ΜΕΡΟΣ 1 Το λιπόσωμα γλυκοσίδης φαινυλαιθανόλης αναστέλλει την επαγόμενη από PDGF ενεργοποίηση HSC μέσω ρύθμισης της οδού σηματοδότησης FAK/PI3K/Akt

Shi-Lei Zhang 1, Long Ma 1, Jun Zhao 2, Shu-Ping You 1, Xiao-Ting Ma 1, Xiao-Yan Ye και Tao Liu 1,*

1 Τμήμα Τοξικολογίας, Σχολή Δημόσιας Υγείας, Ιατρικό Πανεπιστήμιο Σιντζιάνγκ, Αυτόνομη Περιοχή Ουιγούρων Σιντζιάνγκ, Οδός Xinyi No.393, Urumqi 830011, Κίνα

2 Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of Materia Medica of Xinjiang, Xinjiang Uyghur Autonomous Region, Tianshan District, Xinhua South Road No. 140, Urumqi 830004, China

Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε με:Joanna.jia@wecistanche.com

Το Cistanche deserticola έχει πολλά αποτελέσματα, κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Αφηρημένη: Cistanche tubulosaείναι ένα παραδοσιακό κινέζικο φυτικό φάρμακο που χρησιμοποιείται ευρέως για τη ρύθμιση της ανοσίας καιφαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες(CPhGs) είναι από τα κύρια συστατικά που είναι υπεύθυνα για αυτή τη δραστηριότητα. Ωστόσο, η εφαρμογή των CPhG επηρεάζεται αρνητικά από την κακή απορρόφησή τους και τη χαμηλή από του στόματος χρήση. Η στοχευμένη χορήγηση φαρμάκων είναι μια σημαντική κατεύθυνση ανάπτυξης για τη φαρμακευτική. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα CPhGs θα μπορούσαν να εμποδίσουν την αγωγή των οδών σηματοδότησης στο TGF-p1/smad και να αναστείλουν την ενεργοποίηση των ηπατικών αστερικών κυττάρων (HSCs). Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει το αποτέλεσμα κατά της ηπατικής ίνωσης των λιποσωμάτων CPhG αναστέλλοντας την ενεργοποίηση HSC, προάγοντας την απόπτωση, μπλοκάροντας τον κυτταρικό κύκλο, καταστέλλοντας τη αγωγή των οδών σηματοδότησης στην κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK)/φωσφατιδυλινοσιτόλη{{3} κινάση (PI3K)/πρωτεϊνική κινάση Β(Akt), και τον προσδιορισμό τους είναι in vitro ηπατοπροστατευτική δράση. Μελέτες in vitro απελευθέρωσης έδειξαν ότι τα λιποσώματα CPhG έχουν αποτέλεσμα παρατεταμένης απελευθέρωσης σε σύγκριση με τα φαρμακευτικά CPhG. Ο πολλαπλασιασμός των HSC ανεστάλη μετά από επεξεργασία με τα λιποσώματα CPhG (29,45, 14,72, 7,36 ^g/mL), με τιμές IC50 42,54 Rg/mL στον προσδιορισμό ΜΤΤ. Διαφορετικές συγκεντρώσεις των λιποσωμάτων CPhG θα μπορούσαν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των HSC, να προάγουν την απόπτωση και να μπλοκάρουν τον κυτταρικό κύκλο. Η μέθοδος ΜΤΤ έδειξε μια προφανή αναστολή του πολλαπλασιασμού των HSC μετά από θεραπεία με λιπόσωμα CPhG και ανασυνδυασμένου αρουραίου που προέρχεται από αιμοπετάλια αυξητικού παράγοντα-ΒΒ(rrPDGF-BB). Τα επίπεδα του κολλαγόνου-1, του αναστολέα μεταλλοπεπτιδάσης 1 (TIMP-1), της ακτίνης των λείων μυών (a-SMA) και του φωσφορυλιωμένου PI3K/Akt μειώθηκαν και της μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας-1 (MMP{ {23}}) ρυθμίστηκε προς τα πάνω, με προεπεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις λιποσωμάτων CPhG. Επιπλέον, 29,45 Rg/mL λιποσωμάτων CPhG θα μπορούσαν να μειώσουν την έκφραση της πρωτεΐνης FAK και της φωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης PI3K και Akt κατάντη του FAK με υπερέκφραση του γονιδίου FAK. Αυτό το πείραμα προτείνει ότι τα λιποσώματα CPhG μπορεί να αναστείλουν την ενεργοποίηση των HSCs αναστέλλοντας το FAK και στη συνέχεια μειώνοντας την έκφραση του φωσφορυλιωμένου Akt/PI3K, παρέχοντας έτσι νέες γνώσεις σχετικά με την εφαρμογή των CPhG για ηπατική ίνωση.

