Μέρος 2: Η επίδραση των ολικών διτερπενοειδών από την ρίζα Euphorbiae Ebracteolatae αποδίδεται σε μεταβολές των ακουαπορινών μέσω της αναστολής της δραστηριότητας PKC στους νεφρούς κατά του κακοήθους ασκίτη

Για περισσότερες πληροφορίες. Επικοινωνίαtina.xiang@wecistanche.com

Όλοι γνωρίζουμε ότι ο νεφρός είναι το πιο σημαντικό όργανο στο ανθρώπινο σώμα. Εάν το νεφρό δεν είναι καλό, χρειάζεται να θρέψει το νεφρό. Υπάρχουν πολλοί τρόποι για να θρέψετε το νεφρό. Μερικοί άνθρωποι θα φάνεCistancheνα θρέψει τα νεφρά. Το Cistanche είναι πλούσιο σε αλκαλοειδή,εχινακοσίδη, γλυκοσίδες Verbascumκρυσταλλικές ουδέτερες ουσίες, αμινοξέα, ιχνοστοιχεία, βιταμίνες και άλλα συστατικά. Το Cistanche μπορεί επίσης να ρυθμίσει το κυκλοφορικό σύστημα, με τα ακόλουθα αποτελέσματα: προστασία του ισχαιμικού μυοκαρδίου. μειώνουν τα λιπίδια του αίματος, αντιστέκονται στην αθηροσκλήρωση και αντιστέκονται στη θρόμβωση. μείωση της περιφερικής αγγειακής αντίστασης, διαστολή των περιφερειακών αιμοφόρων αγγείων και μείωση της αρτηριακής πίεσης. προστατεύουν το συκώτι και αντιστέκονται στο λιπώδες ήπαρ.

3. Συζήτηση

Το EER έχει χρησιμοποιηθεί ιστορικά στην TCM για τη θεραπεία της κοιλιακής διάτασης και του οιδήματος [1]. Σε αυτή τη μελέτη, οι αντιασκιτικές επιδράσεις του EER διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας ασκιτικά ποντίκια που φέρουν καρκινικά κύτταρα H22. Τα κακοήθη ασκιτικά ποντίκια χρησιμοποιούνται ευρέως στην έρευνα για τη μελέτη θεραπειών όγκων και ασκίτη [21,22]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τόσο το EER όσο και το TDEE μπορούν να μειώσουν σημαντικά τον όγκο του ασκίτη, ενώ το NTDEE δεν είχε καμία επίδραση. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το TDEE ήταν το ενεργό κλάσμα κατά του ασκίτη του EER. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα διτερπενοειδή από την EER έχουν ανασταλτική δράσηκύτταρα όγκουin vitro [5,23]. Ωστόσο, αυτή η μελέτη διαπίστωσε ότι δεν έχουν καμία επίδραση στη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων, στον κυτταρικό κύκλο ή στην απόπτωση των καρκινικών κυττάρων. Πιθανοί λόγοι για αυτή τη διαφορά μπορεί να περιλαμβάνουν τις διαφορές στις δόσεις και την κακή συσχέτιση μεταξύ in vivo και in vitro δραστηριοτήτων. Η TCM υποστηρίζει ότι η EER είναι αποτελεσματική στη θεραπεία του οιδήματος κυρίως ρυθμίζοντας γρήγορα την απέκκριση ούρων και κοπράνων [6]. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε την επίδραση του TDEE στο βάρος των ούρων και την περιεκτικότητα σε νερό στα κόπρανα σε ασκιτικά ποντίκια. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι το βάρος των ούρων και το βάρος του ασκητικού υγρού επηρεάστηκαν και τα δύο από το TDEE σε δόσεις 3 και 0.6g ακατέργαστων βοτάνων/kg, ενώ η περιεκτικότητα σε νερό στα κόπρανα αυξήθηκε μόνο στα 3 g ακατέργαστα βότανα/kg, επομένως το TDEE κυρίως μειωμένος όγκος ασκίτη μειώνοντας την επαναρρόφηση νερού στα νεφρά. Η νεφρική επαναρρόφηση νερού παίζει κεντρικό ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης του νερού στο σώμα [16]. Τα AQP παρέχουν τα κύρια κανάλια για τα νεφρά για την επαναρρόφηση του νερού και τη συγκέντρωση των ούρων [24]. Κατά συνέπεια, η μελέτη της έκφρασης των AQPs μπορεί να παρέχει έναν μηχανισμό για τη μείωση του ασκίτη.

