Μέρος δεύτερο Το DsbA-L αλληλεπιδρά με το VDAC1 στην απόπτωση των σωληνοειδών κυττάρων που προκαλείται από μιτοχόνδρια και συμβάλλει στην εξέλιξη της οξείας νεφρικής νόσου

Αποτελέσματα

1. Η ισχαιμική βλάβη προκάλεσε την έκφραση της DsbA-L σε κύτταρα BUMPT και στους νεφρούς ποντικών και ασθενών

Για να διερευνήσουμε εάν ο ισχαιμικός τραυματισμός προκάλεσε την έκφραση του DsbA-L, εξαντλήσαμε τα κύτταρα BUMPT του ATP για 2 ώρες και στη συνέχεια τα αφήσαμε να ανακάμψουν για μια συνολική περίοδο 4 ωρών. Τα αποτελέσματα RT-qPCR και ανοσοστύπωσης έδειξαν ότι η έκφραση του DsbA-L προκλήθηκε στο I/R 2-0, έφτασε στο μέγιστο στο I/R 2-2 και στη συνέχεια μειώθηκε σταδιακά σε επίπεδα που παρατηρήθηκαν στο I/R 2-0 (Εικόνα 1a, e και i). Η χρώση με ανοσοφθορισμό του DsbA-L επιβεβαίωσε περαιτέρω αυτά τα ευρήματα και έδειξε ότι το DsbA-L εκφράζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων BUMPT (Εικόνα 1 m και n). Ανιχνεύσαμε περαιτέρω την έκφραση του DsbA-L σε ποντικούς C57BL/6 που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ισχαιμία (28 λεπτά) και τραυματισμό επαναιμάτωσης (24 ώρες και 48 ώρες). Τα αποτελέσματα της RT-PCR και της ανοσοστύπωσης έδειξαν ότι η έκφραση του DsbA-L προκλήθηκε τόσο στον φλοιό όσο και στον έξω μυελό του νεφρού ποντικών μετά από 24 ώρες επαναιμάτωσης και έφτασε στο μέγιστο 48 ώρες μετά την επαναιμάτωση (Εικόνα 1 b, c, f, g , j και k). Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω από την ανοσοϊστοχημική χρώση του DsbAL (Εικόνα 1 o και p). Τέλος, διερευνήσαμε εάν τα επίπεδα έκφρασης του DsbA-L προκλήθηκαν σε ασθενείς με AKI που προκαλείται από ισχαιμία. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης DsbA-L ήταν σημαντικά αυξημένα σε ασθενείς με AKI που προκαλείται από ισχαιμία σε σύγκριση με ασθενείς με MCD (Εικόνα 1. d, h, και l). Αυτά τα αποτελέσματα επικυρώθηκαν περαιτέρω με τη χρώση με ανοσοφθορισμό του DsbA-L (Εικόνα 1. q και r).

Σχήμα 1. Το DsbA-L προκλήθηκε με I/R σε κύτταρα BUMPT και νεφρούς ποντικών και ασθενών. Το μοντέλο I/R σε κύτταρα BUMPT προκλήθηκε από 10 mM αντιμυκίνης Α και 1,5 mM ιονοφόρου ασβεστίου για 2 ώρες και ανακτήθηκε για 0, 2 και 4 ώρες. Το μοντέλο ποντικών I/R προκλήθηκε από αμφοτερόπλευρη νεφρική ισχαιμία για 28 λεπτά και επαναιμάτωση για 24 και 48 ώρες. Δείγματα νεφρικής βιοψίας συλλέχθηκαν από ασθενείς με AKI που προκλήθηκαν από I/R και ασθενείς με νόσο ελάχιστης αλλαγής (MCD). (δ) Ανίχνευση RT-qPCR της έκφρασης DsbA-L σε κύτταρα BUMPT, νεφρικό φλοιώδη ιστό ποντικών και από ασθενείς με μυελό και νεφρούς με ή χωρίς πάθηση I/R. (ε- η) Ανάλυση ανοσοστύπωσης DsbA-L και β-τουμπουλίνης σε κύτταρα BUMPT υπό το μοντέλο I/R σε κύτταρα BUMPT, φλοιώδη ιστό, από ασθενείς με μυελό και νεφρούς. (i- l) Πυκνομετρική ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης DsbA-L και β-τουμπουλίνης. (m, o, και q) Ανοσοφθορισμός και ανοσοϊστοχημική χρώση του DsbA-L σε κύτταρα BUMPT και νεφρούς ποντικών και ασθενών με ή χωρίς πάθηση I/R, αντίστοιχα. (n, p, και r) Ποσοτική ανάλυση της χρώσης DsbA-L. Αρχική μεγέθυνση x 400. Scar Bar: 10μM σε m100μM σε o και q. Κάθε πείραμα (e-h, m, o και q) επαναλήφθηκε 6 φορές ανεξάρτητα με παρόμοια αποτελέσματα. Χρησιμοποιήθηκαν δοκιμές t Student δύο ουρών για συγκρίσεις δύο ομάδων. (a- d, i- l, n, p και r). # Π<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε τα οφέλη του Cistanche

