλάμβαναν "Μεταβολισμό ορμονών θυρεοειδούς" και "Σηματοδότηση απόπτωσης με τη μεσολάβηση ρετινοϊκού οξέος". Οι εμπλουτισμένες ασθένειες και οι μοναδικές λειτουργίες του vHPC (συνολικά 295) περιελάμβαναν "Σχηματισμός Κέρας του Άμμωνα [Hippocampus]" και "Quantity of Cellular Protrusions", ενώ οι μοναδικά εμπλουτισμένοι με dHPC όροι ασθένειες και λειτουργίες (συνολικά 111) περιλάμβαναν "Φλεγμονή λευκής ουσίας" και "Απομυελίνωση". ."

3.8 Η πατρική έκθεση στη νικοτίνη μεταβάλλει τη μεθυλίωση του DNA του ιππόκαμπου

Πραγματοποιήθηκε μια στοχευμένη ανάλυση μεθυλίωσης DNA για να προσδιοριστεί εάν η αλλοιωμένη μεθυλίωση DNA σε αντίστοιχες ρυθμιστικές περιοχές αντιπροσώπευε τη διαφορική έκφραση γονιδίου στους απογόνους NIC-Sired F1. Οι στόχοι περιελάμβαναν 1114 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια που ταυτοποιήθηκαν είτε σε dHPC είτε σε vHPC. Σε vHPC, ανιχνεύθηκαν 11 διαφορικά μεθυλιωμένες περιοχές (DMRs), με οκτώ να παρουσιάζουν αυξημένη μεθυλίωση και τρεις να παρουσιάζουν μειωμένη μεθυλίωση (Πίνακας 1). Από τα 11 DMR, τα 10 εντοπίστηκαν σε περιοχές που σχετίζονται με ένα γονίδιο που εμφάνιζε αλλοιωμένη έκφραση στο vHPC. Στο dHPC, ανιχνεύθηκαν 30 DMR, με 15 να παρουσιάζουν αυξημένη μεθυλίωση και 15 να παρουσιάζουν μειωμένη μεθυλίωση. Από τα 30 DMR, τα 29 εντοπίστηκαν σε περιοχές που σχετίζονται με ένα γονίδιο που εμφάνιζε αλλοιωμένη έκφραση στο dHPC.

Μπενωφέλεια εχινακοσίδης κιστάνχης

4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Η αυξημένη κατανόηση των επιγενετικών διεργασιών σε συνδυασμό με πρόσφατα δεδομένα, συμπεριλαμβανομένων των παρόντων ευρημάτων, έχει αμφισβητήσει την παραδοσιακή κατανόηση της κληρονομικότητας. Παράγοντες πέρα ​​από τον γονότυπο και μόνο μπορούν να καθορίσουν τους φαινοτύπους στις επόμενες γενιές και οι εκθέσεις σε μια γενιά μπορεί να μην απομονωθούν από τους απογόνους. Η παρούσα μελέτη προτείνει ότι οι επιβλαβείς επιπτώσεις στην υγεία από την έκθεση στη νικοτίνη μπορεί να υπερβαίνουν την ατομική έκθεση και να επηρεάσουν τις επόμενες γενιές. Προσδιορίσαμε πολυγενεακές και διαγενεακές επιδράσεις της πατρικής έκθεσης στη νικοτίνη πριν από τη σύλληψη σε ποντίκια C57BL/6J στην προετοιμασία του φόβου Παβλόβιου, με αποτέλεσμα ισχυρότερες μνήμες φόβου στους απογόνους F1 και F2. Η μητρική έκθεση στη νικοτίνη είχε επίσης ως αποτέλεσμα μειωμένη αυτοχορήγηση νικοτίνης και εξασθενημένες συμπεριφορές που σχετίζονται με την υποτροπή, υποδηλώνοντας μεγαλύτερη αποστροφή στη νικοτίνη. Προς υποστήριξη αυτών των διαφορών συμπεριφοράς, παρατηρήθηκαν πολυγενεακές αλλαγές στη χολινεργική λειτουργία του ιππόκαμπου και στις επιγενετικές διεργασίες. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν αλλαγές στη λειτουργία του νευρικού συστήματος στους απογόνους ποντικών που εκτέθηκαν στη νικοτίνη με αποτέλεσμα αλλοιωμένους φαινοτύπους συμπεριφοράς.

