Μέρος 1: Μια νέα προσέγγιση για την ενίσχυση του αναγεννητικού δυναμικού των κυκλοφορούντων ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων σε ασθενείς με νεφρική νόσο τελικού σταδίου

Για περισσότερες πληροφορίες. Επικοινωνίαtina.xiang@wecistanche.com

Αφηρημένη: Τα κυκλοφορούντα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα που προέρχονται από το μυελό των οστών (EPCs) διευκολύνουν την αγγειακή επιδιόρθωση σε πολλά όργανα, συμπεριλαμβανομένου του νεφρού, αλλά μειώνονται προοδευτικά στο τελικό στάδιοΝεφρική Νόσος(ESKD), η οποία συσχετίζεται με καρδιαγγειακά αποτελέσματα και σχετική θνησιμότητα. Έτσι, προσδιορίσαμε εάν η ενίσχυση των επιδράσεων αποκατάστασης ιστών των μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων που προέρχονται από τον μυελό των οστών (BM-MSCs) με τις αγγειογενετικές επιδράσεις της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ρελαξίνης (RLX) θα μπορούσε να προάγει τον πολλαπλασιασμό και τη λειτουργία της EPC. Τα CD34 συν EPCs απομονώθηκαν από το αίμα υγιών ασθενών και ασθενών με ESKD, καλλιεργήθηκαν έως ότου σχηματισθούν όψιμα EPC, και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με μέσα κατάστασης που προέρχονται από BM-MSC (CM, 25 τοις εκατό o), RLX (1 ή 10 ng/mL) ή και τα δύο συνδυασμένες θεραπείες. Ενώ το RLX μόνο διεγείρει τον πολλαπλασιασμό EPC, το σχηματισμό τριχοειδών σωλήνων και την επούλωση τραυμάτων in vitro, αυτά τα μέτρα ενισχύθηκαν πιο γρήγορα και σημαντικά από τις συνδυασμένες επιδράσεις των CM που προέρχονται από BM-MSC και RLX σε EPC που προέρχονται τόσο από υγιείς όσο και από ασθενείς με ESKD. Αυτά τα ευρήματα έχουν σημαντικές κλινικές επιπτώσεις, αφού έχουν εντοπίσει μια νέα συνδυαστική θεραπεία που μπορεί να αποκαταστήσει και να ενισχύσει τον αριθμό και τη λειτουργία EPC σε ασθενείς με ESKD.

Λέξεις-κλειδιά: ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα. νεφρική νόσο τελικού σταδίου. μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα που προέρχονται από μυελό των οστών. χαλασίνη? την επούλωση των πληγών; αγγειογένεση; αναγέννηση

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα για το cistanche προς πώληση

1. Εισαγωγή

Χρόνια νεφρική νόσος(ΧΝΝ) είναι ένα παγκόσμιο πρόβλημα υγείας, που ορίζεται ως μείωση του ρυθμού σπειραματικής διήθησης (GFR) μικρότερο ή ίσο με 60 mL/min/1,73 m², που συχνά οδηγεί σε νεφρική νόσο τελικού σταδίου (σταδίου V) (ESKD· ορίζεται ως GFR Μικρότερο ή ίσο με 15 mL/min/1,73m2)[2]. Τα παθολογικά χαρακτηριστικά της ΧΝΝ περιλαμβάνουν τη σωληναριακή ατροφία που σχετίζεται με μειώσεις των νεφρικών τριχοειδών και των ποδοκυττάρων, την καταστροφή των νεφρικών ενδοθηλιακών κυττάρων και την ανάπτυξηνεφρική ίνωση[3,4]. Το ενδοθήλιο των νεφρών τίθεται σε κίνδυνο κατά τη διάρκεια αυτών των διεργασιών, οδηγώντας σε διαταραχή της αγγειογένεσης και της νεφρικής λειτουργίας [5]. ΕΠΟΜΕΝΟνεφρική βλάβη, τα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα που προέρχονται από τον μυελό των οστών (EPCs) στρατολογούνται σε θέσεις τραυματισμού για να διευκολυνθεί η επιδιόρθωση των ιστών [6]. Τα EPC παίζουν καθοριστικό ρόλο στην ωρίμανση και τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων των νεφρών, την αγγειακή ακεραιότητα και την επιδιόρθωση του κατεστραμμένου ενδοθηλίου. Ωστόσο, οι κυκλοφορούντες αριθμοί EPC μειώνονται προοδευτικά σε ασθενείς με ESKD [7-9], γεγονός που συσχετίζεται με ανεπιθύμητες καρδιαγγειακές εκβάσεις [9,10] και τη μακροχρόνια θνησιμότητα.

