Μέρος 2: Διακεκριμένοι ρόλοι για τον τομέα δεακετυλάσης του HDAC3 στον ιππόκαμπο και στον έσω προμετωπιαίο φλοιό στον σχηματισμό και την εξάλειψη της μνήμης
Mar 15, 2022
Για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com
Κάντε κλικ στοΤα οφέλη του εκχυλίσματος Cistanche για τη βελτίωση της μνήμης
Αποτελέσματα
Έκφραση του σημειακού μεταλλαγμένου ιού AAV-HDAC3(Y298H)
Για να στοχεύσουμε τη δραστηριότητα της αποακετυλάσης HDAC3, αναπτύξαμε μια σημειακή μετάλλαξη (Y298H) που εκφράζεται από αδενο-σχετιζόμενο ιό (AAV2.{4}}HDAC3 (Y298H)-v5). Η αντικατάσταση μιας ιστιδίνης για μια τυροσίνη (Y298H) καταργεί την ενζυματική δραστηριότητα του HDAC3 (Kwapis et al., 2017· Lahm et al, 2007, Sun et al., 2013). Προσθέσαμε επίσης μια ετικέτα επιτόπου V5 για να μετρήσουμε την ανοσοαντιδραστικότητα και να ποσοτικοποιήσουμε την έκφραση ιικού mRNA του μεταλλάκτη σημείου HDAC3 ανεξάρτητα από το ενδογενές HDAC3 (Εικ. 1Α). Σε ποντίκια χορηγήθηκαν αμφίπλευρες εγχύσεις είτε του σημειακού μεταλλαγμένου ιού (AAV-HDAC3(Y298H)-v5) είτε του ελέγχου (AAV-EV). Δύο εβδομάδες αργότερα (επιτρέποντας τη βέλτιστη έκφραση (Barrett et al., 2011; Kwapis et al., 2017, McQuown et al., 2011; Rogge et al., 2013), τα ποντίκια θυσιάστηκαν και τα V5 και HDAC3 μετρήθηκαν με ανοσοαντιδραστικότητα και RT-qPCR Για να επιβεβαιώσουμε ότι οι ιικές μας εγχύσεις στοχεύουν το DH, αξιολογήσαμε την ανοσοαντιδραστικότητα στον επίτοπο V5 στο AAV-HDAC3(Y298H). Παρατηρήσαμε επιτυχή μεταγωγή του AAV-HDAC3(Y298H)-v5 σε όλες τις περιοχές CA1 και CA3 του DH όλων των ζώων που έχουν εγχυθεί με σημειακά μεταλλαγμένο ιό, χωρίς χρώση V5 σε ζώα που έχουν εγχυθεί με τον ιό ελέγχου AAV-EV (Εικ. 1Β). Μετρήσαμε επίσης το V5 και τον άγριου τύπου HDAC3 σε ιστό DH χρησιμοποιώντας RT-qPCR. Εκκινητές έναντι και των δύο V{{ 49}}που περιέχει μετάγραφο HDAC3(Y298H) και το ενδογενές μεταγράφημα Hdac3 (το οποίο αναγνωρίζει τόσο το ενδογενές Hdac3 όσο και το μεταλλαγμένο Hdac3(Y298H)-v5 mRNA) επιβεβαίωσε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα σε ποντικούς που εγχύθηκαν με AAV-HDAC3(Y298H)-(v5) 7)=4.14; * p < 0.01,="" κενό="" διάνυσμα="" n="5;" y298h="" n="4;" hdac3:="" t(9)="3.12," *="" p="" {{="" 76}}.012,="" κεν="" y="" διάνυσμα="" n="6;" y298h="" n="6)" (εικ.="" 1c,="">
Ο αποκλεισμός της δραστηριότητας HDAC3 στον ραχιαίο ιππόκαμπο με το AAV-HDAC3(Y298H)-v5 ενισχύει τη μακροπρόθεσμη μνήμη για τη θέση των αντικειμένων
Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η αναστολή HDAC3 ενισχύεταιμνήμηέτσι ώστε ένα συμβάν μάθησης υποκατωφλίου που δεν θα είχε ως αποτέλεσμα μακροπρόθεσμαμνήμημετατρέπεται σε ένα γεγονός που οδηγεί σε μακροπρόθεσμημνήμη(McQuown et al., 2011; Malvaez et al., 2013). To test whether the deacetylase-dead point mutant version ofHDAC3 affects long-term memory, mice received bilateral infusions of either the point mutant virus ((AAV-HDAC3(Y298H)- v5) or control (AAV-EV). Two weeks later, mice were trained on the OLM task. During training, mice were placed in an arena with two identical objects for a 3 min training session, which does not result in long-term memory (Stefanko, et al, 2009; Malvaez et al., 2013), and then tested 24h later in the same arena with one familiar object moved to a novel location (Fig. 2A). In this experiment as well as all subsequent experiments, every animal included in the behavioral analyses had viral infusion confirmed by immunohistochemistry. Empty Vector mice did not show significant discrimination (DI = 3.66 ± 3.4%, t(12) = 1.085, p>{{0}}.1, n=8) επιβεβαιώνοντας ότι τα 3 λεπτά ήταν μια περίοδος προπόνησης υποκατωφλίου (Εικ. 2Β). Αντίθετα, τα ποντίκια Y298H έδειξαν σημαντική μνήμη για τη θέση του αντικειμένου, εμφανής από έναν σημαντικά μεγαλύτερο δείκτη διάκρισης (DI=28.76 ± 4,45 τοις εκατό; t(12)=4.587, * p < {{20="" }}.001,="" n="6·" εικ.="" 2β).="" οι="" ομάδες="" δεν="" διέφεραν="" στον="" συνολικό="" χρόνο="" εξερεύνησης="" των="" δύο="" αντικειμένων="" (t(12)="1.024;" p=""> 0.05; Εικ. 2C).
Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε μια νέα ομάδα ζώων για να ελέγξουμε εάν η έγχυση του σημειακού μεταλλαγμένου ιού στο DH επηρέασε μακροπρόθεσμαμνήμησε μια τυπική νέα εργασία αναγνώρισης αντικειμένων (ORM; Εικ. 2D).
Σε αυτήν την εργασία, ένα από τα γνωστά αντικείμενα αντικαθίσταται με ένα νέο αντικείμενο, αλλά δεν υπάρχει αλλαγή στο περιβάλλον ή τη θέση του αντικειμένου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Ε, μετά από εκπαίδευση σε υποκατώφλι (3 λεπτά), τόσο τα ποντίκια Empty Vector όσο και τα ποντίκια Y298H πέρασαν παρόμοια χρονικά διαστήματα τόσο με τα οικεία όσο και με νέα αντικείμενα την ημέρα της δοκιμής (t(14)=0.55; p > 0.05, Κενό διάνυσμα n=9; Y298H n=7). Οι ομάδες δεν διέφεραν στον συνολικό χρόνο εξερεύνησης των δύο αντικειμένων (t(14)=0.88; p > 0.05; Εικ. 2F). Μαζί, τα δεδομένα στο Σχήμα 2 υποδηλώνουν ότι η έγχυση του μεταλλαγμένου ιού HDAC3 νεκρού σημείου δεακετυλάσης στο DH έχει ως αποτέλεσμα μια επιλεκτική ενίσχυση της μακροπρόθεσμηςμνήμηγια τη θέση του αντικειμένου (Εικ. 2Β) αλλά όχι για το ίδιο το αντικείμενο (Εικ. 2Ε).
Η διαταραχή της δραστηριότητας HDAC3 στον ραχιαίο ιππόκαμπο με AAV-HDAC3(Y298H)-v5 δεν έχει επίδραση στον σχηματισμό μνήμης που σχετίζεται με την κοκαΐνη
Έχει αποδειχθεί σε αρουραίους ότι η DH παίζει ρόλο σε σχετιζόμενα με τα ναρκωτικάμνήμηδιαδικασίες. Συγκεκριμένα, διεγερτοτοξικές βλάβες της DH σε αρουραίους έχει αποδειχθεί ότι διαταράσσουν την απόκτηση κοκαΐνης-CPP (Meyers et al., 2003). Λαμβάνοντας υπόψη το αρχικό μας εύρημα που δείχνει ότι ο χειρισμός του HDAC3 στον ιππόκαμπο επηρεάζει τη μακροπρόθεσμη μνήμη για τη θέση του αντικειμένου (Εικ. 2Β) και τα στοιχεία που υποδηλώνουν ότι το DH παίζει ρόλο στη σχετιζόμενη με τα ναρκωτικάμνήμηformation, we set out to examine whether disrupting HDAC3 activity in the DH with AAV-HDAC3(Y298H)- v5 would affect the acquisition of cocaine-CPP. The schematic ofthe CPP procedure is shown in Fig. 3A (fully described in Materials and Methods). The training dose of cocaine- HCl used for this14 experiment as well as all future acquisition experiments was 5 mg/kg. We used this lower dose in order to avoid a ceiling effect (see Rogge et al., 2013). Neither the Empty Vector nor the Y298H group displayed an initial preference for either context before conditioning (pre-test: Empty vector: t(14) = 0.347; Y298H: t(14) = 1.841, p>{{0}}.05). Μετά την προετοιμασία με δύο ζεύγη κοκαΐνης, αμφότερες οι ομάδες Empty Vector και Y298H καθιέρωσαν μια προτίμηση για το περιβάλλον ζευγαρώματος με κοκαΐνη στη μετά τη δοκιμή (Εικ. 3Β). Μια αμφίδρομη επαναλαμβανόμενη ANOVA μέτρησης αποκάλυψε μια σημαντική κύρια επίδραση της προετοιμασίας (F(1,28)=16.36, p < 0.001)="" αλλά="" όχι="" ομάδα="" (f(1,28)="0.18," p=""> 0.05) και καμία αλληλεπίδραση θεραπείας με δοκιμή (F(1,28)=0.05, p > 0.05). Η Bonferronipost-hocanalysis δεν έδειξε διαφορά μεταξύ Empty Vector και ποντικών Y298H κατά την προ-δοκιμή (t(56)=0.47, p > 0.05) ή τη μετα-δοκιμή (t(56)=0.19, p > 0,05, n=15 ανά ομάδα) (Εικ, 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η έγχυση AAV-HDAC3(Y298H) στο DH δεν είχε καμία επίδραση στην απόκτηση σχετιζόμενης με την κοκαΐνημνήμη.
