Μέρος 2|Γλυκογονική συνθάση κινάση 3b Υπερκινητικότητα σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων προβλέπει την εξέλιξη της διαβητικής νεφρικής νόσου

Κάντε κλικ εδώ για το μέρος 1

Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε με:emily.li@wecistanche.com

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Στις Ηνωμένες Πολιτείες και σε άλλες δυτικές χώρες, η DKD παραμένει η κύρια αιτιολογία της προοδευτικήςχρόνια νεφρική νόσοςκαι επιβάλλει μεγάλο βάρος στο ταμείο και τα συστήματα υγειονομικής περίθαλψης χωρίς να υπάρχει ακόμη οριστική θεραπεία.5 Έχει αναγνωριστεί από καιρό ότι δεν θα προχωρήσουν όλοι οι ασθενείς με διαβήτη να αναπτύξουν DN.5 Ανάλογα με τη κοόρτη που μελετήθηκε, έχει υπολογιστεί ότι η DN πλήττει το 30% έως 50% των διαβητικών ασθενών. Τα μέτρα που υιοθετούνται από την τρέχουσα κλινική πρακτική για τον εντοπισμό διαβητικών ασθενών με κίνδυνο ανάπτυξης DKD περιορίζονται σε μεγάλο βαθμό σε οφθαλμικές εξετάσεις για αμφιβληστροειδοπάθεια και ανάλυση ούρων για λευκωματουρία.5 Ωστόσο, συγκλίνουσες επιδημιολογικές ενδείξεις υποδηλώνουν ότι η εξωνεφρική μικροαγγειοπάθεια ή λευκωματουρία είναι σημαντικά ασυμβίβαστη με την επακόλουθη εξέλιξη της DKD.12,13,26,27 Ως εκ τούτου, υπάρχει επιτακτική ανάγκη να αναπτυχθεί ένας νέος βιοδείκτης για την ακριβή διαστρωμάτωση των διαβητικών ασθενών που διατρέχουν κίνδυνο DN. Η παρούσα μελέτη, για πρώτη φορά, αναφέρει ότι η GSK3b είναι υπερεκφρασμένη και υπερκινητική στο παρεγχυματικόνεφρόκύτταρα τόσο σε πειραματικό όσο και σε κλινικό DN, που σχετίζονται μεεξέλιξη της νεφρικής νόσου. Επιπλέον, η υπερδραστηριότητα του GSK3b σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων είναι πιθανό να προβλέψει την εξέλιξη της DN.

Το Cistanche tubulosa αποτρέπει τη νεφρική νόσο, κάντε κλικ εδώ για να λάβετε το δείγμα

Η GSK3b, μια εξαιρετικά διατηρημένη, ευαίσθητη σε οξειδοαναγωγή κινάση σερίνης/θρεονίνης-πρωτεΐνης, εμπλέκεται κεντρικά στη σηματοδότηση της ινσουλίνης καθώς και σε μια σειρά από άλλες κυτταρικές οδούς σήματος που είναι ζωτικής σημασίας για παθοφυσιολογικές διεργασίες που σχετίζονται μενεφρόβλάβη, επισκευή και αναγέννηση. Σε ευαίσθητους στην ινσουλίνη ιστούς, όπως το ήπαρ και οι σκελετικοί μύες, η GSK3b είναι ενεργή υπό βασικές συνθήκες και καταστέλλει τη δραστηριότητα της συνθάσης του γλυκογόνου.19,28 Η ινσουλίνη απενεργοποιεί γρήγορα τη GSK3b μέσω ανασταλτικής φωσφορυλίωσης στη σερίνη 9, με αποτέλεσμα τη βιοσύνθεση γλυκογόνου. Ένας αυξανόμενος όγκος στοιχείων υποδηλώνει ότι η απορρύθμιση του GSK3b σχετίζεται με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2.19,29-31 Πράγματι, υπάρχουν δεδομένα που υποδεικνύουν υπερέκφραση και υπερκινητικότητα της GSK3b στους μύες των διαβητικών ασθενών31-33 και στους λιπώδεις ιστούς παχύσαρκων διαβητικών ποντικών.34 Επιπλέον , η διαγονιδιακή υπερέκφραση της GSK3b στους σκελετικούς μύες ποντικών προκαλεί μειωμένη ανοχή στη γλυκόζη, αντίσταση στην ινσουλίνη και υπερινσουλιναιμία. μιμούνται τη δράση της ινσουλίνης σε κυτταρικές σειρές και ιστούς.37 Επιπλέον, σε παχύσαρκα διαβητικά ποντίκια, οι αναστολείς GSK3 βελτίωσαν την ευαισθησία στην ινσουλίνη και την ομοιόσταση της γλυκόζης.38νεφρόπαραδοσιακά δεν θεωρείται ως όργανο στόχος της δράσης της ινσουλίνης. Ωστόσο, επιτακτικά στοιχεία πρότειναν πρόσφατα ότι η ινσουλίνη σηματοδοτείνεφρόκύτταρα, ιδιαίτερα στα ποδοκύτταρα, διαδραματίζουν βασικό ρόλο στη διατήρηση του σπειραματικού καινεφρόομοιόσταση.39–41 Η ελαττωματική σηματοδότηση ινσουλίνης στα ποδοκύτταρα, λόγω ανεπάρκειας ή αντίστασης στην ινσουλίνη, είναι πιθανότατα βασικός εκκινητής για πολλές από τις παθολογικές βλάβες που παρατηρούνται στο DN. Επιπλέον, κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι η αντίσταση στην ινσουλίνη συσχετίζεται με την εμφάνιση και τη σοβαρότητα της λευκωματουρίας ακόμη και σε ασθενείς με φυσιολογική πίεση που δεν έχουν διαβήτη, υποδηλώνοντας ότι η αντίσταση στην ινσουλίνη αυτή καθεαυτή μπορεί να προκαλέσει λευκωματουρία. υπό όρους νοκ άουτ του υποδοχέα ινσουλίνης στα σπειραματικά ποδοκύτταρα, ανέπτυξε λευκωματουρία και σπειραματικές αλλοιώσεις που ανακεφαλαιώνουν το DN, παρά την απουσία υπεργλυκαιμίας ή διαβήτη.41 Αντίθετα, σε διαβητικά ζώα, οι ευαισθητοποιητές ινσουλίνης είναι ικανοί να επιβραδύνουν την εξέλιξη του DN ανεξάρτητα από τον γλυκαιμικό έλεγχο.43 Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η σηματοδότηση της ινσουλίνης ρυθμίζει τη λειτουργία των ποδοκυττάρων ανεξάρτητα από τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα. Ωστόσο, ως ο βασικός μετατροπέας του μονοπατιού σηματοδότησης της ινσουλίνης, ο ρόλος της GSK3b στην παθογένεση και την εξέλιξη της DN δεν έχει μελετηθεί σε μεγάλο βαθμό.

