Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Κάντε κλικ εδώ για το Μέρος 1

Κάντε κλικ εδώ για το Μέρος 3

Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη

Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα ευρήματα, στη συνέχεια εξετάσαμε εάν ρυθμίστηκε προς τα πάνω η έκφραση miR-466f{-3 ιππόκαμπου σε ποντίκια κατά τη χωρική εκμάθηση καιμνήμηΟ σχηματισμός επηρέασε επίσης τη μορφολογία των νευρώνων in vivo. Σημαντικά, βρήκαμε ότι η μέση πυκνότητα της σπονδυλικής στήλης των νευρώνων του ιππόκαμπου των ποντικών GLN ήταν υψηλότερη από αυτή των ποντικών PLN, όπως αποκαλύφθηκε από τον εμποτισμό του πυραμιδικού με το Golgi

Εικόνα 3. Επιδράσεις της μεταβολής των επιπέδων έκφρασης miR-466f-3p του ιππόκαμπου στην απόδοση MWM ποντικιού

(Α) Πειραματικό χρονοδιάγραμμα της εργασίας MWM, ανάλυση έκφρασης ή ηλεκτροφυσιολογική μέτρηση του εγκεφάλου του ποντικού μετά την έγχυση φακοϊού.

(Β) Αριστερά πλαίσια: έκφραση του dsRed στον ιππόκαμπο ποντικού. Αντιπροσωπευτικές εικόνες IF χαμηλής και υψηλής μεγέθυνσης του ιππόκαμπου από ποντίκια μολυσμένα με ανασυνδυασμένους φακοϊούς που εκφράζουν μόνο dsRed ως έλεγχο (αριστερή στήλη εικόνων) ή miR-466f-3p συν dsRed (δεξιά στήλη εικόνων). Οι περιοχές σε πλαίσιο των δύο κορυφαίων εικόνων μεγεθύνονται και φαίνονται παρακάτω. Ράβδοι ζυγαριάς, 100 χλστ. Οι διακεκομμένες γραμμές υποδεικνύουν τα όρια της ΓΔ. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI. GCL, κοκκώδης κυτταρική στιβάδα. ML, μοριακό στρώμα. Δεξί ιστόγραμμα, σχετικά επίπεδα έκφρασης miR-466f-3p σε ιππόκαμπο ποντικού που έχει μολυνθεί με έλεγχο που εκφράζει φακοϊό ή miR-466f-3p, όπως προσδιορίστηκε με RT-qPCR ( n=16 ανά ομάδα).

(Γ) Επιδόσεις MWM ποντικών μολυσμένων με διαφορετικούς ανασυνδυασμένους φακοϊούς, συσκευασμένες με τη χρήση πέντε διαφορετικών πλασμιδίων που εκφράζουν dsRed-only, miR-466f-3p, mut-miR-466f{ {5}}p, και miR/SCR-σπόγγοι, αντίστοιχα, στον ιππόκαμπό τους (n=13, 26, 16, 19 και 11 ανά ομάδα, αντίστοιχα). Αριστερό πλαίσιο: λανθάνουσα κατάσταση διαφυγής κατά τη διάρκεια της εκπαίδευσης. Δεξί πλαίσιο: μεμονωμένος λανθάνοντας χρόνος διαφυγής στην 6η συνεδρία.

Τα δεδομένα που φαίνονται στο (Β) παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD και τα δεδομένα που φαίνονται στο (C) παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. Η στατιστική σημασία αξιολογήθηκε με μη ζευγαρωμένη δοκιμή t (B), αμφίδρομη ANOVA με Bonferroni post hoc σύγκριση (C, αριστερό πλαίσιο) ή one-ANOVA με δοκιμασία post hoc Tukey (C, δεξιός πίνακας). Στατιστικές διαφορές: #p < 0.05,="" **/##p="">< 0.01="" και="" ****p="">< 0,0001;="" *mir-466f-3p="" έναντι="" άλλων;="" #mir-σφουγγάρι="" έναντι="">

νευρώνες στον ιππόκαμπο ποντικού GLN και PLN (Εικόνα S3). Αυτά τα ευρήματα αποδεικνύουν ότι η ανοδική ρύθμιση του miR-466f-3p του ιππόκαμπου προάγει την ανάπτυξη νευρίτη και τον σχηματισμό δενδριτικής σπονδυλικής στήλης, ο οποίος είναι παρόμοιος με την επαγωγή της πυκνότητας της σπονδυλικής στήλης που παρατηρείται στον ιππόκαμπο των ποντικών GLN σε σχέση με τα ποντίκια PLN.

