Μέρος 2: Βιοδραστικές ενώσεις από την Ephedra Fragilis: Βελτιστοποίηση εκχύλισης, Χημικός Χαρακτηρισμός, Αντιοξειδωτικές και Αντιγλυκοζωικές Δραστηριότητες

Για περισσότερες πληροφορίες. Επικοινωνίαtina.xiang@wecistanche.com

2.7.Δραστηριότητα κατά της γλυκόζης

2.7.1.UV-Visible Analysis

Το φάσμα UV-vis είναι μια γρήγορη, συνεπής και απλή τεχνική που χρησιμοποιείται συνήθως για την ανίχνευση αλλαγών διαμόρφωσης πρωτεϊνών και σχηματισμού συμπλόκου. Τα φάσματα απορρόφησης της φυσικής και γλυκιωμένης BSA επωάστηκαν για 15 ημέρες παρουσία ή απουσία CEE/κλασμάτων καθώς καικερσετίνη(θετικός έλεγχος) παρουσιάζονται στο Σχήμα 3Α.

Φάνηκε ξεκάθαρα ότι η φυσική BSA εμφανίζει μια χαρακτηριστική κορυφή στα 入2s0 nm, η οποία οφείλεται κυρίως στα αρωματικά αμινοξέα, συμπεριλαμβανομένης της τυροσίνης, της τρυπτοφάνης και της φαινυλαλανίνης [47].

Μετά την τροποποίηση με γλυκόζη, η απορρόφηση στα λ280 nm ήταν 60,57 τοις εκατό πιο υπερχρωμική από τη φυσική BSA. Η αυξημένη ένταση απορρόφησης στα 入2s0 nm μπορεί να αποδοθεί στην προκαλούμενη από γλυκοζυλίωση ξεδίπλωμα της πρωτεϊνικής έλικας, η οποία μπορεί να επηρεάσει τη φυσιολογική της φυσιολογική λειτουργία.

Treatment with CEE/fractions reduced significantly the absorbance at入2so nm compared to glycated BSA, and this reduction varied markedly between fractions according to the solvent polarity. Overall, descending antiglycation activity was portrayed as EAF>WBF>DMF>CCE>WF>HE, τα οποία ήταν 1,82, 1,71, 1,57, 1,35, 1,28 και 1.13-πλάσια χαμηλότερα από το γλυκοζυλιωμένο BSA. Ωστόσο, αυτή η δραστηριότητα ήταν σημαντικά χαμηλότερη από αυτή τουκερσετίνηχρησιμοποιείται ως θετικός μάρτυρας (2.24-πλάσιο χαμηλότερο από το γλυκοζυλιωμένο BSA). Έτσι, μπορεί να συναχθεί ξεκάθαρα το συμπέρασμα από μελέτες απορρόφησης ότι το EAF από το E.fragilis έχει προστατευτική δράση έναντι της ξεδίπλωσης BSA που προκαλείται από τη γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών.

2.7.2. Αναστολή της γλυκοζυλίωσης πρωτεΐνης στο μοντέλο BSA-Glu

Τα AGEs είναι μια ετερογενής ομάδα ενώσεων με χαρακτηριστικά φθορισμού στα λ440 nm όταν διεγείρονται στα 370 nm. Η ικανότητα του CEE και των διαφόρων κλασμάτων του από το Ε. fragilis να αναστέλλουν τον σχηματισμό AGEs αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία BSA-γλυκόζης και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 3Β.

Όπως αποδεικνύεται από το Σχήμα 3Β, ο ρυθμός αναστολής των AGEs όλων των δειγμάτων που δοκιμάστηκαν εμφάνισε μια ανοδική τάση με την αύξηση των συγκεντρώσεων. Στο 1 mg/mL, τα CCE, HE, DME EAE, WBF, WF και κερσετίνη ανέστειλαν το σχηματισμό AGEs κατά 53,26,39,83,54,82,76,68,69.09,48,83 και 97,84 τοις εκατό μετά την επώαση, αντίστοιχα για 15 ημέρες. Το EAF(ICs =0.375±0.034 mg/mL) ήταν ο πιο αποτελεσματικός αναστολέας AGEs μεταξύ όλων των κλασμάτων, ακολουθούμενος από WBF, DMF, CCE και WF με IC5 0 τιμές 0,595 ± {{30}}.047, 0,857 ± 0,018, 0,951 ± 0,099 και 1,044± 0,032 mg/mL, αντίστοιχα. Η HF έδειξε την ασθενέστερη δραστικότητα με την τιμή ICso ως 1,212±0,063 mg/mL.

