ΜΕΡΟΣ Ⅱ: Ο ρόλος της ανθρώπινης πρωτοπαθούς νεφρικής ινοβλάστης σε TGF- 1-Συσκευές Μίμησης Ίνωσης με Διαμεσολάβηση

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

ΜΕΡΟΣ Ⅱ: Ο ρόλος της ανθρώπινης πρωτοπαθούς νεφρικής ινοβλάστης σε TGF- 1-Συσκευές μίμησης ίνωσης με μεσολάβηση

Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee & et al.

Αφηρημένη

Νεφρική ίνωσηείναι μια προοδευτική χρόνια νεφρική νόσος που οδηγεί τελικά σε νεφρική ανεπάρκεια τελικού σταδίου. Παρά τις διάφορες προσεγγίσεις για την καταπολέμησηνεφρική ίνωση, ένα πειραματικό μοντέλο για την αξιολόγηση των διαθέσιμων φαρμάκων δεν είναι ιδανικό. Αναπτύξαμε μοντέλα μίμησης β χρησιμοποιώντας τρισδιάστατες (3D) συσκευές συν-καλλιέργειας σχεδιασμένες με τρία ξεχωριστά στρώματα διάμεσου σωληναρίου, συγκεκριμένα, επιθηλιακά, ινοβλαστικά και ενδοθηλιακά στρώματα. Εισάγαμε ανθρώπινα εγγύς σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα νεφρού (HK-2), ενδοθηλιακά κύτταρα ανθρώπινης ομφαλικής φλέβας και νεφρικούς ινοβλάστες που προέρχονται από ασθενείς και αξιολογήσαμε τα αποτελέσματαtμετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας- (TGF-)καιTGF-θεραπεία με αναστολείς σε αυτόνεφρώνίνωσημοντέλο. Η έκφραση τουίνωσηδείκτης άλφα-λείου μυός ακτίνη επάνωTGF- 1Η θεραπεία αυξήθηκε σε κύτταρα HK-2 που καλλιεργήθηκαν σε μονοστιβάδα σε ένα τρισδιάστατο μοντέλο ασθένειας. Στο αγγειακό διαμέρισμα τουνεφρώνίνωσημοντέλα, η πυκνότητα των αγγείων αυξήθηκε και μειώθηκε στοTGF--θεραπευμένη ομάδα καιTGF--ομάδα θεραπείας με αναστολείς, αντίστοιχα. Multiplex ELISA χρησιμοποιώντας υπερκείμενα στοTGF--Τα διεγερτικά τρισδιάστατα μοντέλα έδειξαν ότι τα επίπεδα προφλεγμονώδους κυτοκίνης και αυξητικού παράγοντα, συμπεριλαμβανομένης της ιντερλευκίνης-1 βήτα, του παράγοντα νέκρωσης όγκου-άλφα, του βασικού αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών καιTGF- 1, TGF- 2, καιTGF- 3αυξήθηκαν, γεγονός που μιμείται το ινωτικό μικροπεριβάλλον των ανθρώπινων νεφρών. Αυτή η μελέτη μπορεί να επιτρέψει την κατασκευή ενός ανθρώπουνεφρώνίνωση-μίμηση μοντέλου συσκευής πέρα ​​από πειράματα παραδοσιακού πολιτισμού.

Λέξεις-κλειδιά: νεφρική ινοβλάστης; ίνωση; TGF- 1

cistanche tubolosa οφέλη για την υγεία: θεραπεία χρόνιων νεφρικών παθήσεων

ΚΑΝΤΕ ΚΛΙΚ ΕΔΩ ΓΙΑ ΜΕΡΟΣ Ⅰ

3. Συζήτηση

TGF- 1παίζει σημαντικό ρόλο στη συσσώρευση μήτρας στη νεφρική ινογένεση και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό στα περισσότερα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των σπειραματικών επιθηλιακών και ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς και των σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων 【1】. Ωστόσο, ο TGF-ß1 επάγει τον πολλαπλασιασμό σε ανθρώπινους νεφρικούς ινοβλάστες μέσω επαγωγής του βασικού αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGF-2) [8].