2. νεφρική βλάβη που προκαλείται από IR, απόπτωση σωληναριακών κυττάρων και μιτοχονδριακή βλάβη εξασθενήθηκαν σε ποντικούς PT-DsbA-LKO

Τα νεογνά των ποντικών PT-DsbA-L-WT και PT-DsbA-L-KO υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ή χωρίς ισχαιμία (28 λεπτά) και τραυματισμό επαναιμάτωσης (24 ώρες και 48 ώρες). Μετά από αυτή τη θεραπεία, λάβαμε δείγματα αίματος και δείγματα ιστών νεφρού για περαιτέρω εξέταση. Λειτουργικά, η επαγόμενη από I/R επιδείνωση της νεφρικής λειτουργίας χαρακτηρίστηκε από αυξανόμενα επίπεδα αζώτου ουρίας αίματος (BUN) και κρεατινίνης στα ποντίκια PT-DsbA-L-WT. αυτό το αποτέλεσμα μειώθηκε σημαντικά στα ποντίκια PT-DsbA-L-KO (Εικόνα 2α και β). Η ιστολογία και οι αναλύσεις TUNEL επαλήθευσαν επίσης ότι το I/R προκάλεσε αξιοσημείωτη βλάβη ιστού και απόπτωση στα ποντίκια PT-DsbA-L-WT, αν και αυτό βελτιώθηκε στα ποντίκια PT-DsbA-L-KO (Εικόνα 2c,d,f, και ζ). Είναι ενδιαφέρον ότι οι αναλύσεις με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (EM) έδειξαν ότι τα ποντίκια PT-DsbA-L-KO εμφάνισαν αξιοσημείωτη εξασθένηση της μιτοχονδριακής βλάβης που προκαλείται από I/R (Εικόνα 2 e και h). Η ανοσοστύπωση επαλήθευσε περαιτέρω ότι τα ποντίκια PT-DsbA-LKO εξέφρασαν επίσης χαμηλότερα επίπεδα διασπασμένης κασπάσης-3, χαμηλότερους ρυθμούς συσσώρευσης Bax στα μιτοχόνδρια και μειωμένα επίπεδα απελευθέρωσης κυτοχρώματος c (Cyt-c) στο κυτοσόλιο (Εικόνα 2 Ι- ο). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης RT-qPCR έδειξαν ότι το PT-DsbA-L-KO ανέστρεψε τη μείωση του NRF1 και του PCG-1a που προκλήθηκε από το I/R (Εικόνα 2 p και q), το οποίο επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από την ανάλυση ανοσοστύπωσης ( Εικόνα 2 r- t). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το DsbA-L έπαιξε κεντρικό ρόλο στην επαγόμενη από I/R AKI.