Το miR-466f-3p διαμορφώνει θετικά τη χωρική εκμάθηση του ποντικιού καιμνήμηαπόδοση, καθώς και συναπτική πλαστικότητα

Για να διερευνηθεί εάν το miR-466f-3p ρυθμίζει θετικά τη χωρική εκμάθηση του ποντικιού καιμνήμησχηματισμό, χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση μόλυνσης από ανασυνδυασμένο φακοϊό για την υπερέκφραση του miRNA στον ιππόκαμπο του ποντικού. Τα ποντίκια αναλύθηκαν 7 ημέρες μετά την ένεση του φακοϊού στο DG (Εικόνα 3Α). Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των επιπέδων έκφρασης του ισχίου του miR-466f-3p ήταν πράγματι αυξημένες στην ομάδα υπερέκφρασης miR{-466f-3p σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (δεξί ιστόγραμμα στο Σχήμα 3Β). Βρήκαμε ότι τα ποντίκια με υπερέκφραση του ιππόκαμπου miR-466f- 3p και που υποβλήθηκαν στην εργασία MWM εμφάνισαν καθυστερήσεις διαφυγής 88 ± 5 δευτερόλεπτα στην 1η συνεδρία και 19 ± 1 δευτερόλεπτο στην 6η συνεδρία (κόκκινο κουκκίδα, Εικόνα 3C), τα οποία ήταν καλύτερα από ποντίκια ελέγχου φορέα (μαύρη γραμμή) ή μεταλλαγμένα ποντίκια ελέγχου (κόκκινη γραμμή κύκλου) και παρόμοια με τις καθυστερήσεις διαφυγής των ποντικών GLN που περιγράφονται στο Σχήμα 1Α. Παράλληλα, εξετάσαμε την επίδραση της απώλειας λειτουργίας miR{-466f-3p στη χωρική μάθηση καιμνήμηαναστέλλοντας το miR-466f-3p χρησιμοποιώντας το σφουγγάρι miR. Συγκεκριμένα, η απόδοση MWM των ποντικών στα οποία ο ιππόκαμπος miR-466f-3p παγιδεύτηκε από το σφουγγάρι miR ήταν παρόμοια με αυτή των ποντικών PLN, δηλαδή, δεν έμαθαν να βρίσκουν την πλατφόρμα ακόμη και η τελευταία συνεδρία (συμπαγή πράσινη τετράγωνη γραμμή,

Εικόνα 3Γ). Επιπλέον, τα ποντίκια στα οποία έγινε ένεση φακοϊού δεν φάνηκε να έχουν διαταράξει την ομοιοστατική πλαστικότητα, καθώς ορισμένα ποντίκια σε κάθε ομάδα είχαν μάθει ή τουλάχιστον βρίσκονταν σε διαδικασία μάθησης κατά την τελευταία συνεδρία (Εικόνα 3C, δεξιό ιστόγραμμα).

Δεδομένου ότι η υπερέκφραση του miR-466f-3p στον ιππόκαμπο του ποντικιού ενίσχυσε τη μάθησή τους καιμνήμηικανότητα, αναλύσαμε τη συγκριτική ηλεκτροφυσιολογία καλλιεργημένων νευρώνων του ιππόκαμπου που εκφράζουν διαφορετικά επίπεδα miR-466f-3p. Το μικροσκοπικό διεγερτικό μετασυναπτικό ρεύμα (mEPSC) από τους νευρώνες του ιππόκαμπου DIV14 που υπερεκφράζουν miR-466f-3p ή mut-miR-466f-3p, miR-σπόγγος ή έλεγχος ήταν καταγράφηκε χρησιμοποιώντας σφιγκτήρες εμπλάστρου ολόκληρων κυττάρων. Ενώ δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στο πλάτος του mEPSC, στην αύξηση του Tau ή στην αποσύνθεση του Tau μεταξύ των τεσσάρων σετ δειγμάτων, η συχνότητα mEPSC των νευρώνων που υπερέκφραζαν miR-466f{-3p ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με άλλες ομάδες (Εικόνα 4Α), υποδεικνύοντας ότι οι μετασυναπτικοί γλουταμινεργικοί υποδοχείς ενεργοποιήθηκαν πιο έντονα κατά την υπερέκφραση miR-466f- 3p.