Διάφορα AQP εκφράζονται σε διαφορετικές περιοχές τουνεφρό.AOP1, AOP2, AOP3, and AQP4 are localized in renal epithelial cells and are closely related to water reabsorption in the kidney [25]. AQP1 is highly expressed in both apical and basolateral membranes of the proximal tubules and control>70 τοις εκατό της απορρόφησης νερού στο σπειραματικό διήθημα [16]. Τα AQP2, AOP3 και AOP4 εκφράζονται αποκλειστικά στους αγωγούς συλλογής, οι οποίοι αποτελούν ζωτικά τμήματα για τη ρύθμιση της ισορροπίας του νερού και της συγκέντρωσης των ούρων [16]. Στην παρούσα μελέτη, το TDEE μείωσε την έκφραση πρωτεΐνης των AQP1, AQP2, AQP3 και AQP4 σε νεφρούς ποντικών. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν από τα αποτελέσματα κυτταρικών πειραμάτων in vitro. Οι ανασταλτικές δραστηριότητες των AQPs των κύριων διτερπενοειδών στο TDEE αξιολογήθηκαν στις κυτταρικές σειρές του εγγύς σωληνίσκου και του αγωγού συλλογής. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα διτερπενοειδή στο TDEE μείωσαν τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης AQPs και mRNA στα κύτταρα HK-2 και mIMCD3.

Κάντε κλικ για να επικοινωνήσετε με τον προμηθευτή για αγορά cistanche tubulosa

Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης AQPs και του mRNA κάθε διτερπενοειδούς συγκρίθηκαν με την ομάδα ελέγχου.ΝεφρώνΤα σωληνάρια είναι ένα σημαντικό συστατικό της επαναρρόφησης του νερού. Μεταξύ των τεσσάρων διτερπενοειδών, τα διτερπενοειδή ent-abietane jolkinolide B (1269 τοις εκατό του TDEE) είχαν την ισχυρότερη επίδραση στη ρύθμιση του AQP1 στα κύτταρα HK-2. Συγκρίνοντάς το με τη δομή της ένωσης 2, το jolkinolide B (ένωση 3) έχει δύο εποξειδικούς δακτυλίους στις θέσεις C-11 και 14. Όταν ο εποξειδικός δακτύλιος στο C-11 και στο 14, αντίστοιχα, μετατράπηκαν σε έναν υδροξυλικό και διπλό δεσμό στην ένωση 2, η ανασταλτική δράση του AQP1 εξαφανίστηκε. Η συγκέντρωση ούρων εμφανίζεται κυρίως στα νεφρικά συλλεκτικά σωληνάρια. Τα αποτελέσματα από τα κύτταρα mIMCD3 έδειξαν ότι η ένωση ροζάνης διτερπενοειδής ένωση 4 και η νορδιτερπενοειδής λακτόνη ένωση 5 (που αντιπροσωπεύουν το 9,16 τοις εκατό και το 39,26 τοις εκατό του TDEE, αντίστοιχα) έχουν τα ισχυρότερα ανασταλτικά αποτελέσματα στην έκφραση AQP2, AQP3 και AQP4. Τα ανασταλτικά αποτελέσματα των διτερπενοειδών ent-abietane ήταν αδύναμα σε σύγκριση με αυτούς τους δύο τύπους διτερπενοειδών. Οι ανασταλτικές επιδράσεις διαφορετικών τύπων διτερπενοειδών σε διάφορα AOPs στο νεφρό δεν ήταν οι ίδιες, κάτι που μπορεί να οφείλεται σε διακυμάνσεις στη χημική δομή των διτερπενοειδών και στον χρόνο απόκρισης των AQP σε κάθε ένωση. Συνολικά, αυτά τα διτερπενοειδή μπορεί να προσδώσουν συνεργιστικά ανασταλτικά αποτελέσματα των AQPs. Επειδή οι δραστηριότητες αυτών των διτερπενοειδών εκτιμήθηκαν in vitro, οι δραστηριότητες αυτών των ενώσεων μετά τον μεταβολισμό in vivo παραμένουν ασαφείς και επομένως χρειάζονται περαιτέρω έρευνα.