Οι απόγονοι F1 και F2 αρσενικών ποντικών που εκτέθηκαν στη νικοτίνη εμφάνισαν βελτιωμένη συνθήκη και συντηρητικό φόβο. Παρά τις διαφορές στην εξάλειψη του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα μεταξύ των ποντικών NIC- και SAL-Sired F1, τα ποντίκια NIC-Sired εμφάνισαν ενισχυμένη αυθόρμητη ανάκτηση των αναμνήσεων φόβου με βάση τα συμφραζόμενα. Είναι σημαντικό ότι δεν βρέθηκαν διαφορές στην ευαισθησία των κραδασμών μεταξύ των ποντικών NIC- και SAL-Sired που θα μπορούσαν να ευθύνονται για την αυξημένη προετοιμασία του φόβου. Η ενισχυμένη προετοιμασία του φόβου μπορεί να υποδηλώνει γενικευμένη ενίσχυση των διαδικασιών μάθησης σε αντίθεση με τη διαμόρφωση διαδικασιών πιο ειδικών για το φόβο για μάθηση. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στην αναγνώριση νέου αντικειμένου, στην εκπαίδευση χειριστή τροφής ή στην κίνηση ανοιχτού πεδίου σε ποντίκια NIC-Sired, αν και εντοπίστηκε μια ειδική για το φύλο επίδραση του αυξημένου χρόνου ανοιχτού βραχίονα EPM σε θηλυκά ποντίκια NIC-Sired. Αν και αυτό δεν αποκλείει πιθανές τροποποιήσεις σε άλλα συστήματα μάθησης ή γνωστικές διαδικασίες, αυτά τα ευρήματα μαζί υποδηλώνουν ότι η μάθηση του φόβου μπορεί να είναι πιο ευαίσθητη στις πολυγενεακές και διαγενεακές επιδράσεις της πατρικής έκθεσης στη νικοτίνη. Επιπλέον, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν μια αλλοιωμένη χολινεργική λειτουργία σε ζώα NIC-Sired. Η νικοτίνη ρυθμίζει τη συνθήκη φόβου. Ενώ η οξεία νικοτίνη ενισχύει τη ρύθμιση του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα,15,45 η απόσυρση από τη χρόνια νικοτίνη διαταράσσει την προετοιμασία του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα.16,21 Στην παρούσα μελέτη, η οξεία νικοτίνη ενίσχυσε τη συνθήκη φόβου σε ποντίκια F1 και F2 από ποντίκια που έλαβαν φυσιολογικό ορό. Αντίθετα, η οξεία νικοτίνη διέκοψε τη συνθήκη φόβου σε ποντίκια NIC-Sired και δεν είχε καμία επίδραση στα ποντίκια NIC-grandsire, γεγονός που μπορεί να υποδεικνύει αλλοιωμένη χολινεργική λειτουργία στον ιππόκαμπο.

Οι επιδράσεις της πατρικής έκθεσης στη νικοτίνη στην επακόλουθη αυτοχορήγηση νικοτίνης στη γενιά F1 δείχνουν επίσης διαταραχή της χολινεργικής λειτουργίας. Κατά τη διάρκεια της απόκτησης της ενδοφλέβιας αυτοχορήγησης νικοτίνης στη χαμηλότερη δόση, οι ομάδες δεν διέφεραν στον αριθμό των εγχύσεων νικοτίνης, αν και διαπιστώθηκε αύξηση στον αριθμό των ενεργών πιεστηρίων μοχλού στην ομάδα NIC-Sired. Αυτό υποδηλώνει ότι τα ποντίκια NIC-Sired μπορεί να έχουν επιδείξει επιμονή στην ανταπόκριση για ανταμοιβή τροφής και/ή μειωμένη γνωστική ευελιξία στη μετάβαση απόκρισης από τροφή σε φάρμακο. Ωστόσο, αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι οι ομάδες δεν διέφεραν την 1η ημέρα της επώασης της λαχτάρας, η οποία αντιπροσωπεύει μια συνεδρία εξαφάνισης (π.χ. χωρίς εγχύσεις νικοτίνης κατά τη διάρκεια της συνεδρίας) και επομένως, αυτό το φαινόμενο φαίνεται να ήταν παρόν όταν οι ενισχυτές αλλά όχι απουσία ενισχυτή κατά τη διάρκεια μιας συνεδρίας κατάσβεσης. Τα ποντίκια NIC-Sired εμφάνισαν επίσης μειωμένη αυτοχορήγηση νικοτίνης στη μέτρια δόση, η οποία ευθυγραμμίζεται με την πρόσφατη εργασία που εντοπίζει μειώσεις στη χορήγηση αλκοόλ, κοκαΐνης και οπιοειδών που σχετίζονται με γονική έκθεση σε αλκοόλ, κοκαΐνη και μορφίνη (π.χ. Vassoler et al,46 ως αναθεωρήθηκε στους Goldberg και Gould47). Η παρατηρούμενη μείωση της αυτοχορήγησης νικοτίνης μπορεί να αποδοθεί είτε σε μειωμένη ευαισθησία στις ανταποδοτικές επιδράσεις της νικοτίνης και/ή σε αυξημένη ευαισθησία στις αποτρεπτικές επιδράσεις της νικοτίνης. Πράγματι, οι ομάδες διέφεραν στη μέτρια δόση νικοτίνης αλλά όχι στη χαμηλότερη δόση νικοτίνης, γεγονός που υποστηρίζει την έννοια της αυξημένης αποστροφής απόκρισης με την υψηλότερη δόση. Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε επίσης έλλειψη επώασης της λαχτάρας την 21η ημέρα σε ποντίκια NIC-Sired μετά από αυτοχορήγηση στη μέτρια δόση, υποδηλώνοντας ότι η μειωμένη συμπεριφορά αναζήτησης νικοτίνης θα μπορούσε να σχετίζεται με μια μνήμη που σχετίζεται με την αποστροφή για τη νικοτίνη. Αν και διάφορα νευρικά υποστρώματα μπορεί να αποτελούν τη βάση αυτών των επιδράσεων στην πρόσληψη νικοτίνης και στην ανταπόκριση που σχετίζεται με την υποτροπή, μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε ότι η μειωμένη μεθυλτρανσφεράση του DNA στην περιοχή CA1 του ιππόκαμπου μείωσε την αυτοχορήγηση μορφίνης.48 Αυτό το εύρημα, μαζί με τη γνωστή λειτουργία της χολινεργικής λειτουργίας του ιππόκαμπου σε διεργασίες μάθησης και μνήμης, υποστηρίζει περαιτέρω την έννοια της διαταραγμένης επεξεργασίας που προκαλείται από τη νικοτίνη στον ιππόκαμπο των ποντικών NIC-Sired.