Λέξεις-κλειδιά: φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδεςλιπόσωμα; ηπατικά αστερικά κύτταρα? πολλαπλασιασμός; απόπτωση; κυτταρικός κύκλος? FAK/PI3K/Akt,

παράγοντες, όπως ο TGF-p1, το αλκοόλ, οι τοξίνες και η στεάτωση, μπορεί να έχουν ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των HSCs. Το PDGF μπορεί επίσης να οδηγήσει στην ενεργοποίηση των HSCs [4]. Επί του παρόντος, οι θεραπευτικές στρατηγικές που στοχεύουν τα HSCs για την πρόληψη της ηπατικής ίνωσης περιλαμβάνουν την αναστολή της ενεργοποίησης, του πολλαπλασιασμού και του κυτταρικού κύκλου των HSCs, καθώς και τη διέγερση της απόπτωσης των HSCs [5].

Cistanche tubulosa(οικογένεια Orobanchaceae), ένα παρασιτικό φυτό, καλλιεργείται ευρέως στη νότια περιοχή του Xinjiang στην Κίνα.C. tubulosaέχει αποδειχθεί ότι παρουσιάζει διάφορες δραστηριότητες, όπως η ενίσχυση της ανοσίας του οργανισμού, η βελτίωση της αντοχής του οργανισμού, η θρέψη των νεφρών, η θεραπεία της ανικανότητας και η αύξηση της νοημοσύνης.

1. Εισαγωγή

έχει επίσης αντιοξειδωτικές και αντιγηραντικές ιδιότητες [6]. Αυτό το φυτό περιέχει φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (CPhGs), ιριδοειδή και πολυσακχαρίτες, εκ των οποίων τα CPhG είναι μερικά από τα κύρια ενεργά βιοενεργά είδη [7]. Σε μια προηγούμενη μελέτη, βρήκαμε ότι τα CPhGs μπορούσαν να εμποδίσουν την αγωγή των μονοπατιών σηματοδότησης στο TGF-p1/smad, να αναστείλουν την ενεργοποίηση των HSC και να ασκήσουν προληπτικά αποτελέσματα στην ηπατική ίνωση που προκαλείται από αλβουμίνη ορού βοοειδών σε αρουραίους [7,8]. Ωστόσο, τα CPhGs έχουν καλή υδατοδιαλυτότητα και φτωχή διαλυτότητα στα λιπίδια και επηρεάζονται από εξωτερικούς παράγοντες όπως η οξύτητα και τα ένζυμα αποσύνθεσης, τα οποία μειώνουν τη σταθερότητα και την αποτελεσματικότητα των CPhG [9]. Μετά την ενδογαστρική χορήγηση, τα CPhG είναι ασταθή στη γαστρεντερική οδό των αρουραίων και η υδρόλυση των δεσμών γλυκοσίδης θα μπορούσε εύκολα να συμβεί. Η από του στόματος βιοδιαθεσιμότητα των αρουραίων ήταν μόνο 0,83 τοις εκατό, επομένως είναι δύσκολο να προσδιοριστεί ο θεραπευτικός τους ρόλος [10]. Ως εκ τούτου, πρέπει να βρούμε ένα ασφαλές, αποτελεσματικό, σταθερό και στοχευμένο αντιινωτικό φάρμακο για τα HSCs για να βελτιώσουμε τη θεραπευτική τους αποτελεσματικότητα. Τα συστήματα χορήγησης φαρμάκων νανοσωματιδίων παρέχουν μια εναλλακτική στρατηγική για την αντιμετώπιση αυτών των ελλείψεων λόγω των πλεονεκτημάτων τους, συμπεριλαμβανομένης της υψηλής ικανότητας φόρτωσης φαρμάκου και της μεγάλης κυκλοφορίας του αίματος [11]. Έχουν ισχυρή συγγένεια με το ήπαρ και μπορούν να μεταφέρουν άμεσα φάρμακα στα κύτταρα μέσω ενδοκυττάρωσης και σύντηξης. Τα μη τροποποιημένα λιποσώματα κατανέμονται κυρίως στους ιστούς ή τα όργανα που αναπτύσσονται από το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα (RES) και έχουν τη λειτουργία της παθητικής στόχευσης του ήπατος [12]. Ως εκ τούτου, τα λιποσώματα CPhG παρασκευάστηκαν με διασπορά μεμβράνης και δευτερεύουσα ενθυλάκωση για να παρέχουν ένα αποτέλεσμα κατά της ίνωσης. Σε αυτή τη μελέτη, στοχεύσαμε να διερευνήσουμε τις επιδράσεις των λιποσωμάτων CPhG στον πολλαπλασιασμό των HSC, την απόπτωση και τον κυτταρικό κύκλο, καθώς και τους μηχανισμούς του.