Το ύψοςαντιγλυκαίωσηΗ δυνατότητα του EAF θα μπορούσε να οφείλεται στην υψηλή περιεκτικότητα σε φαινολικά και φλαβονοειδή, τα οποία έχουν περιγραφεί ως πολύ καλοί αναστολείς του σχηματισμού AGEs [48]. Υψηλότερη αντιγλυκοποίηση του EAF του εκχυλίσματος φύλλων Liquidambar formosana Hance αναφέρθηκε επίσης από τους Zhang et al. [31]σε σύγκριση με εκείνη των κλασμάτων διχλωρομεθανίου, ν-βουτανόλης και νερού.

Όπως δίνεται στον Πίνακα 5, η αναστολή των AGEs συσχετίστηκε ισχυρά με θετικό τρόπο και στους δύο TF(r=0.950;p<0.01)and tp(r=""><0.01)contents, which="" were="" in="" line="" with="" previously="" reported="" studies="" [2,29].="" the="" ages="" inhibition="" was="" also="" correlated="" in="" a="" positive="" way="" to="" dpph",abts,h2o2,reducing="" power,="" tac,andβ-carotene="" assays="" withr="">

r=0.914,r=0.983, r=0.975,r{=0.923,και r=0.963 (σελ<0.01),respectively. these="" reflected="" that="" ages="" inhibition="" is="" linked="" to="" the="" efficiency="" of="" primary="" antioxidants="" [6].="" kaewseejan="" and="" siriamornpun="" [29]="" also="" reported="" that="" phenolic="" compounds="" prevented="" the="" formation="" of="" ages="" through="" its="">σάρωση ελεύθερων ριζώνκαιαντιοξειδωτικόικανότητες.

2.7.3. Επιδράσεις στην Οξείδωση Πρωτεϊνών που προκαλείται από Γλυκίωση

Η γλυκοποίηση των πρωτεϊνών (αντίδραση Maillard) είναι μια αντίδραση που ξεκινά με την ομοιοπολική σύνδεση αναγωγικού σακχάρου σε μια αμινομάδα πρωτεϊνών (κυρίως υπολείμματα λυσίνης και αργινίνης), η οποία οδηγεί στην παραγωγή ενός ασταθούς και αναστρέψιμου προϊόντος, π.χ., της βάσης του Schiff που υφίσταται περαιτέρω αναδιάταξη Amadori. για να σχηματιστούν πιο σταθερά προϊόντα κεταμίνης με το όνομα Amadori. Στη συνέχεια, τα προϊόντα Amadori υφίστανται μια αντίδραση ενδιόλης για την παραγωγή καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών [48]. Η αποικοδόμηση αυτής της κεταμίνης θα μπορούσε να προκαλέσειελεύθερες ρίζεςόπως οι ρίζες υπεροξειδίου, οι οποίες μετατρέπονται περαιτέρω σε HO· μέσω της αντίδρασης Fenton, προκαλώντας οξειδωτική και κυτταρική βλάβη [49].

Protein oxidation is accompanied by carbonyl protein formation and loss of protein thiols, which are often employed as protein oxidation indicators[50]. As given in Figure 3C, the level of carbonyl content in native BSA was 1.16±0.04 nmol/mg protein, which was increased to more than 3.62-fold (4.21 ± 0.10 nmol/mg protein) upon glycation. The treatment with CEE and its various fractions reduced the level of carbonyl content with the increase of samples concentrations ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Furthermore, the inhibition effect of quercetin on the formation of carbonyl proteins was stronger than that of all fractions at every concentration point. When the concentration was 1 mg/mL, CEE, HF, DMF, EAF, WBF, WF, and quercetin decreased the level of carbonyl content by 42.29, 17.37,58.68,73.44,69.17,28.84,and 98.68%, respectively, compared to native BSA. Overall descending, the inhibition of carbonyl content formation was portrayed as Q>EAF>WBF >DMF > CCE> WF >HF.

Οι επιδράσεις του CEE/κλασμάτων στην οξείδωση της πρωτεΐνης θειόλης που προκαλείται από γλυκοζυλίωση παρουσιάζονται στο Σχήμα 3D. Στην εγγενή BSA, το επίπεδο της πρωτεϊνικής θειόλης ήταν 1.06± 0.086 nmol/mg πρωτεΐνης, το οποίο μειώθηκε περισσότερο από τρεις φορές (0 0,34±0,021 nmol/mg πρωτεΐνης) σε γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνη. Παρουσία CEE/κλασμάτων, το επίπεδο της ομάδας θειόλης αυξήθηκε σημαντικά με δοσοεξαρτώμενο τρόπο που κυμαίνεται από 0,1 έως 1 mg/mL. Επιπλέον, το επίπεδο της πρωτεϊνικής θειόλης αυξήθηκε με την ακόλουθη σειρά: HF<><><><>

Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στο φυτό Teucrium polium αφού το EAF ήταν πιο αποτελεσματικό από τα άλλα κλάσματα (διαιθυλαιθέρας και κλάσματα νερού) έναντι της οξείδωσης πρωτεΐνης που προκαλείται από γλυκοζυλίωση[51]. Στη μελέτη τους, οι Golshahi και Bahramikia [52] ανέφεραν επίσης παρόμοια αποτελέσματα όταν χρησιμοποιούσαν αρκετούς διαλύτες με αυξανόμενη πολικότητα (διαιθυλαιθέρας και νερό) στη διάσπαση ενός φαρμακευτικού φυτού Trachyspermum copticum. Σύμφωνα με αυτούς τους συγγραφείς, το EAF έχει την πιο ισχυρή προστατευτική δράση έναντι της οξείδωσης των πρωτεϊνών που προκαλείται από γλυκοζυλίωση, ακολουθούμενη μακριά από τον διαιθυλαιθέρα και το νερό. Αυτό καταδεικνύει την παρουσία στο EAF τέτοιων ενώσεων που μπορεί να έχουν προληπτική δράση έναντι οξειδωτικών βλαβών στην πρωτεΐνη που προκαλείται από υπεργλυκαιμία, η οποία πιστεύεται ότι συμβαίνει κατά τις διαδικασίες γλυκοξείδωσης μειώνοντας τον σχηματισμό καρβονυλίου πρωτεΐνης και προστατεύοντας τις θειόλες πρωτεΐνης από οξείδωση όπως προτείνεται από τα δεδομένα.

2.8.Εντοπισμένες φαινολικές ενώσεις στο EAF

Το EAF, το οποίο έδειξε την υψηλότερη βιολογική δράση από άλλα κλάσματα, επιλέχθηκε για την ταυτοποίηση των κύριων βιοδραστικών του ενώσεων με RP-HPLC. Ένας συνολικός αριθμός έξι ενώσεων ταυτοποιήθηκε συγκρίνοντας τον χρόνο κατακράτησης τους με αυτούς των προτύπων αναφοράς. Οι ταυτοποιημένες φαινολικές ενώσεις παρουσιάζονται στο Σχήμα 4. Τα γαλλικά, βανιλικά, καφεϊκά και φερουλικά οξέα ταυτοποιήθηκαν ως φαινολικά οξέα, ενώ μόνο δύο ενώσεις, δηλαδή η ρουτίνη και η κερκετίνη, ταυτοποιήθηκαν ως φλαβονοειδή. Σύμφωνα με μελέτη των Soumaya et al. [53], φερουλικό οξύ, λουτεολίνη-7-Ο-γλυκοσίδη, μυρικετίνη και καμπφερόλη 3-Ο-ρουτινοσίδη εντοπίστηκαν ως παρόντα στο EAF των εναέριων τμημάτων του Τυνησιακού E.fragilis, ενώ η παρουσία ρουτίνης , η κερκετίνη, το γαλλικό οξύ και το καφεϊνικό οξύ εντοπίστηκαν μόνο για πρώτη φορά στη μελέτη μας. Η διαφορά στη χημική σύνθεση του EAF που λαμβάνεται από το ίδιο είδος φυτού μπορεί να διαφέρει σε διαφορετικά μέρη ενός φυτού, το στάδιο ανάπτυξης του φυτού, τις συνθήκες ανάπτυξης (π.χ. έδαφος, φως, θερμοκρασία, νερό, υγρασία και λιπάσματα), χρόνος συγκομιδής, το σύστημα ξήρανσης και η διαδικασία εκχύλισης [54]. Τα ληφθέντα αποτελέσματα από το προφίλ φυτοχημικών δακτυλικών αποτυπωμάτων έδειξαν έναν καλό πλούτο E.fragilis που είχε αρκετές φαινολικές ενώσεις που θεωρούνται κύριοι συνεισφέροντες στη σάρωση των ελεύθερων ριζών και στις αντιοξειδωτικές δραστηριότητες [55]. Επιπλέον, αυτές οι ενώσεις είναι γνωστές για τις ισχυρές αντιγλυκοζωικές ικανότητές τους [48]. Αρκετές μελέτες έχουν αποκαλύψει την άμεση σύνδεση μεταξύ των αντιοξειδωτικών δράσεων των φαινολικών ενώσεων και των αντιγλυκοζικών ικανοτήτων τους.