Στονεφρό, η GSK3b εκφράζεται κυρίως σε ποδοκύτταρα και, σε μικρότερο βαθμό, σε μεσαγγειακά και ενδοθηλιακά κύτταρα στο σπειράμα20,21 και εκφράζεται εκτενώς από νεφρικά σωληναριακά κύτταρα. Υπάρχουν δεδομένα από τις ομάδες μας και από άλλες ομάδες που υποδεικνύουν ότι η GSK3b μεσολαβεί στον αυτόνομο τραυματισμό των ποδοκυττάρων ενσωματώνοντας πολλαπλές τοπαθικές οδούς σηματοδότησης ποδοκύτταρων. διάφορες μη διαβητικές σπειραματοπάθειες.21 Επιπλέον, σε προοδευτικήχρόνιοςνεφρόνόσος, το GSK3b βρέθηκε ότι είναι ρυθμιστής νεφρικής σωληναριακής και διάμεσης βλάβης. Ωστόσο, αν και πώς εμπλέκεται το GSK3b στο DN ήταν αβέβαιο και έντονα αμφιλεγόμενο, παρόλο που η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η ενισχυμένη ενεργοποίηση του GSK3b στηννεφρόκαι σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων μπορεί να σχετίζεται με την ανάπτυξη ή την εξέλιξη της DKD. Για παράδειγμα, σε αρουραίους με διαβήτη που προκαλείται από στρεπτοζοτοκίνη, οι Lin et al.46 διαπίστωσαν ότι η αναστολή της GSK3b από τον ανταγωνιστικό αναστολέα τριφωσφορικής αδενοσίνης (20 Z,30 E)-6- Bromo στην ινδιρουβίνη-30 -οξίμη ( ΒΙΟ) εξασθενημένη πρωτεϊνουρία και βελτιωμένες σπειραματικές αλλοιώσεις του DN απουσία διόρθωσης της υπεργλυκαιμίας, υποδηλώνοντας ότι η GSK3b παίζει επιζήμιο ρόλο στη DN. Επίσης, σε αρουραίους με διαβήτη που προκαλείται από στρεπτοζοτοκίνη, οι Paeng et al.22 έκαναν παρόμοια ευρήματα χρησιμοποιώντας BIO και συμπέραναν ότι η ενισχυμένη δραστηριότητα GSK3b εντός των ποδοκυττάρων υπό διαβητικές συνθήκες σχετίζεται με την απόπτωση των ποδοκυττάρων και την απώλεια στο DN. Αυτό είναι σύμφωνο με μια άλλη in vitro μελέτη, όπου η GSK3b βρέθηκε ότι μεσολαβεί στην αποδιαφοροποίηση και τον τραυματισμό των ποδοκυττάρων μετά από έκθεση σε μέσο υψηλής γλυκόζης.47 Αντίθετα, οι Mariappan et al.48 υποστήριξαν ότι η ενεργοποίηση του GSK3b αντ' αυτού βελτιώνει τον διαβήτη που προκαλείταινεφρόβλάβη. Στη μελέτη τους, διαβητικά ποντίκια που προκλήθηκαν από στρεπτοζοτοκίνη υποβλήθηκαν σε θεραπεία με νιτροπρωσσικό νάτριο, έναν δότη νιτρικού οξειδίου που είναι σε θέση να ενεργοποιήσει το GSK3b. Διαπίστωσαν ότι η λευκωματουρία, η υπερτροφία των νεφρών και η συσσώρευση εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας στα σπειράματα είχαν όλα βελτιωθεί απουσία βελτίωσης της υπέρτασης ή της υπεργλυκαιμίας. Ωστόσο, αυτά τα ευρήματα έρχονται σε πλήρη αντίθεση με τα δεδομένα από γονιδιακά στοχευμένα ποντίκια με ιδιοσυστατικά ενεργό GSK3 που ανέπτυξαν αυθόρμητη λευκωματουρία και τραυματισμό των ποδοκυττάρων. της GSK3b. Αν και το BIO έχει επανειλημμένα επιβεβαιωθεί ότι είναι ένας εξαιρετικά εκλεκτικός μικρομοριακός αναστολέας της GSK3b, το νιτροπρωσσικό νάτριο δεν είναι ειδικός ενεργοποιητής του GSK3b αλλά είναι γνωστό ότι έχει ισχυρό αιμοδυναμικό αποτέλεσμα,50 το οποίο είναι πιθανό να συγχέει τη μείωση της λευκωματουρίας και την νενοπροστατευτική δράση του διαβητικά ποντίκια. Συνολικά, παρά ορισμένα αντικρουόμενα δεδομένα, τα επικρατέστερα στοιχεία τείνουν να υποστηρίζουν ότι το GSK3b πιθανότατα σχετίζεται μενεφρόβλάβηκαι πρωτεϊνουρία στο DN. Πρέπει να αναφερθούν ορισμένοι περιορισμοί της παρούσας μελέτης. Πρώτον, τα προκλινικά δεδομένα περιορίστηκαν μόνο στα μοντέλα ποντικού DB/DB. Για να προσδιοριστεί η γενίκευση του ρόλου του GSK3b στοδιαβητικό νεφρικό τραυματισμό, είναι απαραίτητο να επικυρωθούν τα ευρήματα σε άλλα μοντέλα DN, συμπεριλαμβανομένων των μοντέλων DN τύπου 1. Δεύτερον, οι κλινικές παρατηρήσεις εδώ προήλθαν από αναδρομικές κοόρτες διαβητικών ασθενών με περιορισμένο μέγεθος δείγματος και σχετικά σύντομο χρόνο παρακολούθησης. Ομολογουμένως, απαιτούνται μεγάλης κλίμακας, προοπτικές, τυχαιοποιημένες, πολυκεντρικές μελέτες για να επαληθεύσουμε τις παρατηρήσεις μας και να επιβεβαιώσουμε τη δύναμη της GSK3b σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων στην πρόβλεψη της έκβασης της DKD.

Η GSK3b, μια εξαιρετικά διατηρημένη, ευαίσθητη σε οξειδοαναγωγή κινάση σερίνης/θρεονίνης-πρωτεΐνης, εμπλέκεται κεντρικά στη σηματοδότηση της ινσουλίνης καθώς και σε μια σειρά από άλλες κυτταρικές οδούς σήματος που είναι ζωτικής σημασίας για παθοφυσιολογικές διεργασίες που σχετίζονται μενεφρόβλάβη, επισκευή και αναγέννηση. Σε ευαίσθητους στην ινσουλίνη ιστούς, όπως το ήπαρ και οι σκελετικοί μύες, η GSK3b είναι ενεργή υπό βασικές συνθήκες και καταστέλλει τη δραστηριότητα της συνθάσης του γλυκογόνου.19,28 Η ινσουλίνη απενεργοποιεί γρήγορα τη GSK3b μέσω ανασταλτικής φωσφορυλίωσης στη σερίνη 9, με αποτέλεσμα τη βιοσύνθεση γλυκογόνου. Ένας αυξανόμενος όγκος στοιχείων υποδηλώνει ότι η απορρύθμιση του GSK3b σχετίζεται με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2.19,29-31 Πράγματι, υπάρχουν δεδομένα που υποδεικνύουν υπερέκφραση και υπερκινητικότητα της GSK3b στους μύες των διαβητικών ασθενών31-33 και στους λιπώδεις ιστούς παχύσαρκων διαβητικών ποντικών.34 Επιπλέον , η διαγονιδιακή υπερέκφραση της GSK3b στους σκελετικούς μύες ποντικών προκαλεί μειωμένη ανοχή στη γλυκόζη, αντίσταση στην ινσουλίνη και υπερινσουλιναιμία. μιμούνται την ινσουλίνη

