Μέρος 3: Ένα μοναδικό μοντέλο ποντικιού άσκησης στην πρώιμη ζωή που επιτρέπει τη μνήμη του ιππόκαμπου και τη συναπτική πλαστικότητα

για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Κάντε κλικ εδώ για το Μέρος 2

Υλικά και μέθοδοι

Των ζώων. Τα ποντίκια άγριου τύπου ήταν απόγονοι των φραγμάτων C57Bl6J, που ελήφθησαν αρχικά από τα εργαστήρια Jackson και εκτράφηκαν περαιτέρω στις εγκαταστάσεις μας για ζώα. Τα ποντίκια είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό και τα φώτα διατηρήθηκαν σε κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών. Μετά τον απογαλακτισμό μια μεταγεννητική ημέρα (Ρ) 21, τα ποντίκια στεγάστηκαν είτε σε τυπικά κλουβιά κλινοσκεπασμάτων είτε σε κλουβιά εξοπλισμένα με τροχό. Τόσο αρσενικά όσο και θηλυκά ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για όλα τα πειράματα άσκησης και συμπεριφοράς. Μόνο αρσενικά ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες. Όλες οι δοκιμές συμπεριφοράς πραγματοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια του κύκλου φωτός. Τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας των ΗΠΑ για τη φροντίδα και τη χρήση των ζώων και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια, Irvine.

Κάντε κλικ στοΕπιδράσεις Cistanche για τη βελτίωση της μνήμης

Παράδειγμα τροχού τρεξίματος. Μετά τον απογαλακτισμό στο P21, τα ποντίκια τοποθετήθηκαν σε ζεύγος είτε σε τυπικά κλουβιά χωρίς τροχό είτε εξοπλισμένα με κινητό ή σταθερό τροχό κίνησης από ανοξείδωτο χάλυβα (διάμετρος 4,5 cm, 112 γραμμάρια, Starr Life Sciences). Τα ζώα που στεγάζονταν με τροχούς είχαν ελεύθερη πρόσβαση για προκαθορισμένη διάρκεια: είτε μία εβδομάδα κατά τη διάρκεια της νεανικής περιόδου (P21–27, juv ELE), μία εβδομάδα κατά την εφηβεία (P35–41, Adol ELE) είτε τρεις συνεχόμενες εβδομάδες πρόσβασης (P21– 41· juv-adol ELE). Μια επιπλέον ομάδα ποντικών στεγάστηκε με έναν σταθερό τροχό κατά τη διάρκεια του P21-41 (sta) για τον έλεγχο του περιβαλλοντικού εμπλουτισμού από την παρουσία ενός τροχού στο κλουβί. Κάθε τροχός ήταν εφοδιασμένος με ένα ελαφρύ πλέγμα πολυουρεθάνης για να αποτρέψει τα μικρά άκρα των απογαλακτισμένων ποντικών να γλιστρήσουν μέσα από τα σκαλοπάτια των τροχών. Η δραστηριότητα του τρεξίματος παρακολουθήθηκε μέσω ψηφιακά παρακολουθούμενων αισθητήρων που συνδέονται σε μια θύρα δεδομένων και έναν υπολογιστή για απόκτηση δεδομένων σε πραγματικό χρόνο (Vital View Sofware) μέσω μαγνητικής ανίχνευσης των στροφών του τροχού. Κάθε ψηφιακά παρακολουθούμενος τροχός παρακολουθούσε την απόσταση τρεξίματος για το κλουβί (δύο ποντίκια στεγάζονται ανά κλουβί, επομένως η απόσταση που διανύθηκε ανά κλουβί αντιπροσωπεύει τη συνολική απόσταση που διανύθηκε μεταξύ δύο ποντικών). Οι στροφές ποσοτικοποιήθηκαν ανά λεπτό καθημερινά για τη διάρκεια του τρεξίματος και μετατράπηκαν σε απόσταση που διανύθηκε ανά κλουβί (km).