Αρκετές μελέτες έχουν προτείνει ότι το PKC και το PKA λειτουργούν στη ρύθμιση των AQP [17-20]. Η PKC είναι μια οικογένεια κινασών σερίνης/θρεονίνης που εμπλέκονται σε διάφορες μεταγωγές κυτταρικού σήματος [26]. Η οικογένεια PKC έχει συμπεριλάβει αρκετές ισομορφές [26]. Μετά την ενεργοποίηση, τα PKCs μετατοπίζονται από το κυτταρόπλασμα στην πλασματική μεμβράνη, συνδέονται με τη διακυλογλυκερόλη (DAG) και στη συνέχεια προκαλούν μια σειρά από φυσιολογικές αλλαγές [27]. Η μετατόπιση της PKC από το κυτταρόπλασμα στην πλασματική μεμβράνη είναι ένας δείκτης ενεργοποίησης της PKC [28]. Το DAG παράγεται από την καταλυόμενη με PLC υδρόλυση της μεμβρανικής φωσφατιδυλινοσιτόλης-4,5-διφωσφορικής (PIP2)[27]. Σε πειράματα σε ζώα, μετρήσαμε τα επίπεδα έκφρασης PKCo και PKC στο κλάσμα της μεμβράνης. Ταυτόχρονα, ανιχνεύσαμε και τις αλλαγές στις ανοδικές πρωτεΐνες της PKC. Τα αποτελέσματα πρότειναν ότι το TDEE μείωσε την έκφραση της PKC στην κυτταρική μεμβράνη και ανέστειλε τη δραστηριότητα της PKC. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε επίδραση του TDEE στο επίπεδο φωσφορυλίωσης του PLC. Το TDEE μπορεί να συνδεθεί απευθείας με το PKC και να αναστείλει την ενεργοποίηση του PKC. Η ενζυματική δραστηριότητα της PKA ελέγχεται κυρίως από ρυθμιστικές υπομονάδες που σχηματίζουν ένα σύμπλεγμα ολοενζύμων με τις καταλυτικές υπομονάδες [29] Η απελευθέρωση των καταλυτικών υπομονάδων είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα της ενεργοποίησης της PKA [29]. Βρήκαμε ότι η θεραπεία TDEE δεν είχε καμία επίδραση στην ενεργοποίηση της PKA. Για να διερευνήσουμε εάν η αναστολή των AQP1, AQP2, AQP3 και AQP4 στους νεφρούς προκαλείται μέσω του αποκλεισμού της ενεργοποίησης των σημάτων PKC, χρησιμοποιήσαμε το PMA ως αγωνιστή PKC για να παρέμβουμε στην έκφραση των AOP1, AOP2, AQP3 και AQP4 στο HK {19}} και κελιά mIMCD3. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η ευφεβρακτεολατίνη Α (το διτερπενοειδές από το TDEE) μείωσε τα επίπεδα έκφρασης των AQP1, AQP2, AQP3 και AQP4 σενεφρικά κύτταρα. Η αναστολή της έκφρασης των AOP1, AOP2, AOP3 και AQP4 που προκαλείται από την ευφεβρακτεολατίνη Α παρεμποδίστηκε από το PMA. Έτσι, συμπεραίνουμε ότι το TDEE ρύθμισε την έκφραση των AQP1, AQP2, AQP3 και AQP4 αναστέλλοντας την ενεργοποίηση της PKC. Οι ισομορφές PKC είναι πολυάριθμες. Το TDEE μπορεί επίσης να ρυθμίζει την έκφραση των AQPs αναστέλλοντας άλλες ισομορφές που περιμένουν περαιτέρω έρευνα. Μέχρι σήμερα, τα μόρια κατάντη της PKC που ρυθμίζουν την έκφραση των AQPs παραμένουν ελάχιστα κατανοητά. Στο επόμενο βήμα, θα επικεντρωθούμε στους κατάντη ρυθμιστικούς μηχανισμούς της PKC.

Συνοπτικά, το TDEE είναι ένα ενεργό κλάσμα του EER κατά του ασκίτη. Το TDEE αποτελείται από διτερπενοειδή όπως ent-abietane, Rosane και νορδιτερπενικές λακτόνες. Το TDEE και τα διτερπενοειδή του μπορούν να αναστείλουν την επαναρρόφηση και τη συγκέντρωση του νερού στους νεφρούς μειώνοντας τα επίπεδα έκφρασης των AQP1, AQP2, AQP3 και AQP4, με αποτέλεσμα να επιλύουν τον ασκίτη. Η αναστολή της έκφρασης AQP1, AQP2, AQP3 και AQP4 στους νεφρούς από το TDEE σχετίζεται με την αναστολή της ενεργοποίησης της PKC. Αυτή η μελέτη μπορεί να παρέχει τη βάση για την κλινική εφαρμογή της EER και τον εντοπισμό υποψήφιων φαρμάκων που προσδίδουν διούρηση και αντι-ασκιτική δράση.