δράση σε κυτταρικές σειρές και ιστούς.37 Επιπλέον, σε παχύσαρκα διαβητικά ποντίκια, οι αναστολείς GSK3 βελτίωσαν την ευαισθησία στην ινσουλίνη και την ομοιόσταση της γλυκόζης.38 Ο νεφρός παραδοσιακά δεν θεωρείται ως όργανο-στόχος της δράσης της ινσουλίνης. Ωστόσο, επιτακτικά στοιχεία υποδεικνύουν πρόσφατα ότι η σηματοδότηση της ινσουλίνης στα νεφρικά κύτταρα, ιδιαίτερα στα ποδοκύτταρα, παίζει βασικό ρόλο στη διατήρηση της σπειραματικής και νεφρικής ομοιόστασης.39-41 Η ελαττωματική σηματοδότηση ινσουλίνης στα ποδοκύτταρα, λόγω ανεπάρκειας ή αντίστασης στην ινσουλίνη, είναι πιθανός βασικός εκκινητής για πολλές από τις παθολογικές βλάβες που παρατηρούνται στο DN. Επιπλέον, κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι η αντίσταση στην ινσουλίνη συσχετίζεται με την εμφάνιση και τη σοβαρότητα της λευκωματουρίας ακόμη και σε ασθενείς με φυσιολογική πίεση που δεν έχουν διαβήτη, υποδηλώνοντας ότι η αντίσταση στην ινσουλίνη αυτή καθεαυτή μπορεί να προκαλέσει λευκωματουρία. υπό όρους νοκ άουτ του υποδοχέα ινσουλίνης στα σπειραματικά ποδοκύτταρα, ανέπτυξε λευκωματουρία και σπειραματικές αλλοιώσεις που ανακεφαλαιώνουν το DN, παρά την απουσία υπεργλυκαιμίας ή διαβήτη.41 Αντίθετα, σε διαβητικά ζώα, οι ευαισθητοποιητές ινσουλίνης είναι ικανοί να επιβραδύνουν την εξέλιξη του DN ανεξάρτητα από τον γλυκαιμικό έλεγχο.43 Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η σηματοδότηση της ινσουλίνης ρυθμίζει τη λειτουργία των ποδοκυττάρων ανεξάρτητα από τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα. Ωστόσο, ως ο βασικός μετατροπέας του μονοπατιού σηματοδότησης της ινσουλίνης, ο ρόλος της GSK3b στην παθογένεση και την εξέλιξη της DN δεν έχει μελετηθεί σε μεγάλο βαθμό.

Στο νεφρό, η GSK3b εκφράζεται κυρίως σε ποδοκύτταρα και, σε μικρότερο βαθμό, σε μεσαγγειακά και ενδοθηλιακά κύτταρα στο σπειράμα20,21 και εκφράζεται εκτενώς από νεφρικά σωληναριακά κύτταρα. Υπάρχουν δεδομένα από τις ομάδες μας και από άλλες ομάδες που υποδεικνύουν ότι η GSK3b μεσολαβεί στον αυτόνομο τραυματισμό των ποδοκυττάρων ενσωματώνοντας πολλαπλές παθητικές οδούς σηματοδότησης των ποδοκυττάρων. διάφορες μη διαβητικές σπειραματοπάθειες.21 Επιπλέον, σε προοδευτική χρόνιανεφρόνόσος, το GSK3b βρέθηκε ότι είναι ρυθμιστής νεφρικής σωληναριακής και διάμεσης βλάβης. Ωστόσο, το εάν και πώς εμπλέκεται η GSK3b στο DN ήταν αβέβαιο και έντονα αμφιλεγόμενο, παρόλο που η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η ενισχυμένη ενεργοποίηση της GSK3b στον νεφρό και στα απολεπισμένα κύτταρα του ουροποιητικού μπορεί να σχετίζεται με την ανάπτυξη ή την εξέλιξη της DKD. Για παράδειγμα, σε αρουραίους με διαβήτη που προκαλείται από στρεπτοζοτοκίνη, οι Lin et al.46 διαπίστωσαν ότι η αναστολή της GSK3b από τον ανταγωνιστικό αναστολέα τριφωσφορικής αδενοσίνης (20 Z,30 E)-6- Bromo στην ινδιρουβίνη-30 -οξίμη ( ΒΙΟ) εξασθενημένη πρωτεϊνουρία και βελτιωμένες σπειραματικές αλλοιώσεις του DN απουσία διόρθωσης της υπεργλυκαιμίας, υποδηλώνοντας ότι η GSK3b παίζει επιζήμιο ρόλο στη DN. Επίσης, σε αρουραίους με διαβήτη που προκαλείται από στρεπτοζοτοκίνη, οι Paeng et al.22 έκαναν παρόμοια ευρήματα χρησιμοποιώντας BIO και συμπέραναν ότι η ενισχυμένη δραστηριότητα GSK3b εντός των ποδοκυττάρων υπό διαβητικές συνθήκες σχετίζεται με την απόπτωση των ποδοκυττάρων και την απώλεια στο DN. Αυτό είναι σύμφωνο με μια άλλη in vitro μελέτη, όπου η GSK3b βρέθηκε ότι μεσολαβεί στην αποδιαφοροποίηση και τον τραυματισμό των ποδοκυττάρων μετά από έκθεση σε μέσο υψηλής γλυκόζης.47 Αντίθετα, οι Mariappan et al.48 υποστήριξαν ότι η ενεργοποίηση του GSK3b αντ' αυτού βελτιώνει τον διαβήτη που προκαλείταινεφρόβλάβη. Στη μελέτη τους, διαβητικά ποντίκια που προκλήθηκαν από στρεπτοζοτοκίνη υποβλήθηκαν σε θεραπεία με νιτροπρωσσικό νάτριο, έναν δότη νιτρικού οξειδίου που είναι σε θέση να ενεργοποιήσει το GSK3b. Διαπίστωσαν ότι η λευκωματουρία, η υπερτροφία των νεφρών και η συσσώρευση εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας στα σπειράματα είχαν όλα βελτιωθεί απουσία βελτίωσης της υπέρτασης ή της υπεργλυκαιμίας. Ωστόσο, αυτά τα ευρήματα έρχονται σε πλήρη αντίθεση με τα δεδομένα από γονιδιακά στοχευμένα ποντίκια με ιδιοσυστατικά ενεργό GSK3 που ανέπτυξαν αυθόρμητη λευκωματουρία και τραυματισμό των ποδοκυττάρων. της GSK3b. Αν και το BIO έχει επανειλημμένα επιβεβαιωθεί ότι είναι ένας εξαιρετικά εκλεκτικός μικρομοριακός αναστολέας της GSK3b, το νιτροπρωσσικό νάτριο δεν είναι ειδικός ενεργοποιητής του GSK3b αλλά είναι γνωστό ότι έχει ισχυρό αιμοδυναμικό αποτέλεσμα,50 το οποίο είναι πιθανό να συγχέει τη μείωση της λευκωματουρίας και την νενοπροστατευτική δράση του διαβητικά ποντίκια. Συνολικά, παρά ορισμένα αντικρουόμενα δεδομένα, τα επικρατέστερα στοιχεία τείνουν να υποστηρίζουν ότι το GSK3b πιθανότατα σχετίζεται μενεφρόβλάβηκαι πρωτεϊνουρία στο DN. Μερικοί περιορισμοί του