Θέση αντικειμένουμνήμη(OLM) πρωτόκολλο. Η θέση του αντικειμένουμνήμηΤο πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη έχει προσαρμοστεί και τροποποιηθεί από προηγούμενα πρωτόκολλα44. Την 36η μεταγεννητική ημέρα, τα ποντίκια μεταφέρθηκαν σε μια αίθουσα δοκιμών με μειωμένη φωτεινότητα δωματίου. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε χειρισμό για περίπου 2 λεπτά το καθένα, για συνολικά 5 συνεχόμενες ημέρες πριν από την προπόνηση OLM (δύο φορές την ημέρα για τις πρώτες 2 ημέρες, ακολουθούμενη από μία φορά την ημέρα για τις επόμενες 3 ημέρες). Οι συνεδρίες εξοικείωσης ήταν 5 λεπτά, δύο φορές την ημέρα για 3 ημέρες (P38-P40) και πραγματοποιήθηκαν μέσα σε θαλάμους που περιείχαν τέσσερις μοναδικές χωρικές ενδείξεις σε κάθε τοίχωμα του θαλάμου (οριζόντιες γραμμές, μαύρο X, κάθετη λωρίδα και κενό τοίχωμα) . Η συνήθεια επικαλύπτεται με τις τελευταίες 2 ημέρες χειρισμού. Κατά τη διάρκεια της φάσης εκπαίδευσης (Ρ41), τα ποντίκια τοποθετήθηκαν στους ίδιους θαλάμους με δύο πανομοιότυπα αντικείμενα και εκτέθηκαν σε περίοδο εκπαίδευσης είτε σε υποκατώφλι (3 λεπτά) είτε σε κατώφλι (10 λεπτά). ένα σχέδιο μελέτης που ενημερώθηκε από προηγούμενη εργασία που δείχνει ότι 3 λεπτά εκπαίδευσης είναι συνήθως ανεπαρκή για μακροχρόνιαμνήμησχηματισμός45. Για τα ποντίκια σε κλουβιά άσκησης, οι τροχοί τρεξίματος κλειδώθηκαν αμέσως μετά την προπόνηση OLM για να εξαλειφθούν τυχόν οξείες επιπτώσεις της άσκησηςμνήμηενοποίηση. Την ημέρα της δοκιμής (P42, 24 ώρες μετά την εκπαίδευση), ένα από τα αντικείμενα μεταφέρθηκε σε μια νέα θέση μέσα στον θάλαμο και τα ποντίκια αφέθηκαν στη συνέχεια να εξερευνήσουν τα αντικείμενα για 5 λεπτά. Οι χρόνοι που δαπανήθηκαν με κάθε αντικείμενο προσδιορίστηκαν μέσω τυφλής ανάλυσης με βαθμολόγηση με το χέρι και οι τιμές που λήφθηκαν τόσο τις ημέρες εκπαίδευσης όσο και τις ημέρες δοκιμών μετατράπηκαν σε δείκτη διάκρισης (DI), με βάση τη νέα θέση του αντικειμένου κατά τη διάρκεια της δοκιμής: [(χρόνος που δαπανήθηκε εξερεύνηση νέου αντικειμένου – χρόνος που αφιερώνεται στην εξερεύνηση οικείου αντικειμένου)/(συνολικός χρόνος εξερεύνησης και των δύο αντικειμένων) × 100 τοις εκατό ]. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές σεμνήμηαπόδοση μεταξύ των καθιστικών ζώων και εκείνων που στεγάζονται με ακίνητο τροχό, έτσι αυτές οι ομάδες συνδυάστηκαν και αντιπροσωπεύτηκαν ως "χωρίς ELE" σε όλες τις αναλύσεις OLM. Οι δοκιμές Habituation αναλύθηκαν για την απόσταση που διανύθηκε μεταξύ των συνεδριών χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης συμπεριφοράς ANY-maze (Stoelting Co). Τα ποντίκια με άνισους χρόνους εξερεύνησης μεταξύ των δύο αντικειμένων κατά τη διάρκεια της φάσης εκπαίδευσης (DI > 20) ή που δεν παρουσίασαν μείωση στη συνολική απόσταση που διανύθηκε στις συνεδρίες εξοικείωσης αποκλείστηκαν από την ανάλυση.