Κατά μήκος αυτών των γραμμών, τα ποντίκια NIC-Sired εμφάνισαν αυξημένη δέσμευση nAChR υψηλής συγγένειας στον ιππόκαμπο. Βρήκαμε επίσης μειώσεις στην απελευθέρωση ACh που προκαλείται από κάλιο στο vHPC καθώς και στην απελευθέρωση ACh που προκαλείται από νικοτίνη τόσο σε dHPC όσο και σε vHPC των ζώων NIC-Sired. Οι αλλαγές στην απελευθέρωση ACh που προκαλείται από την εκπόλωση αντανακλούν αλλοιωμένη χολινεργική λειτουργία κατάντη της δέσμευσης του υποδοχέα, ενώ οι αλλαγές στην απελευθέρωση ACh που προκαλείται από τη νικοτίνη αντανακλούν αλλοιωμένη λειτουργία nAChR. Αυτά τα δεδομένα συνάδουν με προηγούμενα ευρήματα για ρυθμισμένη προς τα πάνω δέσμευση nAChR υψηλής συγγένειας μετά από μειωμένη λειτουργία nAChR.49 Επειδή τόσο η προκαλούμενη από κάλιο όσο και η προκαλούμενη από νικοτίνη απελευθέρωση ACh αλλοιώθηκαν στον vHPC των ποντικών NIC-Sired, το vHPC μπορεί να είναι πιο ευαίσθητο σε τις επιπτώσεις πολλών γενεών της πατρικής έκθεσης στη νικοτίνη. Η DHPC είναι γνωστό ότι ρυθμίζει τη συνθήκη του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα.31,50 Η αναστολή του vHPC διαταράσσει τόσο την κατάσταση του φόβου που προκαλείται όσο και από τα συμφραζόμενα 51,52 και οι χολινεργικές βλάβες vHPC βλάπτουν την προκαλούμενη προετοιμασία του φόβου.53

Βότανο κιστανάκι

Δείξαμε επίσης ότι η άμεση έγχυση νικοτίνης στο dHPC ενισχύει τη ρύθμιση του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα, ενώ η έγχυση σε vHPC διαταράσσει τη συνθήκη φόβου με βάση τα συμφραζόμενα. 54 Ενώ άλλες περιοχές του εγκεφάλου που εμπλέκονται στην προετοιμασία του φόβου, όπως η αμυγδαλή,55 μπορεί επίσης να επηρεαστούν από την πατρική έκθεση στη νικοτίνη, αυτά τα ευρήματα μαζί με τα παρόντα δεδομένα υποδηλώνουν ότι οι αλλαγές στη λειτουργία του vHPC μπορεί να είναι υπεύθυνες για την αλλοιωμένη ρύθμιση του φόβου σε ποντίκια NIC-Sired . Υποθέσαμε ότι τα αποτελέσματα πολλών γενεών της πατρικής έκθεσης στη νικοτίνη μπορεί να σχετίζονται με αλλαγές στους μεταγραφικούς τελεστές που δρουν ανάντη αυτών των νευρικών συστημάτων. Η μεταγραφική αλληλουχία σε ολόκληρο το γονιδίωμα σε vHPC και dHPC ποντικών γενιάς F1 εντόπισε 1114 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια μεταξύ ποντικών NIC- και SAL-Sired. Αυτή η διαφορά ήταν μεγαλύτερη στο vHPC (952) έναντι του dHPC (162), σε συμφωνία με τη μεγαλύτερη αλλαγή στο vHPC σε σχέση με τη χολινεργική λειτουργία του dHPC και τις αλλαγές τόσο στο πλαίσιο όσο και στη συνθήκη φόβου. Η επακόλουθη ανάλυση οδού πρότεινε ευρείες αλλοιώσεις στις μεταγραφικές οδούς που σχετίζονται με τη σηματοδότηση των γλυκοκορτικοειδών και τη νευρική ανάπτυξη/πλαστικότητα και στις δύο περιοχές του ιππόκαμπου.

Προκειμένου να εντοπιστούν πιθανές προσαρμογές ειδικές για τον vHPC, διεξήχθη ανάλυση μονοπατιού χρησιμοποιώντας μόνο μεταγραφές ειδικά για κάθε υποπεριοχή του ιππόκαμπου. Δεν υπάρχουν εμπλουτισμένες κανονικές οδοί IPA που επικαλύπτονται μεταξύ του vHPC και του dHPC, οι οποίες είναι λειτουργικά διακριτές υποπεριοχές του ιππόκαμπου.31 Όταν αφαιρέθηκαν γονίδια που αλληλεπικαλύπτονταν μεταξύ dHPC και vHPC, οι κορυφαίες εμπλουτισμένες κανονικές οδοί μοναδικές για vHPC περιελάμβαναν "Γλυκοκορτικοειδές μοναδικό σήμα υποδοχέα" , πρόσθετη αλλαγή στη λειτουργία των γλυκοκορτικοειδών σε αυτή την περιοχή σε σύγκριση με το dHPC. Με στόχο τον εντοπισμό ανοδικών επιγενετικών ρυθμιστών που μπορεί να δράσουν στην έκφραση γονιδίων, πραγματοποιήσαμε στοχευμένη αλληλουχία μεθυλίωσης DNA χρησιμοποιώντας τη συγκεντρωμένη λίστα των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων dHPC και vHPC που ταυτοποιούνται από την αλληλουχία RNA. Παραδόξως, βρήκαμε μόνο 11 DMRs σε vHPC και 30 DMRs σε dHPC μεταξύ ζώων NIC- και SAL-Sired. Αν και αυτό είναι απροσδόκητο δεδομένου του πολύ μεγαλύτερου αριθμού διαφορικά εκφραζόμενων μεταγραφών σε vHPC, η μεθυλίωση του DNA είναι μόνο ένας από τους πολλούς ρυθμιστικούς παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν την έκφραση γονιδίου και η μεθυλίωση του DNA δεν μεταφράζεται σταθερά σε αλλαγμένη γονιδιακή έκφραση.56 Από τα 11 DMR vHPC, επτά εμφάνισαν μοτίβα μεθυλίωσης σύμφωνα με την κατεύθυνση της διαφορικής μεταγραφής (μειωμένη μεταγραφή με αυξημένη μεθυλίωση DNA και αυξημένη μεταγραφή με μειωμένη μεθυλίωση). Τα διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια στο vHPC περιελάμβαναν τα Fkbp5, Ksr1 και Pnpla2. Είναι ενδιαφέρον ότι η μεταγραφή Fkbp5 και Ksr1 διαταράχθηκε σε ένα μοντέλο συμπεριφοράς ποντικού PTSD,57 όπου τα ποντίκια εκτέθηκαν σε ηλεκτρικό σοκ και στη συνέχεια παρουσίασαν υπενθυμίσεις κατάστασης. Το Fkbp5 κωδικοποιεί έναν συνοδό υποδοχέα γλυκοκορτικοειδών του οποίου η λειτουργία έχει συσχετιστεί με μια δυσπροσαρμοστική παρατεταμένη απόκριση στρες σε άτομα με PTSD και άλλες αγχώδεις διαταραχές.58