2.9. Μελέτη Molecular Docking Προσδιορισμένων Ενώσεων

Για να απεικονίσουμε με σαφήνεια τον λεπτομερή μηχανισμό με τον οποίο οι ταυτοποιημένες ενώσεις στο EAF του E. fragilis συνδέονται με BSA και RAGE, πραγματοποιήσαμε μια μελέτη μοριακής σύνδεσης. Τα αποτελέσματα σύνδεσης παρουσιάζονται στον Πίνακα 6, ενώ οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ της πιο δραστικής ένωσης και των στόχων φαίνονται στο Σχήμα 5. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η κερσετίνη προσαρμόστηκε άνετα στη θέση δέσμευσης, που βρίσκεται στην υδρόφοβη κοιλότητα του υποτομέα IB του BSA με τη χαμηλότερη ενέργεια δέσμευσης {2}}.7 kcal/mol (Εικόνα 5Α). Αντίθετα, λήφθηκε μικρότερη ενέργεια δέσμευσης με φερουλικό οξύ, βανιλικό οξύ, καφεϊκό οξύ, γαλλικό οξύ και ρουτίνη (-6.35,{{7} }.05, -5.84,-5.25 και-4.41 kcal/mol, αντίστοιχα). Συνήθως, ένας υψηλός βαθμός αρνητικότητας της ενέργειας δέσμευσης είναι πιο αποτελεσματικός και η ένωση θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο των διεργασιών γλυκοζυλίωσης. Από το Σχήμα 5Β, είναι σαφές ότι η quercetin σχηματίζει οκτώ δεσμούς υδρογόνου με SER109, ASP111, Leu112, Leu115, Arg144, Arg185 και Arg458of BSA και τέσσερις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις που προκαλούνται από τα αλειφατικά αμινοξέα (Pro110, Pro113, Lys114 και Arg144) . Επίσης, τέσσερα αμινοξέα (ASP108, HIS145, LEU189 και LEU462) που περιβάλλουν την κερσετίνη αλληλεπιδρούν μέσω των δυνάμεων του van der Waal. Έχει αναφερθεί ότι η λυσίνη και η αργινίνη είναι τα κύρια υπολείμματα αμινοξέων που εμπλέκονται στη διαδικασία γλυκοζυλίωσης [56]. Επομένως, η κάλυψη της κερσετίνης σε υπολείμματα λυσίνης και αργινίνης θα μπορούσε να είναι ένας από τους πιθανούς μηχανισμούς του E. fragilis να αναστέλλει τη γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών σε αρχικό στάδιο.

Η δέσμευση προϊόντων AGEs με RAGE είναι γνωστό ότι πυροδοτεί, μέσω του σχηματισμού ROS μέσω της οξειδάσης NADPH και των μιτοχονδρίων [57], την ενεργοποίηση πολλαπλών ενδοκυτταρικών οδών σηματοδότησης (συμπεριλαμβανομένων JAK/STAT, κινάσης φωσφοϊνοσιτόλης, rho GTPases, SAPK/INK κινάσες MAP, κινάσες MAP p38 και erk1/2 (p44/p42) και κορυφώνονται με την ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων NF-kB [58], οδηγώντας στην παθογένεση του διαβήτη και των διαταραχών που σχετίζονται με τη γήρανση [5]. Επομένως, ο αποκλεισμός των αλληλεπιδράσεων AGEs-RAGE μπορεί να καταστείλει τη μεταγωγή σημάτων που προκαλούν στρες, η οποία θεωρείται θεραπευτική στρατηγική αναστολής της γλυκοζυλίωσης σε μεταγενέστερο στάδιο. Τα αποτελέσματα σύνδεσης με RAGE, όπως φαίνεται στον Πίνακα 6, απέδειξαν ότι το γαλλικό οξύ έχει την υψηλότερη βαθμολογία σύνδεσης (G=-6,8 kcal/mol) σε σύγκριση με εκείνα του βανιλικού οξέος, του φερουλικού οξέος, του καφεϊκού οξέος, της κερσετίνης και ρουτίνη(-6.68,-5.94,-5.89,-5.58, και -4.89 kcal/mol, αντίστοιχα). Επιπλέον, η 2D μοντελοποίηση του γαλλικού οξέος και του RAGE έδειξε ότι το γαλλικό οξύ σχημάτισε πέντε συμβατικούς δεσμούς υδρογόνου με τα CYS38, GLY40, ALA41, LYS43 και SER83 του RAGE (Εικόνα 5C, D). Επίσης, τα LYS37 και LYS43 ήταν υπεύθυνα για τις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις του γαλλικού οξέος με το RAGE. Πέντε αμινοξέα που περιβάλλουν το γαλλικό οξύ (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81 και GLY82) προσαρτήθηκαν από τις δυνάμεις του van der Waal, σταθεροποιώντας έτσι το σύμπλοκο γαλλικού οξέος-RAGE παρέχοντας ένα ισχυρό συνεκτικό περιβάλλον. Συνοπτικά, η τρέχουσα μελέτη έδειξε την αποτελεσματική αλληλεπίδραση ορισμένων βιοδραστικών ενώσεων στο EAF του E. fragilis με τις πρωτεΐνες-στόχους του BSA και του RAGE. Το E.fragilis θα μπορούσε να αποτελέσει πηγή πιθανών ανταγωνιστών της γλυκόζης και των AGEs, οι οποίοι θα μπορούσαν να τους αντισταθούν δεσμεύεται με το BSA και το RAGE, αντίστοιχα, και επομένως μειώνει την επακόλουθη ανάπτυξη οξειδωτικού στρες και φλεγμονής (Εικόνα 6).