Στην παρούσα μελέτη καθορίσαμε αίνωση-συσκευή μίμησης που χρησιμοποιεί τρία βασικά κυτταρικά συστατικά, συμπεριλαμβανομένων των πρωτογενών ανθρώπινων νεφρικών ινοβλαστών, των νεφρικών σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων και των ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων και την αξιολόγησε ωςνεφρώνίνωσημοντέλο που βασίζεται σεTGF- 1διέγερση. Να δημιουργήσεινεφρώνίνωση-σε-ένα-τσιπ, δημιουργήσαμε ένα νέο σύστημα τρισδιάστατης καλλιέργειας σχεδιασμένο με τρία ξεχωριστά μέρη ιστού, με στόχο να ξεπεραστούν τα εμπόδια που σχετίζονται με τη μοντελοποίηση νεφρικής νόσου. Η μελέτη μας το έδειξεTGF- 1επαγόμενες κυτταρικές αποκρίσεις, συμπεριλαμβανομένης της σωληναριακής επιθηλιακής-μεσεγχυματικής μετάβασης (EMT) των επιθηλιακών κυττάρων, της μικροαγγειακής αλλοίωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων και των αλλαγών κυτοκίνης στους νεφρικούς ινοβλάστες. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που εισάγει αίνωση-συσκευή μίμησης που περιλαμβάνει πρωτογενείς ινοβλάστες που προέρχονται από ανθρώπινους νεφρούς και διεγερμένους ινοβλάστες που απομονώνονται από ασθενείς μεTGF- 1, ένας γνωστός επαγωγέας ινωτικών αποκρίσεων που χρησιμοποιείται γενικά ως πρότυπο για μίμησηίνωσησε κυτταροκαλλιέργειες [9]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότιTGF- 1-τα επεξεργασμένα επιθηλιακά κύτταρα μετατρέπονται σε φαινότυπο που μοιάζει με μεσεγχυματικό κύτταρο. ΠότεTGF- 1χορηγείται σε ινοβλάστες, διάφορες κυτοκίνες μεταβάλλονται ώστε να αντανακλούν την επαγωγή ινωτικών διεργασιών. Είναι προφανές ότι στονεφρώνίνωσημοντέλο, οι ινοβλάστες είναι η κύρια δύναμη πίσω από την ανάπτυξη του καθιερωμένου συστήματος καλλιέργειας μέσω της διέγερσης του TGF.

Ο Davis et al, ανέφερε ότι η τρισδιάστατη καλλιέργεια των ενδοθηλιακών κυττάρων είναι επαρκής για να εισβάλουν τα κύτταρα και να σχηματίσουν ένα δίκτυο αυλού και σωλήνα, ακολουθώντας έναν άθικτο οργανισμό in vivo [10,11]. Αρκετές ομάδες έχουν αναφέρει ότι τα μοντέλα τρισδιάστατης καλλιέργειας εμφανίζουν υψηλότερα επίπεδα νεφροτοξικότητας από τα μοντέλα 2D κυτταροκαλλιέργειας [12]. Επιπλέον, η έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με τη νεφροτοξικότητα και τη φλεγμονή ήταν σημαντικά υψηλότερη στο μοντέλο νεφρικής 3D κυτταροκαλλιέργειας από ό,τι σε μια τυπική 2D καλλιέργεια[13].

Σε αυτή τη μελέτη, τα μέσα καλλιέργειας του ανθρώπουνεφρώνίνωσηΤο -on-a-chip είχε σημαντικά υψηλότερο επίπεδο κυτοκινών σε σύγκριση με αυτό στο 2Dculture. Η ομάδα μας έχει δείξει ότι οι ινοβλάστες που προέρχονται από ασθενείς μπορούν να αναδημιουργήσουν εγγενείς νεφρικούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένων των ενδοθηλιακών και επιθηλιακών κυτταρικών στοιβάδων, μέσω των προτεινόμενωνίνωση-μοντέλο σε ένα τσιπ. Κατά συνέπεια, αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι τονεφρώνίνωσηΤο μοντέλο -on-a-chip προσομοιώνει με ακρίβεια το μικροφυσικό περιβάλλον του ανθρώπινου νεφρού. Επιπλέον, επειδή οι ινοβλάστες που καλλιεργούνται στο τσιπ προέρχονται από ασθενείς, άλλα κλινικά σχετικά μοντέλα ασθενών μπορούν εύκολα και ξεκάθαρα να ληφθούν με ασφαλή τρόπο. Επομένως, ο άνθρωποςνεφρώνίνωσηΤο σύστημα μοντέλου σε τσιπ μπορεί να επιτρέψει την ανάπτυξη εξατομικευμένης ιατρικής με ευαίσθητες μετρήσεις επιθηλιακών και ενδοθηλιακών λειτουργιών. Στα πειράματά μας,ίνωσηκαι η αγγειογένεση μειώθηκαν στοTGF-ομάδες που έλαβαν θεραπεία με αναστολείς. Οι αναστολείς TGF είναι φυσικοί ανταγωνιστές του TGF-, οι οποίοι έχουν αποδειχθεί χρησιμοποιώντας διάφορα μοντέλα νεφρικής νόσου. Φαίνεται ότι είναι δυνατό να διεξαχθούν πειράματα για να επιβεβαιωθεί η αποτελεσματικότητα της θεραπείας σε μοντέλα ασθενειών χρησιμοποιώντας θεραπευτικούς παράγοντες όπως αυτός ο αναστολέας TGF. Ως εκ τούτου, αυτό το τσιπ έχει παράσχει ένα μέσο για την ανάπτυξη ενός βελτιωμένου μοντέλου νεφρικής ίνωσης για τη μέτρηση της μορφολογίας και της λειτουργίας των κυττάρων και μπορεί να είναι χρήσιμο για τη διεξαγωγή αξιολογήσεων νεφροτοξικότητας για φαρμακευτικά προϊόντα.