Η διαγραφή του HDAC3 στον ραχιαίο ιππόκαμπο δεν έχει επίδραση στον σχηματισμό σχετιζόμενης με κοκαΐνηΜνήμη
Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν η διαγραφή ολόκληρου του γονιδίου Hdac3 στο DH θα επηρεάσει τη σχέση με την κοκαΐνημνήμησχηματισμός. Σε αυτό το πείραμα, δημιουργήθηκαν ομόζυγες διαγραφές του Hdac3 ειδικές για DH σε ενήλικα ποντίκια. Επειδή το HDAC3 εκφράζεται σε νευρώνες, ολιγοδενδροκύτταρα και γλοία (Broide et al., 2007; Baltan et al., 2011), επιτρέπεται η χρήση του ορότυπου AAV 2.1, ο οποίος μετατρέπει κατά προτίμηση τους νευρώνες (Burger et al., 2004). διαγραφή του Hdac3 ειδικά στους νευρώνες. Επίσης, χρησιμοποιήσαμε το CAMKII-Cre και ο προαγωγέας CAMKII θα πρέπει να περιορίζει την έκφραση Cre στους διεγερτικούς νευρώνες του πρόσθιου εγκεφάλου (Kojima et al., 1997). Τα ποντίκια Hdac3 plus / plus και Hdac3flox/flox υποβλήθηκαν σε CPP που προκλήθηκε από κοκαΐνη για να εξεταστεί η επίδραση της ειδικής για την DH διαγραφή Hdac3 στον σχηματισμό μνήμης CPP. Το σχηματικό της διαδικασίας CPP φαίνεται στο Σχ. 4Α. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, τόσο ποντίκια Hdac3 plus / plus όσο και Hdac3flox/flox
καθιέρωσε μια προτίμηση για το περιβάλλον σε συνδυασμό με κοκαΐνη μετά τη δοκιμή. Όταν τα δεδομένα αναλύθηκαν με παραγοντική ANOVA (θεραπεία × γονότυπος), υπήρξε σημαντική κύρια επίδραση της προετοιμασίας (F(1,21)=12.03, p < 0.="" 01)="" αλλά="" όχι="" γονότυπος="" (f(1,21)="" {{10}}.52,="" p=""> 0.05) και καμία αλληλεπίδραση (F). (1,21)=0.12, p > 0.05). Η Bonferronipost-hocanalysis δεν έδειξε διαφορά μεταξύ των ποντικών Hdac3 plus / plus και Hdac3flox/flox στην προ-δοκιμή (t(42)=0.80, p > 0,05) ή μετά τη δοκιμή (t(42) {{31} }.42, p > 0.05, Hdac3 συν / συν n=12, Hdac3flox/flox n=11) (Εικ, 4Β). Η έκταση της διαγραφής HDAC3 σε ποντίκια Hdac3flox/flox φαίνεται στο Σχ. 4Γ. Οι ιικές εγχύσεις και οι εστιακές διαγραφές ήταν αμφοτερόπλευρες και οι διαγραφές Hdac3 περιορίστηκαν στο DH σε όλα τα ποντίκια Hdac3flox/flox που περιλαμβάνονται στα δεδομένα που παρουσιάζονται στα επόμενα σχήματα. Για να επιβεβαιώσουμε ότι η ιική μας έγχυση στόχευε κατάλληλα το DH και είχε ως αποτέλεσμα τη διαγραφή του Hdac3, μετρήσαμε την ανοσοαντιδραστικότητα στο HDAC3. Το Σχήμα 4Γ δείχνει την έκφραση HDAC3 στο DH μετά από χρώση ανοσοφθορισμού με αντίσωμα αντι-HDAC3. Η χρώση DAPI επιβεβαίωσε την παρουσία πυρήνων στο DH και των δύο γονότυπων. Η ποσοτικοποιημένη ανοσοαντιδραστικότητα HDAC3 στο DH όλων των ποντικών Hdac3 plus / plus και Hdac3flox/flox που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη φαίνεται στο Σχήμα 4D. Η ανοσοαντιδραστικότητα HDAC3 μειώθηκε σημαντικά στα ποντίκια DH του Hdac3flox/flox σε σύγκριση με το Hdac3 plus / plus (μέσο ποσοστό Hdac3 συν / συν ±sem: Hdac3 συν / συν=100±26,0· Hdac3flox/flox=30.2 ±7,8, t(9)= 2,790, * p <>
Η διακοπή της δραστηριότητας HDAC3 στο PrL με το AAV-HDAC3(Y298H)-v5 δεν έχει επίδραση στον σχηματισμό μνήμης που σχετίζεται με την κοκαΐνη
Στη συνέχεια, δοκιμάσαμε εάν η διακοπή της δραστηριότητας HDAC3 στον προεγκεφαλικό φλοιό (PrL) με HDAC3-(Y298H)-v5 θα επηρεάσει την κοκαΐνη-CPPμνήμησχηματισμός. Το PrL έχει αποδειχθεί ότι παίζει κρίσιμο ρόλο στην απόκτηση κοκαΐνης-CPP (Isaac et al., 1989· Tzschentke and Schmidt 1998, 1999). Επιπλέον, η νευροπλαστικότητα του προμετωπιαίου φλοιού μπορεί να μεταβληθεί ανώμαλα από εθιστικά φάρμακα κατάχρησης όπως η κοκαΐνη μέσω της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης (Krasnova et al., 2008; Marie-Claire et al., 2003). Έτσι, υποθέσαμε ότι η δραστηριότητα της αποακετυλάσης του HDAC3 μπορεί να διαδραματίσει κρίσιμο ρόλο στο PrL για τη σχετιζόμενη με την κοκαΐνημνήμηformation. The schematic ofthe CPP procedure was the same as in Fig. 3 and the schematic is depicted in Fig. 5A. Neither the Empty Vector nor the Y298H group that received an infusion the AAV-HDAC3-(Y298H)-v5 virus displayed an initial preference for either context before conditioning (pretest: Empty Vector: t(11) = 0.166; Y298H: t(11) = 0.655, p>{{0}}.1). Μετά την προετοιμασία με δύο ζεύγη κοκαΐνης, αμφότερες οι ομάδες Empty Vector και Y298H καθιέρωσαν μια προτίμηση για το περιβάλλον σε συνδυασμό με κοκαΐνη κατά τη μετα-δοκιμή (Εικ. 5Β). Μια αμφίδρομη ANOVA επαναλαμβανόμενων μετρήσεων αποκάλυψε μια σημαντική κύρια επίδραση της προετοιμασίας (F(1,22) {{10}}.10, p < 0.