ΜΕΡΟΣ 2 Απομόνωση και ταυτοποίηση των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών από το Aloysia Polystachya και η δραστηριότητά του ως αναστολείς της μονοαμινοξειδάσης-Α

Ποιος είναι ο λόγος για τον οποίο τα Cistanche Actosides μπορούν να αναστείλουν την ενζυμική δραστηριότητα;

Η αρχή της αντιοξειδωτικής δράσης του Cistanche

Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε με:joanna.jia@wecistanche.com

Το Cistanche deserticola έχει πολλά αποτελέσματα, κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Διαχωρισμός και ταυτοποίηση συστατικών με υγρή χρωματογραφία υπερ-απόδοσης-φασματομετρία μάζας

Πραγματοποιήθηκαν χρωματογραφικές αναλύσεις χρησιμοποιώντας σύστημα Waters Acquity UPLC H-Class εξοπλισμένο με ανιχνευτή διάταξης διόδων (DAD) και φασματόμετρο μάζας διαδοχικών τετραπολικών Waters Xevo TQ-S με πηγή ψεκασμού Ζ που λειτουργεί στον τρόπο λειτουργίας αρνητικών ιόντων. Στοκ διαλύματα που περιέχουν 1.0mg/mL εκχυλίσματος ή τα πρότυπαακτεοσίδη, ισοακτεοσίτης, 6'-ακετυλολακτεοσίδηκαι 4',4'''',5,5''-τετραϋδροξυ-6,6'',3'''-τριμεθοξυ-[C7–O–C7'']-διφλαβόνη σε μεθανόλη βαθμού LC παρασκευάστηκαν χωριστά, με υπερήχους για 30λεπτά το καθένα όταν ήταν απαραίτητο, και διηθήθηκαν μέσω φίλτρων Millipore 0.45μm (Merck Millipore). Τα διαλύματα αραιώθηκαν σε 10μg/mL με μεθανόλη και δείγματα (5μL) εγχύθηκαν σε στήλη Sigma-Aldrich Ascentis Express C18 (1{{30}}0×4,6 mm id; μέγεθος σωματιδίων 2,7 μm). Η κινητή φάση αποτελούνταν από νερό που περιέχει 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ (διαλύτης Α) και μεθανόλη που περιέχει 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ (διαλύτης Β) παρεχόμενο με ρυθμό ροής 0,5 ml/min σύμφωνα με το προφίλ έκλουσης: ισοκρατικό με 3 τοις εκατό Β μεταξύ 0 και 4 λεπτά, ακολουθούμενες από γραμμικές διαβαθμίσεις από 3 έως 60 τοις εκατό Β μεταξύ 4 και 19 λεπτών και από 60 έως 90 τοις εκατό Β μεταξύ 19 και 23 λεπτών, και τελικά επέστρεψαν στο 3 τοις εκατό Β μεταξύ 23 και 28 λεπτών. Η εκροή παρακολουθήθηκε από DAD στην περιοχή από 210 έως 720 nm και από MS με τη βελτιστοποιημένη πηγή και παραμέτρους λειτουργίας ως εξής: τριχοειδής τάση 2,50 kV, θερμοκρασία πηγής ψεκασμού Z 150 μοίρες, θερμοκρασία αποδιάλυσης (N2) 350 μοίρες, ροή αερίου αποδιάλυσης 600 L/h και εύρος μάζας m/z 150 έως 600 στη λειτουργία πλήρους σάρωσης.