Συγκεκριμένα, μελέτες σε ανθρώπους δείχνουν ότι η μεθυλίωση και η μεταγραφή του Fkbp5 συσχετίζονται με τη σοβαρότητα των συμπτωμάτων PTSD, έτσι ώστε η αυξημένη μεθυλίωση και η μειωμένη μεταγραφή προβλέπουν πιο σοβαρή συμπτωματολογία PTSD. Η έκφραση 59,60 Fkbp5 ρυθμίζει τη λειτουργία του άξονα HPA, η οποία θεωρείται ότι μεσολαβεί στη συμμετοχή της PTSD.59,61 Το εύρημα της ενισχυμένης αυθόρμητης ανάκτησης της μνήμης του φόβου σε συνδυασμό με τη δυσρύθμιση των μεταγραφικών οδών που σχετίζονται με τη σηματοδότηση γλυκοκορτικοειδών σε ζώα με NIC-Sired μπορεί να υποδηλώνει αυξημένη ευπάθεια σε φαινότυπους που μοιάζουν με PTSD. Στο dHPC, τα μοτίβα DMR ήταν σε μεγάλο βαθμό ασυνεπή με την κατεύθυνση της διαφορικής έκφρασης μεταγραφής που βρέθηκε από τον προσδιορισμό αλληλουχίας RNA, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι αλλαγές στη μεθυλίωση του DNA του vHPC που παράγεται από την πατρική έκθεση στη νικοτίνη είναι πιο επακόλουθες όσον αφορά την επίδραση της γονιδιακής έκφρασης από εκείνες στο dHPC. Αυτό είναι σύμφωνο με την ταυτοποίησή μας για μεγαλύτερο αριθμό διαφορικά εκφρασμένων μεταγραφών και πιο υπερβολικές αλλαγές στη χολινεργική μετάδοση στο NIC-Sired vHPC σε σύγκριση με το dHPC. Η στοχευμένη μας προσέγγιση αλληλουχίας μπορεί να έχει περιορίσει την ικανότητα ανίχνευσης πιθανής μεταγραφικής ρύθμισης από απομακρυσμένα μεθυλιωμένες αλληλουχίες. Μελλοντικές έρευνες, συμπεριλαμβανομένης της ανάλυσης της μεθυλίωσης του DNA σε όλο το γονιδίωμα, των τροποποιήσεων ιστόνης και της έκφρασης μικρού RNA θα παρέχουν μια πληρέστερη ερμηνεία αυτών των ευρημάτων.

Ένας πιθανός περιορισμός του σχεδιασμού μας για την έκθεση στη νικοτίνη είναι η εστίαση στην πατρική έκθεση στη νικοτίνη για τη διερεύνηση του αντίκτυπου της έκθεσης στη νικοτίνη σε πολλές και διαγενεακές γενεές. Αν και άλλες μελέτες που βρήκαν φαινότυπους πολλαπλών/διαγενεακών μετά από έκθεση από τον πατέρα σε ναρκωτικά, συμπεριλαμβανομένης της κοκαΐνης46 και της μορφίνης,62 δεν βρήκαν διαφορές στη μητρική φροντίδα, είναι πιθανό η πατρική έκθεση στη νικοτίνη να επηρεάζει τη μητρική φροντίδα. Μελλοντικές μελέτες που θα διερευνήσουν τον αντίκτυπο στη μητρική φροντίδα είναι δικαιολογημένες. Καθώς η τρέχουσα εστίασή μας ήταν στην έκθεση του πατέρα, η μελλοντική εργασία θα πρέπει επίσης να συγκρίνει τις επιπτώσεις της έκθεσης από τον πατέρα σε σχέση με τη μητέρα. Συνολικά, τα παρόντα ευρήματα παρέχουν μια νέα κατανόηση των επιπτώσεων πολλών γενεών και διαγενεακών επιδράσεων της έκθεσης στη νικοτίνη, οι οποίες υποστηρίζονται από μια αυξανόμενη βιβλιογραφία που χαρακτηρίζει τις πολλαπλές και διαγενεακές επιδράσεις της έκθεσης στα ναρκωτικά (όπως εξετάζονται στους Goldberg και Gould47). Αυτή η μελέτη ήταν η πρώτη που εξέτασε τη συνθήκη φόβου σε απογόνους F1 και F2 αρσενικών εκτεθειμένων στη νικοτίνη και εντόπισε ενισχυμένο σχηματισμό μνήμης φόβου και αυθόρμητη ανάκτηση αναμνήσεων φόβου. Αυτή η μελέτη ήταν επίσης η πρώτη που εντόπισε αλλοιωμένη αυτοχορήγηση νικοτίνης και επώαση της λαχτάρας σε απογόνους που εκτέθηκαν στη νικοτίνη F1.