Τα μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα (MSC) έχουν αναφερθεί ότι προάγουν την αγγειογένεση διεγείροντας τον προγραμματισμό EPC. Ωστόσο, ενώ τα MSCs έχουν αξιολογηθεί σε διάφορες κλινικές δοκιμές [13], η ικανότητά τους να διευκολύνουν την αναγέννηση του ενδοθηλίου των νεφρών δεν έχει διερευνηθεί. Πρόσφατες μελέτες από το εργαστήριό μας έχουν εντοπίσει το ενισχυμένο θεραπευτικό δυναμικό του συνδυασμού MSC που προέρχονται από ανθρώπινο μυελό των οστών (BM) με έναν αντι-ινωτικό παράγοντα, συγκεκριμένα την ανασυνδυασμένη ανθρώπινη (γονιδιακή-2)ρελαξίνη (serelaxin; RLX[14) στη βελτίωση νεφρική βλάβη,φλεγμονήκαι ίνωση σε προκλινικά μοντέλα νόσου. Ενώ το RLX μόνο μπορεί να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό EPC που προέρχεται από το ανθρώπινο αίμα και την παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου (NO) in vitro, και την αγγειογένεση σε ποντίκια in vivo[18], παραμένει άγνωστο εάν η συνδυασμένη δράση του με BM-MSCs θα μπορούσε να επιταχύνει ή/και να ενισχύσει το EPC- προερχόμενη αγγειογένεση και επούλωση πληγών. Αυτή η μελέτη, λοιπόν, αξιολόγησε τη θεραπευτική δυνατότητα συνδυασμού ρυθμισμένων μέσων (CM) που προέρχονται από RLX και BM-MSC σε πολλαπλασιασμό EPC, αγγειογένεση και επούλωση τραυμάτων υγιή έναντι του ESKD που προέρχεται από ασθενείς in vitro.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Απομόνωση EPC και καλλιέργεια από Περιφερικό αίμα

Μετά τη λήψη ενός υπογεγραμμένου εντύπου συναίνεσης ασθενούς, συλλέχθηκαν περίπου {{0}} mL αίματος από υγιείς άνδρες ελέγχους από την Υπηρεσία Αίματος του Αυστραλιανού Ερυθρού Σταυρού. Αντίθετα, μόνο ~5 mL μέγιστο του αίματος ανδρών ασθενών με ESKD συλλέχθηκαν από το Ιατρικό Κέντρο Monash λόγω της κατάστασης της υγείας τους. Όλα τα δείγματα αίματος υποβλήθηκαν σε επεξεργασία εντός 24 ωρών από το χρόνο συλλογής. Όλα τα δείγματα αίματος αραιώθηκαν με 1× ισορροπημένο διάλυμα άλατος Hank (HBSS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σε συνολικό όγκο 20 mL. Στη συνέχεια, το αίμα επιστρώθηκε προσεκτικά πάνω από 15 mL Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Ουψάλα, Σουηδία) σε ένα σωληνάριο Falcon 50 ml (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) και φυγοκεντρήθηκε στα 400× g για 40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να διαχωριστεί η στρώση από άλλα συστατικά χρησιμοποιώντας μια μέθοδο διαχωρισμού με κλίση πυκνότητας όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19,20]. Μετά τον διαχωρισμό με κλίση, η ανώτερη στιβάδα που περιέχει πλάσμα και αιμοπετάλια αφαιρέθηκε εισάγοντας προσεκτικά μια ορολογική πιπέτα, αφήνοντας αδιατάρακτη την φουσκωτή επικάλυψη που περιέχει μονοπύρηνα κύτταρα από το περιφερειακό αίμα (PBMCs), αποτελούμενη από ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (EPCs). Το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 2 ml από μέσα ανάπτυξης ενδοθηλιακών κυττάρων (EGM)-2 Microvascular (MV)Bullet Kit (προϊόν #CC-3162, Lonza, Hayward, CA, USA). συμπληρωμένο με 5 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), 0,04 τοις εκατό υδροκορτιζόνη, 0,4 τοις εκατό ανθρώπινο αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (hFGF) και 0,1 τοις εκατό αγγειακό ενδοθηλιακό αυξητικό παράγοντα (VEGF), R3-όμοιο με την ινσουλίνη αυξητικό παράγοντα (IGF )-1, ασκορβικό οξύ, ανθρώπινος επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (hEGF) και θειική γενταμικίνη/αμφοτερικίνη (GA-1000), σε απομονωμένα EPC από καλλιέργεια. Τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αυτοματοποιημένο μετρητή κυττάρου CountessM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) προτού εμβολιαστούν σε πλακίδια/φιαλίδια καλλιέργειας επικαλυμμένα με ινονεκτίνη.