πρέπει να αναφερθεί η παρούσα μελέτη. Πρώτον, τα προκλινικά δεδομένα περιορίστηκαν μόνο στα μοντέλα ποντικού dB/dB. Για να προσδιοριστεί η γενίκευση του ρόλου του GSK3b στοδιαβητικό νεφρικό τραυματισμό, είναι απαραίτητο να επικυρωθούν τα ευρήματα σε άλλα μοντέλα DN, συμπεριλαμβανομένων των μοντέλων DN τύπου 1. Δεύτερον, οι κλινικές παρατηρήσεις εδώ προήλθαν από αναδρομικές κοόρτες διαβητικών ασθενών με περιορισμένο μέγεθος δείγματος και σχετικά σύντομο χρόνο παρακολούθησης. Ομολογουμένως, απαιτούνται μεγάλης κλίμακας, προοπτικές, τυχαιοποιημένες, πολυκεντρικές μελέτες για να επαληθεύσουμε τις παρατηρήσεις μας και να επιβεβαιώσουμε τη δύναμη της GSK3b σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων στην πρόβλεψη της έκβασης της DKD.

Συνοπτικά, οι μελέτες μας έδειξαν ότι η νεφρική έκφραση και η δραστηριότητα της GSK3b ενισχύονται σε πειραματικά και κλινικά DN. Η δραστηριότητα της GSK3b σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων μπορεί να χρησιμεύσει ως νέος βιοδείκτης για την πρόβλεψη της εξέλιξης του DN. Τα δεδομένα μας μπορεί να ανοίξουν το δρόμο για μια μεγάλης κλίμακας, σε βάθος εξέταση της τιμής που η GSK3b σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων μπορεί να χρησιμεύσει ως προγνωστικός βιοδείκτης της DN.

ΜΕΘΟΔΟΙ

Μελέτες σε ζώα

Οι μελέτες σε ζώα εγκρίθηκαν από την Ιδρυματική Φροντίδα Ζώων και την Επιτροπή και συμμορφώνονται με τους κανονισμούς του Υπουργείου Γεωργίας των ΗΠΑ και τον Οδηγό του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας για την ανθρώπινη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων. Αρσενικά ποντίκια DB/DB και γέννα ελέγχου db/m ηλικίας 6 εβδομάδων αγοράστηκαν από το NanjingUniversity Model Animal Research Center (Nanjing, Κίνα) και στεγάστηκαν στην Κεντρική Εγκατάσταση Ζώων του Πανεπιστημίου Zhengzhou. Όλα τα ποντίκια τράφηκαν κατά βούληση, και 8 έως 10 ποντίκια θανατώθηκαν σε υποδεικνυόμενες ηλικίες. Δείγματα ούρων και αίματος λήφθηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Μετά τη θανάτωση, τα νεφρά συλλέχθηκαν για περαιτέρω εξέταση. Τα επίπεδα λευκωματίνης στα ούρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ποσοτικοποίησης ανοσοπροσροφητικού προσδιορισμού συνδεδεμένου με ένζυμο λευκωματίνης ποντικού (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Τα επίπεδα κρεατινίνης ούρων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας κρεατινίνης (BioAssay Systems, Hayward, CA).

Κυτταρικής καλλιέργειας

Υπό όρους απαθανατισμένα ποδοκύτταρα ποντικού μεταξύ των διελεύσεων 21 και 25 καλλιεργήθηκαν σε μέσο Roswell Park Memorial Institute 1640 συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό υπό επιτρεπτές συνθήκες όπως περιγράφηκε προηγουμένως.22 Υποκαλλιέργειες των ποδοκυττάρων υποβλήθηκαν σε μη επιτρεπτές συνθήκες για να προκληθεί διαφοροποίηση για 14 στη συνέχεια εκτέθηκε σε ένα κανονικό περιβάλλον/μέσο καλλιέργειας που περιείχε 5 mM γλυκόζη, ένα διαβητικό περιβάλλον που αποτελείται από γλυκόζη (25 mM) και μετασχηματιστικό αυξητικό παράγοντα b1 (2 ng/ml), ή ένα μέσο ελέγχου υψηλής ωσμωτικότητας που περιέχει 20 mM μαννιτόλη για 48 ώρες. Τα εγγύς σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα ποντικού και τα σπειραματικά μεσαγγειακά κύτταρα ποντικού διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle/F12 από Dulbecco συμπληρωμένο με 5 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε 70 τοις εκατό συμβολή στο μέσο που περιείχε 5 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε λιμοκτονία ορού για άλλες 24 ώρες ακολουθούμενη από έκθεση σε ένα κανονικό περιβάλλον/μέσο καλλιέργειας που περιείχε 5 mM γλυκόζη, ένα διαβητικό περιβάλλον που αποτελείται από υψηλή γλυκόζη (25 mM) και αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού b1 (2 ng/ml), ή ένα μέσο ελέγχου υψηλής ωσμωτικότητας που περιέχει 5 mM γλυκόζη και 20 mM μαννιτόλη για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με αποκλεισμό μπλε Trypan. Σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν ή συλλέχθηκαν προϊόντα λύσης κυττάρων για περαιτέρω διερεύνηση.

Παροδική επιμόλυνση φορέων

Οι φορείς που κωδικοποιούν τον κενό φορέα ή τον ιδιοσυστατικά ενεργό (S9A) μετάλλαγμα (S9A-GSK3b-HA/pcDNA3) του GSK3b με επισήμανση αιμοσυγκολλητίνης (HA) και διαμολύνθηκαν σε καλλιεργημένα ποδοκύτταρα, μεσαγγειακά κύτταρα και σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως.44 Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης επαληθεύτηκε με χρώση ανοσοφθορισμού ή ανοσοκηλίδωση για ΗΑ στις 12 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και προετοιμάστηκαν για ανάλυση στυπώματος Western ή άλλες δοκιμασίες.

RNAi

Μια δεξαμενή 3 ποντικών, μικρών, παρεμβαλλόμενων διπλών RNA παρεμβαλλόμενων για το GSK3b—50-CUUGUCCUGUAGAACUUUCtt-30, 50-AUGAUCCAUUUCCAAUCACtt-30 και {{7}AUACCGCAGUCG{8}AUG}tt —σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν σύμφωνα με την πλήρη κωδικοποιητική αλληλουχία του γονιδίου GSK3b ποντικού (GenBank accession no.BC060743.1). Επιπλέον, μια αναμεμειγμένη μικρή, παρεμβαλλόμενη αλληλουχία RNA (50-GCGAGUAGCGCUAGGAAGUtt-30) χωρίς ομοιότητα αλληλουχίας με οποιαδήποτε γνωστή γονιδιακή αλληλουχία από ποντικούς, αρουραίους ή ανθρώπους χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για RNAi. Η αποτελεσματικότητα της γονιδιακής σίγησης που προκαλείται από λιποφεκταμίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA) αξιολογήθηκε με ανάλυση ανοσοστύπωσης για το GSK3b. Ικανοποιητική καταστολή της έκφρασης της πρωτεΐνης GSK3b παρατηρήθηκε σε καλλιεργημένα ποδοκύτταρα, μεσαγγειακά κύτταρα και σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα 24 ώρες μετά το RNAi. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ένα κανονικό περιβάλλον/μέσο καλλιέργειας, ένα διαβητικό περιβάλλον ή ένα μέσο ελέγχου υψηλής ωσμωτικότητας για 48 ώρες όπως αναφέρθηκε παραπάνω πριν τα κύτταρα υποβληθούν σε επεξεργασία για περαιτέρω προσδιορισμούς.