Καθαρισμός προσδιορισμένων συστατικών

Το ακατέργαστο υδροαιθανολικό εκχύλισμα (10 g) διαλύθηκε σε νερό: αιθανόλη (50:50· ν/ν) και κατανεμήθηκε διαδοχικά έναντι εξανίου, οξικού αιθυλεστέρα και η-βουτανόλης. Το κλάσμα βουτανόλης συμπυκνώθηκε σε περιστροφικό εξατμιστήρα και ένα δείγμα 3 g του κλασματοποιημένου εκχυλίσματος εφαρμόστηκε σε μια γυάλινη στήλη (10 × 3 cm od) γεμάτη με C{7}} RP silica gel (230-400 mesh· Sigma -Aldrich) και εκλούστηκε με νερό, ακολουθούμενα από διαδοχικά μίγματα νερού: μεθανόλης (90:10, 50:50 και 10:90, ν/ν). Το υποκλάσμα που ελήφθη με έκλουση με νερό: μεθανόλη (90:10, ν/ν) καθαρίστηκε περαιτέρω με RP-HPLC χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Shimadzu LC{19}}AP συζευγμένο με έναν ανιχνευτή SPD-20Ανιχνευτή UV/Vis και εξοπλισμένο με στήλη Phenomenex Luna® C-18 (250 × 10 mm id, μέγεθος σωματιδίων 5 μm). Η κινητή φάση ήταν νερό: η μεθανόλη ξεκινούσε στα 90:10 (v/v) και μεταβαλλόταν σε 30:70 (v/v) σε 100 λεπτά για να δώσει τις τέσσερις γνωστές ενώσειςακτεοσίδη(750 mg), απομονωμένη πλευρά (430 mg), 6'-ακετυλολακτεοσίδη(42 mg) και 4',4''',5,5''-τετραϋδροξυ-6,6'',3'''-τριμεθοξυ-[C7–O–C7'']-διφλαβόνη ( 13 mg). Ο ρυθμός ροής της κινητής φάσης ήταν 1 mL/min, ο όγκος έγχυσης ήταν 500 μL, το χρωματογράφημα καταγράφηκε στα 340 nm και τα φάσματα UV ελήφθησαν στην περιοχή από 240 έως 400 nm. Οι ταυτότητες των καθαρισμένων συστατικών επιβεβαιώθηκαν από τα φάσματα 1H- (500 MHz) και 13C-NMR (125 MHz) που καταγράφηκαν σε ένα φασματόμετρο Bruker μοντέλου DPX 500 και σύγκριση των δεδομένων με εκείνα που είναι διαθέσιμα στη βιβλιογραφία [18, 19, 41]. Οι καθαρότητες των απομονωμένων ενώσεων επιβεβαιώθηκαν με UPLC-DAD-MS (▶Σύκο. 1b–d) και NMR (▶Σύκο. S1–S12, Βοηθητικές πληροφορίες).

Ποσοτικοποίηση τουακτεοσίδηαπό έναν ανιχνευτή συστοιχίας διόδων HPLC

Ένα δείγμα (1 mg) του ξηρού υδροαιθανολικού εκχυλίσματος επαναδιαλύθηκε σε 1 mL μίγματος (80:20· v/v) μεθανόλης (βαθμός JT Baker HPLC) και Milli-Q Υπερκαθαρό νερό (Merck Millipore), κατεργάστηκε με υπερήχους για 30 λεπτά και διηθήθηκε μέσω ενός φίλτρου 0.45-μm Millipore. Δείγματα (20 μL) αυτού του διαλύματος αναλύθηκαν σε σύστημα Shimadzu LC-10APvp συζευγμένο με SPD-M10Avp DAD και προσαρμοσμένο με στήλη Phenomenex Luna C18 (250 × 4,6 mm id, 5 μm) προστατευμένη από Phenomenex C18 προστήλη (4,0 χ 3,0 mm id, 5 μm). Οι διαχωρισμοί πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου (22 ± 1 βαθμός) χρησιμοποιώντας μια κινητή φάση που περιλαμβάνει οξικό οξύ 0,1 τοις εκατό σε νερό (διαλύτης Α) και μεθανόλη (διαλύτης Β.

ποιότητας JT Baker HPLC) που παρέχεται με σταθερό ρυθμό ροής 1.0 mL/min σύμφωνα με το πρόγραμμα: γραμμική κλίση από 10 έως 70 τοις εκατό B μεταξύ 0 και 32 λεπτά, από 70 έως 10 τοις εκατό Β μεταξύ 32 και 35 λεπτών, και μια τελική ισοκρατική έκλουση με 10 τοις εκατό Β μεταξύ 35 και 40 λεπτών. Το μήκος κύματος ανίχνευσης ορίστηκε στα 330 nm.