Στη συνέχεια μετρήσαμε τη μακροπρόθεσμη ενίσχυση (LTP) για να προσδιορίσουμε άμεσα τον ρόλο του miR-466f-3p στη συναπτική πλαστικότητα in vivo. Εμείς εγχύαμε τον ιππόκαμπο των ποντικών με ανασυνδυασμένο ιό φακού όπως περιγράφεται στο Σχήμα 3 και στη συνέχεια προκαλέσαμε LTP σε φέτες ιπποκαμπώνων με τετανική διέγερση (τρεις αμαξοστοιχίες διέγερσης υψηλής συχνότητας [3xHFS]) της παράπλευρης οδού Schaffer. Βρήκαμε ότι το πρωτόκολλό μας προκάλεσε LTP σε όλες τις ομάδες, όπως αποδεικνύεται από την επίμονη αύξηση των διεγερτικών μετασυναπτικών δυναμικών πεδίου (fEPSPs) στην περιοχή cornu ammonis 1 (CA1) (Εικόνα 4Β, αριστερό πλαίσιο). Το LTP ήταν ισχυρότερο σε φέτες miR-466f-3 που υπερέκφραζαν p (188 τοις εκατό ± 2 τοις εκατό της βασικής γραμμής στα 40-50 λεπτά μετά τη διέγερση, μέσος όρος ± SEM) σε σύγκριση με το μεταλλαγμένο (169 τοις εκατό ± 1 τοις εκατό της βασικής γραμμής), SCR-σπόγγος (173 τοις εκατό ± 3 τοις εκατό της βασικής γραμμής) και φέτες μολυσμένες με ιούς ελέγχου (159 τοις εκατό ± 2 τοις εκατό της βασικής γραμμής), ως αναστολή miR{-466f-3p από Το miR-sponge μείωσε το LTP (128 τοις εκατό ± 1 τοις εκατό της γραμμής βάσης) σε σχέση με τους ελέγχους (Εικόνα 4Β, δεξιός πίνακας). Μετρήσαμε επίσης το LTP των ομάδων GLN και PLN μετά την προπόνηση. Τα αντίστοιχα δεδομένα αποκάλυψαν επίσης σημαντικές διαφορές στην κλίση του fEPSP στην περιοχή CA1 μεταξύ των ομάδων GLN και PLN (Εικόνα 4C). Έτσι, ένα αυξημένο επίπεδο miR-466f{-3p ενισχύει το LTP και τη συναπτική πλαστικότητα που, με τη σειρά του, μπορεί να προωθήσει τη μάθηση καιμνήμηικανότητα των ποντικών. Μαζί, τα δεδομένα που παρουσιάζονται στα σχήματα 2, 3 και 4 δείχνουν ότι το miR-466f-3p παίζει κρίσιμο θετικό ρόλο στη χωρική μάθηση καιμνήμησχηματισμό, πιθανότατα με την ενίσχυση του σχηματισμού της σπονδυλικής στήλης, του LTP και της δύναμης της συναπτικής πλαστικότητας.