Διαφορική μεθυλίωση σε γονίδια που σχετίζονται με PTSD και απορρύθμιση του άξονα HPA καθώς και ταυτόχρονες διαταραχές στις μεταγραφικές οδούς που σχετίζονται με το στρες βρέθηκαν σε ποντίκια NIC-Sired. Η πατρική νικοτίνη συσχετίστηκε επίσης με μειωμένη χολινεργική λειτουργία του ιππόκαμπου και αυξημένη δέσμευση nAChR στον ιππόκαμπο. Είναι ενδιαφέρον ότι οι ασθενείς με μετατραυματική διαταραχή που δεν κάπνιζαν εμφανίζουν σημαντικά υψηλότερη δέσμευση nAChR υψηλής συγγένειας μεσοχρονικής φλοιώδους φλοιού63 και η μετατραυματική μετατραυματική διαταραχή σχετίζεται με μεγαλύτερη προετοιμασία του φόβου και αυθόρμητη ανάκτηση σβησμένων αναμνήσεων φόβου.64 Μαζί, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η έκθεση στη νικοτίνη μπορεί να έχει επίδραση πολλών γενεών αυξάνοντας την ευαισθησία των απογόνων σε συμπτωματολογία παρόμοια με PTSD. Αυτό το εύρημα μαζί με άλλα πρόσφατα ευρήματα που δείχνουν τα αποτελέσματα πολλών γενεών της έκθεσης στη νικοτίνη στη γνωστική ευελιξία2 υποδηλώνουν ότι τα αρνητικά αποτελέσματα για την υγεία της έκθεσης στη νικοτίνη δίνουν ένα ευρύτερο δίχτυ από ό,τι πιστευόταν προηγουμένως.

Εκχύλισμα Cistanche

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1 Dai J, Wang Z, Xu W, et al. Η πατρική έκθεση στη νικοτίνη ορίζει διαφορετική συμπεριφορά στην επόμενη γενιά μέσω υπερμεθυλίωσης του mmu-miR-15b. Sci Rep. 2017;7(1):7286.

2. McCarthy DM, Morgan TJ Jr, Lowe SE, et al. Η έκθεση αρσενικών ποντικών στη νικοτίνη προκαλεί διαταραχές στη συμπεριφορά σε πολλές γενιές απογόνων. PLoS Biol. 2018; 16(10):e2006497.

3. Zhu J, Lee KP, Spencer TJ, Biederman J, Bhide PG. Διαγενεακή μετάδοση υπερκινητικότητας σε μοντέλο ποντικού με ΔΕΠΥ. J Neurosci. 2014;34(8):2768‐2773.

4. Cummings KM, Proctor RN. Η μεταβαλλόμενη δημόσια εικόνα του καπνίσματος στις Ηνωμένες Πολιτείες: 1964-2014. Βιοδείκτες καρκινικής επιδημιόλης Προηγ. 2014;23(1):32‐36.

5. Huang LL, Kowitt SD, Sutfin EL, Patel T, Ranney LM, Goldstein AO. Η χρήση ηλεκτρονικού τσιγάρου μεταξύ μαθητών γυμνασίου και η συσχέτισή της με τη χρήση τσιγάρου και τη διακοπή του καπνίσματος, North Carolina Youth Tobacco Surveys, 2011 και 2013. Prev Chronic Dis. 2016; 13: E103.

6. Holliday ED, Nucero Ρ, Kutlu MG, et αϊ. Μακροπρόθεσμες επιδράσεις της χρόνιας νικοτίνης στις συναισθηματικές και γνωστικές συμπεριφορές και τη μορφολογία των κυττάρων του ιππόκαμπου σε ποντίκια: συγκρίσεις έκθεσης στη νικοτίνη ενηλίκων και εφήβων. Eur J Neurosci. 2016; 44:2818-2828.

7. Johnson JG, Cohen P, Pine DS, Klein DF, Kasen S, Brook JS. Συσχέτιση μεταξύ του καπνίσματος τσιγάρων και των αγχωδών διαταραχών κατά την εφηβεία και την πρώιμη ενήλικη ζωή. ΤΖΑΜΑ. 2000; 284:2348-2351.

8. Jung Y, Hsieh LS, Lee AM, et al. Ένας επιγενετικός μηχανισμός μεσολαβεί στις αναπτυξιακές επιδράσεις της νικοτίνης στη δομή και τη συμπεριφορά των νευρώνων. Nat Neurosci. 2016;19(7):905‐914.

9. Gitik Μ, Holliday ED, Leung Μ, et αϊ. Η χολίνη βελτιώνει τα ελλείμματα μάθησης των ενηλίκων και αναστρέφει την επιγενετική τροποποίηση των παραγόντων αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης που σχετίζονται με την έκθεση των εφήβων στη νικοτίνη. Neurobiol Learn Mem. 2018; 155:239‐248.

10. Πουλί Α. Αντιλήψεις επιγενετικής. Φύση. 2007;447:396-398.

