Πώς η εχινακοσίδη προλαμβάνει τη νόσο του Πάρκινσον

Επικοινωνία: emily.li@wecistanche.com

Μέρος Ⅰ: Μηχανισμός ρύθμισης της αυτοφαγίας σε ποντίκια PD που προκαλούνται από MPTP μέσω της οδού σηματοδότησης MTOR από την Echinacoside

Αφηρημένη:

Σκοπός: Η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει την επίδραση τουεχινακοσίδη(ECH) σε δείκτες που σχετίζονται με την αυτοφαγία μέσω της οδού σηματοδότησης mTOR, ειδικά την επίδραση στην κάθαρση του υποστρώματος αυτοφαγίας P62 και της συνουκλεΐνης, των βασικών παθολογικών προϊόντων τουΝόσος Πάρκινσον(PD), για την παροχή νέων στρατηγικών για τη θεραπεία της PD (Νόσος Πάρκινσον). Μέθοδοι: Ένα μοντέλο ποντικού υποξείας PD(Νόσος Πάρκινσον)καθιερώθηκε με την ενδοπεριτοναϊκή ένεση 1-μεθυλ-4-φαινυλ-1,2,3,6-τετραϋδροπυριδίνης (MPTP). Αρχικά, αξιολογήθηκαν τα νευροσυμπεριφορικά συμπτώματα σε ποντίκια κάθε ομάδας και οι νευροδιαβιβαστές μονοαμίνης στο ραβδωτό σώμα σε κάθε ομάδα μετρήθηκαν με υγρή φάση υψηλής απόδοσης. Η διπλή χρώση ανοσοφθορισμού υιοθετήθηκε για να παρατηρηθεί η έκφραση της υδροξυλάσης τυροσίνης (ΤΗ), - συνουκλεΐνης και LC3. Το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης χρησιμοποιήθηκε για την παρατήρηση των αλλαγών της υπερδομής στη μέλαινα ουσία και τον σχηματισμό αυτοφαγοσωμάτων. Στη συνέχεια, οι εκφράσεις της ΤΗ, -συνουκλεΐνης, Beclin 1, LC3, P62, mTOR και της ανοδικής πρωτεΐνης AKT ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western. Αποτελέσματα: Σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλου, η νευροσυμπεριφορική λειτουργία βελτιώθηκε σημαντικά στοECH (Εχινακοσίδη)ομάδα (P < {{0}}.01),="" μαζί="" με="" αυξημένη="" έκφραση="" th,="" da="" και="" dopac="" στον="" εγκέφαλο="" (p=""><0,01).>ECH (Εχινακοσίδη)ομάδα, ενώ οι εκφράσεις των Beclin 1 και LC3-II αυξήθηκαν (P < 0.01), τα επίπεδα έκφρασης της P62 και της -συνουκλεΐνης μειώθηκαν σημαντικά (P <0,01).ECH (Εχινακοσίδη)θα μπορούσε να ρυθμίσει προς τα πάνω το επίπεδο έκφρασης του σήματος επιβίωσης p-AKT/AKT και να μειώσει την έκφραση του mTOR. Συμπέρασμα:ECH (Εχινακοσίδη)θα μπορούσε να αυξήσει την αυτοφαγία αναστέλλοντας την έκφραση του mTOR, προάγοντας έτσι την κάθαρση της -συνουκλεΐνης και την αποικοδόμηση του υποστρώματος της αυτοφαγίας P62 και ασκώντας το νευροπροστατευτικό αποτέλεσμα.

Λέξεις κλειδιά: Νόσος Πάρκινσον, MPTP,εχινακοσίδη, -συνουκλεΐνη, P62, αυτοφαγία, mTOR