TGF-είναι ο κυρίαρχος προϊβρωτικός παράγοντας σε διάφορες νεφρικές παθήσεις [14] και παίζει ρόλο στην αγγειογένεση [15]. Οι αγγειογενετικές επιδράσεις του TGF- είναι πολύ περίπλοκες και μπορούν να έχουν είτε προαγγειογενετική είτε αντιαγγειογενετική δράση ανάλογα με τη ρύθμιση και διάφορους ρυθμιστικούς παράγοντες [16]. Αγγειογόνοι αυξητικοί παράγοντες όπως ο VEGF και ο FGF-2επάγουν την αγγειογένεση in vivo φαίνεται να παίζουν κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της αγγειογένεσης in vivo [17-20]. Ορισμένα στοιχεία δείχνουν ότι αυτοί οι δύο παράγοντες μπορούν να δράσουν συνεργιστικά για την προώθηση μορφογενετικών συμβάντων ενδοθηλιακών κυττάρων [21,22]. Έχουμε παράσχει στοιχεία ότι η έκφραση mRNA του VEGF και η έκκριση πρωτεΐνης FGF-2 είναι σημαντικά αυξημένες από τον TGF- 1 σε τρισδιάστατα τσιπ σε σύγκριση με την καλλιέργεια 2D.

Ο περιορισμός μαςίνωσητα μοντέλα μπορεί να είναι ότι δημιουργήθηκαν σε σχετικά σύντομο χρονικό διάστημα, 24 ώρες. Ο TGF-βήτα έχει προ-ινωτικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες από νωρίςίνωσηδιαδικασία, όχι στη χρόνια διαδικασία. Συμβατικά,TGF-έχει χρησιμοποιηθεί κυρίως σε επαγόμενη από κυτοκίνηίνωσημοντέλα. Ωστόσο, δεδομένου ότι μόνο μία κυτοκίνη δεν μπορεί να αναπαρασταθεί in vivo,ίνωσηεπαγωγικά μοντέλα που χρησιμοποιούν αρκετές πρόσθετες υποψήφιες ουσίες όπωςTGF-και BMP7 έχουν προταθεί. Ωστόσο, δύο ή τρεις κυτοκίνες εξακολουθούν να μην επαρκούν για την αναπαραγωγή in vivo. ΣυνηθίζαμεTGF-ως σημείο εκκίνησης? Ωστόσο, προσπαθήσαμε να εφαρμόσουμε ένα in vivo μικροπεριβάλλον στο τσιπ προκαλώντας μια πιο διαφοροποιημένη καταιγίδα κυτοκινών. Ινοβλάστες, ένα κύριο κυτταρικό συστατικό τουίνωση, εισήχθη και δευτερογενής διέγερση πιο διαφορετικών κυτοκινών (IL-1, TNF-, b-FGF,TGF- 1, TGF-2, καιTGF-3) προκλήθηκε σε ινοβλάστες που διεγέρθηκαν μεTGF-. Έτσι, ένα περιβάλλον παρόμοιο μείνωσηστο ανθρώπινο σώμα αναπαρήχθη.