11. Skinner MK. Περιβαλλοντική επιγενετική διαγενεακή κληρονομικότητα και σωματική επιγενετική μιτωτική σταθερότητα. Επιγενετική. 2011; 6:838-842.

12. Davis JA, Gould TJ. Συνειρμική μάθηση, ιππόκαμπος και εθισμός στη νικοτίνη. Curr Drug Abuse Rev. 2008;1:9‐19.

13. Kutlu MG, Parikh V, Gould TJ. Εθισμός στη νικοτίνη και ψυχιατρικές διαταραχές. Int Rev Neurobiol. 2015;124:171‐208.

14. Parikh V, Kutlu MG, Gould TJ. Η δυσλειτουργία του nAChR ως κοινό υπόστρωμα για τη σχιζοφρένεια και τον συννοσηρό εθισμό στη νικοτίνη: τρέχουσες τάσεις και προοπτικές. Schizophr Res. 2016; 171:1-15.

15. Kenney JW, Raybuck JD, Gould TJ. Οι νικοτινικοί υποδοχείς στον ραχιαίο και στον κοιλιακό ιππόκαμπο ρυθμίζουν διαφορικά τη συνθήκη του φόβου. Ιππόκαμπος. 2012; 22:1681-1690.

16. Wilkinson DS, Turner JR, Blendy JA, Gould TJ. Το γενετικό υπόβαθρο επηρεάζει τις επιδράσεις της απόσυρσης από τη χρόνια νικοτίνη στη μάθηση και στη δέσμευση του υποδοχέα νικοτινικής ακετυλοχολίνης υψηλής συγγένειας στον ραχιαίο και κοιλιακό ιππόκαμπο. Ψυχοφαρμακολογία (Βερολίνο). 2013;225(1): 201‐208.

17. Davis JA, Gould TJ. Οι επιδράσεις των DHBE και MLA στην επαγόμενη από τη νικοτίνη ενίσχυση της συνθήκης φόβου σε ποντίκια C57BL/6. Ψυχοφαρμακολογία (Βερολίνο). 2006; 184:345-352.

18. Kutlu MG, Zeid D, Tumolo JM, Gould TJ. Τα προ-εφηβικά και έφηβα ποντίκια είναι λιγότερο ευαίσθητα στις επιπτώσεις της οξείας νικοτίνης στην εξαφάνιση και την αυθόρμητη ανάκαμψη. Brain Res Bull. 2018; 138:50‐55.

19. Kutlu MG, Gould TJ. Η οξεία νικοτίνη καθυστερεί την εξάλειψη του συναφούς φόβου στα ποντίκια. Behav Brain Res. 2014; 263:133-137.

20. Benowitz NL, Hukkanen J, Jacob P 3rd. Χημεία νικοτίνης, μεταβολισμός, κινητική και βιοδείκτες. Στο: Ψυχοφαρμακολογία Νικοτίνης. Βερολίνο, Χαϊδελβέργη: Springer; 2009:29-60.

21. Davis JA, James JR, Siegel SJ, Gould TJ. Η απόσυρση από τη χρόνια χορήγηση νικοτίνης μειώνει τη συνθήκη φόβου σε ποντίκια C57BL/6. J Neurosci. 2005; 25:8708-8713.

22. Petersen DR, Norris KJ, Thompson JA. Μια συγκριτική μελέτη της διάθεσης της νικοτίνης και των μεταβολιτών της σε τρία συγγενή στελέχη ποντικών. Drug Metab Dispos. 1984; 12:725-731.

23. Gould TJ, Portugal GS, Andre JM, et al. Η διάρκεια των ελλειμμάτων που σχετίζονται με τη στέρηση της νικοτίνης στη συνθήκη του φόβου είναι παράλληλη με τις αλλαγές στην ανοδική ρύθμιση του υποδοχέα νικοτινικής ακετυλοχολίνης υψηλής συγγένειας του ιππόκαμπου. Νευροφαρμακολογία. 2012;62:2118‐2125.

24. Kutlu MG, Oliver C, Huang P, Liu‐Chen LY, Gould TJ. Η εξασθένηση της εξάλειψης του φόβου με βάση τη χρόνια νικοτίνη και η απόσυρση από τη χρόνια νικοτίνη σχετίζεται με την ανοδική ρύθμιση του nAChR του ιππόκαμπου. Νευροφαρμακολογία. 2016; 109:341‐348. 25. Damaj MI, Kao W, Martin BR. Χαρακτηρισμός της αυθόρμητης και κατακρημνισμένης απόσυρσης νικοτίνης στο ποντίκι. J Pharmacol Exp Ther. 2003; 307:526-534.

26. Fowler CD, Lu Q, Johnson PM, Marks MJ, Kenny PJ. Η σηματοδότηση της υπομονάδας άλφα5 νικοτινικού υποδοχέα ελέγχει την πρόσληψη νικοτίνης. Φύση. 2011; 471:597-601.

27. Lomazzo E, MacArthur L, Yasuda RP, Wolfe BB, Kellar KJ. Ποσοτική ανάλυση των ετερομερών νευρωνικών νικοτινικών υποδοχέων στον ιππόκαμπο αρουραίου. J Neurochem. 2010; 115:625-634.

28. Turner JR, Castellano LM, Blendy JA. Παράλληλες αγχολυτικές επιδράσεις και ανοδική ρύθμιση των νευρωνικών νικοτινικών υποδοχέων ακετυλοχολίνης μετά από χρόνια νικοτίνη και βαρενικλίνη. Nicotine Tob Res. 2011; 13:41-46.