{{="" 44}}001)="" αλλά="" όχι="" ομάδα="" (f(1,22)="0.11," p=""> 0.05) και καμία αλληλεπίδραση θεραπεία προς δοκιμή (F(1,22)=0.10, p > 0,05). Η Bonferronipost-hocanalysis δεν έδειξε διαφορά μεταξύ ποντικών AAV-EV και HDAC3(Y298H)-v5 στην προ-δοκιμή (t(44)=0.11, p > 0,05) ή μετά τη δοκιμή (t(44) {{ 42}}.45, p > 0,05, n=12 ανά ομάδα) (Εικ. 5Β). Για να επιβεβαιώσουμε ότι οι ιικές μας εγχύσεις στοχεύουν ειδικά το PrL, μετρήσαμε την ανοσοαντιδραστικότητα στον επίτοπο V5 στο AAV-HDAC3 (Y298H). Παρατηρήσαμε επιτυχή μεταγωγή του AAV-HDAC3(Y298H)-v5 όλων των ζώων που εγχύθηκαν με σημειακά μεταλλαγμένο ιό σε όλο το PrL, ενώ αποφεύχθηκε η εξάπλωση στην περιοχή του υπομετωπιαίου φλοιού (IL) του έσω προμετωπιαίου φλοιού (mPFC). Όπως αναμενόταν, δεν παρατηρήθηκε χρώση V5 σε ζώα στα οποία έγινε έγχυση του ιού ελέγχου AAV-EV (Εικ. 5C). Το Σχήμα 5Δ απεικονίζει τη στοχευμένη ιική έγχυση στο PrL. Η έγχυση περιορίστηκε στο PrL σε όλα τα ζώα που περιλαμβάνονται στα δεδομένα που παρουσιάστηκαν. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι, όπως και η έγχυση DH, AAV-HDAC3(Y298H) στο PrL, επίσης δεν είχε καμία επίδραση στην απόκτηση μνήμης που σχετίζεται με την κοκαΐνη.
Αποκλεισμός της δραστηριότητας HDAC3 στον υπολιμβικό φλοιό με AAV-HDAC3(Y298H)-v5 δεν έχει επίδραση στην εξαφάνιση της μνήμης που σχετίζεται με την κοκαΐνη
Στη συνέχεια, εξετάσαμε εάν ο επιλεκτικός αποκλεισμός της δραστηριότητας της αποακετυλάσης HDAC3 στο IL ενισχύει την εξαφάνιση της κοκαΐνης-CPP. Το IL έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στην εξαφάνιση της αναζήτησης κοκαΐνης (LaLumiere et al., 2010; Peters et al., 2008, 2009). Τα ζώα υποβλήθηκαν σε προετοιμασία κοκαΐνης-CPP με μια δόση εκπαίδευσης κοκαΐνης-HCl 20 mg/kg. Ο λόγος αυτής της υψηλότερης δόσης κοκαΐνης σε αυτό το πείραμα εξαφάνισης καθώς και σε όλες τις επακόλουθες μελέτες εξαφάνισης ήταν η πρόληψη των επιπτώσεων του εδάφους της εξαφάνισης και η δημιουργία μιας αρκετά ισχυρής προτίμησης που θα μπορούσε να αντέξει τις δύο εβδομάδες που είναι απαραίτητες για την έκφραση του ιού μετά την έγχυση του ιού. Μετά την προετοιμασία της κοκαΐνης-CPP, τα ζώα έδειξαν σημαντική προτίμηση στη μετά τη δοκιμή 1 (μετά τη δοκιμή 1; t(64)=15.11; p <0,001). στη="" συνέχεια="" εγχύαμε="" αμφοτερόπλευρα="" hdac3(y298h)-v5="" ή="" aav-ev="" στο="" il,="" και="" τα="" ποντίκια="" υποβλήθηκαν="" σε="" μετα-δοκιμές="" χωρίς="" φάρμακο="" (εκπαίδευση="" εξαφάνισης)="" δύο="" εβδομάδες="" μετά="" τις="" εγχύσεις="" (εικ.="" 6α).="" η="" διακοπή="" της="" δραστηριότητας="" hdac3="" στο="" il="" με="" hdac3(y298h)="" δεν="" είχε="" καμία="" επίδραση="" στην="" εξαφάνιση="" του="">μνήμη. Χρησιμοποιώντας μια διπλής κατεύθυνσης επαναλαμβανόμενων μετρήσεων ANOVA, βρήκαμε μια σημαντική κύρια επίδραση της δοκιμής (F (1, 155)=35.91, p< 0.001),="" as="" expected,="" but="" no="" significant="" treatment-by-test="" interaction="" (f="" (5,="" 155)="0.62," p=""> 0.05) nor main treatment group effect (F (1, 31) = 0.75, p>0.05) (AAV-EV: n=17, HDAC3(Y298H)-v5: n=16 ανά ομάδα) (Εικ. 6B). Για να επιβεβαιώσουμε ότι οι ιικές μας εγχύσεις στοχεύουν ειδικά τον υπολεμφικό, μετρήσαμε την ανοσοαντιδραστικότητα στον επίτοπο V5 στο AAV-HDAC3 (Y298H). Παρατηρήσαμε επιτυχή μεταγωγή του AAV-HdAC3(Y298H)-v5 όλων των ζώων που εγχύθηκαν με σημειακά μεταλλαγμένο ιό σε όλη την IL, ενώ αποφεύχθηκε η εξάπλωση στην περιοχή PrL του mPFC. Δεν παρατηρήθηκε χρώση V5 σε ζώα στα οποία έγινε έγχυση του ιού ελέγχου AAV-EV (Εικ. 6C). Το Σχήμα 6Δ δείχνει τη στοχευμένη ιική έγχυση στο IL. Η έγχυση περιορίστηκε στην IL σε όλα τα ζώα που περιλαμβάνονται στα δεδομένα που παρουσιάστηκαν.