2. Αποτελέσματα

2.1. Φυσικές ιδιότητες του λιποσώματος CphG

Οι φυσικές ιδιότητες των όπως παρασκευασμένων λιποσωμάτων CPhG ήταν οι εξής: Το μέγεθος σωματιδίου ήταν (216,7 ± 3,47) nm, το δυναμικό Ζήτα ήταν (-55},6 ± 1,3) mV. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, τα σωματίδια ήταν στρογγυλά, επικαλυμμένα με ομοιόμορφο πάχος στην επιφάνεια και η κατανομή του μεγέθους των σωματιδίων ήταν ομοιόμορφη. Η αποτελεσματικότητα φόρτωσης φαρμάκου και ενθυλάκωσης των λιποσωμάτων CPhG ήταν (3,71 ± 0},32) τοις εκατό και (38,46 έως 7,85) τοις εκατό.

2.2. In vitro Απελευθέρωση από τα λιποσώματα και τα CPhG CPhG

Ο εκτιμώμενος ρυθμός αθροιστικής απελευθέρωσης υπολογίστηκε και σχεδιάστηκε ως συνάρτηση του χρόνου για τα λιποσώματα και τα CPhG CPhG (Εικόνα 2). Στην παρούσα μελέτη; ο ρυθμός απελευθέρωσης των CPhGs μετά από 12 ώρες κανονικοποιήθηκε στο 100 τοις εκατό, ενώ αυτός των λιποσωμάτων CPhG ήταν κοντά στο 100 τοις εκατό μετά από 24 ώρες, και ο ρυθμός απελευθέρωσης των CPhG αυξήθηκε με το χρόνο. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας διαφορετικά μοντέλα προσαρμογής για τους μηχανισμούς ελεγχόμενης απελευθέρωσης, συμπεριλαμβανομένων των εξισώσεων μηδενικής τάξης, πρώτης τάξης και Higuchi. Οι προσαρμοσμένες εξισώσεις και οι συντελεστές συσχέτισης για τα τρία μοντέλα απελευθέρωσης φαίνονται στον Πίνακα 1.