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1. Χημικά και Αντιδραστήρια

Ένα κιτ δοκιμασίας αλβουμίνης αγοράστηκε από το Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Κίνα). Το ακετονιτρίλιο ποιότητας HPLC αγοράστηκε από την Media Co. (Anqing, Κίνα). Το τροποποιημένο μέσο Eagle της Dulbecco (DMEM) ελήφθη από την HyClone (Logan, UT, ΗΠΑ). Ελάχιστο απαραίτητο μέσο με μη απαραίτητα αμινοξέα (MEM NEAA) και εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) ελήφθη από την Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Κίνα). Τα αντισώματα Rabbit-anti-AQP1 και AQP3 ελήφθησαν από EnoGene Co., Ltd. (Nanjing, Κίνα). Αντισώματα Rabbit-anti-AQP2, AQP4 και ποντικού κατά της ακτίνης- -αγοράστηκαν από την Zen BioScience Co., Ltd. (Chengdu, Κίνα). Αντισώματα Rabbit-anti-PKC, PKC, PLC και φωσφο-PLC(Tyr783) αγοράστηκαν από την Affinity Biosciences Co., Ltd. (Changzhou, Κίνα). Ρυθμιστικό προσδιορισμού ραδιοϊσοκαταβύθισης (ρυθμιστικό διάλυμα RIPA), κιτ ανίχνευσης κυτταρικού κύκλου και απόπτωσης κυττάρου παρέχονται από την Yifeixue Biotechnology (Nanjing, Κίνα). Ένα κιτ BCA αγοράστηκε από την Beyotime Biotechnology (Σαγκάη, Κίνα). Το ρυθμιστικό αντιδραστηρίου ΤΡΙζόλης αγοράστηκε από την Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). Οι μεμβράνες PVDF αγοράστηκαν από την Millipore (Bedford, ΜΑ, ΗΠΑ). Ένα κιτ σύνθεσης cDNA αγοράστηκε από την YEASEN Biotech Co., Ltd. (Σαγκάη, Κίνα).

4.2.Φυτικό Υλικό

Το EER, η ρίζα του Euphorbia ebracteolate Hayata, αγοράστηκε από την Baohetang Pharmaceutical Co., Ltd. (Bozhou, Κίνα) στις 15 Σεπτεμβρίου 2017 και επικυρώθηκε από τον καθηγητή Harbin Hu του Ινστιτούτου Jiangsu για τον Έλεγχο Τροφίμων και Φαρμάκων. Ένα δείγμα κουπονιού (WH20170915) κατατέθηκε στο Ερμπάριο Παραδοσιακής Κινεζικής Ιατρικής στη Φαρμακευτική Σχολή του Πανεπιστημίου Κινεζικής Ιατρικής της Ναντζίνγκ.

4.3. Εκχύλιση και απομόνωση TDEE και Καθαρισμός Διτερπενοειδών

Το EER κονιοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μηχανικό μύλο. Η σκόνη (100 g) υποβλήθηκε σε διαδοχική εκχύλιση σε εκχυλιστή Soxhlet για 6 ώρες με διχλωρομεθάνιο. Μετά από αυτό, το εκχύλισμα συμπυκνώθηκε υπό ελαττωμένη πίεση, η οποία έδωσε εκχύλισμα διχλωρομεθανίου. Το εκχύλισμα διχλωρομεθανίου υποβλήθηκε σε χρωματογραφία στήλης (CC) σε ODS με έκλουση με 40 τοις εκατό και 90 τοις εκατό μεθανόλη διαδοχικά. Το υγρό έκλουσης 90 τοις εκατό μεθανόλης συλλέχθηκε, συμπυκνώθηκε και ξηράνθηκε για να παρασκευαστεί το TDEE (2,4 g). Τα εκχυλισμένα υπολείμματα συγχωνεύθηκαν και εκχυλίστηκαν τρεις φορές με 95 τοις εκατό αιθανόλη. Το εκχύλισμα στη συνέχεια συνδυάστηκε και εξατμίστηκε μέχρι ξηρού για να ληφθεί NTDEE (15,6 g). Το TEER (19,8 g) εκχυλίστηκε από την σκόνη EER (100 g) με 95 τοις εκατό αιθανόλη. Αυτά τα εκχυλίσματα χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα σε ζώα.