Κλινικές μελέτες

Το κλινικό μέρος αυτής της μελέτης συμμορφώθηκε με τις δεοντολογικές κατευθυντήριες γραμμές της Διακήρυξης του Ελσίνκι του 1975 και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικής Αναθεώρησης του Πρώτου Συνεργαζόμενου Νοσοκομείου του Πανεπιστημίου Zhengzhou. Οι συμμετέχοντες στην ανθρώπινη έρευνα δεν στρατολογήθηκαν ειδικά για αυτήν τη μελέτη. Όλα τα κλινικά δεδομένα συλλέχθηκαν με αναδρομική ανασκόπηση του διαγράμματος και με εξέταση αρχειοθετημένων τομών ιστού ή δειγμάτων ούρων σε τράπεζα. Υπερβολικά ή απορριπτόμενα δείγματα βιοψίας νεφρού, καθώς και δείγματα κλασματοποιημένων ούρων, φυλάσσονται τακτικά στο Ινστιτούτο Νεφρολογίας του Πρώτου Συνεργαζόμενου Νοσοκομείου του Πανεπιστημίου Zhengzhou. Αρχειοθετημένοι μη ταυτοποιημένοι ιστοί βιοψίας νεφρού ενσωματωμένοι σε παραφίνη από ασθενείς σε διάφορα στάδια DN επιλέχθηκαν τυχαία για εξέταση. Επιπρόσθετα δείγματα νεφρού χωρίς ιστομορφολογικές αλλοιώσεις ελήφθησαν από νεφρούς που απορρίφθηκαν για μεταμόσχευση λόγω αγγειακών ανωμαλιών ή από ιστούς βιοψίας προεμφυτευτικής βιοψίας και χρησίμευσαν ως φυσιολογικοί έλεγχοι. Για την αναδρομική μελέτη κοόρτης, συνολικά 127 ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2, οι οποίοι παρακολουθούνταν από το 2010 με συσσωρευμένα δείγματα κλασματοποιημένων ούρων, εξετάστηκαν αναδρομικά για συμπερίληψη σε αυτή τη μελέτη. Οι ασθενείς που μελετήθηκαν ήταν ηλικίας μεταξύ 29 και 80 ετών και διαγνώστηκαν με διαβήτη τύπου 2 σύμφωνα με τα κριτήρια της Αμερικανικής Ένωσης Διαβήτη. Τα κριτήρια αποκλεισμού περιελάμβαναν απώλεια παρακολούθησης, ανεπαρκείς πληροφορίες,νεφρόδυσλειτουργία, or overt proteinuria at baseline, or other superimposed kidney diseases such as acute kidney injury or glomerulopathies. Finally, 60 patients have enrolled in this study for further assessment. All patients had been followed up for >5 χρόνια. Κατά τη συνήθη παρακολούθηση, τεκμηριώθηκαν δημογραφικά δεδομένα, καθώς και κλινικές παράμετροι, όπως φύλο, ηλικία, συννοσηρότητες, φάρμακα, διάρκεια διαβήτη, αρτηριακή πίεση, γλυκαιμικό επίπεδο, επίπεδο κρεατινίνης ορού, δεδομένα ανάλυσης ούρων, ΗΑΕ και eGFR. Το κλινικό αποτέλεσμα μετά από παρακολούθηση 5 ετών ήταν η παρουσία ή η απουσία της προόδου της νεφρικής δυσλειτουργίας, η οποία ορίστηκε είτε ως μείωση κατά 25 τοις εκατό στο eGFR είτε ως εξέλιξη της λευκωματουρίας, όπως υποδεικνύεται από την κλιμάκωση της σοβαρότητας της λευκωματουρίας σε διάφορα κλινικά στάδια DN, δηλαδή, φυσιολογική αλβουμινουρία, μικρολευκωματινουρία, μακρολευκωματινουρία ή έκδηλη πρωτεϊνουρία. Όλοι οι ασθενείς παρείχαν γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση.

Αξιολόγηση μορφολογίας νεφρού και ανοσοϊστοχημεία

Μπλοκ ιστού νεφρού ποντικού με ενσωματωμένη φορμαλίνη ενσωματωμένα σε παραφίνη κόπηκαν σε τμήματα 3-mm. Για τη γενική ιστολογία, οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για χρώση με περιοδικό οξύ-Schiff. Η ανοσοϊστοχημική χρώση για τα GSK3b και p-GSK3b πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ VECTASTAIN ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως.20 Ως αρνητικός έλεγχος, το πρωτογενές αντίσωμα αντικαταστάθηκε από μη ανοσοποιητικό ορό από το ίδιο είδος. δεν εμφανίστηκε χρώση. Τα μορφολογικά χαρακτηριστικά όλων των τομών αξιολογήθηκαν από έναν μόνο παρατηρητή με τυφλό τρόπο με τη βοήθεια νεφροπαθολόγου.

Ανοσοφθορισμού χρώση

Καλλιεργημένα κύτταρα ή κατεψυγμένες τομές κρυοστάτη σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με πρωτογενή αντισώματα και ακολούθησε εφαρμογή των δευτερογενών αντισωμάτων συζευγμένων με Alexa Fluor (Invitrogen). Ως αρνητικός έλεγχος, τα πρωτογενή αντισώματα αντικαταστάθηκαν από προάνοση IgG από το ίδιο είδος. δεν εμφανίστηκε χρώση. Τέλος, οι τομές αντιχρωματίστηκαν με 40,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη ή ιωδιούχο προπίδιο και στερεώθηκαν με μέσο στήριξης VECTASHIELD (Vector Laboratories). Για τη μικροσκοπία φθορισμού FL, όλες οι τομές αναλύθηκαν ταυτόχρονα για να αποκλειστούν τεχνουργήματα λόγω μεταβλητής αποσύνθεσης του φθορισμού. Οι τομές εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού Olympus FL εξοπλισμένο με ψηφιακή κάμερα Spot II (Olympus, Τόκιο, Ιαπωνία). Για χρώση διπλού χρώματος, οι εικόνες αποκτήθηκαν διαδοχικά για να αποφευχθεί η παρεμβολή της βαφής. Το λογισμικό ImageJ (Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, Bethesda, MD) χρησιμοποιήθηκε για την μετεπεξεργασία των εικόνων, για παράδειγμα, κλιμάκωση, συγχώνευση και ανάλυση εντοπισμού.