Το Cistanche μπορεί να θεραπεύσει τη νόσο του Πάρκινσον

Εισαγωγή

Νόσος Πάρκινσον (PD)είναι μια χρόνια και προοδευτική νευροεκφυλιστική νόσος. Τυπικό παθολογικό χαρακτηριστικό της Π.Δ(Νόσος Πάρκινσον)είναι ο σχηματισμός σωμάτων Lewy, και -συνουκλεΐνη και ουβικιτίνη είναι τα κύρια συστατικά των σωμάτων Lewy. Όλο και περισσότερα στοιχεία δείχνουν ότι η διαταραχή της ρύθμισης της αυτοφαγίας οδηγεί τελικά στη συσσώρευση μη αναδιπλωμένων πρωτεϊνών και τραυματισμένων οργανιδίων.54 Η οδός αυτοφαγίας-λυσοσώματος μπορεί όχι μόνο να αποικοδομήσει πρωτεΐνες που δεν μπορούν να αποικοδομηθούν από την οδό ουβικιτίνης-πρωτεασώματος αλλά και την οδό μπορεί να αποικοδομήσει -συνουκλεΐνη. Ως εκ τούτου, η ρύθμιση της αυτοφαγίας μπορεί να προσφέρει μια νέα στρατηγική για τη θεραπεία της PD (Νόσος Πάρκινσον). Η αυτοφαγία είναι η κύρια οδός για την αποικοδόμηση των ενδοκυτταρικών συσσωματωμάτων και η κινάση mTOR είναι μια βασική ρυθμιστική θέση για την αυτοφαγία. Ως εκ τούτου, είναι θεωρητικής και πρακτικής σημασίας να αποσαφηνιστεί η σχέση μεταξύ της ΠΔ(νόσος του Πάρκινσον) και αυτοφαγία που ρυθμίζεται από το μονοπάτι σηματοδότησης mTOR. Εφόσον η αποικοδόμηση της -συνουκλεΐνης εξαρτάται κυρίως από το σύστημα αυτοφαγίας-λυσοσωμικού με στόχο την εξάλειψη των μη φυσιολογικών πρωτεϊνών, η ανάπτυξη νευροπροστατευτικών φαρμάκων ικανών να ρυθμίζουν την αυτοφαγία μπορεί να παρέχει οδηγίες για τη θεραπεία νευροεκφυλιστικών ασθενειών. ECH (Εχινακοσίδη) έχει μοριακό τύπο C35 H46 O20. Είναι το κύριο συστατικό των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών της κινεζικής ιατρικής Cistanche. Απομονώθηκε για πρώτη φορά από τους Stoll et al από τη ρίζα τουEchinaceaAngustifolia DC.ECH (Εχινακοσίδη)έχει ένα ευρύ φάσμα φαρμακολογικών επιδράσεων. Έχει αντιφλεγμονώδη, αντιοξειδωτική, προστασία των νεύρων, βελτίωση της μάθησης και της μνήμης, ηπατική προστασία, ανοσολογική ρύθμιση και αντικαρκινική δράση. Η παρούσα μελέτη, ξεκινώντας από τους βασικούς παθολογικούς μηχανισμούς της Π.Δ(Νόσος Πάρκινσον), με στόχο τη διερεύνηση της ρύθμισης των νευροπροστατευτικών επιδράσεων τουECH (Εχινακοσίδη)σε PD ποντικιού(Νόσος Πάρκινσον)μοντέλο που επάγεται από MPTP από την αυτοφαγία-λυσοσωμική οδό.

Υλικά και Συσκευές

Πειραματικό Ζώο

Η πειραματική ομάδα αποτελούνταν από 108 αρσενικά ποντίκια C57BL/6J με βαθμό SPF, ηλικίας οκτώ εβδομάδων, βάρους 20-22 g, τέσσερα ποντίκια ανά κλουβί, που διατηρήθηκαν στους 22-25 βαθμούς. Τα ποντίκια παρασχέθηκαν από το Κέντρο Εργαστηριακών Ζώων της Σαγκάης, της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών, που στεγάστηκε στο Πανεπιστήμιο Κινεζικής Ιατρικής του Ναντζίνγκ και τα ζώα έλαβαν ανθρώπινη φροντίδα σύμφωνα με τις οδηγίες του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας, στο δωμάτιο βαθμού SPF με θερμοκρασία 22– 25 βαθμοί , σχετική υγρασία 55 τοις εκατό και κάτω από τον κιρκάδιο ρυθμό 12-ώρας. Τα ποντίκια ήταν ελεύθερα να έχουν φαγητό και νερό.