29. Parikh V, Ji J, Decker MW, Starter M. Οι υποδοχείς που περιέχουν προμετωπιαία βήτα2 υπομονάδα και άλφα7 νικοτινική ακετυλοχολίνη ελέγχουν διαφορικά τη γλουταμινεργική και τη χολινεργική σηματοδότηση. J Neurosci. 2010;30: 3518‐3530.

30. Parikh V, Starter M. Forebrain cholinergic systems and cognition: new insights που βασίζονται στην ταχεία ανίχνευση αιχμών χολίνης χρησιμοποιώντας βιοαισθητήρες βασισμένους σε ένζυμα. Στο: Microelectrode Biosensors. Totowa, NJ: Humana Press; 2013:257‐277.

31. Fanselow MS, Dong HW. Είναι ο ραχιαίος και ο κοιλιακός ιππόκαμπος λειτουργικά διακριτές δομές; Νευρώνας. 2010;65(1):7‐19.

32. Kim D, Pertea G, Trapnell C, Pimentel H, Kelley R, Salzberg SL. TopHat2: ακριβής ευθυγράμμιση των μεταγραφωμάτων παρουσία εισαγωγών, διαγραφών και συγχωνεύσεων γονιδίων. Genome Biol. 2013; 14(4): R36.

33. Afgan Ε, Baker D, van den Beek Μ, et al. Η πλατφόρμα Galaxy για προσιτές, αναπαραγώγιμες και συνεργατικές βιοϊατρικές αναλύσεις: ενημέρωση 2016. Nucleic Acids Res. 2016;44:W3‐w10.

34. Trapnell C, Williams BA, Pertea G, et al. Η συναρμολόγηση και η ποσοτικοποίηση μεταγραφής από το RNA-Seq αποκαλύπτει μη σχολιασμένα μεταγραφήματα και εναλλαγή ισομορφών κατά τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Nat Biotechnol. 2010;28(5): 511‐515.

35. Benjamini Y, Drai D, Elmer G, Kafkafi N, Golani I. Έλεγχος του ποσοστού ψευδούς ανακάλυψης στην έρευνα γενετικής συμπεριφοράς. Behav Brain Res. 2001; 125(1‐2):279‐284.

36. Kramer A, Green J, Pollard Jr, Tugendreich S. Προσεγγίσεις αιτιατικής ανάλυσης στην Ανάλυση Διαδρομής Επινοητικότητας. Βιοπληροφορική. 2014;30(4): 523‐530.

37. Kuleshov MV, Jones MR, Rouillard AD, et al. Enrichr: μια ολοκληρωμένη ενημέρωση διακομιστή web 2016 για ανάλυση εμπλουτισμού συνόλων γονιδίων. Nucleic Acids Res. 2016;44(Ε1): Ε90‐Ε97.

38. Wendt J, Rosenbaum Η, Richmond ΤΑ, Jeddeloh JA, Burgess DL. Στοχευμένη αλληλουχία διθειώδους με χρήση του συστήματος εμπλουτισμού SeqCap epi. Μέθοδοι ΜοΙ ΒίοΙ. 2018; 1708:383-405.

39. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: ένα ευέλικτο trimmer για δεδομένα ακολουθίας Illumina. Βιοπληροφορική. 2014;30(15):2114‐2120.

40. Langmead B, Salzberg SL. Γρήγορη ευθυγράμμιση ανάγνωσης με κενό με Bowtie 2. Μέθοδοι Nat. 2012;9(4):357‐359.

41. Krueger F, Andrews SR. Bismark: ένας εύκαμπτος ευθυγραμμιστής και καλωτής μεθυλίωσης για εφαρμογές Bisulfite‐Seq. Βιοπληροφορική. 2011;27(11):1571‐1572.

42. Akalin Α, Kormaksson Μ, Li S, et αϊ. methylKit: ένα ολοκληρωμένο πακέτο R για την ανάλυση προφίλ μεθυλίωσης DNA σε όλο το γονιδίωμα. Genome Biol. 2012; 13(10): R87.

43. Gould TJ, Lommock JA. Η νικοτίνη ενισχύει τη συνθήκη φόβου και βελτιώνει τα ελλείμματα που προκαλούνται από αιθανόλη στη συνθήκη φόβου. Behav Neurosci. 2003;117(6):1276‐1282.

44. Fowler CD, Kenny PJ. Ενδοφλέβια αυτοχορήγηση νικοτίνης και επαναφορά που προκαλείται από σήματα σε ποντίκια: επιδράσεις της δόσης νικοτίνης, ρυθμός έγχυσης φαρμάκου και προηγούμενη εκπαίδευση με όργανα. Νευροφαρμακολογία. 2011;61(4):687‐698.

45. Gould TJ, Wehner JM. Ενίσχυση της νικοτίνης της συνθήκης φόβου. Behav Brain Res. 1999;102(1‐2):31‐39.

46. ​​Vassoler FM, White SL, Schmidt HD, Sadri‐Vakili G, Pierce RC. Επιγενετική κληρονομικότητα ενός φαινοτύπου ανθεκτικότητας στην κοκαΐνη. Nat Neurosci. 2013;16(1):42‐47.

47. Goldberg LR, Gould TJ. Πολυγενεακές και διαγενεακές επιπτώσεις της πατρικής έκθεσης σε ναρκωτικά κατάχρησης στη συμπεριφορά και τη νευρική λειτουργία. Eur J Neurosci. 2018;50(3):2453‐2466.