Μηχανογραφημένη μορφομετρία

Εικόνες χρώσης ανοσοϊστοχημείας καταγράφηκαν και ψηφιοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρονικό σύστημα ανάλυσης εικόνας που αποτελείται από μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή συσκευής υψηλής ανάλυσης συνδεδεμένη με φορτίο συνδεδεμένη σε μικροσκόπιο (Olympus BX41, Olympus) και σε υπολογιστή. Οι εικόνες εμφανίστηκαν σε ανάλυση pixel 1024 768 pixel (χωρική ανάλυση, 0,24 mm/pixel). Για εικόνες ανοσοϊστοχημείας χρώσης ιστών ανθρώπινου νεφρού, χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό ImageJ για την κατάτμηση εικόνας, τη δημιουργία κατωφλίου και τις μετρήσεις της έντασης του σήματος. Έγιναν χειροκίνητες διορθώσεις όπως απαιτείται. Συνολικά, 10 σπειράματα ή 10 τυχαία σωληναρισιακά πεδία λήφθηκαν για μορφομετρική ανάλυση και τα τελικά δεδομένα εκφράστηκαν ως η τιμή της ενσωματωμένης πυκνότητας εικονοστοιχείων σε σχέση με την ομάδα ελέγχου.

Ανάλυση ανοσοστύπωσης Western

Τα καλλιεργημένα κύτταρα υπέστησαν λύση.νεφρόιστούςή απομονωμένα νεφρικά σπειράματα ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό προσδιορισμού ραδιοανοσοκαθίζησης συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης και τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση ανοσοστύπωσης. Για την ανάλυση ανοσοστύπωσης του περιορισμένου αριθμού απολεπισμένων κυττάρων στα ούρα, το πρωτόκολλο του στυπώματος Western τροποποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως χρησιμοποιώντας τα υψηλής απόδοσης NuPAGE Bis-Tris Gels (Invitrogen) και μεμβράνες μεταφοράς υψηλής ποιότητας. ανιχνεύουν μέτρια εκφρασμένες πρωτεΐνες σε μόλις 1000 κύτταρα. Τα αντισώματα κατά της GSK3b, της φιμπρονεκτίνης, του κολλαγόνου IV, της ακτίνης και της αφυδρογονάσης της φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Αυτά κατά της συναπτοποδίνης αγοράστηκαν από την PROGEN Biotechnik GmbH (Χαϊδελβέργη, Γερμανία). και αυτά κατά των ZO-1 και p-GSK3b αποκτήθηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Στατιστική ανάλυση

All in vitro studies were repeated 3 to 6 times. For immunoblot analysis, bands were scanned and the integrated pixel density was determined using a densitometer and the ImageJ analysis program, version 1.48 (National Institutes of Health). Data were expressed as mean -SD or median (interquartile range). All included patients had baseline data. Patients with missing data or lost to follow-up were excluded from this study. Continuous variables were analyzed as appropriate by using the t-test, Mann-Whitney U test, or 1-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Student-NewmanKeuls test if there were 3 comparisons or by the Scheffé test if there were >3 συγκρίσεις. Τα κατηγορικά δεδομένα συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων χρησιμοποιώντας το τεστ chi-square. Εφαρμόστηκε ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης για να εξεταστούν πιθανές σχέσεις μεταξύ 2 παραμέτρων. Πραγματοποιήθηκαν μονομεταβλητές αναλογικές αναλύσεις παλινδρόμησης αναλογικών κινδύνων Cox για την αξιολόγηση των συσχετίσεων μεταξύ των σχετικών μεταβλητών και του κινδύνου εξέλιξης της νεφρικής δυσλειτουργίας, ακολουθούμενες από πολυμεταβλητές αναλύσεις σε σχέση με πιθανούς συγχυτές. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση καμπύλης ROC και μετρήθηκαν οι περιοχές κάτω από τις καμπύλες ROC για να αναλυθεί η ισχύς ορισμένων μεταβλητών στην πρόβλεψη της εξέλιξης της νεφρικής δυσλειτουργίας σε διαβητικούς ασθενείς. Οι μη κανονικά κατανεμημένες μεταβλητές, όπως τα ΗΑΕ, μετασχηματίστηκαν με λογάριθμο για να επιτευχθεί κανονικότητα για τις αναλύσεις παλινδρόμησης κινδύνων αναλογίας Cox αναλύσεις καμπύλης ROC. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας PSS έκδοση 22 (IBM Corporation, Armonk, NY). Τιμές P<0.05 in2-tailed="" tests="" were="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

ΑΠΟΚΑΛΥΨΗ

Όλοι οι συγγραφείς δεν δήλωσαν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Μέρος αυτής της μελέτης παρουσιάστηκε ως προφορική παρουσίαση στο KidneyWeek 2016: American Society of Nephrology Annual Meeting, 15–20 Νοεμβρίου 2016, Σικάγο, IL. Η RG υποστηρίχθηκε εν μέρει από το ίδρυμα για την υγεία. Η XL υποστηρίχθηκε από μια ερευνητική υποτροφία για να λάβει εξωσχολική εκπαίδευση. Η ZL υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας, επιχορηγήσεις U1604284, 81770672 και 81873612. Οι χρηματοδότες δεν είχαν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό και τη διεξαγωγή αυτής της μελέτης, τη συλλογή και την ερμηνεία των δεδομένων ή την προετοιμασία και την έγκριση του χειρογράφου.

ΣΥΝΕΙΣΦΟΡΕΣ ΣΥΓΓΡΑΦΕΩΝ

Ο RG επινόησε τις εννοιολογικές ιδέες. Τα XL, ZL και RG συνέβαλαν στο σχεδιασμό της μελέτης. Οι XL, PW, BC, YG, AYG και BF πραγματοποίησαν τα πειράματα κυτταροκαλλιέργειας. Οι XL και ZL πραγματοποίησαν τα πειράματα σε ζώα και συνέλεξαν τα δεδομένα από διαβητικούς ασθενείς. XL, LJW, DKM, LDD, ZL, και συνέβαλαν στη συζήτηση και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. πρωτοστάτησε στη συγγραφή του χειρογράφου. Οι XL, BC και BF συνέβαλαν στην επεξεργασία χειρογράφων. Όλοι οι συγγραφείς συμφώνησαν ότι ολόκληρη η ιδέα και η ιδιοκτησία αυτού του έργου ανήκουν στην RG. Όλοι οι συγγραφείς ενέκριναν το τελικό χειρόγραφο.

ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ

Συμπληρωματικές Μέθοδοι.