Κύρια Αντιδραστήρια

MPTP (Sigma Company), ποντίκια anti-TH μονοκλωνικό αντίσωμα (Sigma Company), Alexa Fluor 555 anti-rabbit anti-body (Biyuntian Institute of Biotechnology), Alexa Fluor 488 αντίσωμα κατά κουνελιού (Biyuntian Institute of Biotechnology), HRP -Δευτερογενές αντίσωμα κατσίκας κατά κουνελιού (Biyuntian Institute of Biotechnology), αντίσωμα πολυκλωνικού - συνουκλεΐνης κουνελιού (Cell Signaling Technology Company), δευτερογενές αντίσωμα HRP-κατσίκας κατά ποντικών (Biyuntian Institute of Biotechnology),ECH(Εχινακοσίδη) (Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), αντίσωμα κουνελιού anti-p-AKT (Ser473) (Cell Signaling Technology Company), Ραπαμυκίνη (Cell Signaling Technology Company), Χλωροκίνη (Sigma Company), Wortmannin (Sigma Company), πολυκλωνικό κουνέλι Αντίσωμα LC3 (Abcam Company), πολυκλωνικό αντίσωμα P62 κουνελιού (Enzo Life Science Company), αντίσωμα μονοκλωνικής ακτίνης ποντικών (Santa Cruz Company), πολυκλωνικό αντίσωμα Beclin 1 (Abcam Company).

Πληροφορίες για τα υλικά:

MPTP (America, Sigma Company), μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-TH ποντικών (America, Sigma Company), αντίσωμα πολυκλωνικής συνουκλεΐνης κουνελιού (America, Cell Signaling Technology Company), δευτερογενές αντίσωμα HRP-κατσίκας κατά ποντικών (Κίνα, Biyuntian Institute of Biotechnology ),ECH(Εχινακοσίδη) (Κίνα, Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), αντίσωμα κουνελιού anti-p-AKT (Ser473) (America, Cell Signaling Technology Company), ραπαμυκίνη (Αμερική, Cell Signaling Technology Company), χλωροκίνη (America, Sigma Company), Wortmannin (America, Sigma Company), πολυκλωνικό αντίσωμα LC3 κουνελιού (America, Abcam Company), πολυκλωνικό αντίσωμα P62 κουνελιού (America, Enzo Life Science Company), μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικών - ακτίνη (America, Santa Cruz Company), Beclin 1 πολυκλωνικό αντίσωμα ( Αμερική, Abcam Company).

Θεραπεία εχινακοσίδηςΝόσος Πάρκινσον

Πειραματικές Μέθοδοι

Ομαδοποίηση Πειραματικών Ζώων

Τα 108 ποντίκια C57BL/6J χωρίστηκαν τυχαία σε έξι ομάδες, με 18 ποντίκια σε κάθε ομάδα. Οι λεπτομέρειες ήταν οι εξής: Η ομάδα φυσιολογικού ελέγχου (η ομάδα φυσιολογικού ορού, ομάδα Ν), η ομάδα μοντέλου (ομάδα MPTP, ομάδα Μ), ηECH(Εχινακοσίδη) ομάδα (MPTP συνECH (Εχινακοσίδη), ομάδα EH), η επαγόμενη ομάδα αυτοφαγίας (MPTP συν ομάδα ραπαμυκίνης, ομάδα RA), η ομάδα αναστολέα αυτοφαγίας Α (MPTP συνECH (Εχινακοσίδη)συν την ομάδα χλωροκίνης, την ομάδα CQ), την ομάδα Β αναστολέα της αυτοφαγίας (MPTP συνECH (Εχινακοσίδη)συν ομάδα Wortmannin, ομάδα WO). Η δόση του MPTP ήταν 30 mg/kg/ημέρα, με συνεχή ένεση για 7 ημέρες.ECH (Εχινακοσίδη) χορηγήθηκε σε δόση 30 mg/kg/ημέρα, ενδογαστρικά.9

Μοντελοποίηση των πειραματόζωων και φαρμακευτική αγωγή

Η ομάδα Ν και η ομάδα ΕΗ έλαβαν φυσιολογικό ορό καιECH(Εχινακοσίδη) τρεις ημέρες πριν από το μόντελινγκ, αντίστοιχα, έως επτά ημέρες μετά το μόντελινγκ. Η ραπαμυκίνη, 10 βορτμαννίνη, 11 και χλωροκίνη χορηγήθηκαν για επτά διαδοχικές ημέρες μετά την τελευταία ένεση MPTP. Η δόση της ένεσης ραπαμυκίνης στη φλέβα της ουράς υπολογίστηκε ως 2 mg/kg/ημέρα. Η δόση της ενδοπεριτοναϊκής ένεσης χλωροκίνης σε ποντικούς ήταν 50 mg/kg/ημέρα. Η δόση της ένεσης wortmannin στη φλέβα της ουράς σε ποντίκια ήταν 0,7 mg/kg/ημέρα (Συμπληρωματικό Σχήμα 1).