3. Υλικά και Μέθοδοι

3.1. Χημικά και Αντιδραστήρια

22-αζινοδις-(3-αιθυλοβενζοθειαζολίνη-6-σουλφονικό οξύ) (ABTS), βουτυλιωμένο υδροξυ-τολουόλιο (BHT), αζίδιο του νατρίου, υδροχλωρική γουανιδίνη, tween-40,1,{ {7}}διφαινυλ-2-πικρυλυδραζυλ (DPPH), αντιδραστήριο Folin Ciocalteau, -καροτίνη, λινολεϊκό οξύ, γλυκόζη, 2,4-δινιτροφαινυλυδραζίνη (DNPH), 5,5'-Dithiobis-({{16 }}Τα πρότυπα νιτροβενζοϊκού οξέος (DTNB), μολυβδαινικού αμμωνίου και πολυφαινολών αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) αγοράστηκε από τη Fluka (Βασιλεία, Ελβετία). Χλωριούχο αργίλιο (AICl3), ανθρακικό νάτριο (NazCO3), χλωριούχος σίδηρος (FeCl3), υπερθειικό κάλιο (K2S2Os), σιδηροκυανιούχο κάλιο (K3Fe(CN)6), θειικό οξύ και όλοι οι διαλύτες ελήφθησαν από τη Merck Lifesta SciencetD, ). Το ασκορβικό οξύ και το τριχλωροξικό οξύ (TCA) ελήφθησαν από το Scharlau (Βαρκελώνη, Ισπανία).

3.2.Φυτικά Υλικά

Το E. fragilis (εναέρια μέρη) συλλέχτηκε από το Dour Lagfifat, Oulad Teima, Taroudant, Μαρόκο (γεωγραφικό πλάτος, 30 μοίρες 24'0"Β, γεωγραφικό μήκος, 9 μοίρες 12'36"W) τον Μάιο του 2019. αναγνωρίστηκε από τον καθηγητή Najat ELKHIATI, βοτανολόγο του ινστιτούτου μας, όπου κατατέθηκε συλλογή δειγμάτων κουπονιών. Το φυτό ξεπλύθηκε με απεσταγμένο νερό, ξηράνθηκε στον αέρα, κονιοποιήθηκε σε ένα μπλέντερ και αποθηκεύτηκε στους 49 C μέχρι τη χρήση.

3.3.Πειραματικός Σχεδιασμός

3.3.1.Επιλογή Μεταβλητών

Πολλές παράμετροι είναι γνωστό ότι έχουν σημαντικές επιπτώσεις στην εκχύλιση φαινολικών ενώσεων, όπως ο τύπος του διαλύτη, η συγκέντρωση του διαλύτη, ο χρόνος εκχύλισης και η θερμοκρασία εκχύλισης [59]. Διαφορετικοί διαλύτες όπως η ακετόνη, η μεθανόλη και η αιθανόλη είναι κατάλληλοι για την εκχύλιση διαφορετικών φαινολικών ενώσεων [16], αλλά η αιθανόλη επιλέχθηκε ως διαλύτης σε αυτή τη μελέτη, λόγω της βρώσιμης ασφάλειας και της πράσινης παραγωγής της [60]. Ως εκ τούτου, όλοι οι παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της συγκέντρωσης αιθανόλης (Χ), της θερμοκρασίας εκχύλισης (Χ2) και του χρόνου εκχύλισης (Χ3) επιλέχθηκαν ως μεταβλητές.