Πίνακας S1. Χαρακτηριστικά ατόμων ελέγχου και ασθενών με διαβητική νεφροπάθεια, στρωματοποιημένα σύμφωνα με ιστολογικές κατηγορίες διαβητικής νεφροπάθειας. Πίνακας S2. Βασικά δημογραφικά, κλινικά και εργαστηριακά δεδομένα της αναδρομικής κοόρτης διαβητικών ασθενών πρώιμου σταδίου χωρίς σημεία DKD. Πίνακας S3. Δημογραφικά, κλινικά και εργαστηριακά δεδομένα ασθενών με διαβήτη τύπου 2 πρώιμου σταδίου, στρωματοποιημένα ανάλογα με τα νεφρικά τους αποτελέσματα μετά από 5 χρόνια παρακολούθησης. Εικόνα S1. Η ενισχυμένη νεφρική δραστηριότητα του GSK3b προβλέπει την ανάπτυξη και τη σοβαρότητα τουδιαβητικόςνεφρόνόσοςσε ποντίκια db/db. Τα αρσενικά ποντίκια db/db και db/m παρακολουθήθηκαν μεταξύ 4 και 13 εβδομάδων. (Α) Ελήφθη δείγμα αίματος από ποντίκια που δεν είχαν νηστέψει σε ηλικία 4 και 7 εβδομάδων και προσδιορίστηκαν τα επίπεδα γλυκόζης στο πλάσμα. *P < 0.001="" έναντι="" ποντικών="" db/m="" σε="" ηλικία="" 7="" εβδομάδων.="" ν="" ¼="" 15–18.="" (β)="" λήφθηκαν="" δείγματα="" ούρων="" κηλίδων="" σε="" ηλικία="" 4,="" 7,="" 10="" και="" 13="" εβδομάδων="" και="" υποβλήθηκαν="" σε="" δοκιμασία="" λευκωματίνης="" ούρων="" και="" κρεατινίνης="" ούρων="" για="" τον="" προσδιορισμό="" των="" αναλογιών="" λευκωματίνης="" ούρων="" προς="" κρεατινίνη="" (uacrs).="" *p=""><0,001 έναντι="" db/m="" ποντικών="" σε="" ηλικία="" 10="" εβδομάδων="" (n="" ¼="" 15–18).="" #p=""><0,001 έναντι="" ποντικών="" db/m="" σε="" ηλικία="" 13="" εβδομάδων.="" ν="" ¼="" 15–18.="" (γ)="" όλα="" τα="" ποντίκια="" έλαβαν="" ανοικτή="" βιοψία="" νεφρού="" σε="" ηλικία="" 7="" εβδομάδων="" και="" τα="" δείγματα="" βιοψίας="" υποβλήθηκαν="" σε="" επεξεργασία="" για="" ανάλυση="" ανοσοστύπωσης="" για="" p-gsk3b,="" gsk3b="" και="" gapdh.="" (δ)="" τα="" ανοσοστυπώματα="" υποβλήθηκαν="" σε="" πυκνομετρική="" ανάλυση.="" η="" σχετική="" αφθονία="" των="" gsk3b="" και="" p-gsk3b="" προσδιορίστηκε="" ως="" πυκνομετρικοί="" λόγοι="" του="" αντίστοιχου="" μορίου/gapdh="" ως="" πολλαπλές="" αλλαγές="" σε="" σύγκριση="" με="" ποντίκια="" ελέγχου="" db/m.="" η="" σχετική="" δραστικότητα="" του="" gsk3b="" υπολογίστηκε="" ως="" αναλογίες="" p="" gsk3b="" προς="" gsk3b="" ως="" πτυχές="" ποντικών="" ελέγχου="" db/m.="" (ε)="" η="" ανάλυση="" γραμμικής="" παλινδρόμησης="" έδειξε="" μια="" στατιστικά="" σημαντική="" θετική="" συσχέτιση="" μεταξύ="" της="" νεφρικής="" δραστηριότητας="" gsk3b="" στην="" ηλικία="" των="" 7="" εβδομάδων="" σε="" ποντικούς="" db/db="" και="" της="" ανάπτυξης="" και="" της="" σοβαρότητας="" της="" λευκωματουρίας,="" χαρακτηριστικό="" γνώρισμα="">διαβητικόςνεφρόνόσοςσε ηλικία 13 εβδομάδων. R ¼ 0.699; P ¼ 0.0{{20}}1. (ΣΤ) Η ανάλυση χαρακτηριστικής καμπύλης λειτουργίας δέκτη έδειξε ότι η νεφρική δραστηριότητα GSK3b στα πρώιμα στάδια του διαβήτη (ηλικίας 7 εβδομάδων) παρέχει εξαιρετική ακρίβεια και δύναμη στην πρόβλεψη της ανάπτυξης λευκωματουρίας και DKD στην ηλικία των 13 εβδομάδων σε ποντικούς db/db. Εικόνα S2. Η αντίσταση στην ινσουλίνη και η υψηλή περιβαλλοντική γλυκόζη ενεργοποιούν συνεργιστικά το GSK3b στα νεφρικά κύτταρα. (Α) Καλλιεργημένα ποδοκύτταρα ποντικού, (Β) σπειραματικά μεσαγγειακά κύτταρα ούρων (MMCs) και (C) νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα (TECs) επιμολύνθηκαν με κρυπτογραφημένα ολιγονουκλεοτίδια siRNA (siCon) ή ολιγονουκλεοτίδια siRNA (siIRb) ειδικά για την ισόμορφη β τον υποδοχέα ινσουλίνης (IRB) για τη μοντελοποίηση της κατάστασης της αντίστασης στην ινσουλίνη in vitro. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτέθηκαν για 48 ώρες στο φυσιολογικό περιβάλλον που περιέχει γλυκόζη (NG) ή στο διαβητικό περιβάλλον με υψηλή περιεκτικότητα σε γλυκόζη (HG). Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοστυπώματος για IRB, p-GSK3b, GSK3b και GAPDH που ακολουθήθηκε από πυκνομετρική ανάλυση των κηλίδων. *P < 0,01="" έναντι="" έκφρασης="" irb="" σε="" κύτταρα="" που="" έχουν="" υποστεί="" αγωγή="" με="" sicon="" που="" εκτίθενται="" στο="" ίδιο="" περιβάλλον="" (n="" ¼="" 3),="" #p="">< 0,05="" έναντι="" της="" ίδιας="" έκφρασης="" πρωτεΐνης="" στην="" ομάδα="" siirb="" þ="" ng="" ή="" sicon="" þ="" hg="" (n="" ¼="" 3),="" &p="">< 0,05="" έναντι="" της="" ίδιας="" έκφρασης="" πρωτεΐνης="" στη="" δεύτερη="" ομάδα="" þ="" hg="" ή="" siirb="" þ="" ng="" (n="" ¼="" 3).="" εικόνα="" s3.="" επίπεδα="" έκφρασης="" του="" gsk3b="" mrna="" σε="" δείγματα="" ανθρώπινου="" νεφρού="" που="" προέρχονται="" από="" υγιείς="" ζωντανούς="" δότες="" και="" ασθενείς="" με="" διαβητική="" νεφροπάθεια.="" τα="" δεδομένα="" προήλθαν="" από="" το="" www.nephroseq.org="" με="" βάση="" το="" σύνολο="" δεδομένων="" ju="" ckd="" glom51="" και="" εκφράστηκαν="" ως="" log2="" μέσης-κεντρική="" ένταση.="" εικόνα="" s4.="" η="" ενισχυμένη="" δραστηριότητα="" του="" gsk3b="" σε="" απολεπισμένα="" κύτταρα="" ούρων="" που="" συλλέγονται="" από="" διαβητικούς="" ασθενείς="" πρώιμου="" σταδίου="" προβλέπει="" την="" ανάπτυξη="" διαβητικής="" νεφρικής="" νόσου.="" (α,="" β)="" ανίχνευση="" gsk3b="" και="" ενεργοποιημένης="" gsk3b="" σε="" απολεπισμένα="" κύτταρα="" ούρων="" που="" συλλέχθηκαν="" από="" διαβητικούς="" ασθενείς="" πρώιμου="" σταδίου="" (pts)="" και="" υγιείς="" μάρτυρες="" (ctrls).="" τα="" απολεπισμένα="" ούρα="" κύτταρα="" συλλέχθηκαν="" και="" υποβλήθηκαν="" σε="" λύση.="" τα="" κυτταρολύματα="" υποβλήθηκαν="" σε="" επεξεργασία="" για="" ανάλυση="" ανοσοστύπωσης="" για="" gsk3b,="" p-gsk3b="" και="" gapdh.="" (γ)="" τα="" ανοσοστυπώματα="" υποβλήθηκαν="" σε="" πυκνομετρική="" ανάλυση.="" η="" σχετική="" αφθονία="" των="" gsk3b="" και="" p-gsk3b="" προσδιορίστηκε="" ως="" πυκνομετρικοί="" λόγοι="" του="" αντίστοιχου="" μορίου/gapdh="" ως="" πολλαπλές="" αλλαγές="" σε="" σύγκριση="" με="" τους="" ελέγχους="" (ctrls).="" η="" σχετική="" δραστικότητα="" του="" gsk3b="" υπολογίστηκε="" ως="" αναλογίες="" του="" p-gsk3b="" προς="" το="" gsk3b="" ως="" πτυχές="" του="" κανονικού="" ελέγχου="" (ctrls).="" (δ)="" η="" ανάλυση="" χαρακτηριστικής="" καμπύλης="" λειτουργίας="" δέκτη="" έδειξε="" ότι="" η="" σχετική="" δραστηριότητα="" gsk3b="" (αναλογία="" p-gsk3b/gsk3b)="" σε="" απολεπισμένα="" κύτταρα="" ούρων="" που="" συλλέχθηκαν="" από="" διαβητικούς="" ασθενείς="" πρώιμου="" σταδίου="" παρέχει="" εξαιρετική="" ακρίβεια="" στην="" πρόβλεψη="" της="">διαβητική νεφρική νόσοσε 5 χρόνια, με την περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) να είναι 0.886.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1. Umanath K, Lewis JB. Ενημέρωση για τη Διαβητική Νεφροπάθεια: Βασικό Πρόγραμμα Σπουδών 2018. Am J Kidney Dis. 2018; 71:884–895.