Το Cistanche μπορεί να βοηθήσει στη βελτίωση της μνήμης

ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες. Πειράματα ηλεκτροφυσιολογίας πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως και η πηγή αυτών των μεθόδων έχει δημοσιευθεί αλλού66. Μόνο αρσενικά ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για ηλεκτροφυσιολογικά πειράματα. Εν συντομία, αρσενικά ποντίκια από όλες τις ομάδες ELE θυσιάστηκαν μεταξύ P42-51 και συλλέχθηκαν φέτες από τον ιππόκαμπο της ράχης. Οι στεφανιαίες φέτες κόπηκαν (Leica VT1000 S) σε πάχος 320um και τοποθετήθηκαν σε θάλαμο καταγραφής διεπαφής με προθερμασμένο (31 ± 1 βαθμό) τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 1,5 mM MgS04, 2,5 mM CaCl2, 26 mM NaHC03 και 10 mM d-γλυκόζη). Οι φέτες διαχέονταν συνεχώς με ρυθμό 1,75–2 ml ανά λεπτό, ενώ η επιφάνεια των φετών εκτέθηκε σε ζεστό, υγροποιημένο 95 τοις εκατό O2/5 τοις εκατό CO2. Οι εγγραφές ξεκίνησαν μετά από τουλάχιστον 2 ώρες επώασης. Τα διεγερτικά μετασυναπτικά δυναμικά πεδίου (fEPSPs) καταγράφηκαν από την ακτινοβολία της στιβάδας CA1b χρησιμοποιώντας μια μονή γυάλινη πιπέτα (2–3 MΩ) με 2 M NaCl. Οι παλμοί διέγερσης (0,05 Hz) παραδόθηκαν σε προβολές ασφαλείας Schafer χρησιμοποιώντας ένα διπολικό ηλεκτρόδιο διέγερσης (στριμμένο σύρμα νιχρώμου, 65 μm) τοποθετημένο στο CA1c. Η ένταση του ρεύματος ρυθμίστηκε για να ληφθεί το 50 τοις εκατό της μέγιστης απόκρισης fEPSP. Αφού καθιερώθηκε μια σταθερή γραμμή βάσης, το LTP προκλήθηκε με ένα μόνο συρμό πέντε ριπών θήτα, στις οποίες κάθε ριπή (τέσσερις παλμοί στα 100 Hz) χορηγήθηκε σε απόσταση 200 ms (δηλαδή, στη συχνότητα θήτα). Η ένταση διέγερσης δεν αυξήθηκε κατά τη διάρκεια του TBS. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν και ψηφιοποιήθηκαν με NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Teta Burst). Τα δεδομένα στο σχήμα LTP κανονικοποιήθηκαν στα τελευταία 10 λεπτά της βασικής γραμμής και παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± SE. Τα βασικά μέτρα στις καμπύλες I/O, η διευκόλυνση ζευγαρωμένων παλμών και η LTP αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας αμφίδρομη ANOVA και ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης (λογισμικό Graphpad Prism 8).Το Cistanche μπορεί να βοηθήσει στη βελτίωση της μνήμης.