Σχήμα 2. Εξασθένηση της νεφρικής βλάβης που προκαλείται από IR, απόπτωσης σωληναριακών κυττάρων, βλάβης μιτοχονδρίων και έκφρασης Bax, Cytc και διασπασμένης κασπάσης3 σε ποντικούς PT-DsbA-L-KO. Οι αμφοτερόπλευρες νεφρικές αρτηρίες των πτωμάτων ποντικών PT-DsbA-L-KO και PT-DsbA-L-WT σφίγγονται για 28 λεπτά και στη συνέχεια απελευθερώνονται για 48 ώρες για να δημιουργηθεί ένα μοντέλο IR. (α) BUN (β) Κρεατινίνη ορού (γ) Χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης. (δ) Αντιπροσωπευτικά τμήματα θετικών κυττάρων TUNEL. (ε) Ανίχνευση μορφολογίας μιτοχονδρίων με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. (στ) Βαθμολογία σωληνοειδούς βλάβης. (ζ) Ο αριθμός των θετικών στο TUNEL κυττάρων. (η) Βαθμολογία τραυματισμού μιτοχονδρίων. (i) Η ανάλυση ανοσοστύπωσης της έκφρασης της διασπασμένης κασπάσης3 και DsbA-L και της έκφρασης BAX και Cyt-c σε μιτοχονδριακά και κυτοσολικά κλάσματα. Η β-τουμπουλίνη και η GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως πλήρες κυτταρόλυμα ή έλεγχος φόρτισης κυτοσολίου, αντίστοιχα. Το COX IV χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης μιτοχονδρίων. (ι- ο) Ανάλυση της εικόνας σε κλίμακα του γκρι μεταξύ τους. (p και q) Ανίχνευση RT-qPCR της έκφρασης NRF1 και PCG-1α. (r) Η ανάλυση ανοσοστύπωσης της έκφρασης NRF1 και PCG-1α. (s και t) Ανάλυση της εικόνας σε κλίμακα του γκρι μεταξύ τους. Αρχική μεγέθυνση x 400 ή x6000. Scar Bar: 100μM σε c&d 20μM σε e. Κάθε πείραμα (ce, I και r) επαναλήφθηκε 6 φορές ανεξάρτητα με παρόμοια αποτελέσματα. Χρησιμοποιήθηκε μονόδρομη ANOVA για τις συγκρίσεις πολλαπλών ομάδων. (a, b,f- h, jo, pq&s- t). # Π<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-DsbA-L-WT with IR group.

Cistanche tubulosa

3. DsbA-L επαγόμενη από I/R απόπτωση σε κύτταρα BUMPT

Για να διερευνήσουμε περαιτέρω εάν το DsbA-L μεσολαβεί στην απόπτωση σε κύτταρα BUMPT που προκαλούνται από I/R, επιμολύναμε κύτταρα BUMPT με DsbA-L siRNA και στη συνέχεια εξαντλήσαμε αυτά τα κύτταρα από το ATP για 2 ώρες. τα κύτταρα στη συνέχεια αφέθηκαν να ανακτήσουν για 2 ώρες. Οι αναλύσεις FCM βρήκαν ότι το DsbA-L siRNA εξασθένησε σημαντικά την απόπτωση που προκαλείται από I/R σε κύτταρα BUMPT (Εικόνα 3α). Οι αναλύσεις ανοσοστύπωσης επιβεβαίωσαν περαιτέρω ότι το DsbA-L siRNA κατέστειλε σημαντικά την επαγόμενη από I/R αύξηση στην έκφραση της διασπασμένης κασπάσης-3, την αυξημένη συσσώρευση Bax στα μιτοχόνδρια και την αυξημένη απελευθέρωση Cyt-c στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 3 β- η). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης RT-qPCR έδειξαν ότι το I/R κατέστειλε την έκφραση των NRF1 και PCG-1a, η οποία αντιστράφηκε από το DsbA-L siRNA (Εικόνα 3 i και j). Τα αποτελέσματα της ανοσοστύπωσης ήταν σύμφωνα με τα ευρήματα της RT-qPCR (Εικόνα 3 km). Αντίθετα, το πλασμίδιο DsbA-L ενίσχυσε την επαγόμενη από I/R απόπτωση σε κύτταρα BUMPT, αύξησε την έκφραση της διασπασμένης κασπάσης-3, αύξησε τη συσσώρευση Bax και αύξησε την απελευθέρωση Cyt-c στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 3 ο- u). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης RT-qPCR έδειξαν ότι το I/R κατέστειλε την έκφραση των NRF1 και PCG-1a, η οποία ενισχύθηκε από το πλασμίδιο DsbA-L (Εικόνα 3 ν και w). Τα αποτελέσματα ανοσοστύπωσης επιβεβαίωσαν περαιτέρω τα ευρήματα της RT-qPCR (Εικόνα 3 x-z). Αυτά τα δεδομένα επιβεβαίωσαν περαιτέρω ότι το DsbA-L μεσολάβησε στη διαδικασία της απόπτωσης καθώς και στη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία κατά τη διάρκεια ισχαιμικού τραυματισμού.

