Μέρος 4 Μελέτες έχουν δείξει ότι η αυτοφαγία παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής εναπόθεσης LD

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

2.14. Δοκιμασία γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH).

Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκα 96-πηγαδιού με 5000 κύτταρα/φρεάτιο και συλλέχθηκε ένα μέσο καλλιέργειας για τη μέτρηση των επιπέδων LDH με ένα κιτ ανάλυσης (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Στη συνέχεια η απορρόφηση των δειγμάτων ανιχνεύθηκε από το Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) στα 450 nm.

2.15. BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11 και MitoTracker βαθύ κόκκινο χρώση

Τα ζωντανά κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 2 ug/ml BOD-IPY 493/503 (InvitrogenTM, Cat D3922) ή BODIPY 581/591 C11 (BD-C11）（2.{15} μΜ, InvitrogenTM, Cat D3861) σε PBS για 15 λεπτά στους 37 βαθμούς. Για τη χρώση MitoTracker Deep Red, τα ζωντανά κύτταρα επωάστηκαν με 0,5 ug/ml MitoTracker Deep Red (InvitrogenTM, Cat M22426) σε PBS για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 3,5 τοις εκατό PFA για 10 λεπτά ακολουθούμενη από πλύση και αντιχρώση με Hoechst 3342 (Sigma, Cat B2261) για 10 λεπτά πριν καλυφθούν σε γυάλινες πλάκες για απεικόνιση.πόση στάμπα να πάρειςΠαρατηρήθηκαν εικόνες και ελήφθησαν φωτογραφίες με μικροσκόπιο φθορισμού (Όλυμπος, Τόκιο, Ιαπωνία).

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

2.16.Χρώση Hoechst και PI

Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33,342 (1 ul) αραιωμένο σε 500 ul PBS, Sigma, Cat B2261) και (ή) PI (0,1 ul) αραιωμένο σε 500 ul PBS, Solarbio, (κλιμακίου ύπνου και CA) στη συνέχεια σταθεροποιήθηκε και παρατηρήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού (Όλυμπος, Τόκιο, Ιαπωνία).

2.17.Κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα χωνεύτηκαν και ξεπλύθηκαν με D-hank's και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Annexin V-FITC (5 ul αραιωμένα σε 500 ul PBS)/PI (0,1 ul αραιωμένα σε 500 ul PBS) κιτ απόπτωσης (CA1020, Solarbio, Πεκίνο, ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, τα αποπτωτικά κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (guava easyCyterM 8, Millipore, USA). Οι μετρήσεις μιτοχονδριακού ROS και δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης πραγματοποιήθηκαν όπως δημοσιεύτηκε 【12】. Τα κύτταρα SH-SY5Y χρωματίστηκαν με MitoSOX (2,5 μM, Invitrogen, USA) ή με JC1 (10 μg/ml, Τ-3168, Invitrogen, ΗΠΑ) στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά. Μετά από πλύση με PBS δύο φορές, τα κύτταρα στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε ψυχρό PBS που περιείχε 1 τοις εκατό FBS για κυτταρομετρική ανάλυση ροής. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το λογισμικό FCS Express (Guava Easy CyterM8, Millipore, Hayward, CA, USA).

2.18. Δοκιμασίες αναπνοής ιππόκαμπος

Η μιτοχονδριακή αναπνευστική λειτουργία σε ζωντανά κύτταρα SH-SY5Y μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον αναλυτή εξωκυτταρικής ροής Seahorse (XFe96) (Agi-lent, Santa Clara, ΗΠΑ) μέσω αλλαγών στον ρυθμό κατανάλωσης οξυγόνου (OCR). Κύτταρα SH-SY5Y που σπάρθηκαν σε 3 × 103 κύτταρα/φρεάτιο αφέθηκαν να προσκολληθούν στις πλάκες κυτταροκαλλιέργειας Seahorse και έφθασαν περίπου στο 80 τοις εκατό συρροή τη στιγμή του πειράματος. (τσάι cistanche) Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με Ka και στη συνέχεια εκτεθειμένο σε MPP* για άλλες 24 ώρες. Το OCR ανιχνεύθηκε υπό βασικές συνθήκες ακολουθούμενη από διαδοχική προσθήκη 1 μΜ ολιγομυκίνης, 1 μΜ FCCP, καθώς και 1 μΜ ροτενόνης και αντιμυκίνης Α.

Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει την ανοσία

2.19. Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± SEM. Η σημασία της διαφοράς προσδιορίστηκε με το Student's t-test, αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης ή μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από το post hoc test Tukey. Η διαφορά θεωρήθηκε σημαντική στο P<>

3. Αποτελέσματα

Αποτέλεσμα 1. Το Ka αποκαθιστά την κινητική δυσλειτουργία και αυξάνει τα επίπεδα ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα ποντικών μοντέλου MPTP/p PD

Για να διερευνηθεί το νευροπροστατευτικό αποτέλεσμα της παθογένεσης του Kaon PD, 4-αρσενικά ποντίκια C57BL/6 μηνών εγχύθηκαν με τη νευροτοξίνη MPTP για να καθιερωθεί το μοντέλο MPTP/p PD και έλαβαν θεραπεία με Ka (Εικ. la). Μετά την επαγωγή του μοντέλου, η δοκιμή rotarod και η δοκιμή πόλων χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της απόδοσης κινητήρα και συμπεριφοράς των ποντικών στις διαφορετικές ομάδες. Όπως φαίνεται, ο χρόνος απόδοσης του rotarod μειώθηκε σημαντικά σε ποντίκια που έλαβαν MPTP και αυτό το αποτέλεσμα αποφεύχθηκε από το Ka (Εικ. 1b). (Οφέλη cistanche tubulosa) Το Ka αποκατέστησε επίσης τα ελλείμματα συμπεριφοράς που προκλήθηκαν από το MPTP, όπως υποδεικνύεται από τις μειώσεις του χρόνου περιστροφής και του συνολικού χρόνου στη δοκιμή πόλου (Εικ. 1c και d), χωρίς να επηρεάσει το σωματικό βάρος των ποντικών (Εικ. le). Επιπλέον, η ανάλυση HPLC έδειξε ότι το επίπεδο της ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα μειώθηκε σημαντικά σε ποντίκια με πρόκληση MPTP/p και αυτό το επίπεδο αποκαταστάθηκε με θεραπεία με Ka (Εικ. 1στ). (εκχύλισμα cistanche tubulosa). μείωση των επιπέδων διυδροξυ-φαινυλοοξικού οξέος (DOPAC, μεταβολίτης της ντοπαμίνης) στο ραβδωτό σώμα που προκαλείται από το p (Εικ. 1g).σούπερμαν βότανα cistancheΑυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το Ka αποκαθιστά την κινητική δυσλειτουργία και αυξάνει τα επίπεδα ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα σε ποντίκια PD που προκαλούνται από MPTP.

Αποτέλεσμα 2. Το Ka ανακουφίζει την απώλεια νευρώνων DA στο SNpc ποντικών μοντέλου MPTP/p PD

Στη συνέχεια, για να αξιολογήσουμε περαιτέρω το νευροπροστατευτικό αποτέλεσμα της νευρωνικής βλάβης DA που προκαλείται από MPTP/p από Kaon, εξετάσαμε τους νευρώνες υδροξυλάσης τυροσίνης (TH) στο SNpc ποντικού με ανοσοχρώση. Όπως φαίνεται στα Σχ. 2α και β, το MPTP/p προκάλεσε σημαντική μείωση στον αριθμό των νευρώνων ΤΗ, η οποία ανακουφίστηκε από τη θεραπεία με Ka. Επιπλέον, οι στερεολογικές μετρήσεις των συνολικών νευρώνων στο SNpc, όπως ορίζονται από τον Nissl

Εικ.1. Η θεραπεία Ka ανακουφίζει την κινητική δυσλειτουργία και αυξάνει τα επίπεδα ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα ποντικών μοντέλου MPTP/p PD.