Το Mef2a mRNA είναι ένας ρυθμιστικός στόχος του miR-466f-3p

Πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση βιοπληροφορικής για να αναγνωρίσουμε πιθανά mRNA-στόχους που ρυθμίζονται με τη σύνδεση του miR-466f-3p στα 30 UTR τους. Μεταξύ των υποψηφίων που προσδιορίσαμε ήταν το mRNA Mef2a που κωδικοποιεί το MEF2A. Είναι ενδιαφέρον ότι η έκφραση MEF2A είχε προηγουμένως βρεθεί ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά την εκπαίδευση MWM και η υπερέκφραση αυτού του παράγοντα άσκησε αρνητική επίδραση στις επιδόσεις των ποντικών (Cole et al., 2012). Επομένως, χρησιμοποιήσαμε μια δοκιμασία αναφοράς λουσιφεράσης για να εξετάσουμε εάν το miR-466f-3p ρυθμίζει τη μετάφραση του mRNA του Mef2a δεσμεύοντας στο 30 UTR του. Εισαγάγαμε άγριου τύπου ή μεταλλαγμένες αλληλουχίες Mef2a 30 UTR κατάντη ενός cDNA λουσιφεράσης που βασίζεται σε SV40-προαγωγέα (Luc), με αποτέλεσμα το πλασμίδιο αναφοράς psiCHECK2-MEF2A 30 UTR ή psiCHECK{{19} mut-MEF2A 30 UTR (Εικόνα 5Α). Όπως φαίνεται στο αριστερό ιστόγραμμα του Σχήματος 5Β, η συνέκφραση του miR{-466f{-3p μείωσε την έκφραση της λουσιφεράσης που κατευθύνεται από το Mef2a 30 UTR. Αυτό το φαινόμενο φάνηκε να εξαρτάται από την αλληλεπίδραση μεταξύ του miR{-466f-3p και του Mef2a 30 UTR αφού η μετάλλαξη είτε της προβλεπόμενης θέσης δέσμευσης του miR{-466f-3p σε το Mef2a 30 UTR (50-UGU- GUAU-30) ή την περιοχή σπόρου miR-466f-3p (50-AUACACA-30) Η αναγνώριση του Mef2a 30 UTR ακύρωσε την ανασταλτική επίδραση του miR{-466f{-3p στη δραστηριότητα της λουσιφεράσης (Εικόνα 5Β, μεσαίο ιστόγραμμα). Επιπλέον, η συνέκφραση του σπόγγου miR, αλλά όχι του σπόγγου CR, εξάλειψε επίσης την κατασταλτική επίδραση του miR{-466f-3p στη δραστηριότητα της λουσιφεράσης (Εικόνα 5Β, δεξιό ιστόγραμμα). Σημειωτέον, ούτε η υπερέκφραση του miR{-466f{-3p ούτε ο σπόγγος miR είχαν καμία επίδραση στα επίπεδα του mRNA Mef2a στους πρωτογενείς νευρώνες του ιππόκαμπου (Εικόνα 5C), αλλά μείωσαν ή αύξησαν, αντίστοιχα, το επίπεδο πρωτεΐνης MEF2A (Εικόνα 5D). Βρήκαμε επίσης ότι η υπερέκφραση του miR{-466f{-3p ή του σπόγγου miR, αντίστοιχα, μείωσε ή ρύθμισε προς τα πάνω το επίπεδο mRNA της ρυθμιζόμενης από τη δραστηριότητα κυτταροσκελετικής πρωτεΐνης (Arc) στους πρωτογενείς νευρώνες του ιππόκαμπου (Εικόνα 5C) , ο οποίος ήταν ένας γνωστός κατάντη στόχος που ρυθμίστηκε θετικά από το MEF2A (Flavell et al., 2006)

Πραγματοποιήσαμε επίσης υβριδισμό φθορισμού in situ (FISH) για να ανιχνεύσουμε το miR-466f-3p και το συνδυάσαμε με την επισήμανση IF του MEF2A σε πρωτεύοντες νευρώνες ιππόκαμπου DIV14 χωρίς ή με θεραπεία με φορσκολίνη. Η φορσκολίνη είναι γνωστό ότι επάγει τη χημική LTP και ενεργοποιεί την αδενυλυλοκυκλάση, αυξάνοντας έτσι τα ενδοκυτταρικά επίπεδα cAMP. Παρατηρήσαμε πυρηνικό εντοπισμό του MEF2A με miR-466f- 3p, όπως φαίνεται από τις αντιπροσωπευτικές εικόνες στο Σχήμα 5Ε. Μετά τη διέγερση με φορσκολίνη, ωστόσο, το σήμα miR-466f-3p αυξήθηκε τόσο στο σώμα όσο και στους δενδρίτες, ενώ το σήμα MEF2A στο

ο πυρήνας μειώθηκε, όπως φαίνεται από τις αμοιβαίες αλλαγές των εντάσεων των σημάτων MEF2A και Fast Red, αντίστοιχα, των μεμονωμένων νευρωνικών κυττάρων (Εικόνα 5Ε). Συνολικά, τα δεδομένα στα Σχήματα 5Α-5Ε υποδεικνύουν ότι το miR-466f-3p ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση της πρωτεΐνης MEF2A δεσμεύοντας στο 30 UTR του mRNA του Mef2a και συνεπώς καταστέλλοντας τη μετάφρασή του.

Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που περιγράφηκαν παραπάνω, βρήκαμε ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης MEF2A στον ιππόκαμπο ήταν μειωμένα σε ποντίκια GLN μετά από προπόνηση MWM, αλλά όχι σε ποντίκια PLN (Εικόνα 5ΣΤ). Επιπλέον, τα σχετικά επίπεδα του MEF2A σε μεμονωμένα ποντίκια GLN (κουκκίδες) και ποντίκια PLN (τετράγωνα) συσχετίστηκαν αντιστρόφως με τα επίπεδα miR-466f-3p (R=0.60, Εικόνα 5G). Έτσι, ετερογενή πρότυπα χωρικής μάθησης καιμνήμηΗ ικανότητα ρυθμίζεται από στοχαστικές αυξήσεις του miR- 466f-3p του ιππόκαμπου σε μεμονωμένα ποντίκια και επακόλουθες μειώσεις του MEF2A κατά τη διέγερση της νευρωνικής δραστηριότητας.

Στοχαστική ενεργοποίηση του CREB του ιππόκαμπου και επακόλουθη μεταγραφική ανοδική ρύθμιση του συμπλέγματος miR- 466-669 κατά τη διάρκεια της εκπαίδευσης MWM

Ερευνήσαμε τους μηχανισμούς με τους οποίους τοmiR-466f-3p στον ιππόκαμπο του ποντικιού θα μπορούσε να ρυθμιστεί στοχαστικά προς τα πάνω από την εργασία MWM. Υπάρχουν τρεις πρόδρομοι miRNA που κωδικοποιούν το miR-466f-3p, και όλοι ανήκουν στο σύμπλεγμα miR-466-669 που είναι ειδικό για τρωκτικό που βρίσκεται στο εσώνιο 10 του γονιδίου του ξενιστή, mSfmbt2 (Inoue et al ., 2017) (Εικόνα 6Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε αντίθεση με το miR-466f-3p, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης του mSfmbt2 μεταξύ των ομάδων GLNandPLN(Εικόνα 6Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι το σύμπλεγμα miR-466-669 μπορεί να κωδικοποιεί μια ξεχωριστή μεταγραφή αντί να αποτελεί μέρος της κύριας μεταγραφής του mSfmbt2. Αντίστοιχα, σχεδιάσαμε πολλά σετ εκκινητών για να αναγνωρίσουμε το υποτιθέμενο πρωτεύον μεταγράφημα του συμπλέγματος miR-466-669 με RT-qPCR. Όπως απεικονίζεται στο σχήμα 6Α, ένα μακρύ θραύσμα PCR (συν 282 έως 2.381), μαζί με μια σειρά από επικαλυπτόμενες ταινίες qPCR, συγκεκριμένα Α (συν 282 έως 115), Β (131 έως 406), C (388 έως 686), D ( 662 έως 1.028), E (1.004 έως 1.299), F (1.242 έως 1.629), G (1.605 έως 2.029) και H(2.005 έως 2.381), θα μπορούσαν να ανιχνευθούν στον ιππόκαμπο ποντικού, αλλά όχι στον ιππόκαμπο ποντικιού, αλλά όχι στον 2,3706 έως ) (δεν εμφανίζονται τα δεδομένα). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν ότι το σύμπλεγμα miR{-466-669 κωδικοποίησε μια μακρά μεταγραφή κοντά σε περίπου 2.388 bp ανάντη του πρώτου προδρόμου miRNA (δηλαδή, pre-mir-466m, που συμβολίζεται συν 1στο Σχήμα 6Α). Είναι αξιοσημείωτο ότι, παρόμοιο με αυτό που βρήκαμε για το miR{-466f-3p, το μέσο επίπεδο αυτής της μεταγραφής στον ιππόκαμπο των ποντικών GLN ήταν υψηλότερο από ό,τι για τα ποντίκια PLN (Εικόνα 6Γ). Έτσι, ενισχυμένη μάθηση καιμνήμηΗ ικανότητα των ποντικών GLN οφείλεται στη μεταγραφική ενεργοποίηση του συμπλέγματος miR-466-669.