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50 κύτταρα/αποικία) χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία μονάδας σχηματισμού αποικίας (CFU).

2.2. Παρασκευή ρυθμισμένων μέσων (CM) από καλλιεργημένο BM-MSC

Καθώς η προσθήκη BM-MSCs σε καλλιέργειες EPC θα έθετε σε κίνδυνο τα προς μέτρηση τελικά σημεία που σχετίζονται με EPC, αποφασίστηκε ότι θα ήταν καλύτερο να αναλυθούν οι επιδράσεις του CM που προέρχεται από BM-MSC στη λειτουργία EPC, όπως χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως για την ανάλυση άλλων τελικών σημείων [19]. Εν συντομία, τα BM-MSCs αναπτύχθηκαν σε Alpha-Minimum Essential Media ( -MEM; Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Αυστραλία), συμπληρωμένα με 16 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) και 1 τοις εκατό 200 mM L-γλουταμίνη και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη. Μόλις τα κύτταρα έφτασαν στο ~80 τοις εκατό συρροή, τα BM-MSCs υποκαλλιεργήθηκαν περαιτέρω και επιστρώθηκαν σε 12-πλάκα φρεατίου σε πυκνότητα ~0,5×10 μοιρών ανά φρεάτιο και διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια για 24-48 ώρες για να διασφαλιστεί η κυτταρική προσκόλληση. Για την παρασκευή ρυθμισμένων μέσων (CM) από BM-MSCs, για λίγο τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με προθερμασμένο 1 mL 1× HBSS. Μετά τα βήματα πλύσης, 500 μL βασικού μέσου ενδοθηλιακών κυττάρων χωρίς ορό και αυξητικό παράγοντα (EBM). Προϊόν #CC-3121.Lonza, Hayward, CA, USA) προστέθηκε στα κύτταρα και διατηρήθηκε σε καλλιέργεια σε 5 τοις εκατό CO, 37 βαθμούς για άλλες 24 ώρες. Στο τέλος αυτής της περιόδου επώασης, το CM στη συνέχεια συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε στα 400×g για 10 λεπτά για να αφαιρεθούν τυχόν κυτταρικά υπολείμματα. Το CM σε κλάσματα των 500 μL αποθηκεύτηκε σε -80 βαθμό μέχρι τη μελλοντική χρήση.

2.3. Λειτουργικές Αναλύσεις

2.3.1. Θεραπεία καλλιεργημένων όψιμων EPC

Μόλις συλλέχθηκαν τα όψιμα EPC, πραγματοποιήθηκαν λειτουργικές δοκιμασίες. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σε αποσπάσματα 3-6. Πραγματοποιήθηκαν λειτουργικές δοκιμασίες για τη διερεύνηση της επίδρασης (i) 25 τοις εκατό ρυθμισμένων μέσων που προέρχονται από BM-MSC (25 τοις εκατό CM)[20]· (ii) 1 [RLX-1] ή 10 [RLX{-10 ]ng/mL [18] RLX (που αντιπροσωπεύει τα κυκλοφορούντα επίπεδα H2 χαλαρίνης που βρίσκονται σε έγκυες γυναίκες [21]). ή (i) τα συνδυασμένα αποτελέσματα 25 τοις εκατό CM και 1 ή 10 ng/mL RLX· (iv) 20 τοις εκατό FBS χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος στο δυναμικό πολλαπλασιασμού και σχηματισμού σωλήνα (αγγειογενετικό) των καθυστερημένων EPC που προέρχονται από ασθενείς ελέγχου . Οι ομάδες θεραπείας συγκρίθηκαν με κύτταρα που δεν υποβλήθηκαν σε αγωγή.