εκχύλισμα cistanche deserticola: θεραπεία νεφρικών παθήσεων

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1.Κυτταρικές καλλιέργειες

Kidney fibroblasts(KFs)were isolated from biopsies of the normal tissue portion of renal cell carcinoma patients with an estimated glomerular filtration rate (eGFR)>60 mL/λεπτό/1,73 m2 αφού οι ασθενείς είχαν δώσει τη συγκατάθεσή τους για δεύτερη βιοψία για ερευνητικούς σκοπούς. Τα KF καλλιεργήθηκαν σε ένα μέσο ανάπτυξης ινοβλαστών (FGM-2, Lonza, Ελβετία) και χρησιμοποιήθηκαν τα περάσματα 3 έως 4 για τα πειράματα. Οι νεφρικοί ινοβλάστες αποξέστηκαν από την καλλιέργεια για 1-2 εβδομάδες έως ότου τα κύτταρα σχηματίσουν μια μονοστιβάδα. Για την εξάλειψη των επιθηλιακών κυττάρων που μολύνουν την καλλιέργεια, επιλέχθηκαν ινοβλάστες χρησιμοποιώντας μαγνητικά σφαιρίδια κατά των ινοβλαστών (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, USA) μετά την πρώτη διέλευση. Τα κύτταρα αποσπάστηκαν χρησιμοποιώντας 0.05 τοις εκατό τρυψίνη-αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA) (Welgene, Gyeongsan, Κορέα), επωάστηκαν με σφαιρίδια κατά των ινοβλαστών και διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας μαγνητική στήλη και η ροή μέσω συγκεντρώθηκε. Οι καθαρισμένοι πρωτογενείς ινοβλάστες χαρακτηρίστηκαν με ανάλυση ταξινόμησης κυττάρων ενεργοποιημένων με φθορισμό (FACS) χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-ινοβλαστών συζευγμένων με ΡΕ. Ο ήπιος μαγνητικός-ενεργοποιημένος διαχωριστής διαλογής κυττάρων (MACS) χρησιμοποιήθηκε για την ήπια κοπή νεφρικού ιστού. Ένας μαγνητικός διαχωριστής Octo MACSTM με στήλες MACS LS (με έμβολα) που εφαρμόστηκε για τον καθαρισμό των επισημασμένων με μικροσφαιρίδια κυττάρων αγοράστηκε από την Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA, USA). Απαλοί σωλήνες MACS C (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, USA) χρησιμοποιήθηκαν για κοπή νεφρών για διαχωρισμό κυττάρων. Τα MACS Smart Strainers (70 μm) ελήφθησαν από την Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA, USA). Ρυθμιστικό διάλυμα στήλης χρησιμοποιήθηκε για την έκπλυση στηλών και την εκ νέου εναιώρηση σφαιριδίων κυττάρων. Το ρυθμιστικό παρασκευάστηκε ως διάλυμα που περιέχει 0,5 τοις εκατό αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) με 2 mM EDTA σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) (ρΗ7,4) και αγοράστηκε από την Miltenyi Biotec Inc. (Auburn, CA, USA). Τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα της ομφαλικής φλέβας που εκφράζουν πράσινα φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP-HUVECs, Lonza, Switzerland) καλλιεργήθηκαν σε Μέσο Ενδοθηλιακής Ανάπτυξης (EGM-2, Lonza, Ελβετία) και χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα στα περάσματα 3 έως 4. Κύτταρα ανθρώπινης εγγύς σωληναριακής κυτταρικής σειράς (ανθρώπινος νεφρός-2(HK-2) κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Η κυτταρική σειρά αναπτύχθηκε σε θρεπτικό υλικό Eagle που τροποποιήθηκε από Dulbecco (DMEM) με υψηλή περιεκτικότητα σε γλυκόζη. συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), πενικιλλίνη (100 U/mL) και στρεπτομυκίνη (100 ug/mL) Τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Gibco (Rockville, MD, ΗΠΑ). EDTA και διατηρήθηκε σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 βαθμούς και 5 τοις εκατό CO2. Τα KFs επαναιωρήθηκαν σε FGM-2 σε συγκέντρωση κυττάρων 4×10 μοιρών κυττάρων/mL. Ανθρώπινα νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα (HK{49 }}) επαναιωρήθηκαν σε συγκέντρωση 2×10 μοιρών κυττάρων/mL σε DMEM υψηλής γλυκόζης. Τα GFP-HUVEC επαναιωρήθηκαν σε συγκέντρωση 2×10 μοιρών κυττάρων/mL σε EGM-2.