Η ενεργοποίηση του πυρηνικού CREB με φωσφορυλίωση κατά τη διάρκεια εργασιών MWM ή σε άλλες μορφές μάθησης είναι ένα κρίσιμο βήμα για τη μετατροπή της βραχυπρόθεσμης σε μακροπρόθεσμημνήμη(Lisman et al., 2018; Roger-son et al., 2014). Επομένως, ερευνήσαμε εάν τα διαφορετικά επίπεδα miR-466f-3p μεταξύ μεμονωμένων ποντικών που υποβλήθηκαν στην εργασία MWM μπορεί να συσχετίζονται με την κατάσταση ενεργοποίησης του CREB. Για να διερευνήσουμε αυτή την ιδέα, πρώτα εξετάσαμε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του CREB του ιππόκαμπου σε μεμονωμένα ποντίκια. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Δ, η ενεργοποίηση CREB (με φωσφορυλίωση στο υπόλειμμα S-133) ενισχύθηκε σε ποντικούς GLN σε σχέση με ποντίκια PLN και HC. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι το miR-466f-3p συνεκφράστηκε πράγματι με το pCREB σε νευρώνες πραγματοποιώντας miRNA ISH σε συνδυασμό με χρώση IF του pCREB και του MAP2 σε πρωτογενείς νευρώνες του ιππόκαμπου (Εικόνα S2A). Επιπλέον, τα πρωτεύοντα επίπεδα μεταγραφής της ομάδας miR- 466-669 συσχετίστηκαν θετικά με το pCREB σε ποντίκια GLN (R=0.52), ενώ συσχετίστηκαν αρνητικά με το pCREB σε ποντίκια PLN (R=0 .71) (Εικόνα 6Ε). Ελέγξαμε για συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων ενός άλλου ενεργού παράγοντα, της φωσφο-εξωκυτταρικής κινάσης ρυθμιζόμενης με σήμα (pERK) και των επιπέδων πρωτογενούς μεταγραφής του συμπλέγματος miR{-466-669. Βρήκαμε ότι και οι δύο τύποι ποντικών που εκπαιδεύτηκαν με MWM παρουσίασαν θετικές συσχετίσεις μεταξύ του σήματος συμπλέγματος miR{-466-669 και του pERK (R=0.59 και 0.48, αντίστοιχα· Εικόνα S4A) και δεν υπήρχε διαφορά στο pERK/ Έκφραση tERK μεταξύ αυτών των δύο ομάδων (Εικόνα S4B). Για να αποσαφηνιστεί περαιτέρω ο αντίκτυπος της ενεργοποίησης του CREB στη μεταγραφική ανώτατη ρύθμιση του συμπλέγματος-466-669και, κατά συνέπεια,

inductionofmiR-466f-3p,weusedaspecicCREBinhibitor,666- 15 (Xie et al., 2015), σε συνδυασμό με θεραπεία με φορσκολίνη των πρωτογενών νευρώνων του ιππόκαμπου DIV14. Η φορσκολίνη είναι γνωστό ότι ενεργοποιεί τη φωσφορυλίωση CREB (Malhotra et al., 2015). Βρήκαμε ότι η προθεραπεία των πρωτογενών νευρώνων του ιππόκαμπου με 666-15 απέκλεισε την επαγόμενη από φορσκολίνη ενεργοποίηση CREB (Εικόνα 6F) και μείωσε τα επίπεδα του συμπλέγματος miR-466f{-3p και miR-466-669 μεταγραφή (Εικόνες 6G και 6H). Ταυτόχρονα, τα επίπεδα mRNA των γνωστών γονιδίων-στόχων pCREB nurr1 και homer1a (Bridi et al., 2017; Jensen et al., 2017) μειώθηκαν επίσης κατά τη θεραπεία με 666-15 (Εικόνα 6Η). Συνολικά, το σχήμα 6 δείχνει ότι η στοχαστική ενεργοποίηση του CREB στον ιππόκαμπο ενός υποπληθυσμού αμιγών ποντικών που υποβάλλονται σε εργασία MWM προκαλεί μεταγραφή του συμπλέγματος miR{-466-669 και, κατά συνέπεια, επαγωγή miR-466f{{23 }}p, ενισχύοντας έτσι τη χωρική μάθησή τους καιμνήμηικανότητα για καλύτερη απόδοση στην εργασία.