48. Zhang JJ, Jiang FZ, Zheng W, et αϊ. Το DNMT3a στο CA1 του ιππόκαμπου είναι ζωτικής σημασίας για την απόκτηση αυτοχορήγησης μορφίνης σε αρουραίους. Addict Biol. 2019;▪:▪‐▪.

49. Schwartz RD, Kellar KJ. Θέσεις δέσμευσης νικοτινικών χολινεργικών υποδοχέων στον εγκέφαλο: ρύθμιση in vivo. Επιστήμη. 1983;220(4593):214‐216.

50. Logue SF, Paylor R, Wehner JM. Οι βλάβες του ιππόκαμπου προκαλούν ελλείμματα μάθησης σε ποντίκια που ανήκουν στον υδάτινο λαβύρινθο Morris και εξαρτημένο φόβο. Behav Neurosci. 1997, 111(1):104‐113.

51. Zhang WN, Bast T, Feldon J. Ο κοιλιακός ιππόκαμπος και η προετοιμασία του φόβου σε αρουραίους: διαφορετικές προχωρημένες αμνησίες φόβου μετά από έγχυση N-methyl-D-aspartate ή του μη ανταγωνιστικού ανταγωνιστή του MK-801 στον κοιλιακό ιππόκαμπο. Behav Brain Res. 2001;126(1‐2):159‐174.

52. Maren S, Holt WG. Ο ιππόκαμπος και ο φόβος του Παβλόβιου ρυθμισμού σε αρουραίους: οι εγχύσεις μουσκιμόλης στον κοιλιακό, αλλά όχι στον ραχιαίο, ιππόκαμπο βλάπτουν την απόκτηση της κατάψυξης υπό όρους σε ένα ακουστικό υπό όρους ερέθισμα. Behav Neurosci. 2004;118(1):97‐110.

53. Staib JM, Della Valle R, Knox DK. Η διάρρηξη του έσω διαφράγματος και των διαγώνιων ζωνών των χολινεργικών προβολών Broca στον κοιλιακό ιππόκαμπο διαταράσσει την ακουστική μνήμη φόβου. Neurobiol Learn Mem. 2018; 152:71-79.

54. Vasquez JH, Leong KC, Gagliardi CM, Harland B, Apicella AJ, Muzzio ΙΑ. Η ειδική για το μονοπάτι ενεργοποίηση των κοιλιακών κυττάρων του ιππόκαμπου που προβάλλουν στον προεγκεφαλικό φλοιό μειώνει την ανανέωση του φόβου. Neurobiol Learn Mem. 2019; 161:63-71.

55. LeDoux JE, Cicchetti P, Xagoraris A, Romanski LM. Ο πλάγιος αμυγδαλοειδής πυρήνας: η αισθητική διεπαφή της αμυγδαλής σε συνθήκες φόβου. J Neurosci. 1990;10(4):1062‐1069.

56. Jones PA. Λειτουργίες μεθυλίωσης DNA: νησίδες, θέσεις έναρξης, γονιδιακά σώματα και πέρα. Nat Rev Genet. 2012;13(7):484‐492.

57. Tanaka Μ, Li Η, Zhang X, et αϊ. Ρύθμιση γονιδίων που εξαρτάται από την περιοχή και τον χρόνο στην αμυγδαλή και τον πρόσθιο περιφερικό φλοιό ενός μοντέλου ποντικού που μοιάζει με PTSD. Μολ Εγκέφαλος. 2019; 12 (1): 25.

58. Βιβλίο ΕΒ. Ο ρόλος του FKBP5, ενός συνοδηγού του υποδοχέα γλυκοκορτικοειδών στην παθογένεση και τη θεραπεία συναισθηματικών και αγχωδών διαταραχών. Ψυχονευροενδοκρινολογία. 2009;34(Suppl 1): S186‐S195.

59. Sarapis C, Cai G, Bierer LM, et al. Γενετικοί δείκτες για τον κίνδυνο PTSD και την ανθεκτικότητα μεταξύ των επιζώντων από τις επιθέσεις του Παγκόσμιου Κέντρου Εμπορίου. Μαρκαδόροι Dis. 2011;30(2‐3):101‐110.

60. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F, et al. Επιγενετικοί βιοδείκτες ως προγνωστικοί παράγοντες και συσχετισμοί της βελτίωσης των συμπτωμάτων μετά από ψυχοθεραπεία σε βετεράνους μάχης με PTSD. Μπροστινό Ψυχ. 2013; 4:118.

61. Yehuda R, Cai G, Grolier JA, et al. Μοτίβα γονιδιακής έκφρασης που σχετίζονται με διαταραχή μετατραυματικού στρες μετά από έκθεση σε επιθέσεις στο Παγκόσμιο Κέντρο Εμπορίου. Biol Psychiatry. 2009; 66:708-711.

62. Li CQ, Luo YW, Bi FF, et αϊ. Ανάπτυξη συμπεριφοράς παρόμοιας με άγχος μέσω σηματοδότησης IGF-2 του ιππόκαμπου στους απογόνους της γονικής έκθεσης στη μορφίνη: επίδραση εμπλουτισμένου περιβάλλοντος. Νευροψυχοφαρμακολογία. 2014;39(12):2777‐2787.

63. Czermak C, Staley JK, Kasserman S, et al. Διαθεσιμότητα βήτα2 νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης στη διαταραχή μετατραυματικού στρες. Int J Neuropsychopharmacol. 2008;11(3):419‐424.

64. Milad MR, Pitman RK, Ellis CB, et al. Νευροβιολογική βάση της αποτυχίας ανάκλησης μνήμης εξαφάνισης στη διαταραχή μετατραυματικού στρες. Biol Psychiatry. 2009;66(12):1075‐1082.