Το περιεχόμενο τουακτεοσίδηστο απόσπασμα υπολογίστηκε χρησιμοποιώνταςακτεοσίδη(Sigma-Aldrich; CAS αρ. 61276-17-3) ως εξωτερικό πρότυπο. Παρασκευάστηκαν διαλύματα που περιείχαν 500, 250, 125, 62,5, 31,2 και 15,6 ug/mL του προτύπου αναφοράς και οι καμπύλες βαθμονόμησης κατασκευάστηκαν υποβάλλοντας κάθε διάλυμα σε ανάλυση HPLC εις τριπλούν [42]. Ο λόγος της επιφάνειας κορυφής του προτύπουακτεοσίδηστην αντίστοιχη συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας καθορίστηκε μέσω γραμμικής παλινδρόμησης των τυπικών καμπυλών (▶Σύκο. S13, Βοηθητικές πληροφορίες). Τα αναλυτικά δεδομένα επικυρώθηκαν σε σχέση με τη γραμμικότητα, την ακρίβεια και την ακρίβεια σύμφωνα με τις οδηγίες που εκδόθηκαν από την Agência Nacional de Vigilância Sanitária [42]. Όρια ανίχνευσης (LoD) και ποσοτικοποίησης (LoQ) τουακτεοσίδηήταν {{0}},30 και 0,92 μg/mL, αντίστοιχα.

Δοκιμασίες αναστολής μονοαμινοξειδάσης-Α

Ανασυνδυασμένο ανθρώπινο ΜΑΟ-Α, τυραμίνη, κλοργυλίνη, βανιλικό οξύ, 4-αμινο αντιπυρίνη και υπεροξειδάση χρένου αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές αναστολής ΜΑΟ-Α χρησιμοποιώντας πλακίδια 96- φρεατίων ακολουθώντας μια τροποποιημένη έκδοση της μεθόδου που περιγράφεται από τους López et al. [43]. Κάθε φρεάτιο φορτώθηκε με 50 μL χρωμογόνου διαλύματος (0,8 mM βανιλικού οξέος, 2,5 mM 4-αμινο αντιπυρίνης και 4 U/mL υπεροξειδάσης χρένου σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών σε pH 7,6), 100 μL του 3 mM τυραμίνη και ένα δείγμα 50-μL του ακατέργαστου υδροαιθανολικού εκχυλίσματος ή ενός από τα καθαρισμένα φαινυλαιθανοειδή διαλυμένα σε μεθανόλη. Τέλος, δείγματα 50 μL 8 U/mL ΜΑΟ-Α προστέθηκαν σε καθένα από τα φρεάτια και η πλάκα επωάστηκε στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά, κατά τη διάρκεια του οποίου οι απορροφήσεις καταγράφονταν κάθε 5 λεπτά χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών. Η κλοργυλίνη (Μεγαλύτερη ή ίση με 97 τοις εκατό GC, Sigma-Aldrich) και η μεθανόλη συμπεριλήφθηκαν ως θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες, αντίστοιχα, σε κάθε πλάκα ανάλυσης.

Στατιστική ανάλυση

Πραγματοποιήθηκαν τρεις ανεξάρτητες αξιολογήσεις των ανασταλτικών ενεργειών ΜΑΟ-Α και τα δεδομένα που αποκτήθηκαν αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Graph-Pad Prism. Το IC₅₀Οι τιμές του υδροαιθανολικού εκχυλίσματος, των καθαρισμένων φαινυλαιθανοειδών και του θετικού μάρτυρα υπολογίστηκαν με μη γραμμική παλινδρόμηση, προσομοιώνοντας διαγράμματα log (συγκέντρωση αναστολέα) έναντι κανονικοποιημένης ποσοστιαίας αναστολής.

Βοηθητικές πληροφορίες

Φάσματα H- και 13C-NMR τωνακτεοσίδη, ισοακτεοσίδη, 6'-ακετυλολακτεοσίδη και 4,4,5,5-τετραϋδροξυ-6,6,3 τριμεθοξυ-[C7–O– C7'']-διφλαβόνη και αναλύσεις συσχέτισης HSQC/HMBC για τα τρία φαινυλαιθανοειδή είναι διαθέσιμα ως Υποστηρικτικές Πληροφορίες.