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Εξερευνήσαμε τον πιθανό ρόλο των miRNAs στη διαμόρφωση της ποικίλης ικανότητας της χωρικής μάθησης καιμνήμημεταξύ συγγενών ποντικών C57BL/6J. Προτείνουμε ότι η στοχαστική ενεργοποίηση του CREB και η επακόλουθη ανοδική ρύθμιση του miR-466f-3p του ιππόκαμπου ευθύνεται για τη μεγαλύτερη χωρική μάθηση καιμνήμηικανότητα μιας υποομάδας των δοκιμαστικών μας ποντικών, πιθανότατα λόγω του miR-466f-3p που μεσολαβεί στη μεταφραστική αναστολή του Mef2a mRNA που κωδικοποιεί τομνήμηαρνητικός ρυθμιστής MEF2A. Τα ευρήματά μας παρέχουν ένα σενάριο που δείχνει τον λειτουργικό και εξελικτικό ρόλο ενός συγκεκριμένου miRNA στη ρύθμιση της γνωστικής λειτουργίας μέσω στοχαστικής επαγωγής ενός άξονα CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A από περιβαλλοντικά ερεθίσματα.

Η εργασία MWM έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για να εξετάσει τις ποικίλες δυνατότητες της χωρικής μάθησης καιμνήμηγια τρωκτικά. Υπό κανονικές συνθήκες, τα τρωκτικά χρησιμοποιούν απομακρυσμένες ενδείξεις για να προσανατολιστούν, επιτρέποντάς τους να μάθουν και να απομνημονεύσουν τη θέση της κρυμμένης πλατφόρμας στην εργασία. Τα περισσότερα από τα δοκιμαστικά ποντίκια C57BL/6J (62 τοις εκατό ) εμφάνισαν ένα κανονικό μοτίβο λανθάνοντος χρόνου διαφυγής, βρίσκοντας την πλατφόρμα εντός 30 δευτερολέπτων από τις συνεδρίες 3η-6η (Εικόνα 1A, GLN). Αντίθετα, μια ομάδα ποντικών (38 τοις εκατό ) δεν έμαθε την εργασία ακόμη και στην 6η συνεδρία (PLN). Σημειωτέον, υποβάλαμε επίσης τα ποντίκια σε δύο άλλα τεστ αναγνώρισης. Το πρώτο ήταν το νέο τεστ αναγνώρισης αντικειμένων (NOR), το οποίο είναι μια μεμονωμένη δοκιμή που βασίζεται στην έμφυτη εξερεύνηση χωρίς ενίσχυση ή άγχος για την παρακίνηση συμπεριφοράς (Leger et al., 2013). Η συσχέτιση μεταξύ των εργασιών NOR και MWM όσον αφορά τις επιδόσεις του ποντικιού είναι φτωχή (R {{1{{2{{0}}}}.13), η οποία είναι παρόμοια με τη συσχέτιση μεταξύ των επιδόσεων NOR και των επιπέδων έκφρασης του ιππόκαμπου από miR-466f-3p (R=0.01; τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Η δοκιμή NOR δεν αποκάλυψε επίσης διαφορές στον δείκτη διάκρισης μεταξύ των ομάδων MWM GLN και PLN (0,36 ± 0,25 έναντι 0,29 ± 0,18· Εικόνα S1B). Η άλλη χωρική μάθηση καιμνήμη-εξαρτώμενη εργασία που έχουμε εφαρμόσει είναι ο λαβύρινθος Barnes (BM), ο οποίος είναι παρόμοιος με τον MWM. Βασίζεται στην υπόθεση ότι τα τρωκτικά που τοποθετούνται σε ένα αποκρουστικό περιβάλλον πρέπει να μάθουν και να θυμούνται τη θέση ενός κουτιού διαφυγής που βρίσκεται κάτω από την επιφάνεια της πλατφόρμας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S1C, βρήκαμε ότι οι επιδόσεις σε ποντίκια στις δοκιμές ανιχνευτή BM συσχετίζονται επίσης θετικά με τα επίπεδα έκφρασης του ιππόκαμπου miR-466f-3p. Έτσι, επαγωγή του άξονα CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A στον ιππόκαμπο κατά τη διάρκεια της εκμάθησης καιμνήμηο σχηματισμός εξαρτάται χωρικά από το πλαίσιο.