4.2.Αντιδραστήρια

Η μήτρα αποτελούνταν από πηκτώματα ινώδους, συμπεριλαμβανομένου του εμπορικά διαθέσιμου ινωδογόνου από βόειο πλάσμα, απρωτινίνης από βόειο πνεύμονα και θρομβίνης από βόειο πλάσμα. Τα προαναφερθέντα τρία υλικά αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, MO, ΗΠΑ). Το ινωδογόνο διαλύθηκε σε 1×PBS σε λουτρό νερού (37 μοίρες) για 30 λεπτά σε συγκέντρωση 10 mg/mL. Η θρομβίνη και η απροτινίνη διαλύθηκαν σε απιονισμένο νερό σε συγκέντρωση 50 μονάδες/mL και 4 TIU/mL. Τα τρία διαλύματα αποστειρώθηκαν με διήθηση μέσω φίλτρου 0,22 μm. Ανασυνδυασμένος άνθρωποςTGF- 1ελήφθη από την PeproTech EC Ltd. (Λονδίνο, Η.Β.). Ένας ειδικός αναστολέας της κινάσης του υποδοχέα TGF-βήτα, SB431542, αγοράστηκε από την Tocris Cookson, Inc. (Ellisville, ΜΟ, ΗΠΑ).

4.3. Μοτίβο κελιών στη συσκευή

Πριν από τη σπορά των κυττάρων για τη διευκόλυνση της στενής συγκόλλησης, η συσκευή υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 1 λεπτό σε μηχανή πλάσματος (Femto Science Inc., Suwon, Κορέα) με ισχύ 70 W, 50 Hz. Η επιφανειακή υδροφιλία προκλήθηκε από την επεξεργασία πλάσματος και βοήθησε στη διευκόλυνση του μοτίβου γέλης και της φόρτωσης των μέσων. Για να αποφευχθούν αλλαγές στην υδροφιλικότητα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα εντός 30 λεπτών μετά την επεξεργασία με πλάσμα. Διαφορετικά κυτταρικά μοτίβα μέσα στις συσκευές μπορούν να γίνουν με εξαιρετικά προσαρμόσιμο τρόπο. Ήταν σημαντικό να καθοριστεί εκ των προτέρων η σύνθεση και η συγκέντρωση των διαφορετικών τύπων κυττάρων που έπρεπε να διαμορφωθούν. Για κυτταρικά εναιωρήματα υδρογέλης, παρασκευάστηκαν αμέσως 37,5 μL κυτταρικού εναιωρήματος και ξεχωριστό κλάσμα 12,5 μL διαλύματος ινωδογόνου 10 mg/mL (250 μL διαλύματος ινωδογόνου 10 mg/mL με 40 μL 4 TIU/mL απρωτινίνης) πριν από τη φόρτωση. Αμέσως πριν από τη φόρτωση, τα 37,5 μL κυτταρικού εναιωρήματος αναμίχθηκαν με 12,5 μL 10 mg/mL ινωδογόνου μέχρι να ομογενοποιηθούν. Τα 50 uL υδρογέλης αναμίχθηκαν με μια σταγόνα θρομβίνης 1 uL (0,5 μονάδα/mL). Αμέσως μετά την ανάμιξη, θρομβίνη με εναιώρημα ινώδους GFP-HUVECs (συγκέντρωση κυττάρων 2×10' κύτταρα/mL) εγχύθηκε στο εξωτερικό άκρο του εξωτερικού καναλιού (Εικόνα 3, Gel A). Περιμέναμε 3 λεπτά για να ολοκληρωθεί η διασταύρωση ινωδογόνου. Αμέσως μετά την ανάμειξη, τοποθετήθηκε θρομβίνη με εναιώρημα ινώδους KFs (συγκέντρωση κυττάρων 4×10 βαθμούς κύτταρα/mL) σε κάθε πλευρά του δαπέδου της δεξαμενής ανά φρεάτιο (Εικόνα 3, Gel C). Αυτό το εναιώρημα ινώδους των KFs αφέθηκε να διασταυρωθεί σε θερμοκρασία δωματίου για 3 λεπτά. Ένα κυτταρικό εναιώρημα 10 μL ανθρώπινων νεφρικών εγγύς σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων (HK-2) εγχύθηκε στη θύρα ένεσης του εσωτερικού καναλιού (Εικόνα 3, Gel B). Για να προσαρτηθεί το HK-2 στο τοίχωμα του γέλη ινώδους στο κανάλι GFP-HUVECs, η συσκευή περιστράφηκε κατά 90 μοίρες και τοποθετήθηκε σε 5 τοις εκατό CO2, σε επωαστήρα για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς. Το HK-2 κατακάθισε και σχημάτισε ένα κυτταρικό φύλλο στο πλάι της γέλης φιμπρίνης.