Οι Νευροσυμπεριφορικές Παρατηρήσεις

Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία,12 με ελάχιστη τροποποίηση, η αυτοδημιούργητη συσκευή για τη δοκιμή πόλου ήταν η εξής: Η συσκευή ήταν ένας φωτοβολταϊκός σωλήνας μήκους 55 cm, διαμέτρου 1 cm με διάμετρο 2 cm σφαιρική προβολή στο πάνω μέρος του συσκευή ως σημείο προσάρτησης για ποντίκια. Η συσκευή καλύφθηκε με μαύρη ταινία για να μην πέσουν τα ποντίκια. Κάθε ποντίκι τοποθετήθηκε στο σφαιρικό προεξέχον σημείο με το κεφάλι του προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της δοκιμής. Καταγράφηκε ο χρόνος από την κορυφή της τοποθετημένης ράβδου μέχρι το κεφάλι προς τα κάτω (T-turn) και ο συνολικός χρόνος από την κορυφή της τοποθετημένης ράβδου για να ανέβει στο κάτω μέρος του σωλήνα για να προσγειωθεί (T-total).

Η Αυθόρμητη Δραστηριότητα

Η αυθόρμητη δραστηριότητα, γνωστή και ως δραστηριότητα ανοιχτού πεδίου, είναι ένας κοινός δείκτης για την ανίχνευση της σπάνιας δραστηριότητας μετά από τραυματισμό MPTP.13 Στην παρούσα μελέτη, υιοθετήθηκε ένα σύστημα ανάλυσης βίντεο πειράματος ανοιχτού πεδίου. Οι συγκεκριμένες ενέργειες ήταν οι εξής: Πριν από το πείραμα, τέσσερα ποντίκια της ίδιας ομάδας τοποθετήθηκαν σε ένα κουτί παρατήρησης (με μήκος 25 cm, πλάτος 25 cm και ύψος

25 cm) για προσαρμογή για 30 λεπτά. Στη συνέχεια καταγράφηκαν βίντεο συνεχώς για 30 λεπτά. Στο παράθυρο χρόνου παρατήρησης 30-λεπτών, ο αριθμός των κάθετων κινήσεων (Αριθμός ανατροφής) μετρήθηκε χωριστά σε τρία ασυνεχή διαστήματα των πέντε λεπτών. Το σύστημα ανάλυσης βίντεο ανέλυσε αυτόματα την τροχιά των δραστηριοτήτων του ποντικιού και έλαβε μια 30-λεπτή συνολική απόσταση (Συνολική απόσταση) ως δείκτη της οριζόντιας κίνησης.

Ανάλυση βάδισης

Ανάλυση βάδισης: Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία,14 χρησιμοποιήθηκε μια αυτοκατασκευασμένη συσκευή ανάλυσης βάδισης. Αυτή η συσκευή είχε ως εξής: Ένας ξύλινος διάδρομος (με μήκος 42 cm, πλάτος του

4,5 cm και ύψος 12 cm), το ένα άκρο ήταν ανοιχτό, το άλλο άκρο οδηγούσε στο κλουβί του σκίουρου. Το κλουβί του σκίουρου ήταν καλυμμένο με ένα μαύρο πανί. Μπλε μελάνι βυθίστηκε στο κάτω μέρος των ποδιών του ποντικιού. Στη συνέχεια το ποντίκι τοποθετήθηκε στο ανοιχτό άκρο του διαδρόμου. Το ποντίκι μετακινήθηκε φυσικά στο τέλος του κλουβιού του σκίουρου που ήταν καλυμμένο με μαύρο ύφασμα. Μετρήθηκαν οι τρεις μεγαλύτεροι διασκελισμοί του μπροστινού και του πίσω άκρου αντίστοιχα και ελήφθησαν οι μέσες τιμές.