2. Gregg EW, Li Y, Wang J, et al. Αλλαγές στις επιπλοκές που σχετίζονται με τον διαβήτη στις Ηνωμένες Πολιτείες, 1990-2010. N Engl J Med. 2014; 370:1514–1523.

3. Haller Η, Ito S, Izzo JL Jr, et al. Olmesartan για την καθυστέρηση ή την πρόληψη της μικρολευκωματινουρίας στο διαβήτη τύπου 2. N Engl J Med. 2011; 364:907–917.

4. Schena FP, Gesualdo L. Παθογενετικοί μηχανισμοί διαβητικής νεφροπάθειας. J Am Soc Nephrol. 2005; 16 (suppl 1): S30–S33.

5. Ritz E, Zeng XX, Rychlik I. Κλινική εκδήλωση και φυσικό ιστορικό διαβητικής νεφροπάθειας. Contrib Nephrol. 2011; 170:19–27.

6. Holman RR, Paul SK, Bethel MA, et al. 10-ετής παρακολούθηση του εντατικού ελέγχου της γλυκόζης στον διαβήτη τύπου 2. N Engl J Med. 2008;359:1577–1589.

7. Perkins ΒΑ, Ficociello LH, Ostrander ΒΕ, et αϊ. Η μικρολευκωματινουρία και ο κίνδυνος για πρώιμη προοδευτική μείωση της νεφρικής λειτουργίας στον διαβήτη τύπου 1. J Am Soc Nephrol. 2007; 18:1353–1361.

8. Koye DN, Magliano DJ, Reid CM, et al. Κίνδυνος εξέλιξης της νορμολευκωματουρικής ΧΝΝ σε νεφρική νόσο τελικού σταδίου σε άτομα με διαβήτη: Μελέτη CRIC (Cohort Chronic Renal Insufficiency). Am J Kidney Dis. 2018; 72:653–661.

9. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Η ανάγκη για πρώιμους προγνωστικούς παράγοντες κινδύνου διαβητικής νεφροπάθειας: είναι επαρκής ο ρυθμός απέκκρισης λευκωματίνης; Διαβήτης. 2000; 49:1399-1408.

10. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Χαμηλός ρυθμός σπειραματικής διήθησης σε ασθενείς με διαβήτη τύπου 1 με νορμολευκωματουρία: δείκτης πιο προχωρημένων σπειραματικών αλλοιώσεων. Διαβήτης. 2003; 52:1036-1040.

11. Κρολέφσκι Α.Σ. Προοδευτική νεφρική πτώση: το νέο παράδειγμα της διαβητικής νεφροπάθειας στον διαβήτη τύπου 1. Φροντίδα Διαβήτη. 2015; 38:954–962.

12. Robles NR, Villa J, Gallego RH. Μη πρωτεϊνουρική διαβητική νεφροπάθεια. J Clin Med. 2015; 4:1761–1773.

13. Adler AI, Stevens RJ, Manley SE, et αϊ. Ανάπτυξη και εξέλιξη της νεφροπάθειας στο διαβήτη τύπου 2: η Προοπτική Μελέτη Διαβήτη του Ηνωμένου Βασιλείου (UKPDS 64). Kidney Int. 2003; 63:225-232.

14. Gluhovschi C, Gluhovschi G, Petrica L, et αϊ. Βιοδείκτες ούρων στην εκτίμηση της πρώιμης διαβητικής νεφροπάθειας. J Diabetes Res. 2016;2016: 4626125.

15. Doi T, Moriya T, Fujita Υ, et αϊ. Τα IgG4 και Smad1 των ούρων είναι ειδικοί βιοδείκτες για δομικές και λειτουργικές αλλαγές των νεφρών στα αρχικά στάδια της διαβητικής νεφροπάθειας. Διαβήτης. 2018; 67:986–993.

16. De S, Kuwahara S, Hosojima Μ, et αϊ. Η μεσολαβούμενη από εξωκυττάρωση η πλήρης απέκκριση μεγαλίνης στα ούρα συνδέεται με την παθογένεση της διαβητικής νεφροπάθειας. Διαβήτης. 2017; 66: 1391-1404.

17. Xu W, Ge Y, Liu Z, et al. Η κινάση συνθάσης 3b του γλυκογόνου υπαγορεύει την κινητικότητα των ποδοκυττάρων και την αλλαγή εστιακής προσκόλλησης ρυθμίζοντας τη δραστηριότητα της παξιλλίνης: επιπτώσεις για την προστατευτική επίδραση λιθίου χαμηλής δόσης στην ποδοκυτταροπάθεια. Am J Pathol. 2014; 184:2742–2756.

18. Ali A, Hoefiich KP, Woodgett JR. Γλυκογονική συνθάση κινάση-3: ιδιότητες, λειτουργίες και ρύθμιση. Chem Rev. 2001, 101:2527-2540.

19. Beurel E, Grieco SF, Jope RS. Γλυκογονοσυνθάση κινάση-3 (GSK3): ρύθμιση, δράσεις και ασθένειες. Pharmacol Ther. 2015; 148:114–131.

20. Li C, Ge Y, Dworkin L, et αϊ. Η ισόμορφη β της GSK3 μεσολαβεί στην αυτόνομη βλάβη των ποδοκυττάρων στην πρωτεϊνουρική σπειραματοπάθεια. J Pathol. 2016; 239:23.