Στατιστικές αναλύσεις. Χρησιμοποιήθηκαν μονόδρομες ANOVA για την ανάλυση της επίδρασης του χρονισμού της άσκησης πρώιμης ζωής στους DI απόκτησης OLM (Εικ. 2d, g), OLM Testing DIs (Εικ. 2e, h) και OLM Testing συνολικούς χρόνους εξερεύνησης (Εικ. 2στ , i) σε κάθε φύλο. Οι post-hoc πολλαπλές συγκρίσεις του Dunnett χρησιμοποιήθηκαν για να γίνουν συγκεκριμένες συγκρίσεις με την ομάδα "χωρίς ELE" (καθιστική ζωή) όταν παρατηρήθηκαν σημαντικά αποτελέσματα ANOVA. Η αμφίδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του βάρους ποντικού που αποκτήθηκε κατά τη διάρκεια της περιόδου ELE (Εικ. 1b, παράγοντες της ομάδας ELE και του φύλου). Οι αμφίδρομες επαναλαμβανόμενες μετρήσεις (RM)-ANOVA χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση ημερήσιας απόστασης τρεξίματος (Εικ. 1c–e, παράγοντες μεταγεννητικής ημέρας και φύλου), συνεδρίες εξοικείωσης (Εικ. 2β, γ) και για τη σύγκριση της DI απόκτησης OLM έναντι της δοκιμής DI για κάθε ποντίκι για συγκρίσεις εντός της ομάδας. Οι δοκιμές post hoc του Sidak χρησιμοποιήθηκαν για να γίνουν συγκεκριμένες συγκρίσεις όταν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλληλεπιδράσεις ή κύρια αποτελέσματα μιας ομάδας τρεξίματος ή μιας συνεδρίας OLM. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε τριμερής ANOVA για OLM Testing DIs για τον προσδιορισμό τυχόν σημαντικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ τριών ονομαστικών μεταβλητών (διάρκεια εκπαίδευσης OLM, ομάδα ELE και φύλο). Για σπάνιες περιπτώσεις που δεν καταγράφηκαν δεδομένα τρεξίματος 24 ωρών για μια συγκεκριμένη ημέρα, οι τιμές καταλογίστηκαν με βάση τη λήψη της μέσης διαδρομής διαδρομής των προηγούμενων τριών ημερών, για την εκτέλεση στατιστικών αναλύσεων. Οι μη ζευγαρωμένες δοκιμές t Student χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των συνολικών αποστάσεων τρεξίματος για κάθε ομάδα ELE (Εικ. 1f–h), καθώς και για τη σύγκριση των DI δοκιμής OLM μεταξύ 3-min και 10-min εκπαιδευμένων καθιστικών ποντικών. Οι αθροιστικές αποστάσεις τρεξίματος εκφράζονται ως Μέσος όρος ± SD. Τα κύρια αποτελέσματα και οι αλληλεπιδράσεις για όλα τα ANOVA περιγράφονται στο υπόμνημα κειμένου και εικόνας, μαζί με τον συγκεκριμένο αριθμό ζώων κάθε φύλου που χρησιμοποιούνται σε κάθε πείραμα. Όλες οι αναλύσεις ήταν δύο ουρών και απαιτούσαν τιμή 0,05 για σημαντικότητα. Οι γραμμές σφαλμάτων σε όλα τα σχήματα αντιπροσωπεύουν το SEM. Για όλα τα πειράματα, οι τιμές ±2 τυπικές αποκλίσεις από τον μέσο όρο της ομάδας θεωρήθηκαν ακραίες και αφαιρέθηκαν από τις αναλύσεις. Όλες οι στατιστικές πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό GraphPad Prism 8. Συνολικός αριθμός ποντικών που χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα συμπεριφοράς=152.

Το Cistanche μπορεί να βοηθήσει στη βελτίωση της μνήμης

Λήψη: 16 Ιανουαρίου 2020; Αποδοχή: 13 Μαΐου 2020.

Δημοσιεύθηκε: xx xx xxxx

Ευχαριστίες

Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Νευρολογικών Διαταραχών και Εγκεφαλικού των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας, με αριθμό βραβείου K12NS098482 (που απονεμήθηκε στην ASI) και την Ιατρική Σχολή UC Irvine, Τμήμα Παιδιατρικής. Θα θέλαμε επίσης να ευχαριστήσουμε τον Δρ. Marcelo Wood για τις επιστημονικές συζητήσεις και την κριτική του συμβολή στο έργο.

Συνεισφορές συγγραφέα

Οι ASI, TY, SP, FS και TV πραγματοποίησαν πειράματα άσκησης και συμπεριφοράς και ανέλυσαν δεδομένα. Ο EK πραγματοποίησε όλα τα πειράματα ηλεκτροφυσιολογίας, ανέλυσε τα δεδομένα και επεξεργάστηκε το χειρόγραφο. Η ASI σχεδίασε τη μελέτη, ανέλυσε δεδομένα, ερμήνευσε τα αποτελέσματα και έγραψε το χειρόγραφο.

ανταγωνιστικά συμφέροντα

Οι συγγραφείς δεν δηλώνουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Επιπλέον πληροφορίες

Η αλληλογραφία και τα αιτήματα για υλικά θα πρέπει να απευθύνονται στην ASI

Πληροφορίες για τις ανατυπώσεις και τις άδειες είναι διαθέσιμες στη διεύθυνση www.nature.com/reprints.

Σημείωση εκδότη Το Springer Nature παραμένει ουδέτερο όσον αφορά τις αξιώσεις δικαιοδοσίας σε δημοσιευμένους χάρτες και θεσμικές σχέσεις.