Μετά την προσάρτηση του HK-2, η συσκευή γεμίστηκε με ΗΓΜ-2. Η συσκευή επωάστηκε για 3 ημέρες στους 37 βαθμούς σε επωαστήρα 5 τοις εκατό CO. Το μέσο άλλαξε με ή χωρίς 5 ng/mLTGF- 1και με 5 ng/mLTGF- 1και 10 μμTGF- 1αναστολέα μετά από τρεις ημέρες επώασης (Εικόνα 3).

τι είναι το cistanche

4.4. Ανοσοκυτταροφθορισμός

Οι συγκαλλιεργημένοι ιστοί στη συσκευή σταθεροποιήθηκαν με διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 4 τοις εκατό (β/ο) (Biosesang, Seongnam, Κορέα) σε PBS (Welgene, Gyeongsan, Κορέα) για 20 λεπτά, ακολουθούμενη από διαπερατότητα με 20 ελάχιστη βύθιση σε 0,15 τοις εκατό Triton X-100(Sigma, St.Louis, MO, ΗΠΑ). Τα δείγματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 τοις εκατό BSA (Sigma, ΗΠΑ) για 1 ώρα. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντισώματα που αγοράστηκαν από την Abcam. Τα πρωτεύοντα αντισώματα ήταν αντι-κυτταροκερατίνη 8 και αντι-ο-SMA, που αφέθηκαν για 2 ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Ως δευτερεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε συζευγμένο Alexa Fluor 647 αντι-κουνελιού IgG (Η συν L) γαϊδουριού. Η επισήμανση DNA πραγματοποιήθηκε με αραίωση 1:250 του Hoechst33342 (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) για 3 ώρες σε RT. Οι εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ Zeiss LSM 710. Η μέση ένταση φθορισμού (MFI) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ImageJ και έναν αναλυτή έντασης φθορισμού.

4.5. Multiplex Analysis of Cytokines

Το κιτ MSD V-Plex Cytokine and Angiogenesis Panel 1 Human (Rockville, MD, USA) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση των συγκεντρώσεων ιντερλευκίνης-1 βήτα (IL-1ß) και βασικού αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (b-FGF). σε μεμονωμένα δείγματα, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα δείγματα αξιολογήθηκαν για ολικά επίπεδα πρωτεΐνης IL-1 και b-FGF. Η ποσότητα (σε pg/mL) προσδιορίστηκε ποσοτικά από την τυπική καμπύλη κάθε μέτρησης.

4.6. Multiplex Bead Immunoassay

Οι συγκεντρώσεις κυτοκίνης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανοσοδοκιμασίας πολλαπλών σφαιριδίων (Procarta Cytokine Assay Kit; Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA), με βάση την τεχνολογία πολλαπλής πλέξης (xMAP; Luminex, Austin, TX, USA), σύμφωνα με την οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν σταθμό εργασίας συμβατό με Luminex και το λογισμικό διαχειριστή του (λογισμικό Bio-Plex και έκδοση 6.{4}}, Bio-Rad, Τόκιο, Ιαπωνία), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ανθρώπινο TGF- 1, TGF- 2 και TGF- 3 που σχετίζονται μείνωσηδιαδικασία αναλύθηκαν ταυτόχρονα στα αραιωμένα δείγματα. Οι ισομορφές τουTGF-ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας συστήματα Bio-Plex 200 και εμπορικά διαθέσιμα Bio-Plex ProTM HumanTGF-αναλύσεις (Bio-Rad Laboratories, Inc); με βάση τις πληροφορίες που παρέχονται από τον κατασκευαστή. Το κιτ δοκιμασίας πολυπλεξίας μπορεί να μετρήσει ποσοτικά πολλαπλές κυτοκίνες από το υπερκείμενο υγρό με χαμηλότερο όριο ανίχνευσης 1 pg/mL ανά κυτοκίνη. Κάθε δείγμα εκτελέστηκε ως μία μόνο μέτρηση για περιορισμένη ποσότητα του συλλεγόμενου υπερκειμένου.