Ο αποκλεισμός της δραστηριότητας HDAC3 στον ραχιαίο ιππόκαμπο με AAV-HDAC3(Y298H)-v5 Διευκολύνει την εξαφάνιση της μνήμης που σχετίζεται με την κοκαΐνη
Στη συνέχεια, εξετάσαμε εάν ο επιλεκτικός αποκλεισμός της δραστηριότητας της αποακετυλάσης HDAC3 στο DH ενισχύει την εξαφάνιση της κοκαΐνης-CPP. Όπως περιγράφηκε παραπάνω, τα ζώα υποβλήθηκαν σε προετοιμασία κοκαΐνης-CPP και έδειξαν σημαντική προτίμηση στη μετά τη δοκιμή 1 (μετά τη δοκιμή 1; t(42)=9.79; p < 0.0001).="" στη="" συνέχεια="" εγχύαμε="" αμφίπλευρα="" hdac3(y298h)-v5="" ή="" aav-ev="" στο="" dh="" και="" βάλαμε="" ζώα="" να="" υποβληθούν="" σε="" μετα-δοκιμές="" χωρίς="" φάρμακο="" (εκπαίδευση="" εξαφάνισης)="" δύο="" εβδομάδες="" μετά="" τις="" εγχύσεις="" (εικ.="" 7α).="" η="" διακοπή="" της="" δραστηριότητας="" hdac3="" στο="" dh="" με="" hdac3(y298h)="" είχε="" ως="" αποτέλεσμα="" μια="" σημαντική="" εξάλειψη="" του="" cpp="" στη="" μετά="" τη="" δοκιμή="" 2,="" όπως="" αποκαλύφθηκε="" από="" την="" anova="" που="" συγκρίνει="" τη="" βαθμολογία="" προτίμησης="" (ps)="" των="" ομάδων="" aav-ev="" και="" hdac3(y298h)-v5="" σε="" όλες="" τις="" μετα-δοκιμές="" 1="" και="" 2="" που="" δείχνουν="" μια="" σημαντική="" κύρια="" επίδραση="" της="" δοκιμής="" (f="" (1,="" 20)="25.58,">< 0.001)="" and="" a="" significant="" treatment-by-test="" interaction="" (f="" (1,="" 20)="5.67," p="0.02)." both="" the="" aav-ev="" control="" and="" the="" hdac3(y298h)="" animals="" showed="" similar="" cpp="" preferences="" on="" post-test="" 1,="" but="" after="" viral="" manipulation,="" the="" animals="" that="" received="" the="" point="" mutant="" virus="" showed="" a="" significant="" decrease="" in="" ps="" on="" post-test="" 2="" compared="" to="" the="" aav-ev="" control="" animals="" as="" shown="" by="" bonferronipost-="" hocanalysis="" (t(40)="2.73," p="0.02;" aav-ev="" n="10," hdac3(y298h)-v5="" n="12)" (fig,="" 7b).these="" findings="" demonstrate="" that="" mice="" infused="" with="" aav-hdac3(y298h)-v5="" showed="" enhanced="" extinction="" of="" cocaine-associated="">
Συζήτηση
Έχει αποδειχθεί ότι η συστηματική χορήγηση ενός εκλεκτικού αναστολέα HDAC3-ενισχύει τη μακροπρόθεσμη θέση του αντικειμένουμνήμηκαθώς και η εξαφάνιση της κοκαΐνηςμνήμη(Malvaez et al., 2013). Περαιτέρω, η αναστολή HDAC3 προάγει ένα ξεχωριστό μοτίβο ακετυλίωσης ιστόνης που συνδέεται με γονιδιακή έκφραση στον ιππόκαμπο και τον υπομετασχηματικό φλοιό (Malvaez et al., 2013). Το εργαστήριό μας έχει εξετάσει το ρόλο του HDAC3 στο DH και τον επικλινή πυρήνα στο OLM καθώς και που σχετίζεται με την κοκαΐνημνήμη, αντίστοιχα (McQuown et al., 2011; Rogge et al., 2013). Ωστόσο, το κατά πόσον η περιοχή αποακετυλάσης του HDAC3 είναι ή όχι απαραίτητη για αυτές τις διαδικασίες μνήμης σε συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου παρέμεινε ασαφές. Εδώ, εξετάσαμε τον συγκεκριμένο ρόλο που διαδραματίζει ο τομέας αποακετυλάσης του HDAC3 στον μακροπρόθεσμο σχηματισμό OLM, στο σχηματισμό μνήμης που σχετίζεται με το πλαίσιο της κοκαΐνης, καθώς και στην εξάλειψη του σχετιζόμενου πλαισίου κοκαΐνηςμνήμη.