(α) Σχηματικό διάγραμμα του πειραματικού σχεδιασμού. (cistanche tubulosa reddit) (β) Ο χρόνος στη ράβδο μετρήθηκε για τη δοκιμή rotarod σε τρεις διαδοχικές ημέρες. (γδ) Ο χρόνος που απαιτείται για να γυρίσει (χρόνος στροφής) και να κατέβει ένας στύλος (χρόνος αναρρίχησης) καταγράφηκε για τη δοκιμή πόλου. (ε) Τα σωματικά βάρη ποντικών μετρήθηκαν στο τέλος της μελέτης. (fg)Ντοπαμίνη (DA) και διυδροξυ-φαινυλοοξικό οξύ (DOPAC) στο ραβδωτό σώμα αναλύθηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος±SEM.n=9-10 για κάθε ομάδα στο (b,c,d);n=6-8 για κάθε ομάδα στο (f,g).ns, μη σημαντικό,* Π<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,kaempferol.="" staining,="" verified="" that="" the="" loss="" of="" th+="" cells="" reflected="" cellular="" death="" but="" not="" the="" downregulation="" of="" th="" expression="" and="" showed="" that="" ka="" treatment="" restored="" the="" decrease="" in="" the="" number="" of="" nissl-positive="" neurons="" in="" the="" snpc="" of="" mptp-treated="" mice="" from="" 43.3%="" to="" 25.4%="" (fig.="" 2c="" and="" d).in="" addition,="">οφέλη από τα βιοφλαβονοειδήΤο Ka βελτίωσε σημαντικά την επαγόμενη από MPTP μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης TH και DAT, όπως μετρήθηκε με στύπωμα Western (Εικ. 2e-g). Αυτά τα στοιχεία επιβεβαιώνουν τη νευροπροστατευτική δράση του Kaon στο μοντέλο ποντικού PD.

Αποτέλεσμα 3. Το Ka μειώνει τη συσσώρευση κενοτοπίων LD και το οξειδωτικό στρες στο SNpc των ποντικών που έλαβαν MPTP/p

Τα αυξανόμενα στοιχεία έχουν δείξει τη συμμετοχή των LD σε NDDs [10], με συνέπεια, η προηγούμενη εργασία μας εντόπισε αυξημένες LDs στο SNpc ποντικών PD που προκαλούνται από MPTP [12]. Τα LD μπορούν εύκολα να αναγνωριστούν και να εμφανίζουν στρογγυλές, χαμηλής πυκνότητας δομές με ομοιογενή άμορφα περιεχόμενα [28]. Κανονικά, τα LDs μπορούν να αποικοδομηθούν μέσω αυτοφαγίας για να αποφευχθεί η συσσώρευση [29].αγοράστε κιστανάκιΓια να διερευνηθεί εάν το Ka μπορούσε να ρυθμίσει τα LDs σε PD, η συσσώρευση LDs αναλύθηκε με ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης (TEM) στο SNpc των ποντικών ελέγχου, MPTP/p και MPTP/p ＋ Ka. Όπως φαίνεται στην προηγούμενη εργασία μας [12], ο αριθμός και το μέγεθος των LD ήταν

αυξήθηκε σε ποντίκια MPTP/p σε σύγκριση με μάρτυρες που έλαβαν αλατούχο διάλυμα (Εικ. 3α και β) και μειώθηκαν σημαντικά σε ποντίκια που έλαβαν Ka (Εικ. 3c-e). Επιπλέον, σε ποντίκια που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Ka, τα LDs παρατηρήθηκαν πιο συχνά κοντά, εγκλωβισμένα ή αποικοδομημένα από αυτολυσοσώματα, τα οποία ορίστηκαν ως κόκκοι λιποφουσκίνης με πυκνότητα ηλεκτρονίων. Περαιτέρω ιστολογική χρώση των νευρώνων TH με BODIPY, μια χρωστική που επισημαίνει ειδικά ουδέτερα λιπίδια και χρησιμοποιείται συνήθως για την ανίχνευση LDs [30], έδειξε ότι τόσο ο αριθμός όσο και το μέγεθος των BODIPY συν LD στο SNpc ήταν υψηλότεροι σε ποντίκια PD από ό,τι στους ελέγχους. και μειώθηκαν σημαντικά με τη θεραπεία με Ka (Εικ.3f-h).

Εάν τα LD δεν μπορούν να αποικοδομηθούν έγκαιρα, τα συσσωρευμένα LD μπορεί να υποστούν υπεροξείδωση και να συμβάλουν στο στρες που προκαλείται από το μιτοχονδριακό ROS [4],απόστασηπου ενισχύει τη νευροτοξικότητα και την εξέλιξη της νόσου. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε περαιτέρω τα προφίλ έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με την προστασία από την τοξικότητα της ελεύθερης FA (Gpx8), τα εξουδετερωτικά οξειδωτικά είδη, τις ρίζες υπεροξειδίου (Sod3) και το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Cat) και τον μεταβολισμό FA (Acsbg1 και Dbi) όπως αναφέρεται [31] , όλα αυτά μειώθηκαν εντυπωσιακά στο SNpc των ποντικών που έλαβαν MPTP σε σύγκριση με τους μάρτυρες, και αυτά τα αποτελέσματα βελτιώθηκαν σε ποντίκια PD που έλαβαν Ka (Εικ. 3i). Ομοίως, το MPTP/p αύξησε επίσης τα επίπεδα έκφρασης του mRNA

Εικ.2. Το Ka βελτιώνει την απώλεια νευρώνων DA στο SNpc ποντικών μοντέλου MPTP/p PD.