4.7.PCR σε πραγματικό χρόνο

Η εκχύλιση RNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Το Master Mix και ένα κιτ σύνθεσης cDNA First Strand Revert Aid χρησιμοποιήθηκαν για την αντίστροφη μεταγραφή του συνολικού RNA. Οι qPCR πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το Applied BiosystemsTM PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Οι συγκεκριμένοι εκκινητές παρασκευάστηκαν από την Bioneer (Daejeon, Κορέα) και χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το πείραμα ως εξής. Οι αλληλουχίες εκκινητών συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Δέκα μικρολίτρα PowerUp SYBR Green Master Mix, 4 μL cDNA και 2 pmol από κάθε εκκινητή χρησιμοποιήθηκαν για PCR σε πραγματικό χρόνο σε τελικό όγκο 20 μL. Η αντίδραση διεξήχθη στους 95 βαθμούς για 1 δευτερόλεπτα και στους 60 βαθμούς για 20 δευτερόλεπτα για 45 κύκλους μετά από μετουσίωση στους 95 βαθμούς για 20 δευτερόλεπτα. Η PCR πραγματοποιήθηκε εις διπλούν ή εις τριπλούν για κάθε δείγμα. Τα επίπεδα cDNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μια τυπική καμπύλη κατωφλίων κύκλου. Όλα τα δεδομένα για κάθε cDNA ήταν εντός της αντίστοιχης τυπικής καμπύλης. Τα δεδομένα που ελήφθησαν κανονικοποιήθηκαν σε cDNA -ακτίνης.

4.8. Στατιστική ανάλυση

Τα ποσοτικά δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ±SD ή SE τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν με χρήση t-test Student δύο ουρών. Θεωρήσαμε μια σημαντική διαφορά μόνο σε επίπεδο εμπιστοσύνης 95 τοις εκατό ή υψηλότερο (σελ<>

5. Συμπεράσματα

Συνοπτικά, τα πρωτόκολλα αυτής της μελέτης επέτρεψαν την κατασκευή του ανθρώπουνεφρώνίνωση-μιμείται συσκευές ως μοντέλο και έδειξε διάφορα εφέ που δεν είναι δυνατά σε πειράματα δισδιάστατης καλλιέργειας. Πιστεύουμε ότι η στρατηγική αξιολόγησης που προτείνεται σε αυτή τη μελέτη θα οδηγήσει σε καλύτερη κατανόηση των λεπτομερειώνίνωσημηχανισμούς που εμπλέκονται σε παθολογικές αλλαγές κατά τη διάρκειανεφρική νόσο. Η ανεπτυγμένη τρισδιάστατη νεφρική ίνωση-σε-ένα-τσιπ θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένα πιθανό μοντέλο in vitro, το οποίο θα μας φέρει πιο κοντά στη δημιουργία ενός βελτιωμένου μοντέλου νεφρού σε τσιπ.

cistanche phelypaes: θεραπεία για παθήσεις των νεφρών

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Border, W.; Noble, Ν. Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας στον ιστόίνωση.Ν. Engl. J. Med. 1994, 331, 1286-1292.

2. Wang, W.;Huang, XR;Li,AG;Liu, F;Li,J.; Truong, LD; Wang, XJ; Lan, Μηχανισμός HYSignaling του TGF-betal στην πρόληψη της νεφρικής φλεγμονής: Ρόλος του Smad. Είμαι. Soc. Nephrol.2005, 16, 1371-1383. [CrossRef]

3. Liu,Y.Νεφρώνίνωση: Νέες γνώσεις για την παθογένεια και τη θεραπεία. Kidney Int.2006,69,213-217. [CrossRef][PubMed]

4. Andes, D.; Craig, WA Φαρμακοκινητική και φαρμακοδυναμική του ζωικού μοντέλου: Μια κριτική ανασκόπηση. Int. J.Antimicrob.Agents 2002, 19,261-268. [CrossRef]

5. Kim, S.; Takayama, S.Organ-on-a-chip και το νεφρό. Kidney Res. Clin. Pract.2015, 34, 165-169.[CrossRef][PubMed]

6. Jang, KJ; Mehr, AP; Hamilton, GA; McPartlin, LA; Chung, S.; Suh, KY; Ingber, DEHuman εγγύς νεφρικό σωληνάριο σε τσιπ για μεταφορά φαρμάκων και αξιολόγηση νεφροτοξικότητας. Ακέραιος αριθμός. Biol. 2013, 5, 1119-1129. [CrossRef[PubMedl

7. Reardon, S. Το «Organs-on-chips» γίνεται mainstream. Nature 2015, 523, 266. [CrossRef]

8. Strutz, F; Zeisberg, Μ; Renziehausen, Α.; Raschke, Β.; Becker, V; Kooten, βιογραφικό; MuLler, GATGF- 1επάγει τον πολλαπλασιασμό σε ανθρώπινους νεφρικούς ινοβλάστες μέσω επαγωγής του βασικού αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGF-2). Kidney Int. 2001, 59, 579-592.[CrossRef][PubMed]