Το τεστ Rotarod

Το ποντίκι τοποθετήθηκε σε ένα ροταρόντ μεταβλητής ταχύτητας, με την ταχύτητα του ροταρόντ να ρυθμίζεται ώστε να αυξάνεται από τέσσερις γύρους/λεπτό σε 40 γύρους/λεπτό μέσα σε πέντε λεπτά. Ο χρόνος από την αρχή της περιστροφής του ροταρόντ μέχρι την πτώση του ποντικιού από το ροταρόντ κάθε φορά καταγράφηκε ως καθυστέρηση πτώσης. Προσδιορισμός της περιεκτικότητας των νευροδιαβιβαστών μονοαμίνης στο ραβδωτό σώμα με Ηλεκτροχημεία Ανίχνευσης Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (HPLC-ECD)

Δειγματοληψία και Θεραπεία

Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία και το ραβδωτό σώμα διαχωρίστηκε γρήγορα σε πάγο και ζυγίστηκε. Σύμφωνα με την αναλογία 1 mL υπερχλωρικού οξέος 5 τοις εκατό προς 0.1 g εγκεφάλου (υγρό βάρος), τα δείγματα κάθε ομάδας τοποθετήθηκαν στο ποτήρι που περιείχε τον αντίστοιχο όγκο υπερχλωρικού οξέος και ομογενοποιήθηκαν σε ένα σωλήνα πολτού . Το ομογενοποίημα φυγοκεντρήθηκε σε χαμηλή θερμοκρασία με 13,000 r/min για 20 λεπτά. Το υπερκείμενο λήφθηκε και η φυγοκέντρηση επαναλήφθηκε. Το υπερκείμενο τοποθετήθηκε σε ψυγείο χαμηλής θερμοκρασίας για περαιτέρω ανίχνευση. Οι Συνθήκες για το HPLC-ECD ήταν ως εξής. Εγκρίθηκε η ηλεκτροχημική χρωματογραφία Couloehemlll 5300. Τα μέσα ανίχνευσης ήταν κύτταρα 5020 και 504 lb, με τη χρωματογραφική στήλη MD-150 (3,0*150 mm, 3 um), την κινητή φάση του MDTM-2 και την ευαισθησία 2uA. Ο ρυθμός ροής ορίστηκε σε 0,6 mL/min, το δυναμικό του ηλεκτροδίου ρυθμίστηκε στα 220 mV και η θερμοκρασία της στήλης ορίστηκε στους 30 βαθμούς. Ο όγκος της ένεσης ήταν 20 ul (αρχικά αραιώθηκε δέκα φορές).

Τα περιεχόμενα των ακόλουθων νευροδιαβιβαστών ανιχνεύθηκαν ντοπαμίνη (DA), διυδροξυφαινυλοξικό οξύ (DOPAC), υψηλό βανιλικό οξύ (HVA), νορεπινεφρίνη (NE), {{0}}Υδροξυτρυπταμίνη (5-HT), 5-Υδροξυινδολεϊκό οξύ (5-HIAA). Η ανοσοφθορισμός χρώση ΤΗ, -Συνουκλεΐνη, LC3 και p62 Τα ποντίκια (n=6 ανά ομάδα) υπέστησαν ευθανασία υπό βαθιά αναισθησία (5 τοις εκατό ένυδρη χλωράλη) και εγχύθηκαν με 0.9 τοις εκατό χλωριούχο νάτριο, ακολουθούμενη από 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη μέσω της αριστερής καρδιακής κοιλίας. Οι εγκέφαλοι αφαιρέθηκαν γρήγορα και τοποθετήθηκαν εκ των υστέρων για 24 ώρες, στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) που περιείχε 30 τοις εκατό σακχαρόζη στους 4 βαθμούς C μέχρι να βυθιστούν. Ο ιστός ενσωματώθηκε σε παραφίνη και οι στεφανιαίες τομές (30 μm) κόπηκαν μέσω της μέλαινας ουσίας συμπαγούς ουσίας (SNc, -2,8 έως -3,8 mm ουραίο προς το βρεγμα) χρησιμοποιώντας μικροτόμο έλκηθρου. Οι τομές αποκηρώθηκαν και ενυδατώθηκαν και η ενδογενής υπεροξειδάση σβήστηκε με 0,3 τοις εκατό Η2Ο2 για 30 λεπτά. Μετά από ανάκτηση αντιγόνου που προκλήθηκε από τη θερμότητα, οι αντικειμενοφόρες πλάκες επωάστηκαν με 0,5 τοις εκατό Triton-X100 και στη συνέχεια 5 τοις εκατό αλβουμίνη ορού βοοειδών για 30 λεπτά το καθένα. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα αντι- -συνουκλεΐνης, αντίσωμα αντι-ΤΗ, αντίσωμα αντι-LC3, αντίσωμα αντι-ρ62 και τα αντίστοιχα φθορίζοντα δευτερεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς C. Μετά από τρεις πλύσεις πέντε λεπτών σε PBS , οι τομές επωάστηκαν σε βιοτινυλιωμένο δευτερεύον αντίσωμα για μία ώρα, ακολουθούμενο από σύμπλοκο αβιδίνης-βιοτίνης για 30 λεπτά. Η δραστικότητα υπεροξειδάσης απεικονίστηκε με 3.3-διαμινοβενζιδίνη.