Οι κύριες ενώσεις του TDEE απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας την ακόλουθη διαδικασία. Η ρίζα του EER(20 kg) κονιοποιήθηκε και εκχυλίστηκε με διχλωρομεθάνιο για 72 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με διαβροχή τρεις φορές. Το εκχύλισμα διχλωρομεθανίου ελήφθη και συμπυκνώθηκε χρησιμοποιώντας έναν περιστροφικό εξατμιστή. Το υπόλειμμα υποβλήθηκε σε CC σε σιλικαζέλ χρησιμοποιώντας ένα σύστημα βαθμίδωσης αυξανόμενης πολικότητας με CH, Cl, και MeOH (100:0-0:100) για να δώσει 8 κλάσματα (Fr. 1-Fr.8) . Το Fr.4 υποβλήθηκε σε στήλη πυριτικής πηκτής εκλούοντας με πετρελαϊκό αιθέρα-EtOAc (από 50:1 έως 1:1), ακολουθούμενη από ODS CC ανάστροφης φάσης με έκλουση με MeOH-H, O από 60 τοις εκατό έως 80 τοις εκατό για να δώσει ενώσεις 5 και 6. Το Fr.5 χρωματογραφήθηκε σε στήλη πυριτικής πηκτής εκλούοντας με πετρελαϊκό αιθέρα-EtOAc (από 35:1 έως 0:1) για να δώσει 7 υποκλάσματα (Fr.5.1-Fr.5.7). Το Fr.5.3 διαχωρίστηκε με ODS CC με έκλουση με MeOH-H2O (από 75 τοις εκατό σε 100 τοις εκατό), και ακολούθησε

με ημι-παρασκευαστική HPLC (MeOH-H2O, από 75 τοις εκατό σε 100 τοις εκατό) για να δώσει την ένωση 4. Fr.5.4 χρωματογραφήθηκε σε στήλη πυριτικής πηκτής με έκλουση με πετρελαϊκό αιθέρα-EtOAc (από 30:1 έως 5:1), ακολουθούμενη από Sephadex LH-20(MeOH: CH2Cl, 1:1) και ημι-παρασκευαστική HPLC (MeOH-H, O, από 60 τοις εκατό έως 95 τοις εκατό) για να δώσει την ένωση 3.Fr. Το 5.6 καθαρίστηκε με ODS CC εκλούοντας με βαθμίδωση MeOH-H2O από 40:60 έως 100:0, ακολουθούμενο από Sephadex LH-20 CC (CHCl-MeOH, 1:1) για να δώσει τις ενώσεις 1 και 2.

4.4. In Vivo Experiments

4.4.1. Ζώα και Πειραματικός Σχεδιασμός

Τα αρσενικά ποντίκια ICR (βάρος: 18-22 g) ελήφθησαν από τη φάρμα αναπαραγωγής ζώων Qing Long Shan (Ναντζίνγκ, Κίνα). Τα ποντίκια διατηρήθηκαν σε τυπικά εργαστηριακά κλουβιά σε μέτρια υγρασία (50 τοις εκατό ± 5 τοις εκατό) σε σταθερή θερμοκρασία (22±1 βαθμός) σε ένα δωμάτιο κύκλου φωτός-σκότους 12 ωρών. Όλα τα ζώα είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό κατά τη διάρκεια της πειραματικής περιόδου. Το πειραματικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Πανεπιστημίου Κινεζικής Ιατρικής της Ναντζίνγκ (Ναντζίνγκ, Κίνα).