(αβ) Μικροφωτογραφίες θετικών νευρώνων υδροξυλάσης τυροσίνης (ΤΗ) (α) και στερεολογικές μετρήσεις θετικών σε ΤΗ νευρώνων στη μέλαινα ουσία συμπαγή (SNpc) (β). Οι ράβδοι κλίμακας είναι όπως υποδεικνύονται. (γδ) Μικροφωτογραφίες κυττάρων θετικών στο cresyl violet (γ) και στερεολογικές μετρήσεις κυττάρων cresyl violet θετικών στο SNpc (d). Μπάρα ζυγαριάς, 120 um. (π.χ.) ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης πρωτεΐνης ΤΗ και DAT στο SNpc (e) και ποσοτική ανάλυση (f,g). Τα ποσοτικά δεδομένα κανονικοποιούνται στην ομάδα ελέγχου φυσιολογικού ορού. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM.*P<><0.01, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydroloyridine..="" (for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" nox1,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

Αποτέλεσμα 4. Το Ka προστατεύει τα κύτταρα SH-SY5Y από την επαγόμενη από MPP συν απόπτωση

Το MPP, ο ενεργός μεταβολίτης του MPTP, αναστέλλει τα ένζυμα του μιτοχονδριακού συμπλέγματος και προκαλεί τον κυτταρικό θάνατο που σχετίζεται άμεσα με την PD [32]. Στη συνέχεια ερευνήσαμε εάν το Ka θα μπορούσε να αποτρέψει την επαγόμενη από MPPt νευρωνική απόπτωση in vitro. Όπως φαίνεται στα Σχ. 4α και β, το MPPt (40 υΜ, 24 ώρες) προκάλεσε την απελευθέρωση LDH από κύτταρα SH-SY5Y και το Ka(30 και 60 μΜ) εξασθένησε σημαντικά την απελευθέρωση LDH χωρίς να επηρεάσει την κυτταρική επιβίωση (Εικ. 4α). Δεδομένου ότι το Ka προκάλεσε μια ουσιαστική προστατευτική δράση σε συγκέντρωση 30 μM (Εικ. 4b), χρησιμοποιήσαμε αυτή τη συγκέντρωση σε επόμενα πειράματα. Τα αποτελέσματα της χρώσης Hoechst/PI έδειξαν επίσης ότι το Ka μείωσε σημαντικά το ποσοστό των κυττάρων με συμπύκνωση χρωματίνης που προκαλείται από MPPt (Εικ. 4c και d) και κυτταρική απόπτωση, όπως αποδεικνύεται από την αυξημένη ένταση φθορισμού Hoechst (Εικ. 4c) και το ποσοστό Κύτταρα χρωματισμένα με Hoechst/PI (Hoechst συν /ΡΙ') (Εικ. 4e). Επίσης, όπως ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής, η MPP συν προκάλεσε κυτταρική απόπτωση, που αποδεικνύεται από το αυξημένο ποσοστό των χρωματισμένων με αννεξίνη V κυττάρων (AV/PI και AV συν/ΡΙ συν) προστατεύτηκε με Ka (Εικ. 4f και g). Επιπρόσθετα, το Ka ανέστρεψε τις επαγόμενες από MPP αλλαγές στην έκφραση πρωτεΐνης που σχετίζεται με την απόπτωση, όπως αποδεικνύεται από την ανοδική ρύθμιση του Bcl-2, τη μείωση του Bax (Εικ. 4hi-j) και τη μειωμένη διάσπαση της κασπάσης-3 (Εικ. 4η, κ). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το Ka μπορεί να καταργήσει τις επιβλαβείς επιδράσεις του MPPt στην επιβίωση των κυττάρων.