Σχήμα 3. Το DsbA-L προκάλεσε την επαγόμενη από IR έκφραση της διασπασμένης κασπάσης3, BAX και Cyt-c σε κύτταρα BUMPT. Το πλασμίδιο και το siRNA του DsbA-L επιμολύνθηκαν σε κύτταρα BUMPT και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε εξάντληση ΑΤΡ για 2 ώρες και ανάκτηση για 2 ώρες. (α&ν) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της απόπτωσης κυττάρων BUMPT. (β&ο) Οι ανοσοκηλίδες ανέλυσαν την έκφραση της διασπασμένης κασπάσης3 και DsbA-L και την έκφραση BAX και Cyt-c σε μιτοχονδριακά και κυτοσολικά κλάσματα. Η β-τουμπουλίνη και η GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως πλήρες κυτταρόλυμα ή έλεγχος φόρτισης κυτοσολίου, αντίστοιχα. Το COX IV χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης μιτοχονδρίων. (c- h, και q- u) Ανάλυση της εικόνας σε κλίμακα του γκρι μεταξύ τους. (i,j και v, w) Το RT-qPCR ανιχνεύει την έκφραση του NRF1 και του PCG-1α. (k και x) Η ανάλυση ανοσοστύπωσης της έκφρασης NRF1 και PCG-1α. (l, m και y,z) Ανάλυση της εικόνας σε κλίμακα του γκρι μεταξύ τους. Κάθε πείραμα (a, b, k, n, o και x) επαναλήφθηκε 6 φορές ανεξάρτητα με παρόμοια αποτελέσματα. Χρησιμοποιήθηκε μονόδρομη ANOVA για τις συγκρίσεις πολλαπλών ομάδων. (c- j,c- m, p- w & y, z). # Π<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus scramble with the saline group. * P<0.05 versus scramble with IR group.

Συμπλήρωμα Cistanche

4. Το DsbA-L αλληλεπιδρά με το VDAC1 σε κύτταρα BUMPT που είχαν υποστεί μείωση του ATP καθώς και στους νεφρούς ποντικών και ασθενών με AKI