Η Ανίχνευσητης πρωτεΐνης από Western Blot

Η πρωτεΐνη SNc εκχυλίστηκε (n {{0}} ποντίκια ανά ομάδα), διαχωρίστηκε χρησιμοποιώντας 12-15 τοις εκατό SDS-PAGE και μεταφέρθηκε σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με 5 τοις εκατό άπαχο γάλα για 1,5 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν με αντισώματα έναντι TH, συνουκλεΐνης, p62, Beclin 1, LC3, p-AKT, AKT, p-mTOR, mTOR και GAPDH στους 4 βαθμούς C όλη τη νύχτα . Την επόμενη μέρα, οι μεμβράνες ξεπλύθηκαν με αλατούχο διάλυμα τρις-ρυθμιστικού που περιείχε 0,1 τοις εκατό Tween 20 και υβριδοποιήθηκαν με αντίστοιχα δευτερεύοντα αντισώματα για 1,5 ώρα. Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια και οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες αναλύθηκαν με λογισμικό ανάλυσης εικόνας (Gel Doc 1000-UV; Bio-Rad, Richmond, CA) για τον υπολογισμό της οπτικής πυκνότητας των ζωνών -συνουκλεΐνης και ΤΗ που κανονικοποιήθηκαν σε GADPH.

Πληροφορίες αντισωμάτων: πολυκλωνικό LC3 αντισώματος κουνελιού: 1:1000. Πολύκλωνο αντίσωμα P62 κουνελιού: 1:1000. Πολυκλωνικό αντίσωμα Beclin 1: 1:1000. Μονόκλωνο αντίσωμα ποντικών κατά της TH: 1:1000. Αντίσωμα πολυκλωνικής συνουκλεΐνης κουνελιού: 1:1000.

Παρατήρηση της Υπερδομής της Substantia Nigra με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης

Τα ποντίκια (n=6 ανά ομάδα) υποβλήθηκαν σε ευθανασία με 5 τοις εκατό ένυδρη χλωράλη και εγχύθηκαν μέσω της αριστερής κοιλίας με παγωμένο PBS, ακολουθούμενο από 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη και 1 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη σε PBS. Οι εγκέφαλοι αφαιρέθηκαν και τοποθετήθηκαν εκ των υστέρων σε 2,5 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη στους 4 βαθμούς C για έξι ώρες. Το SNc κόπηκε σε τεμάχια περίπου 1 mm3 και στερεώθηκε σε PBS που περιείχε 2,5 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη και διατηρήθηκε στους 4 βαθμούς C για περαιτέρω επεξεργασία. Τα θραύσματα στερεώθηκαν εκ των υστέρων σε 1 τοις εκατό τετροξείδιο του οσμίου στο ίδιο ρυθμιστικό, αφυδατώθηκαν μέσω διαβαθμισμένων αλκοολών και ενσωματώθηκαν σε Epon 812 (Shell Chemical Co., Houston, ΤΧ). Υπερλεπτές τομές (50 nm) κόπηκαν χρησιμοποιώντας υπερμικρότομο, χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο και αναλύθηκαν κάτω από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (Leica TCS SP2CLSM, School of Medicine Electron Microscopy Center, Πανεπιστήμιο Fudan).

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα μετρήσεων στην παρούσα μελέτη εκφράστηκαν με τη μορφή μέσου όρου ± τυπικών σφαλμάτων και η στατιστική ανάλυση υποβλήθηκε σε επεξεργασία από το λογισμικό GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA). Π<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" one-way="" analysis="" of="" variance="" (one-way="" anova)="" was="" used="" to="" test="" the="" statistical="" differences,="" and="" the="" comparison="" between="" multiple="" groups="" was="" analyzed="" by="" tukey's="" multiple="" group="">

ΚΑΝΤΕ ΚΛΙΚ ΕΔΩ ΓΙΑ ΤΟ ΜΕΡΟΣ Ⅱ