3.3.2. BBD για βελτιστοποίηση εξαγωγής

Αναπτύχθηκε μια διαδικασία βελτιστοποίησης χρησιμοποιώντας RSM για τον προσδιορισμό των επιδράσεων των παραγόντων εκχύλισης και την επιλογή των βέλτιστων πειραματικών συνθηκών εκχύλισης της φαινολικής ένωσης E. fragilis. Πραγματοποιήθηκε ένα BBD τριών επιπέδων, τριών παραγόντων για τη διερεύνηση της επίδρασης τριών ανεξάρτητων παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων των X1 (συγκέντρωση αιθανόλης, ποσοστό ), X, (θερμοκρασία εκχύλισης, βαθμός) και X3 (χρόνος εκχύλισης, h) στα περιεχόμενα TP και TF του Ε, εκχυλίσματα fragilis [17]. Για λόγους βελτιστοποίησης, διεξήχθη τυχαία ένας συνολικός αριθμός 15 δοκιμών συμπεριλαμβανομένων τριών κεντρικών σημείων (Πίνακας 1). Με βάση το προκαταρκτικό μας πείραμα ενός παράγοντα (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται), όλες οι μεταβλητές ορίστηκαν σε τρία επίπεδα (-1,0 και συν 1), με X, (40,60 και 80 τοις εκατό ), X , (25,42,5 και 60 μοίρες) και X3(6, 15 και 24 h) (Πίνακας 1). Η ακόλουθη πολυωνυμική εξίσωση δεύτερης τάξης (Εξίσωση (1)) χρησιμοποιήθηκε για να χωρέσει τις μεταβλητές απόκρισης:

όπου Y είναι η προβλεπόμενη απόκριση. o, ; εγώ και ; είναι οι συντελεστές παλινδρόμησης για όρους τομής, γραμμικούς, τετραγωνικούς και αλληλεπιδράσεις, αντίστοιχα. και X;, και X; είναι οι ανεξάρτητες μεταβλητές (i ≠ j).

3.3.3. Διαδικασία εξαγωγής

Το κονιοποιημένο δείγμα (10 g) εκχυλίστηκε με μέθοδο διαβροχής σε σχεδιασμένη συγκέντρωση αιθανόλης (40-80 τοις εκατό ;1:10, w/v), σε ποικίλες θερμοκρασίες (25-60 βαθμοί) για διάφορες περιόδους ({ {5}} η) σε επωαστήρα τροχιακού δονητή (160 rpm). Για την απομάκρυνση της αδιάλυτης μάζας χρησιμοποιήθηκαν γάζα και διηθητικό χαρτί Whatman αρ.1. Το διήθημα στη συνέχεια ξηράνθηκε στους 40 βαθμούς υπό χαμηλή πίεση χρησιμοποιώντας R-3 Rotavapor(Büchi) για να δώσει το ακατέργαστο αιθανολικό εκχύλισμα (CEE).

3.4. Κλασματοποίηση του CEE που λήφθηκε υπό τις βέλτιστες συνθήκες

Το CEE που ελήφθη υπό τις βέλτιστες συνθήκες διαλυτοποιήθηκε σε απεσταγμένο νερό (100 mL) και η εκχύλιση υγρού-υγρού πραγματοποιήθηκε με διάφορους διαλύτες αυξανόμενης πολικότητας για να δώσει κλάσμα εξανίου (HF, 3×100 mL), κλάσμα διχλωρομεθανίου (DMF, 3×100 mL), κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα (EAF.3×100 mL), ένα κορεσμένο με νερό κλάσμα η-βουτανόλης (WBF, 3×100 mL),

και το υπόλοιπο υδατικό κλάσμα (WF). Αυτά τα κλάσματα στη συνέχεια διηθήθηκαν και ξηράνθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω, και η απόδοση εκχύλισης καταγράφηκε σύμφωνα με την Εξίσωση (2):

Were Wo και W είναι το βάρος των αποξηραμένων CEE/κλασμάτων και το αρχικό βάρος της σκόνης E.fragilis. αντίστοιχα.

3.5. Φυτοχημική Ανάλυση

Οι φασματοφωτομετρικές τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση των φυτοχημικών περιεχομένων των εκχυλισμάτων E. fragilis περιγράφονται λεπτομερώς στα Συμπληρωματικά Υλικά [61,62].

3.6. Βιολογικές Δραστηριότητες

Λεπτομέρειες για τις δοκιμές αντιοξειδωτικών [43,63-67] και αντιγλυκοζικών δραστηριοτήτων [68-70] in vitro δόθηκαν στα Συμπληρωματικά Υλικά.