2.3.2. Δοκιμασία βιωσιμότητας και πολλαπλασιασμού

Η βιωσιμότητα και το πολλαπλασιαστικό δυναμικό των όψιμων EPCs προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το {{0}}(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5- Δοκιμασία βρωμιούχου διφαινυλτετραζολίου (MTT) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Sigma-Aldrich, Μελβούρνη, VIC, Αυστραλία). Εν συντομία, ~5×103 κύτταρα ανά φρεάτιο σπάρθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίων (BD Falcon, North Ryde, NSW, Αυστραλία), και στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CM, RLX που προέρχεται από BM-MSC (10 ng/ mL), ή συνδυασμό CM και RLXat 1 ή 10 ng/mL για 24 ώρες. Στο τέλος της περιόδου επώασης, προστέθηκαν 10 μL αντιδραστηρίου επισήμανσης MTT (0,5 mg/mL, Sigma-Aldrich, Μελβούρνη, VIC, Αυστραλία) και επωάστηκαν στους 37 βαθμούς Cand 5 τοις εκατό CO2 για άλλες 4 ώρες. Τα κύτταρα διαλυτοποιήθηκαν με την προσθήκη 100 μL του διαλύματος διαλυτοποίησης (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC Australia) και το δυναμικό πολλαπλασιασμού των όψιμων EPCs προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης κάθε δείγματος στα 590 nm χρησιμοποιώντας μια πλάκα Micro αναγνώστη (Bio-strategy, Balwyn North, VIC, Αυστραλία) και αναλύθηκε με το λογισμικό SoftMax Pro για λειτουργικό σύστημα Windows (έκδοση 7.3, Molecular Devices LLC, CA, USA). Κάθε μία από τις ομάδες θεραπείας εκτελέστηκε και αναλύθηκε σε έξι επαναλήψεις.

2.3.3. Προσδιορισμός Σχηματισμού Σωλήνων

Τα αποτελέσματα των διαφόρων θεραπειών για την προώθηση του αγγειογενετικού δυναμικού των όψιμων EPCs, χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα, προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία μ-αγγειογένεσης (Abidi, Fitchburg, WI, ΗΠΑ). Εν συντομία, 10 μL μειωμένου αυξητικού παράγοντα (GFR) Matrigel (Προϊόν #356231, Corning, Tewksbury, MA, ΗΠΑ) προστέθηκαν στο εσωτερικό φρεάτιο του μ-Slide του κιτ προσδιορισμού αγγειογένεσης (Abidi, Fitchburg, WI, ΗΠΑ, ). Οι συρρέουσες καλλιέργειες των όψιμων EPC σπάρθηκαν στα επικαλυμμένα κύτταρα και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CM προερχόμενο από BM-MSC, RLX (10 ng/mL) ή συνδυασμό CM και RLX στα 10 ng/mL. Συνολικός όγκος 50 μL εναιωρήματος κυττάρων που περιείχε~1 × 104 κύτταρα εφαρμόστηκε σε κάθε φρεάτιο. Οι εικόνες καταγράφηκαν αμέσως και επισημάνθηκαν ως το χρονικό σημείο της ώρας 0-. Η ικανότητα των κυττάρων κάτω από διάφορες θεραπείες να

Παρατηρήθηκαν σωλήνες μορφής και οι εικόνες καταγράφηκαν σε 2-24 ώρα μετά τη σπορά των κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός. Ο αριθμός των σωλήνων, το μήκος του σωλήνα και ο αριθμός των σημείων διακλάδωσης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

2.3.4.Δοκιμασία επούλωσης πληγών

Τα αποτελέσματα των διαφόρων θεραπειών στο αναγεννητικό δυναμικό των όψιμων EPC προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία επούλωσης πληγών. Για να πραγματοποιηθεί ο προσδιορισμός, ~ 1 × 10 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης 50 μL και σπάρθηκαν σε 2 φρεάτια σιλικόνης σε δίσκο 35 mm για δοκιμασία επούλωσης τραυμάτων (Abidi Inc., Fitchburg, WI, ΗΠΑ). Τα τεχνητά τραύματα μέσα στα πιάτα δημιουργήθηκαν αφαιρώντας απαλά τα φρεάτια σιλικόνης χρησιμοποιώντας ένα αποστειρωμένο τσιμπιδάκι (απόσταση κενού=500±100μm）. Τα πιάτα αναπληρώθηκαν με 2 mL 50% EGM-2, με την προσθήκη διαφόρων θεραπείες που περιλαμβάνουν CM που προέρχεται από BM-MSC, RLX (10 ng/mL) ή συνδυασμό CM και RLX σε 1 ή 10 ng/mL. Ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν για να κλείσουν το τραύμα εκτιμήθηκε με χρήση μικροσκοπίου φωτός. Μικρογραφίες του Τα μεταναστευτικά κύτταρα καταγράφηκαν σε 0-24 ώρες μετά τη θεραπεία. Το ποσοστό της περιοχής κλεισίματος κενού προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image].