Σε αυτά τα πειράματα, χρησιμοποιήσαμε έναν μεταλλαγμένο ιό αποακετυλάσης νεκρού σημείου (AAV-HDAC3(Y298H)-v5 που αναστέλλει επιλεκτικά τη δραστηριότητα της αποακετυλάσης του HDAC3 (Lahm et al., 2007; Sun et al., 2013). Βρήκαμε ότι ο επιλεκτικός αποκλεισμός ο τομέας αποακετυλάσης του HDAC3 στο DH ενίσχυσε μακροπρόθεσμαμνήμηγια τον εντοπισμό αντικειμένων μετά από μια περίοδο εκπαίδευσης υποκατωφλίου. Αυτό το εύρημα ήταν ειδικό για τον σχηματισμό μνήμης εντοπισμού αντιρρήσεων, επειδή η περιοχή αποακετυλάσης του HDAC3 στο DH δεν φάνηκε να παίζει κανένα ρόλο στην απόκτηση/ενοποίηση σχετιζόμενων με την κοκαΐνημνήμησχηματισμός. Ερευνήσαμε επίσης τον ρόλο του HDAC3 στον προεγκεφαλικό φλοιό σε σχέση με τον σχηματισμό μνήμης κοκαΐνης-CPP και βρήκαμε ότι η δραστηριότητα της αποακετυλάσης του HDAC3 σε αυτήν την περιοχή του εγκεφάλου δεν φαινόταν να είναι κρίσιμη για την απόκτηση μνήμης κοκαΐνης-CPP. Τέλος, διαπιστώσαμε ότι η παρεμπόδιση της δραστηριότητας HDAC3 στο DH διευκόλυνε επίσης την εξαφάνιση της κοκαΐνης-CPP, ενώ αυτός ο ίδιος χειρισμός δεν είχε καμία επίδραση στον υπολιμβικό φλοιό, μια περιοχή που εμπλέκεται στη μάθηση της εξαφάνισης (Quirk et al., 2000· Quirk et al. , 2006· Lebrón et al. 2004· Sierra-Mercado et al., 2006· Laurent and Westbrook, 2009). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η περιοχή αποακετυλάσης του HDAC3 παίζει έναν επιλεκτικό ρόλο σε συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου που υποκρύπτουν τον σχηματισμό μακροπρόθεσμης μνήμης της θέσης του αντικειμένου καθώς και τον σχηματισμό και την εξαφάνιση της μνήμης που σχετίζεται με την κοκαΐνη.
Πρόσφατα δείξαμε ότι αυτός ο συγκεκριμένος μεταλλαγμένος ιός νεκρού σημείου αποακετυλάσης μπλοκάρει τη δραστηριότητα της αποακετυλάσης του HDAC3 και προάγει την επαγόμενη από τη μάθηση ακετυλίωση ιστόνης (Kwapis et al., 2017). Οι Kwapis et al. (2017) διαπίστωσε ότι ο επιλεκτικός αποκλεισμός της δραστηριότητας της αποακετυλάσης HDAC3 είτε στον DH είτε στον βασικό πυρήνα της αμυγδαλής ενίσχυσε τον φόβο του πλαισίου χωρίς να επηρεάζει τον τόνο του φόβου. Ωστόσο, ο αποκλεισμός της δραστηριότητας HDAC3 στον πλευρικό πυρήνα της αμυγδαλής ενίσχυσε τον τόνο, αλλά όχι τη μνήμη του φόβου του περιβάλλοντος. Έτσι, η δραστηριότητα HDAC3 ρυθμίζει διαφορετικές πτυχές του φόβουμνήμηστις βασικές και πλευρικές υποπεριοχές της αμυγδαλής. Μαζί, τα ευρήματα που παρουσιάζονται στο Kwapis et al. (2017) μαζί με την παρούσα μελέτη δείχνουν ότι η περιοχή αποακετυλάσης του HDAC3 είναι σημαντική για τις διαδικασίες μνήμης.
Αντίθετα, οι Sun et al. (2013) έδειξε ότι η περιοχή αποακετυλάσης του HDAC3 δεν είναι απαραίτητη για τη λειτουργία του HDAC3 στο ήπαρ. Βρήκαν ότι ένα μετάλλαγμα HDAC3 νεκρό από δεακετυλάση ήταν σε θέση να διασώσει σχεδόν πλήρως την κατασταλμένη λιπογονική έκφραση γονιδίου καθώς και τον μεταβολισμό των λιπιδίων. Περαιτέρω, έδειξαν ότι η αλληλεπίδραση με τον συνθλιπτικό NCOR απαιτείται για την ανεξάρτητη από τη δεακετυλάση λειτουργία του HDAC3. Έτσι, παρά τα στοιχεία για τον σημαντικό ρόλο του τομέα αποακετυλάσης του HDAC3, το HDAC3 έχει επίσης κρίσιμους μη ενζυμικούς ρόλους στις μεταγραφικές διαδικασίες.
Στην προηγούμενη μελέτη μας, McQuown et al., (2011), βρήκαμε ότι η εστιακή διαγραφή του HDAC3 στο DH οδηγεί σε ενισχυμένη μακροπρόθεσμημνήμηγια OLM, αλλά όχι ORM. Ομοίως, στην τρέχουσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι ο επιλεκτικός αποκλεισμός της δραστηριότητας της αποακετυλάσης HDAC3 (χρησιμοποιώντας μια μετάλλαξη νεκρού σημείου αποακετυλάσης του HDAC3) στο DH μειώνει το OLM, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στο ORM. Στα τρωκτικά, η εμπλοκή του ιππόκαμπου στην αναγνώριση αντικειμένων έχει αποτελέσει σημείο διαμάχης (Mumby, 2001· Dere