3.7.RP-HPLC Ανάλυση EAF

Η ανάλυση των φαινολικών ενώσεων στο EAF πραγματοποιήθηκε με Agilent 1100(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) εξοπλισμένο με αναλυτική στήλη αντίστροφης φάσης ZORBAX Eclipse SB-C18 100×4 mm και 3,5 um μέγεθος σωματιδίων [71]. Η θερμοκρασία της στήλης διατηρήθηκε σταθερή στους 48 βαθμούς. Η ισοκρατική έκλουση με ακετονιτρίλιο, 0,1 τοις εκατό οξικό οξύ σε νερό (12:88, ν/ν) ως κινητή φάση και 1 mL/min ρυθμός ροής εξασφάλισαν καλό διαχωρισμό των πολυφαινολών στο EAF του E.fragilis. Ο όγκος που εγχύθηκε ήταν 10 μL και τα χρωματογραφήματα μετρήθηκαν στα 330 nm. Οι χρόνοι κατακράτησης των φαινολικών ενώσεων στο EAF συγκρίθηκαν με αυτούς των καθαρά διαθέσιμων προτύπων για την ταυτοποίησή τους.

3.8. Molecular Docking

Το AutoDock Tools (ADT) έκδοση 1.5.6 χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση μιας μελέτης μοριακής σύνδεσης. Η μορφή SDF όλων των ενώσεων ελήφθη από τη βάση δεδομένων PubChem και στη συνέχεια μετατράπηκε σε αρχείο 3Dpdb χρησιμοποιώντας το Open Babel GUI (έκδοση 2.4.1). Οι κρυσταλλικές δομές του BSA (PDB ID:4ORO) και του RAGE (PDB ID:4LP5) συλλέχθηκαν από την RCSB Protein Data Bank (PDB). Εν συντομία, οι πρωτεΐνες αρχικά προετοιμάστηκαν για σύνδεση με (i) αφαίρεση όλων των ετεροατόμων και μορίων νερού, (i) προσθήκης πολικών ατόμων υδρογόνου και (ii) εκχώρησης φορτίων Kollman. Η διάσταση του πλαισίου πλέγματος ορίστηκε σε x{{1{0}}, y=126, z=126 και x=80, y=80.Z{{ 15}} με κέντρο πλέγματος x=8.415,y=21.626,z=106.57 andx=37.98,y=-43.581 ,z{=9.371 με απόσταση πλέγματος 0,375A που δημιουργείται γύρω από τη θέση δέσμευσης των BSA και RAGE, αντίστοιχα. Το λογισμικό σύνδεσης εκτελέστηκε 100 φορές χρησιμοποιώντας τον Γενετικό Αλγόριθμο Lamarckian (LGA) για να βρεθεί η καλύτερη στάση σύνδεσης. Ο συνδέτης με τη χαμηλότερη βαθμολογία ενέργειας δέσμευσης επιλέχθηκε για περαιτέρω διερεύνηση. Η έκδοση λογισμικού Discovery Studio 2020 (BIOVIA, San Diego, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων σύνδεσης.

3.9. Στατιστική ανάλυση

Η έκδοση λογισμικού Design-Expert 119 (Stat-Ease Inc. και Minneapolis, MN, USA) χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση RSM. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ακολουθούμενη από το post-hoc τεστ Duncan χρησιμοποιώντας SPSS 26.0(IBM Co., USA);p.<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" pearson="" correlation="" analysis="" was="" conducted="" to="" investigate="" correlations="" between="" variables="" and="" their="" significance.="" all="" graphics="" were="" constructed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0="" software="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" all="" experiments="" were="" conducted="" in="" triplicate="" and="" presented="" as="" mean="" values="" ±standard="" deviation="">

4. Συμπεράσματα

Χρησιμοποιήθηκε RSM με BBD για τον καθορισμό των βελτιστοποιημένων παραμέτρων για την εκχύλιση των βιοδραστικών ενώσεων από το μαροκινό φαρμακευτικό βότανο E. fragilis. Η βέλτιστη συγκέντρωση αιθανόλης, η θερμοκρασία εκχύλισης και ο χρόνος εκχύλισης προβλέφθηκαν για το μέγιστο