9. Zanotti, S.; Bragato, C.; Zucchella, Α.; Maggi, L.; Mantegazza, R.; Morandi, L.; Mora, M.Αντι-ινωτικό αποτέλεσμα της πιρφενιδόνης σε μυϊκούς ινοβλάστες από ασθενείς με μυϊκή δυστροφία Duchenne. Life Sci. 2016, 145, 127-136. [CrossRef]

10. Davis, GE.:Camarillo. C, W. Ένας εξαρτώμενος από άλφα 2 βήτα 1 ιντεγκρίνη πινοκυτταρικός μηχανισμός που περιλαμβάνει τον σχηματισμό και τη συνένωση ενδοκυτταρικών κενοτοπίων ρυθμίζει τον τριχοειδικό αυλό και τον σχηματισμό σωλήνων σε μια τρισδιάστατη μήτρα κολλαγόνου. Exp. Cell Res. 1996, 224, 39-51.[CrossRef]

11. Bayless, KJ; Davis, G. Οι Cdc42 και Race GTPases απαιτούνται για το σχηματισμό τριχοειδούς αυλού σε τρισδιάστατες εξωκυτταρικές μήτρες. J. Cell Sci. 2002,115,1123-1136. [CrossRef [PubMed]

12. DesRochers, ΤΜ; Suter, L.; Roth, Α.; Kaplan, DL Bioengineered 3D ανθρώπινο νεφρικό ιστό, μια πλατφόρμα για τον προσδιορισμό της νεφροτοξικότητας. PLoS ONE 2013, 8, e59219. [CrossRef]

13. Astashkina, AI; Mann, ΒΚ; Prestwich, GD; Grainger, DW Σύγκριση προγνωστικών βιοδεικτών νεφροτοξικότητας φαρμάκων σε νεφρική 3-Δ πρωτογενή οργανοειδή καλλιέργεια και απαθανατισμένες κυτταρικές σειρές. Biomaterials 2012, 33, 4712-4721. [CrossRef] [PubMed]

14. Meng, XM; Nikolic-Paterson, DJ; Lan, HY TGF-beta: Ο κύριος ρυθμιστής τουίνωση. Nat.Rev.Nephrol.2016,12, 325-338. [CrossRef]

15. Pardali, E.;Goumans, MJ;ten Dijke,P. Σηματοδότηση από μέλη της οικογένειας TGF-beta σε αγγειακή μορφογένεση και νόσο. Trends Cell Biol.2010, 20, 556-567. [CrossRef] [PubMed]

16. Cunha, SL; Pietras, K. ALK1 ως αναδυόμενος στόχος για την αντιαγγειογενετική θεραπεία του καρκίνου. Blood 2011,117,6999-7006.[CrossRef]

17.Klagsbrun, M.;D'Amore, PA Regulators of angiogenesis. Annu. Rev. Physiol.1991,53, 217-239. [CrossRef]

18. Folkman, J.· Shing, Υ. Angiogenesis. J.Biol. Chem. 1992, 267, 10931-10934. [CrossRef]

19. Shweiki, D. Itin, A.Soffer, D.Keshet, E. Ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας που προκαλείται από την υποξία μπορεί να μεσολαβεί στην αγγειογένεση που ξεκινά από την υποξία. Nature 1992, 359, 843-848. [CrossRef]

20. Kim, KJ; Li, Β.; Winer, J.; Armanini, Μ; Gillett, Ν.; Phillips, HS; Ferrera, N. Η αναστολή της επαγόμενης από τον αγγειακό ενδοθηλιακό αυξητικό παράγοντα αγγειογένεσης καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου in vivo. Nature 1993, 362, 841-844. [CrossRefl]

21. Pepper, MS; Ferrara, Ν.; Orci, L.; Montesano, R. Ισχυρός συνεργισμός μεταξύ αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα και βασικού αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών στην επαγωγή αγγειογένεσης in vitro.Biochem. Biophys. Res. Commun.1992,189,824-831.[CrossRefl

22. Goto, F.; Goto, Κ.; Weindel, Κ.; Folkman, J. Συνεργικές επιδράσεις του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα και του βασικού αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών στον πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό του λώρου ενδοθηλιακών κυττάρων των τριχοειδών βοοειδών εντός πηκτωμάτων κολλαγόνου. Εργαστήριο. Investig.1993,69, 508-551.[PubMed]

ΚΑΝΤΕ ΚΛΙΚ ΕΔΩ ΓΙΑ ΜΕΡΟΣ Ⅰ