2.3.5.Αναλύσεις εικόνας

Όλες οι αναλύσεις εικόνας για τις λειτουργικές δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ για MacOS (έκδοση 1.8, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, Bethesda, MD, ΗΠΑ). Για το δυναμικό σχηματισμού σωλήνων των όψιμων EPCs, οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόσθετο προσδιορισμού αγγειογένεσης και καταγράφηκαν τέσσερις διαφορετικές παράμετροι, συμπεριλαμβανομένου του συνολικού μήκους, του αριθμού των ματιών, του αριθμού των συνδέσεων και του αριθμού διακλαδώσεων. Για τον προσδιορισμό επούλωσης τραύματος, η περιοχή κλεισίματος του τραύματος αναλύθηκε με χειροκίνητη σήμανση της περιοχής χωρίς κύτταρα σε κάθε ένα από τα χρονικά σημεία. Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον 3 φορές για έλεγχο διακύμανσης.

2.3.6. Ανοσοφθορισμός

Ο εντοπισμός πρωτεΐνης του υποδοχέα πεπτιδίου οικογένειας Relaxin 1 (RXFP1, ο συγγενής υποδοχέας RLX) σε καλλιεργημένα όψιμα EPCs προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας χρώση ανοσοφθορισμού. Πρώτον, ~1× 1{{2{{0}} κύτταρα μοιρών που αναπτύχθηκαν σε γυάλινη καλυπτρίδα 13 mm (επικαλυμμένη με πολυ-D-λυσίνη) σε πλάκα 12-πηγαδιού στερεώθηκαν σε 4 τοις εκατό PFA για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα σταθεροποιημένα κύτταρα αποκλείστηκαν για μη ειδική δέσμευση πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας 1 τοις εκατό αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA) για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στο τέλος της περιόδου επώασης, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS για 5 λεπτά (3 φορές) και επωάστηκαν με ένα πολύκλωνο αντίσωμα RXFP1 κουνελιού (aa 609-624; A 9227; 1:2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim, Γερμανία ) σε 0,01 τοις εκατό BSA κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 βαθμούς. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα Alexa-fluor 594 κατσίκας-αντι-κουνελιού (1:500, Invitrogen, Scoresby, Victoria, Αυστραλία) σε 0,01 τοις εκατό BSA για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Πραγματοποιήθηκε πυρηνική αντιχρώση προσθέτοντας 40 μL DAPI σε μέσο στήριξης Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) και καλυπτρίστηκε. Η ανοσοαντιδραστική πρωτεΐνη RXFP1 οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού σε μεγέθυνση ×40 (Olympus BX51) και οι εικόνες συγχωνεύτηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

2.4. Στατιστικές αναλύσεις

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος ± SEM και όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism'M (έκδοση 9, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Χρησιμοποιήθηκε ένας τρόπος ANOVA για τη σύγκριση της επίδρασης διαφόρων θεραπειών στον πολλαπλασιασμό (δοκιμασία ΜΤΤ) και στο αγγειογενετικό (δοκιμασία σχηματισμού σωλήνων) δυναμικό των όψιμων EPCs, ακολουθούμενο από μια δοκιμασία Tukey's post-hoc για να επιτραπούν πολλαπλές συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων θεραπείας. Χρησιμοποιήθηκε μια επαναλαμβανόμενη μέτρηση - δύο κατευθύνσεων - ANOVA για να συγκριθεί η επίδραση των διαφόρων θεραπειών στο κλείσιμο του τραύματος από τα όψιμα EPCs με την πάροδο του χρόνου, ακολουθούμενη από το post-hoc τεστ Tukey για σύγκριση καθεμίας από τις ομάδες θεραπείας. Μια τιμή p μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.