Αποτέλεσμα 5. Το Ka καταστέλλει τη συσσώρευση LD που προκαλείται από MPPt και την υπεροξείδωση των λιπιδίων, που μεσολαβούν στη μιτοχονδριακή βλάβη στα κύτταρα SH-SY5Y

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η απροσδόκητη συσσώρευση LD μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένο στρες που προκαλείται από την υπεροξείδωση των λιπιδίων και να επιταχύνει τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, η οποία προάγει τον νευροεκφυλισμό [10]. Η προηγούμενη εργασία μας έδειξε επίσης ότι οι αυξημένες LDs στο SNpc συσχετίστηκαν με την παθολογία της PD σε ποντίκια [12]. Για να διερευνήσουμε εάν η προστατευτική δράση του Ka σχετιζόταν με τη συσσώρευση LD in vitro, πραγματοποιήσαμε πρώτα ειδική χρώση για LD σε κύτταρα SH-SY5Y χρησιμοποιώντας BODIPY 493/503 και παρατηρήσαμε αυξημένη εναπόθεση LD (βελτιωμένα επίπεδα ουδέτερων λιπιδίων)

Αποτέλεσμα 6. Το Ka προάγει την αυτοφαγία και μειώνει την παραγωγή mtROS σε κύτταρα SH-SY5Y που έχουν υποστεί αγωγή με MPP συν

Κανονικά, τα LDs παραδίδονται στα λυσοσώματα μέσω αυτοφαγίας και μπορούν να διασπαστούν σε FA για να αποφευχθεί η υπεροξείδωση. Ωστόσο, τα στοιχεία δείχνουν ότι η αυτοφαγία είναι εξασθενημένη, η οποία διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην PD [2]. Όταν η αυτοφαγία περιλαμβάνει την κατανομή των LDs για διάσπαση σε λυσοσώματα (Εικ. 6a), η διαδικασία ονομάζεται συγκεκριμένα λιποφαγία [2]. Για να διερευνήσουμε εάν η αυτοφαγία εμπλέκεται στη νευροπροστατευτική δράση του Ka, εξετάσαμε τα επίπεδα των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την αυτοφαγία. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6b-d, σε καλλιεργημένα κύτταρα SH-SY5Y, το επίπεδο της πρωτεΐνης ελαφριάς αλυσίδας 3 (LC3)-II που σχετίζεται με μικροσωληνίσκους μειώθηκε σημαντικά, ενώ η έκφραση της ρ62 αυξήθηκε σημαντικά σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MPP συν. όπως μετρήθηκε με ανοσοστύπωση, και αυτό το αποτέλεσμα αντιστράφηκε σημαντικά από το Ka. Εξετάσαμε περαιτέρω τις αλλαγές στην αυτοφαγία με ανοσοχρώση για LC3. Για να επιτραπεί η συσσώρευση αυτοφαγοσωμάτων εντός των κυττάρων, προστέθηκε βαφιλομυκίνη για να αποτραπεί η σύντηξη αυτοφαγοσωμάτων με λυσοσώματα. Όπως φαίνεται, αυξημένοι αριθμοί LC3b puncta ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με MPP*, υποδεικνύοντας εξασθενημένη αυτοφαγική αποικοδόμηση, και αυτό το αποτέλεσμα αντιστράφηκε επίσης από το Ka (Εικ. 6e και f). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα LD στα κύτταρα SH-SY5Y κινητοποιούνται με αυτοφαγία για τελική απομάκρυνση και ότι το Ka μπορεί να προάγει την αυτοφαγία για να μειώσει τη συσσώρευση οξειδωμένων λιπιδίων. Η αυξημένη υπεροξείδωση των λιπιδίων μπορεί να επιδεινώσει τη μιτοχονδριακή βλάβη αυξάνοντας το μιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες [4]. Επιπλέον, η θεραπεία με Ka μείωσε σημαντικά την ισχυρή παραγωγή mtROS, όπως προσδιορίστηκε με χρώση MitoSOX (Εικ. 6g και h), και μείωσε τον αριθμό των δυσλειτουργικών μιτοχονδρίων, όπως προσδιορίστηκε από ειδικές για τα μιτοχόνδρια ετικέτες για τη διάκριση της αναπνοής (MitoTracker βαθύ κόκκινο) και της συνολικής ( MitoTracker πράσινο) μιτοχόνδρια (Εικ. 6i και j). Επιπλέον, για να έχουμε άμεση άποψη των μιτοχονδριακών αλλαγών, ανιχνεύσαμε περαιτέρω τον ρυθμό κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) από τον αναλυτή Seahorse XF. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6k, η αναπνοή των μιτοχονδρίων μειώθηκε σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με MPPt, ενώ η θεραπεία με Ka προφανώς αναστρέφει αυτή τη βλάβη που προκαλείται από το MPP plus (Εικ. 6k).