Συνολικά 90 αρσενικά ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 9 ομάδες (n= 10). Η ομάδα ελέγχου εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκά με 0,2 mL αλατούχο διάλυμα. Τα ποντίκια στις άλλες ομάδες εμβολιάστηκαν ενδοπεριτοναϊκά με κύτταρα 1 × 1{{1{0}} βαθμού Η22 σε όγκο 0,2 mL. Όλα τα φάρμακα εναιωρήθηκαν σε νερό με 0,5 τοις εκατό (β/ο)νατριούχο καρβοξυλομεθυλοκυτταρίνη (0,5 τοις εκατό Na-CMC). Μετά από 24 ώρες, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με καθετηριασμό κάθε μέρα σύμφωνα με το ακόλουθο σχήμα για 8 ημέρες: φυσιολογικές ομάδες και ομάδες μοντέλου χορηγήθηκαν 0,5 τοις εκατό Na-CMC. Η φουροσεμίδη (6 mg/kg) επιλέχθηκε ως θετικός μάρτυρας επειδή χρησιμοποιείται εκτενώς για τη θεραπεία οιδηματικών ασθενειών όπως ο ασκίτης λόγω της διούρησης. Στις ομάδες TEER, TDEE και NTDEE χορηγήθηκαν αντίστοιχα εκχυλίσματα EER (3,0 και 0,6 g ακατέργαστων βοτάνων/kg).

4.4.2. Αναλύσεις βάρους ασκιτικού υγρού, βάρους ούρων και περιεκτικότητας σε νερό κοπράνων

Τα ποντίκια από το μοντέλο και τις ομάδες που έλαβαν θεραπεία θυσιάστηκαν και συλλέχθηκε ασκητικό υγρό από την περιτοναϊκή κοιλότητα. Στη συνέχεια το υγρό ζυγίστηκε σε ηλεκτρονική ζυγαριά.

Τα ποντίκια στεγάστηκαν σε μεμονωμένα κλουβιά. Τα κόπρανα συλλέχθηκαν σε ζυγισμένα και σφραγισμένα φιαλίδια. Μετά από 5 ώρες, τα φιαλίδια που περιείχαν υγρά κόπρανα ζυγίστηκαν. Στη συνέχεια τα φιαλίδια ξηράνθηκαν σε σταθερό βάρος στους 105 βαθμούς. Η περιεκτικότητα σε νερό κοπράνων ( ποσοστό )=((βάρος φιαλιδίων που περιέχουν υγρά κόπρανα- το βάρος φιαλιδίων που περιέχουν αποξηραμένα κόπρανα)/(βάρος φιαλιδίων που περιέχουν υγρά κόπρανα - βάρος φιαλιδίων))× 100.

Το βάρος της απέκκρισης ούρων μετρήθηκε με τροποποίηση μιας προηγούμενης μεθόδου [30]. Τα ποντίκια στεγάστηκαν σε μεμονωμένα ποτήρια ζέσεως. Τα ποτήρια ζέσεως καλύφθηκαν με ένα μεταλλικό δίχτυ στα στόμια, στη συνέχεια αναποδογυρίστηκαν στα πλαστικά πιάτα που περιείχαν υπεραπορροφητικό πολυμερές (SAP). Σε αυτή τη δοκιμή, τα κόπρανα καθαρίστηκαν. Μετά από 5 ώρες, τα πλαστικά πιάτα που περιείχαν SAP και ούρα ζυγίστηκαν. Η ακόλουθη εξίσωση χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του βάρους των ούρων: βάρος ούρων (g)=βάρος των πλαστικών πιάτων που περιέχουν SAP και βάρος ούρων των πλαστικών πιάτων που περιέχουν SAP.

4.4.3. Ανάλυση λευκωματίνης ορού

Το αίμα από όλες τις ομάδες συλλέχθηκε με τροχιακή παρακέντηση και φυγοκεντρήθηκε στα 5000 x g για 10 λεπτά στους 4 βαθμούς. Η λευκωματίνη ορού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας λευκωματίνης.

4.4.4. Αναλύσεις βιωσιμότητας, κύκλου και απόπτωσης καρκινικών κυττάρων

Αφού θυσιάστηκαν τα ποντίκια, το ασκιτικό υγρό που περιείχε τα καρκινικά κύτταρα συλλέχθηκε από την περιτοναϊκή κοιλότητα και αραιώθηκε 20 φορές με αλατούχο διάλυμα αμέσως. Η βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων εκτιμήθηκε με χρώση 0,4 τοις εκατό με μπλε τρυπανίου και μετρήθηκε σε έναν αυτοματοποιημένο μετρητή κυττάρων (ALIT Life Science Co., Ltd., Shanghai, China).