Προηγούμενα αποτελέσματα πρότειναν ότι ο εξαρτώμενος από την τάση κανάλι ανιόντων-1 (VDAC1), μια σημαντική πρωτεΐνη της εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης, εμπλέκεται στην απόπτωση των κυττάρων36 Η πρόσφατη μελέτη μας ανέφερε ότι το DsbA-L εκφράζεται επίσης στα μιτοχόνδρια. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι το DsbA-L αλληλεπιδρά με το VDAC1 για να ρυθμίσει την εξέλιξη της ΑΚΙ. Τα αποτελέσματα της ανοσοκατακρήμνισης (IP) έδειξαν ότι το αντίσωμα αντι-VDAC1 κατέρρευσε και τις πρωτεΐνες VDAC1 και DsbA-L, ενώ το αντι-DsbA-L κατακρήμνισε τόσο το DsbA-L όσο και το VDAC1 σε ολόκληρα προϊόντα λύσης των ομάδων ελέγχου και I/R των κυττάρων BUMPT, και νεφροί ποντικών και νεφροί ασθενών (Εικόνα 4α). Επιπλέον, τα μιτοχονδριακά προϊόντα λύσης των νεφρών ποντικών BUMPT κυττάρων και των νεφρών ασθενών χρησιμοποιήθηκαν επίσης για τη συν-ΙΡ των DsbA-L και VDAC1. Τα ευρήματα ήταν συνεπή με αυτά για ολόκληρο το προϊόν λύσης (Εικόνα 4β). Η δομή του DsbA-L περιέχει μια περιοχή δέσμευσης νουκλεοτιδίων/τομέα ΑΤΡάσης (αμινοξέα 1-51), μια αμινοτελική περιοχή (NTD), μια ελικοειδή περιοχή για διμερισμό (αμινοξέα 56-178) και μια καρβοξυτελική περιοχή (CTD, αμινοξέα 185-216) (Εικόνα 4c). Με βάση τη δομή του VDAC1, η πρόβλεψη λογισμικού έδειξε ότι η Ν-τερματική περιοχή (αμινοξέα 1 έως 25) του VDAC1 μπορεί να αλληλεπιδράσει με το DsbA-L (Εικόνα 4δ). Για να διευκρινίσουμε ποιες περιοχές του VDAC1 μπορούν να αλληλεπιδράσουν με το DsbA-L, κατασκευάσαμε τρία πλασμίδια για το HA-VDAC1 που περιλαμβάνει τα αμινοξέα 1- 75, τα αμινοξέα 76-1098 και το πλήρες γονίδιο (Εικ. 4e). Το αντίσωμα αντι-ΗΑ καθίζησε το DsbA-L σε ομάδες που χαρακτηρίζουν το VDAC1 με τα αμινοξέα 1-75 και το πλήρες γονίδιο, αλλά όχι με το VDAC1 και το πλασμίδιο που διαθέτει αμινοξέα 76-1098. Αυτό έδειξε ότι το DsbA-L αλληλεπιδρά με την περιοχή του VDAC1 που διαθέτει αμινοξέα 1-75 (Εικόνα 4στ). Για να διερευνήσουμε περαιτέρω ποιες συγκεκριμένες περιοχές του VDAC1 αλληλεπιδρούσαν με το DsbA-L, επιμολύναμε κύτταρα BUMPT με την HA-Tag των πλασμιδίων VDAC1 με D9-13, 22-27, D{39-45, {{59 }}, D{9-13, 22-27, 39-45, 55-57. Τα αποτελέσματα IP έδειξαν ότι το αντίσωμα αντι-ΗΑ καθίζανε μόνο το DsbA-L με τα πλασμίδια D{{39-45 και {{55-57, και όχι τα πλασμίδια D{9-13 και 22-27 (βλ. Εικόνα 4g ). Αυτό έδειξε περαιτέρω ότι το DsbA-L αλληλεπιδρά με τα αμινοξέα 9-13 και 22-27 του VDAC1. Το σχήμα 4g παρουσιάζει ένα μοντέλο που δείχνει πώς το DsbA-L αλληλεπιδρά με τα αμινοξέα 9-13 και 22-27 του VDAC1 (Εικόνα 4g). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το DsbA-L αλληλεπιδρά με τα αμινοξέα 9-13 και 22-27 του VDAC1.

Σχήμα 4. Αλληλεπίδραση μεταξύ DsbA-L και VDAC1 σε κύτταρα BUMPT με ή χωρίς μείωση του ATP και στους νεφρούς ποντικών και ασθενών με νεφρική I/R. (a&b n=3 ανά ομάδα) Το πλήρες ή το μιτοχονδριακό λύμα εκχυλίστηκε για αμοιβαία συν-ανοσοκαθίζηση των DsbA-L και VDAC1 σε κύτταρα BUMPT που υποβλήθηκαν σε αγωγή με εξάντληση και ανάκτηση ATP και στους νεφρούς ποντικών και ασθενών με AKI που επάγονται από I/R. (cn=3 ανά ομάδα) Οι λειτουργικοί τομείς και η δομή του DsbA-L. (dn=3 ανά ομάδα) Το μοντέλο πρόβλεψης της αλληλεπίδρασης DsbA-L και VDAC1. (e-gn=3 ανά ομάδα) Τα ανοσοϊζήματα αντι-ΗΑ αναλύθηκαν για HA και στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν για DsbA-L χρησιμοποιώντας ανοσοστύπωμα.