βιβλιογραφικές αναφορές

[1] Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας. Κατάθλιψη και άλλα κοινά ψυχικά

Διαταραχές: Παγκόσμιες Εκτιμήσεις Υγείας. Γενεύη: ΠΟΥ; 2017

[2] Ferguson JM. Αντικαταθλιπτικά φάρμακα SSRI: Ανεπιθύμητες ενέργειες και ανεκτικότητα. Prim Care Companion J Clin Psychiatry 2001; 3: 22–27

[3] van der Watt G, Laugharne J, Janca A. Συμπληρωματική και εναλλακτική ιατρική στη θεραπεία του άγχους και της κατάθλιψης. Curr Opin Psychiatry 2008; 21: 37–42

[4] Sarris J, McIntyre E, Camfield DA. Φυτικά φάρμακα για αγχώδεις διαταραχές, μέρος 1: Ανασκόπηση προκλινικών μελετών. CNS Drugs 2013; 27: 207–219

[5] Sarris J, McIntyre E, Camfield DA. Φυτικά φάρμακα για αγχώδεις διαταραχές, μέρος 2: Ανασκόπηση κλινικών μελετών με υποστηρικτικά προκλινικά στοιχεία. CNS Drugs 2013; 27: 301–319

[6] Del Vitto LA, Petenatti EM, Petenatti ME. Recursos herbolarios de San Luis (República Argentina). Primera parte: Plantas Nativas. Multequina 1997; 6: 49–66

[7] González Y, Arrúa RD, Rojas GD, García MG. Etnofarmacobotánica foliar de "burrito",Aloysia πολυσταχία (Griseb.) Moldenke (Verben- aceae), Culturedo en Paraguay. Rojasiana 2014; 13: 31–41

[8] Mora S, Díaz-Véliz G, Millán R, Lungenstrass H, Quirós S, Coto-Morales T, Hellión-Ibarrola MC. Αγχολυτικά και αντικαταθλιπτικά αποτελέσματα του υδροαλκοολικού εκχυλίσματος απόAloysia polystachyaσε αρουραίους. Pharmacol Biochem Behav 2005; 82: 373–378

[9] Hellión-Ibarrola MC, Ibarrola DA, Montalbetti Y, Kennedy ML, Heinichen O, Campuzano M, Tortoriello J, Fernández S, Wasowski C, Marder M, De Lima TCM, Mora S. Οι αγχολυτικές επιδράσεις τουAloysiaπολυσταχία(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) σε ποντίκια. J Ethnopharmacol- col 2006; 105: 400–408

[10] Hellión-Ibarrola MC, Ibarrola DA, Montalbetti Y, Kennedy ML, Heinichen O, Campuzano M, Ferro EA, Alvarenga N, Tortoriello J,

De Lima TCM, Mora S. The antidepressant-like effect ofAloysiaπολυσταχία(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) σε ποντίκια. Phytomedicine 2008; 15: 478–483

[11] Herraiz T, González D, Ancín-Azpilicueta C, Arán VJ, Guillén H.

-Αλκαλοειδή καρβολίνης στο Peganum harmala και αναστολή της ανθρώπινης μονοαμινοξειδάσης (ΜΑΟ). Food Chem Toxicol 2010; 48: 839–845

[12] Herraiz T, Guillén H, Arán VJ, Salgado A. Αναγνώριση, εμφάνιση και δραστηριότητα των αλκαλοειδών κιναζολίνης στο Peganum harmala. Food Chem Toxicol 2017; 103: 261–269

[13] Herraiz T, Guillén H. Αναστολή μονοαμινοξειδάσης-Α και σχετική αντιοξειδωτική δράση σε φυτικά εκχυλίσματα με πιθανές αντικαταθλιπτικές δράσεις. Bio-Med Res Int 2018; 1018: 4810394

[14] Carradori S, D'Ascenzio M, Chimenti P, Secci D, Bolasco A. Επιλεκτικοί αναστολείς ΜΑΟ-Β: Ένα μάθημα από φυσικά προϊόντα. Mol Divers 2014; 18: 219–243

[15] Fajemiroye JO, Silva DM, Oliveira DR, Costa EA. Θεραπεία άγχους και κατάθλιψης: Φαρμακευτικά φυτά εκ των υστέρων. Fundam Clin Pharmacol 2016; 30: 198–215

[16] Fišar Z. Τα φάρμακα σχετίζονται με τη δραστηριότητα της μονοαμινοξειδάσης. Prog Neuropsy- chopharmacol Biol Psychiatry 2016; 69: 112–124

[17] Naoi M, Maruyama W, Shamoto-Nagai M. Η μονοαμινοξειδάση τύπου Α και η σεροτονίνη εμπλέκονται συντονισμένα σε καταθλιπτικές διαταραχές: Από ανισορροπία νευροδιαβιβαστών έως μειωμένη νευρογένεση. J Neural Transm 2017; 125: 53–66