et al., 2007· Winters et al., 2008· Ennaceur 2010). Το εργαστήριό μας βρήκε προηγουμένως μια σημαντική έκπτωση στο ORM όταν χρησιμοποιήσαμε μουσκιμόλη μετά την προπόνηση για να απενεργοποιήσουμε τον ιππόκαμπο. Ωστόσο, όταν ο ιππόκαμπος απενεργοποιήθηκε πριν από την ανάκτηση του ORM, δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση (Haettig et al., 2011). Ως εκ τούτου, φαίνεται ότι ο ιππόκαμπος είναι απαραίτητος για την ενοποίηση αλλά όχι για την ανάκτηση του ORM στην ίδια εργασία ποντικού που χρησιμοποιήθηκε στην τρέχουσα μελέτη. Πολλαπλές μελέτες από το εργαστήριό μας (Barret et al., 2011; McQuown et al., 2011; Vogel-Ciernia et al., 2013) και άλλες (Balderas et al., 2008) καταδεικνύουν ομοίως ότι ο χειρισμός του ραχιαίου ιππόκαμπου επηρεάζει μόνο την OLM και όχι ORM. Στα πειράματά μας, χειριζόμαστε ένα γονίδιο ενδιαφέροντος (CBP, Barrett et al., 2011; HDAC3, McQuown et al., 2011; BAF53b, Vogel-Ciernia et al., 2013), το οποίο αφήνει την επικοινωνία μεταξύ του DH και άλλου εγκεφάλου περιοχές ανέπαφες ενώ διαταράσσουν επιλεκτικά την τοπική πλαστικότητα. Ομοίως, ο αποκλεισμός της πρωτεϊνικής σύνθεσης με ανισομυκίνη αποτυγχάνει να επηρεάσει την ενοποίηση του ORM (Balderas et al., 2008). Ο αποκλεισμός της δραστηριότητας του ιππόκαμπου με μουσκιμόλη, από την άλλη πλευρά, βλάπτει την ενοποίηση του ORM. Η μουσκιμόλη απενεργοποιεί τα κύτταρα του ιππόκαμπου, αποτρέποντας την επικοινωνία με βασικές περιοχές του εγκεφάλου που είναι απαραίτητες για την απόκτηση/ενοποίηση ORM. Έτσι, φαίνεται ότι ο χειρισμός της γονιδιακής έκφρασης ή ο αποκλεισμός της πρωτεϊνοσύνθεσης εντός του DH δεν επαρκεί για να διαταράξει τους μηχανισμούς απόκτησης/ενοποίησης που απαιτούνται για τη μακροπρόθεσμη μνήμη για την αναγνώριση αντικειμένων. Πράγματι, μελέτες έχουν προτείνει ότι μακροπρόθεσμαμνήμηδιότι η αναγνώριση αντικειμένων βασίζεται σε περι-μεταρρινικούς και νησιωτικούς φλοιούς, παρά στο DH (Balderas et al., 2008; Roozendaal et al., 2010).
Προηγούμενες μελέτες από το εργαστήριό μας χρησιμοποιούσαν αναστολείς HDAC3 που χορηγήθηκαν συστηματικά προκειμένου να αποκλειστεί απότομα η ενζυματική δραστηριότητα του HDAC3 (Malvaez et al., 2013). Εδώ, χρησιμοποιούμε ιικούς χειρισμούς για να αναστέλλουμε χρόνια τη δραστηριότητα της αποακετυλάσης του HDAC3. Αυτή η χρόνια αναστολή μπορεί να επιτρέψει την εμφάνιση αντισταθμιστικών μηχανισμών στην περιοχή του εγκεφάλου στην οποία έγινε ο χειρισμός μας, με αποτέλεσμα τη φυσιολογική μάθηση. Η περιοχή αποακετυλάσης του HDAC3 στο DH μπορεί να παίξει ρόλο στην εξαφάνιση της κοκαΐνης-CPPμνήμη, αφού η έγχυση του σημειακού μεταλλαγμένου ιού HDAC3 στο DH είχε ως αποτέλεσμα τη διευκόλυνση της εξαφάνισης. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι ο αποκλεισμός της δραστηριότητας αποακετυλάσης του HDAC3 στο DH ενίσχυσε την εκμάθηση εξαφάνισης αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην απόκτηση/ενοποίηση χρησιμοποιώντας το μοντέλο CPP. Μια πιθανή εξήγηση για αυτό είναι ότι η μάθηση που εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της εξαφάνισης πιστεύεται ότι είναι πιο επιρρεπής σε χειρισμούς σε σύγκριση με την αρχική προετοιμασία. Μελέτες έχουν δείξει ότι ο ρυθμός εξαφάνισης μπορεί να είναι πιο αργός από τον ρυθμό αρχικής απόκτησης (Rescorla, 2002), υποδηλώνοντας ότι η εξαφάνιση είναι πιο δύσκολη και επομένως πιο επιρρεπής σε διαταραχές. Αυτό φαίνεται αρκετά εύλογο όταν πρόκειται για ισχυρές μνήμες που σχετίζονται με την κοκαΐνη, επειδή το αρχικό Neurobiol LearnMem. Χειρόγραφο συγγραφέα; διαθέσιμο στο PMC 2018 01 Νοεμβρίου.
Ο σχηματισμός αυτών των αναμνήσεων περιλαμβάνει την ισχυρή ψυχοδιεγερτική κοκαΐνη, που διευκολύνει τα ζώα να σχηματίσουν αυτό το πρωτότυπομνήμηέναντι μιας επακόλουθης εξαφάνισηςμνήμη.