Herba Cistanche

5. Συνεντοπισμός του DsbA-L ή του VDAC1 στα μιτοχόνδρια και ο συνεντοπισμός του DsbA-L και του VDAC1 σε (i) κύτταρα BUMPT χωρίς ATP και (ii) στους νεφρούς ποντικών και ασθενών

Για να επιβεβαιώσουμε τα αποτελέσματα της IP μας, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία συνεντοπισμού. Η ομοεστιακή μικροσκοπία ανοσοφθορισμού έδειξε ότι το DsbA-L ή το VDAC1 εντοπίστηκε στα μιτοχόνδρια των κυττάρων BUMPT και στους νεφρούς τόσο ψευδών ποντικών όσο και ασθενών με MCD και ότι αυτό το αποτέλεσμα ενισχύθηκε περαιτέρω σε κύτταρα BUMPT που είχαν εξαντληθεί σε ATP και στους νεφρούς ποντικών και ασθενείς με ΑΚΙ (Εικόνα 5 α,β,δ,ε,ζ και η). Είναι ενδιαφέρον ότι η ομοεστιακή μικροσκοπία ανοσοφθορισμού επαλήθευσε ότι το σήμα συνεντοπισμού των DsbA-L και VDAC1 στα κύτταρα BUMPT και στους νεφρούς ψευδών ποντικών και ασθενών με MCD, ήταν σχετικά αδύναμο. Ωστόσο, το σήμα συνεντοπισμού αυξήθηκε σημαντικά στα κύτταρα BUMPT που είχαν εξαντληθεί σε ATP και στους νεφρούς ποντικών και ασθενών με AKI (Εικόνα 5 γ, στ, και i). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα παρέχουν περαιτέρω στοιχεία για την υποστήριξη της αλληλεπίδρασης του DsbA-L και του VDAC1 στα μιτοχόνδρια.

Εικόνα 5. Εντοπισμός DsbA-L και VDAC1 στα μιτοχόνδρια των κυττάρων BUMPT και των νεφρών ποντικών AKI και ασθενών. (α, d&g n=4 ανά ομάδα) Εντοπισμός DsbA-L στα μιτοχόνδρια σε κύτταρα BUMPT με ή χωρίς μείωση και ανάκτηση ATP, τα νεφρά ποντικών μοντελοποιούν στις εικονικές και I/R ομάδες καθώς και MCD και I/R ασθενείς. (β, e&h n=4 ανά ομάδα) Εντοπισμός του VDAC1 στα μιτοχόνδρια σε κύτταρα BUMPT με ή χωρίς μείωση και ανάκτηση ATP, τα νεφρά των ποντικών μοντελοποιούν στις εικονικές και I/R ομάδες καθώς και MCD και I/ R. (c, f&i n=4 ανά ομάδα) Ο συνεντοπισμός των DsbA-L και VDAC1 στα μιτοχόνδρια σε κύτταρα BUMPT με ή χωρίς εξάντληση και ανάκτηση ATP, τα νεφρά των ποντικών μοντελοποιούν στις εικονικές και I/R ομάδες καθώς και ασθενείς με MCD και I/R.

6. Το VDAC1-προκαλείται απόπτωση των κυττάρων BUMPT που προκαλείται από ισχαιμία-επαναιμάτωση

Στη συνέχεια, προσπαθήσαμε να προσδιορίσουμε εάν το VDAC1 εμπλέκεται στη διαδικασία της απόπτωσης που προκαλείται από I/R σε κύτταρα BUMPT. Τα αποτελέσματα ανοσοστύπωσης έδειξαν ότι η έκφραση VDAC1 προκλήθηκε στο I/R 2-0 και έφτασε στο μέγιστο στο I/R 2-2, προτού στη συνέχεια μειωθεί σταδιακά στα επίπεδα που παρατηρήθηκαν στο I/R 2-0 ( Εικόνα 6 α και β). Η ανάλυση FCM έδειξε ότι το I/R προκάλεσε απόπτωση σε κύτταρα BUMPT. αυτό το αποτέλεσμα μετριάστηκε με την εφαρμογή του VDAC1 siRNA (Εικόνα 6c). Τα αποτελέσματα ανοσοστύπωσης επαλήθευσαν περαιτέρω ότι το VDAC1 siRNA βελτίωσε σημαντικά την επαγόμενη από I/R αύξηση στην έκφραση της διασπασμένης κασπάσης-3, την αυξημένη συσσώρευση Bax στα μιτοχόνδρια και την αυξημένη απελευθέρωση του Cyt-c στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 6δ- κ). Αντίθετα, οι παραπάνω αλλαγές ενισχύθηκαν από την υπερέκφραση του πλασμιδίου VDAC1 (Εικόνα 6 l-s). Μαζί, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το VDAC1-διαμεσολάβησε την απόπτωση που προκαλείται από I/R σε κύτταρα BUMPT.