Το αραιωμένο κυτταρικό εναιώρημα (0.5 mL) φυγοκεντρήθηκε στα 1000 g για 5 λεπτά στους 4 βαθμούς C. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε ψυχρή αιθανόλη 70 τοις εκατό στους 4 βαθμούς όλη τη νύχτα. Μετά τη στερέωση, τα καρκινικά κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και φυγοκεντρήθηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν με διάλυμα RNase A (100 μL) για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς. Τέλος, τα κύτταρα επωάστηκαν με 400μL ιωδιούχου προπιδίου

(PI) για 30 λεπτά στους 4 βαθμούς στο σκοτάδι και διηθήθηκε μέσω νάιλον μεμβράνης 300-πλέγματος. Το ποσοστό των κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Η απόπτωση των καρκινικών κυττάρων ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας κιτ απόπτωσης Annexin V-FITC/PI. Το αραιωμένο κυτταρικό εναιώρημα (0,5 mL) πλύθηκε δύο φορές σε PBS και φυγοκεντρήθηκε στα 1000 g για 5 λεπτά στους 4 βαθμούς. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης 100 uL ακολουθούμενη από επώαση με 5 μL Annexin V-FITC και 10 μL διαλύματος χρώσης PI για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Μετά την επώαση, προστέθηκαν 400 μL ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης σε κάθε σωληνάριο. Η κυτταρική απόπτωση ανιχνεύθηκε με χρήση κυτταρόμετρου ροής Accuri C6.

4.4.5. Ανάλυση Western Blot των AQP, PKC, PKA και PLC στα νεφρά

Αφού τα ποντίκια θυσιάστηκαν, οι νεφροί απομονώθηκαν και καταψύχθηκαν και στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν σε -80 βαθμό για ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης. Τα δείγματα ιστού ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA. Μετά από αποθήκευση στους{2}} βαθμούς κατά τη διάρκεια της νύχτας, τα προϊόντα λύσης ιστού συλλέχθηκαν μετά από φυγοκέντρηση για 10 λεπτό στους 12,000×g. Μετά τη φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο συλλέχθηκε για τον προσδιορισμό των ολικών και φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών. Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από τους νεφρούς χρησιμοποιώντας κιτ εξαγωγής πρωτεΐνης μεμβράνης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ BCA. Τα διαλύματα πρωτεΐνης μετουσιώθηκαν σε βραστό νερό για 5 λεπτά και αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης 5x. Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν σε ηλεκτροφόρηση γέλης 10 τοις εκατό SDS-πολυακρυλαμιδίου, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) και στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν με 5 τοις εκατό αλβουμίνη από βόειο ορό (BSA) για 2 ώρες. Μετά τον αποκλεισμό, οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα κατά των AOP1 (1:2000), AOP2 (1:1000), AQP3 (1:2000), AQP4 (1:1000), PKC (1:2000), PKC (1: 2000), PKA(1:2000), PLC(1:2000), ρ-PLC(1:800) και -ακτίνη (1:5000) στους 4 βαθμούς κατά τη διάρκεια της νύχτας. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες πλύθηκαν με αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με Tris που περιείχε 0,1 τοις εκατό Tween-20 (TBST) και τα πρωτογενή αντισώματα ανιχνεύθηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου (1:5000). Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν με ένα αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας και ένα σύστημα απεικόνισης χημειοφωταύγειας Tanon 5200 (Tanon, Σαγκάη, Κίνα). Οι ζώνες στυπώματος ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας ImageJ.

4.5. Προσδιορισμός Έξι Κύριων Διτερπενοειδών στο TDEE

Euphoria G, ent{{0}}l -hydroxyabicta-8(14),13(15)-dien-16,12-olide,jolkinolide B, EU-phebracteolatin Τα Α, Fischer Α και jolkinolide Ε διαλύθηκαν σε ακετονιτρίλιο στις κατάλληλες συγκεντρώσεις. Το TDEE διαλύθηκε επίσης σε ακετονιτρίλιο για να ανιχνεύσει τα περιεχόμενα του συστατικού χρησιμοποιώντας HPLC. Η ανάλυση HPLC πραγματοποιήθηκε σε σύστημα διαχωρισμού Waters 2695 εξοπλισμένο με ανιχνευτή διάταξης φωτοδιόδου (Waters, Milford, CT, ΗΠΑ) και στήλη Agilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm×250 mm, 5 μm). Μια κινητή φάση αποτελούνταν από 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ νερό (Α) και ακετονιτρίλιο (Β). Ο διαλύτης αναπτύχθηκε με ρυθμό ροής 1 mL/min χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρόγραμμα βαθμίδωσης:0-25 min, 65% B;25-40 min,65% -85% B;{{25 }} min, 85 % -100 % B. Ο όγκος της ένεσης ήταν 10μL. Η θερμοκρασία της στήλης ήταν 30 βαθμοί και χρησιμοποιήθηκε ένα μήκος κύματος 265 mm.