Όσον αφορά την απόκτηση/ενοποίηση αναμνήσεων που σχετίζονται με το φάρμακο, διαπιστώσαμε ότι είτε χρησιμοποιήσαμε έναν μεταλλαγμένο ιό αποακετυλάσης νεκρού σημείου είτε διαγράψαμε ολόκληρο το γονίδιο Hdac3 χρησιμοποιώντας ομόζυγη διαγραφή Hdac3 στο DH, οι χειρισμοί μας απέτυχαν να έχουν καμία επίδραση στην απόκτηση/ενοποίηση της κοκαΐνης-CPPμνήμη. Η DH έχει συσχετιστεί με την επεξεργασία πληροφοριών (για ανασκόπηση, βλέπε Fanselow και Dong 2010) και οι διεγερτοτοξικές βλάβες της DH σε αρουραίους έχουν αποδειχθεί ότι διαταράσσουν την απόκτηση κοκαΐνης-CPP (Meyers et al., 2003). Αν και το DH έχει προταθεί να παίζει ρόλο στην έκφραση της αναζήτησης κοκαΐνης που προκαλείται από τα ναρκωτικά (Fuchs et al., 2005; 2007) και απαιτείται για την επεξεργασία πληροφοριών με βάση τα συμφραζόμενα, το DH δεν απαιτείται για τη συσχέτιση μιας ακουστικής εξαρτημένης ερέθισμα με το ερέθισμα χωρίς όρους, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία του φόβου (Maren 2001). Έτσι, ενώ το DH επεξεργάζεται πληροφορίες σχετικά με το πλαίσιο, δεν πιστεύεται ότι είναι ο τόπος συσχετιστικής σύγκλισης μεταξύ περιβάλλοντος και σοκ (Maren 2001). Ως εκ τούτου, αν και το HDAC3 φαίνεται να παίζει έναν απαραίτητο ρόλο στην απόκτηση/ενοποίηση της μνήμης κοκαΐνης-CPP σε περιοχές του εγκεφάλου όπως ο επικλινής πυρήνας που παίζει κεντρικό ρόλο στα κυκλώματα ανταμοιβής και είναι ο κύριος μεσολαβητής των ενισχυτικών ιδιοτήτων των ναρκωτικών κατάχρησης και επεξεργασία εξαρτημένων ερεθισμάτων σε συνδυασμό με φάρμακα (Parkinson et al., 1999; Kalivas and McFarland, 2003; Rogge et al., 2013), τα σημερινά μας ευρήματά υποδηλώνουν ότι η περιοχή αποακετυλάσης του HDAC3 στο DH δεν φαίνεται να μεσολαβεί στο σχηματισμό κοκαΐνης -σχετιζόμενοςαναμνήσεις.
Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η περιοχή αποακετυλάσης του HDAC3 παίζει ρόλο σε συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου που εμπλέκονται στην εξαφάνιση της κοκαΐνηςμνήμη. Ερευνήσαμε αρχικά τον ρόλο της ενζυματικής δραστηριότητας HDAC3 στον υπολιμβικό φλοιό επειδή αυτή η περιοχή του εγκεφάλου έχει θεωρηθεί ως κεντρικός τόπος για την εξαφάνιση των αναμνήσεων (Peters et al., 2008; LuLumiere et al., 2010). Stafford et al. (2012) τόνισε το ρόλο των μηχανισμών αποακετυλίωσης ιστόνης στο IL στην εξαφάνιση του φόβου δείχνοντας ότι ο αναστολέας αποακετυλάσης ιστόνης Κατηγορίας Ι NaB είχε ως αποτέλεσμα ενισχυμένη εξαφάνιση όταν εγχυθεί στο IL, αλλά όχι στο PrL. Όταν εγχύσαμε τον σημειακό μεταλλαγμένο ιό HDAC3 στο IL, δεν βρήκαμε καμία επίδραση στον ρυθμό εξαφάνισης της μνήμης που σχετίζεται με την κοκαΐνη. Η οικογένεια HDAC Κατηγορίας Ι αποτελείται από τα HDAC-1, -2, -3 και -8 (Haberland et al., 2009). Ο Ressler και οι συνεργάτες του (2015) διαπίστωσαν ότι ο αναστολέας HDAC-1, -2 και -3, RGFP963, ενισχύει την εδραίωση της προκαλούμενης εξαφάνισης του φόβου, αλλά ο RGFP966, ένας εκλεκτικός αναστολέας του HDAC3, δεν το έκανε . Περαιτέρω, οι Rumbaugh et al. (2015) έδειξε ότι ο RGFP963 και ένας άλλος αναστολέας HDAC-1, -2 και -3, ο RGFP968, ήταν πιο αποτελεσματικοί στη διέγερση της συναπτογένεσης, ενώ ο RGFP966 ήταν αναποτελεσματικός. Αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν τις σημαντικές διαφορές στα ευρήματα που παρατηρήθηκαν ανάλογα με το εάν στοχεύεται ο τομέας αποακετυλάσης του HDAC3, ολόκληρης της οικογένειας HDAC Τάξης 1 ή ένα υποσύνολο HDAC κατηγορίας Ι και προτείνουν ότι η στόχευση αρκετών ισομορφών HDAC κατηγορίας Ι μπορεί να αποφέρει πιο ισχυρά αποτελέσματα στα διαδικασίες μάθησης και μνήμης.
Εν ολίγοις, τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν τον ρόλο του τομέα της αποακετυλάσης του HDAC3 σε συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου που εμπλέκονται στη θέση του αντικειμένουμνήμηκαι ο σχηματισμός και η εξαφάνιση της κοκαΐνηςμνήμη. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι προηγούμενες μελέτες είχαν στοχεύσει έντονα το HDAC3 χρησιμοποιώντας συστημικούς χειρισμούς που διασχίζουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και στοχεύουν πολλές περιοχές του εγκεφάλου (π.χ.Malvaez et al., 2010, 2013, Stafford et al., 2012). Εδώ, δείχνουμε πώς ο χρόνιος χειρισμός της περιοχής αποακετυλάσης του HDAC3 σε βασικές περιοχές του εγκεφάλου που εμπλέκονται στην εκμάθηση εντοπισμού αντικειμένων και ο σχηματισμός και η εξαφάνιση των αναμνήσεων που σχετίζονται με την κοκαΐνη επηρεάζουν αυτές τις διαδικασίες μνήμης. Τα ευρήματά μας επεκτείνουν τα προηγούμενα ευρήματα ότι η δραστηριότητα της αποακετυλάσης του HDAC3 παίζει κρίσιμο ρόλο στις διαδικασίες μακροπρόθεσμης μνήμης και μιλά για τον ειδικό ρόλο της δραστηριότητας της αποακετυλάσης HDAC3 όσον αφορά τόσο τις περιοχές του εγκεφάλου όσο και τη διαδικασία μνήμης.