Αποτέλεσμα 7. Η αναστολή της αυτοφαγίας αναστρέφει την κατασταλτική επίδραση της συσσώρευσης LD Kaon, της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας και της νευρωνικής βλάβης DA in vitro

Για να εξεταστεί εάν η αυτοφαγία είναι ένας από τους κύριους μηχανισμούς με τους οποίους το Ka μεσολαβεί στη νευροπροστασία DA, χρησιμοποιήθηκε ο αναστολέας αυτοφαγίας 3-MA. Βρήκαμε ότι οι ανασταλτικές επιδράσεις του Ka σε τραυματισμό που προκαλείται από MPP#, συμπεριλαμβανομένης της μειωμένης συσσώρευσης LD (Εικ. 7a και b), της μειωμένης παραγωγής mtROS (Εικ. 7c και d) και της ανακούφισης της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας (Εικ. 7e και f) στο Τα κύτταρα SH-SY5Y αποκλείστηκαν σημαντικά από το 3-MA. Δεδομένου ότι η οξείδωση της LD και η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία συνδέονται στενά με τον νευρωνικό θάνατο DA, εξετάσαμε στη συνέχεια τους πρωτεύοντες καλλιεργημένους νευρώνες DA. Αντιμετωπίσαμε καλλιεργημένους νευρώνες ΤΗ μεσεγκεφάλου συν με Ka και/ή MPPf και ποσοτικοποιήσαμε τον αριθμό και τη διάρκεια των διεργασιών ΤΗ συν νευρώνων με ανοσοχρώση. Η μορφολογική ανάλυση αποκάλυψε ότι ο αριθμός και το μήκος των νευρωνικών διεργασιών μειώθηκαν σημαντικά κατά MPP plus και προστατεύτηκαν από Ka, και αυτή η προστασία αντιστράφηκε περαιτέρω κατά 3-MA (Εικ. 7g-i). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το Ka ανακουφίζει τη νευρωνική βλάβη του DA προάγοντας την αυτοφαγία.

Αποτέλεσμα 8. Η σίγαση Atg5 κατάργησε την πρόληψη της απώλειας νευρώνων in vivo με τη μεσολάβηση Ka

Για να επιβεβαιώσουμε περαιτέρω ότι το Ka προστατεύει από την επαγόμενη από MPTP/p TH συν την απώλεια νευρώνων με τρόπο εξαρτώμενο από την αυτοφαγία, σιωπήσαμε το Atg5 με μικροέγχυση ενός αδενο-σχετιζόμενου ιού (AAV) που εκφράζει ένα προηγουμένως χαρακτηρισμένο shRNA έναντι Atg5 στον αμφοτερόπλευρο μεσεγκέφαλο (Εικ. .8a) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Σε προκαταρκτικά πειράματα, παρατηρήσαμε ότι η επιμόλυνση Atg5 shRNA για 2 εβδομάδες πέτυχε επαρκή έκφραση GFP σε νευρώνες ΤΗ συν (Εικ. 8β) και ανέστειλε την έκφραση ATG5 στο SNpc των ποντικών που είχαν λάβει ένεση (Εικ. 8γ). Βρήκαμε ότι το knockdown Atg5-αντέστρεψε το νευροπροστατευτικό αποτέλεσμα του Ka, όπως αποδεικνύεται από την ρυθμισμένη προς τα πάνω πρωτεϊνική έκφραση της ΤΗ (Εικ. 8d και e) και τον αυξημένο αριθμό των TH συν νευρώνων (Εικ. 8f και g). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν περαιτέρω τη συμβολή της αυτοφαγίας στην προστατευτική δράση του Ka σε ποντικούς με PD. Συμπερασματικά, επιβεβαιώσαμε ότι το Ka προστατεύει από τραυματισμό που προκαλείται από MPTP/p μειώνοντας την οξείδωση LD και τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία προάγοντας την αυτοφαγία.

4. Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι το φυσικό μικρό μόριο Ka ήταν ένας βασικός παράγοντας μέσω του οποίου η αυτοφαγική σηματοδότηση θα μπορούσε να αναστείλει την οξειδωτική τοξικότητα των λιπιδίων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η οδός αυτοφαγίας είναι ένας βασικός ρυθμιστικός βρόχος μέσω του οποίου το Ka ανακουφίζει την υπεροξείδωση της LD και την επακόλουθη μιτοχονδριακή βλάβη και επικεντρώθηκε στον ρόλο της ρυθμιζόμενης από την αυτοφαγία τοξικότητας LD στην ανακούφιση της μιτοχονδριακής βλάβης ενώ προλαμβάνει τον νευροεκφυλισμό λόγω υπερβολικού οξειδωτικού στρες (Εικ. 9).

Οι LD είναι οι ενδοκυτταρικές θέσεις αποθήκευσης ουδέτερων λιπιδίων [5] και είναι κρίσιμες για τον μεταβολισμό των λιπιδίων και την ενεργειακή ομοιόσταση, ενώ η δυσλειτουργία της LD έχει συνδεθεί με πολλές ασθένειες [16]. Τα συσσωρευμένα στοιχεία υποδηλώνουν ότι οι ρόλοι που διαδραματίζουν τα LD στη βιολογία και την παθολογία είναι σημαντικά ευρύτεροι από ό,τι πιστεύαμε προηγουμένως. Στο ΚΝΣ, τα στοιχεία έχουν δείξει ότι οι αυξημένες LDs σε νευρώνες και γλοία εμπλέκονται στη νευροεκφυλιστική παθολογία [10,36]. Αναλυτικά, οι LDs έχουν ανιχνευθεί τόσο στους άξονες των νευρώνων Aplysia που καλλιεργήθηκαν in vitro [37] όσο και σε εγκεφαλικές τομές από Μοντέλα της νόσου του Huntington [38]. Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι οι νευρώνες είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι στην τοξικότητα των λιπιδίων και η συσσώρευση LDs που δεν μπορούν να αφαιρεθούν εγκαίρως οδηγεί σε επιταχυνόμενη υπεροξείδωση της LD και μπορεί να προκαλέσει νευροεκφυλισμό [17].

Η συσσώρευση λιπιδίων σε υπερκινητικούς νευρώνες είναι τοξική όχι μόνο λόγω της ευαισθησίας αυτών των λιπιδίων στην υπεροξείδωση. Επιπλέον, το περιεχόμενο της περίσσειας LD μπορεί να εισέλθει σε μη οξειδωτικές μεταβολικές οδούς, προκαλώντας υπερβολική παραγωγή κεραμιδίου, το οποίο είναι τοξικό για τα κύτταρα [39]. Πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι σε ελαττωματικά κύτταρα LD, τα FAs μπορούν να μετατραπούν σε ακυλκαρνιτίνες, οι οποίες στη συνέχεια προκαλούν μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και παραγωγή ROS [40]. Αυτές οι διεργασίες είναι πιθανό να έχουν συγκεκριμένες και βαθιές συνέπειες στους υπερκινητικούς νευρώνες επειδή τα δυσλειτουργικά μιτοχόνδρια θέτουν σε κίνδυνο την ικανότητα κατανάλωσης FA και η παραγωγή mtROS προκαλεί περαιτέρω υπεροξείδωση των λιπιδίων της μεμβράνης.