4.6. Πειράματα In Vitro

4.6.1. Κυτταρικής καλλιέργειας

Τα κύτταρα HK-2 και mIMCD3 αγοράστηκαν από την Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Κίνα). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε επωαστήρα σε ατμόσφαιρα 5 τοις εκατό CO2 στους 37 βαθμούς μέχρι 90 τοις εκατό συρροή και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές ενώσεις και αντιμετωπίστηκαν για τα πειράματα. Τα κύτταρα HK-2 αναπτύχθηκαν σε ΜΕΜ NEAA συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS και 1 τοις εκατό αντιβιοτικά, ενώ τα κύτταρα mIMCD3 αναπτύχθηκαν σε ένα μέσο DMEM που περιείχε 10 τοις εκατό FBS και 1 τοις εκατό αντιβιοτικά.

4.6.2. Western Blot και Quantitative Reverse Transcription-PCR (qRT-PCR) Αναλύσεις AQPs

Τα κύτταρα HK{{{{0}} και mIMCD3 σπάρθηκαν (5× 105/φρεάτιο) σε 6-πλάκες φρεατίου για 24 και 12 ώρες πριν από τη θεραπεία. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές ενώσεις για 8 ώρες σε 5 τοις εκατό CO, έναν επωαστήρα στους 37 βαθμούς. Κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,1 τοις εκατό διμεθυλοσουλφοξείδιο χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φορέα. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε ψυχρό PBS, συλλέχθηκαν με απόξεση σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA και στη συνέχεια λύθηκαν. Μετά από αποθήκευση στους -20 βαθμούς όλη τη νύχτα, τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση στους 12,000×g για 10 λεπτά και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν σε ανάλυση στυπώματος Western. Το Western blot διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως στα πειράματα σε ζώα σε αυτό το άρθρο.

Για την απομόνωση ολικού RNA. Μετά από επώαση με διαφορετικές ενώσεις για 8 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα αντιδραστηρίου TRIzol και το RNA απομονώθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το cDNA συντέθηκε από ίση ποσότητα RNA χρησιμοποιώντας κιτ σύνθεσης cDNA. Το μίγμα αντίδρασης για gRT-PCR παρασκευάστηκε με την προσθήκη cDNA, εμπρόσθιων και ανάστροφων εκκινητών που αναφέρονται στον Πίνακα 1, νερό DEPC και κύριο μείγμα SYBR πράσινου. Για ανάλυση γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιήθηκε ένα όργανο PCR σε πραγματικό χρόνο Applied Biosystems 7500. Οι συνθήκες PCR ήταν οι εξής: αρχική μετουσίωση στους 95 βαθμούς για 5 λεπτά ακολουθούμενη από 40 κύκλους 95 μοιρών για 10 δευτερόλεπτα και 60 μοίρες για 34 δευτερόλεπτα. Τέλος, τα δεδομένα PCR αναλύθηκαν με μεθόδους διπλής δέλτα CT σε υπολογιστικό φύλλο του Microsoft Excel.

4.6.3. Επίδραση του αγωνιστή PKC PMA στην έκφραση της πρωτεΐνης AQPs στα νεφρικά κύτταρα

Τα κύτταρα HK-2 και mIMCD3 επιστρώθηκαν σε6-πλάκες φρεατίου σε πυκνότητα 5×10 μοιρών κυττάρων/φρεάτιο. Μετά την προσάρτηση των κυττάρων, τα κύτταρα προεπωάστηκαν με ή χωρίς αγωνιστή PKC 200 nM (PMA) για 1,5 ώρα και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ευφεβρακτεολατίνη Α (2,5 μΜ) για 8 ώρες. Η εκχύλιση ολικών και μεμβρανικών πρωτεϊνών και ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε λεπτομερώς προηγουμένως.

4.7.Στατιστική Ανάλυση

Για στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε λογισμικό ανάλυσης SPSS 19.0. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA ή δοκιμή κατάταξης. Τα αριθμητικά δεδομένα εκφράστηκαν ως η μέση ± τυπική απόκλιση (SD). Διαφορές με σ<0.05 were="" considered="" statistically="">