Σχήμα 6. Η επαγόμενη από IR έκφραση της διασπασμένης κασπάσης3, BAX και Cyt-c σε κύτταρα BUMPT προκλήθηκε από το VDAC1. Το siRNA ή το πλασμίδιο του VDAC1 επιμολύνθηκε σε κύτταρα BUMPT και στη συνέχεια εκτέθηκε σε εξάντληση ΑΤΡ για 2 ώρες και ανάκτηση για 2 ώρες. (α) Ανάλυση ανοσοστυπώματος του VDAC1 και της β-τουμπουλίνης σε κύτταρα BUMPT. (β) Ανάλυση της εικόνας σε κλίμακα του γκρι μεταξύ τους (γ) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της απόπτωσης κυττάρων BUMPT. (δ) Οι ανοσοκηλίδες ανέλυσαν την έκφραση της διασπασμένης κασπάσης3, VDAC1 και DsbA-L και την έκφραση BAX και Cyt-c σε μιτοχονδριακά και κυτοσολικά κλάσματα. Η β-τουμπουλίνη και η GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως πλήρες κυτταρόλυμα ή έλεγχος φόρτισης κυτοσολίου, αντίστοιχα. Το COX IV χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης μιτοχονδρίων. (εκ) Ανάλυση της εικόνας σε κλίμακα του γκρι μεταξύ τους. (i) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της απόπτωσης κυττάρων BUMPT. (m) Οι ανοσοκηλίδες αναλύουν την έκφραση της διασπασμένης κασπάσης3, VDAC1 και DsbAL και την έκφραση BAX και Cyt-c σε μιτοχονδριακά και κυτοσολικά κλάσματα. Η β-τουμπουλίνη και η GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως πλήρες κυτταρόλυμα ή έλεγχος φόρτισης κυτοσολίου, αντίστοιχα. Το COX IV χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης μιτοχονδρίων. (νδ) Ανάλυση της εικόνας σε κλίμακα του γκρι μεταξύ τους. Κάθε πείραμα (a,c,d,l & m) επαναλήφθηκε 6 φορές ανεξάρτητα με παρόμοια αποτελέσματα. Χρησιμοποιήθηκαν δοκιμές t Student δύο ουρών για συγκρίσεις δύο ομάδων. (β), χρησιμοποιήθηκε μονόδρομη ANOVA για τις συγκρίσεις πολλαπλών ομάδων. (e- k και n- s). # Π<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group.# P<0.05 versus scramble with the saline group. * P<0.05 versus scramble with IR group.

Εκχύλισμα Cistanche

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h και Dongshan Zhang a,b *

ένα Τμήμα Επείγουσας Ιατρικής, Λαϊκή Δημοκρατία της Κίνας

β Ινστιτούτο Επείγουσας Ιατρικής και Δύσκολων Ασθενειών, Δεύτερο Νοσοκομείο Xiangya, Central South University, Changsha, Hunan 410011, Λαϊκή Δημοκρατία της Κίνας

γ Τμήμα Οφθαλμολογίας, Λαϊκή Δημοκρατία της Κίνας

δ Τμήμα Ουροχειρουργικής, Λαϊκή Δημοκρατία της Κίνας

e Τμήμα Χειρουργικής Θώρακος, Λαϊκή Δημοκρατία της Κίνας

f Τμήμα Γενικής Χειρουργικής, Δεύτερο Νοσοκομείο Xiangya, Λαϊκή Δημοκρατία της Κίνας

g Τμήμα Δημόσιας Υγείας, Central South University, Changsha, Hunan, Λαϊκή Δημοκρατία της Κίνας

h Τμήμα Ενδοκρινολογίας, Λαϊκό Νοσοκομείο Shenzhen, The Second Clinical Medical College of Jinan University, The First Affiliated Hospital of Southern University of Science and Technology, Shenzhen, Λαϊκή Δημοκρατία της Κίνας

1 Xiaozhou Li και Jian Pan συνέβαλαν εξίσου σε αυτή τη μελέτη