Έτσι, η ομοιόσταση της LD θα πρέπει να ελέγχεται καλά στους νευρώνες, κάτι που είναι κρίσιμο για την αποφυγή της τοξικότητας και τελικά τη διατήρηση της υγείας του εγκεφάλου. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε ότι το μικρό φυσικό μόριο Ka αναστέλλει την νευρωνική τοξικότητα LD που εκδηλώνεται ως αυξημένη συσσώρευση LD, αυξημένη υπεροξείδωση λιπιδίων και ρυθμισμένη προς τα πάνω γονιδιακή έκφραση που σχετίζεται με την τοξικότητα λιπιδίων σε κύτταρα SH-SY5Y που προσβάλλονται με MPP#. Το πιο σημαντικό, δείξαμε επίσης ότι η θεραπεία με Ka μειώνει τα 45]. Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήσαμε ελαττωματική αυτοφαγία/λιποφαγία σε τραυματισμένα με MPPt νευρωνικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων μειωμένων επιπέδων LC3-II και αυξημένης έκφρασης p62 και αυξημένος αριθμός των σημείων LC3B που εναποτίθενται στα κύτταρα. Η ελαττωματική λιποφαγία σε τραυματισμένα κύτταρα SH-SY5Y αντιστράφηκε με θεραπεία με Ka. Ως αποτέλεσμα, το Ka μείωσε τη συσσώρευση οξειδωμένων LDs, κατεστραμμένων μιτοχονδρίων και παραγωγής mtROS σε κύτταρα SH-SY5Y που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MPP#. Είναι σημαντικό ότι η αναστολή της αυτοφαγίας από το 3-MA κατάργησε την εξάλειψη των οξειδωμένων LDs και των κατεστραμμένων μιτοχονδρίων με τη μεσολάβηση Ka και την ανακούφιση της βλάβης του νευρώνα DA in vitro. Επιπλέον, η αναστολή της αυτοφαγίας από το knockdown Atg5 in vivo ανέστρεψε τα προστατευτικά αποτελέσματα του νευρωνικού εκφυλισμού Kaon DA στο μοντέλο ποντικού PD που προκαλείται από MPTP. Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι το Ka αναστέλλει τη μιτοχονδριακή βλάβη που σχετίζεται με την τοξικότητα της LD προάγοντας την αυτοφαγία σε ένα πειραματικό μοντέλο PD.

Τα συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι η αυξημένη παραγωγή mtROS είναι ένα πρωταρχικό χαρακτηριστικό των νευρώνων υψηλής δραστηριότητας και έχει παρατηρηθεί σε πολλά NDDs, συμπεριλαμβανομένης της PD [46]. Οι αναφορές σχετικά με το εάν το ROS είναι αιτία ή συνέπεια του σχηματισμού LD είναι αντιφατικές [47,48]. Είναι ενδιαφέρον ότι τα in vitro αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η φαρμακολογική αναστολή της υπεροξείδωσης της LD με ο-τοκοφερόλη εμπόδισε τη δημιουργία mtROS και τις ανωμαλίες του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης και ανακούφισε τις μιτοχονδριακές μειώσεις, όπως αποδεικνύεται από τη χρώση Tomm20 σε κύτταρα SH-SY5Y, η οποία υποστηρίζει την ιδέα ότι η υπεροξείδωση παίζει α. αιτιολογικός ρόλος στην επαγόμενη από MPP μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και τη δημιουργία mtROS. Ωστόσο, είναι πιθανό ότι τα αυξημένα ROS αρχικά επιταχύνουν το σχηματισμό LD και στη συνέχεια, τα LDs προκαλούν περαιτέρω παραγωγή ROS και επιδεινώνουν τα ενδοκυτταρικά και μιτοχονδριακά επίπεδα ROS.

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι τα ποντίκια με PD που προκαλείται από MPTP είχαν υψηλά επίπεδα συσσώρευσης LD, η οποία συνοδεύτηκε από αυξημένη απώλεια νευρώνων DA, επιταχυνόμενο στρες που προκαλείται από ROS και ελλείμματα συμπεριφοράς. Η θεραπεία με Ka εμπόδισε την τοξικότητα LD in vitro και βελτίωσε την απώλεια νευρώνων DA και τα ελλείμματα συμπεριφοράς στο μοντέλο ποντικού PD και αυτές οι επιδράσεις εξαρτώνται από την αυτοφαγία. Επομένως, είναι λογικό να συμπεράνουμε ότι το Ka προάγει την αυτοφαγία και αυτή η ενισχυμένη αυτοφαγία μειώνει την οξειδωμένη συσσώρευση LD, μειώνει την παραγωγή mtROS και ανακουφίζει τη μιτοχονδριακή βλάβη στους νευρώνες DA, η οποία συμβάλλει στην αναστολή της τοξικότητας της LD, μειώνοντας έτσι την παθολογία της PD (Εικ. . 9).

Χρηματοδότηση

Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αρ. 81903587), το έργο που χρηματοδοτήθηκε από το Ίδρυμα Μεταδιδακτορικών Επιστημών της Κίνας (No.2019M661807), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (Αρ. BK20190120) και το Open Project of Chinese Materia Medica First-Class Dicipline of Nanjing University of Chinese Medicine (No. 2020YLXK006) και το Drug Innovation Major Project (No.2018ZX09711001-003-007).

Αυτό το άρθρο εξάγεται από το Redox Biology 41 (2021) 101911