απόδοση εκχύλισης φαινολικών ενώσεων και έδειξε ότι είναι 61,93 τοις εκατό, 44,43 βαθμοί C και 15,84 ώρες, αντίστοιχα. Το CEE που ελήφθη υπό τις βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης και τα διάφορα κλάσματά του αναλύθηκαν για την περιεκτικότητά τους σε TP και TF, καθώς καιαντιοξειδωτικόκαι αντιγλυκαιμικές δραστηριότητες. Το κλάσμα EAF εμφανίζει την υψηλότερη περιεκτικότητα σε TP και TF και τις ισχυρότερες αντιοξειδωτικές δραστηριότητες σε σύγκριση με άλλα κλάσματα. Επίσης, η αξιολόγηση αρκετών βιοδεικτών όπως το φάσμα απορρόφησης UV-vis, ο φθορισμός ειδικών AGEs, η περιεκτικότητα σε καρβονύλια και η ομάδα ελεύθερων θειόλων, έδειξε τη μεγαλύτερη προστατευτική δράση του EAF έναντι της γλυκοζυλίωσης που προκαλείται από τη γλυκόζη. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μια σημαντική θετική σχέση μεταξύ των αντιοξειδωτικών ικανοτήτων των φαινολικών ενώσεων και των αντιγλυκοζικών τους δράσεων. Αυτό δείχνει ότι οι φαινολικές ενώσεις μπορεί να είναι τα κύρια κυρίαρχα συστατικά που είναι υπεύθυνα τόσο για τις αντιοξειδωτικές όσο και για τις αντιγλυκοζωικές δραστηριότητες. Οι βιοδραστικές ενώσεις στο EAF χαρακτηρίστηκαν με ανάλυση RP-HPLC και ταυτοποιήθηκε ένας συνολικός αριθμός έξι ενώσεων. Η ανάλυση μοριακής σύνδεσης στο silico έδειξε επίσης μια αποτελεσματική αλληλεπίδραση μεταξύ κερκετίνης και γαλλικού οξέος με BSA και RAGE ως πρωτεΐνες-στόχους, αντίστοιχα. Συλλογικά, αυτή η μελέτη προτείνει ότι το E.fragilis μπορεί να είναι μια πιθανή πηγή φυσικών βιοδραστικών ενώσεων με ισχυρές αντιοξειδωτικές και αντιγλυκοζωικές δράσεις και θα πρέπει να εφαρμόζεται στη θεραπεία και την πρόληψη της γήρανσης και των επιπλοκών που σχετίζονται με τη γλυκοζυλίωση. Πρέπει να διεξαχθούν περαιτέρω μελέτες για την απομόνωση βιοδραστικών ενώσεων και τον φαρμακολογικό έλεγχο (δηλαδή, μελέτη κυτταροτοξικότητας) για τη διερεύνηση της φυτοχημείας και των μηχανισμών δράσης των φαρμακολογικών ιδιοτήτων του E. fragilis.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Martins, Ν.; Barros, L.; Santos-Buelga, C.; Silva, S.; Henriques, Μ.; Ferreira, Αφέψημα ICFR, Έγχυμα και Υδροαλκοολικό Εκχύλισμα Καλλιεργημένου Θυμαριού: Αντιοξειδωτικές και Αντιβακτηριδιακές Δραστηριότητες και Φαινολικός Χαρακτηρισμός. Food Chem. 2015, 167, 131–137. [CrossRef]

2. Deetae, Ρ.; Παριχανών, Ρ.; Trakunleewatthana, Ρ.; Chanseetis, C.; Λερτσίρη, Σ. Αντιοξειδωτικές και Αντιγλυκαιοτικές ιδιότητες των Ταϊλανδέζικων τσαγιών σε σύγκριση με τα συμβατικά τσάι. Food Chem. 2012, 133, 953–959. [CrossRef]

3. Yao, Q.; Liang, Υ.; Shao, Υ.; Bian, W.; Fu, Η.; Xu, J.; Sui, L.; Yao, Β.; Li, M. Προηγμένες συγκεντρώσεις τελικού προϊόντος γλυκαίωσης σε ωοθυλακικό υγρό γυναικών που υποβάλλονται σε IVF/ICSI με πρωτόκολλο αγωνιστή GnRH. Αναπαραγωγή. Biomed. Online 2018, 36, 20–25. [CrossRef] [PubMed]

4. Grimm, S.; Ott, C.; Hörlacher, Μ.; Weber, D.; Höhn, Α.; Grune, T. Σχηματισμός ανοσοπρωτεασωμάτων που προκαλείται από προηγμένη γλυκαιοποίηση-τελικό προϊόν: Συμμετοχή των RAGE και Jak2/STAT1. Biochem. J. 2012, 448, 127–139. [CrossRef]

5. Meenatchi, Ρ.; Purushothaman, Α.; Maneemegalai, S. Antioxidant, Antiglycation and Insulinotrophic Properties of Coccinia Grandis (L.) in vitro: Possible Role in Prevention of Diabetic Complications. J. Tradit. Συμπλήρωμα. Med. 2017, 7, 54–64. [CrossRef] [PubMed]

6. Nakagawa, Τ.; Yokozawa, Τ.; Terasawa, Κ.; Shu, S.; Juneja, LR Προστατευτική Δραστηριότητα του Πράσινου Τσάι κατά της Βλάβης των Πρωτεϊνών που Μεσολαβούνται από Ελεύθερες Ρίζες και Γλυκόζη. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 2418–2422. [CrossRef] [PubMed]