Το καλύτερο μοντέλο που ταιριάζει για τα CPhG και τα λιποσώματα CPhG είναι οι εξισώσεις Higuchi και πρώτης τάξης. Η in vitro μελέτη απελευθέρωσης των λιποσωμάτων CPhG δεν έδειξε κανένα αποτέλεσμα έκρηξης. Η καλύτερη συνάρτηση κατανομής επιλέχθηκε για τον υπολογισμό των παραμέτρων διάλυσης T50 (διάλυση 50 τοις εκατό ). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο μέσος χρόνος κατακράτησης των λιποσωμάτων CPhG είναι μεγαλύτερος από εκείνον των CPhG και το Τ50 των λιποσωμάτων CPhG είναι 9,39 ώρες. Σε σύγκριση με τις 1,69 ώρες για τα CPhG, τα λιποσώματα CPhG εμφανίζουν προφανές αποτέλεσμα παρατεταμένης αποδέσμευσης (Πίνακας 2).

Διερευνήσαμε αρχικά τις κυτταροτοξικές επιδράσεις των λιποσωμάτων CPhG στα HSCs με έναν προσδιορισμό MTT in vitro. Τα HSC εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις των λιποσωμάτων CPhG, που κυμαίνονταν από 0 έως 117,79 卩g/mL για 24 ώρες. Τα λιποσώματα CPhG μείωσαν τη βιωσιμότητα των HSC με δοσοεξαρτώμενο τρόπο και η τιμή IC50 τους ήταν 42,535 (π.χ./mL. Η επίδραση των λιποσωμάτων CPhG (29,45, 14,72 και 7,36 ^g/mL) στα κύτταρα στους 24, Οι 48 και 72 ώρες φαίνονται στο Σχήμα 3. Μετά την επεξεργασία με τα λιποσώματα CPhG, ο πολλαπλασιασμός των HSCs παρεμποδίστηκε σημαντικά σε διαφορετικά χρονικά σημεία (Εικόνα 3).

Η απελευθέρωση γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) των HSCs ανιχνεύθηκε μετά από 24 ώρες θεραπείας με διαφορετικές συγκεντρώσεις του λιποσώματος CPhG. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 3. Τα HSC που υποβλήθηκαν σε αγωγή με τα λιποσώματα CPhG δεν είχαν σημαντική επίδραση στην απελευθέρωση LDH.

2.4. Τα λιποσώματα CPhG προκαλούν απόπτωση των HSCs και σταματούν τον κυτταρικό κύκλο

Τα HSC εκτέθηκαν στα λιποσώματα CPhG (29,45, 14,72, 7,36 μg/mL) για 24 ώρες και διεξήχθη διπλή χρώση με αννεξίνη-V-FITC/PE για την ανίχνευση της απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4α. Η συνολική απόπτωση των κυττάρων αυξήθηκε στατιστικά σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (p < 0.05).="" μετά="" από="" 24="" ώρες="" θεραπείας="" σε="" hscs="" για="" κάθε="" ομάδα="" δόσης,="" τα="" λιποσώματα="" cphg="" (29,45="" ^g/ml)="" μπορούσαν="" να="" προκαλέσουν="" όψιμη="" απόπτωση="" των="" hscs="" και="" το="" ποσοστό="" των="" όψιμων="" αποπτωτικών="" κυττάρων="" ήταν="" υψηλότερο="" από="" αυτό="" των="" πρώιμων="" αποπτωτικών="" κυττάρων.="" το="" ποσοστό="" των="" πρώιμων="" αποπτωτικών="" κυττάρων="" ήταν="" πολύ="" υψηλότερο="" από="" τα="" όψιμα="" αποπτωτικά="" κύτταρα="" στις="" ομάδες="" που="" έλαβαν="" αγωγή="" με="" λιπόσωμα="" cphg="" (14,72="" και="" 7,36="" |^g/ml).="" αυτά="" τα="" αποτελέσματα="" δείχνουν="" ξεκάθαρα="" ότι="" τα="" λιποσώματα="" cphg="" επάγουν="" απόπτωση="" ηπατοκυττάρων,="" ειδικά="" στα="" τελευταία="" στάδια="" των="" hscs.="" επιπλέον,="" η="" ολική="" απόπτωση="" αυξήθηκε="" με="" τη="" δόση="" των="" λιποσωμάτων="" cphg.="" αυτά="" τα="" αποτελέσματα="" υποδηλώνουν="" ότι="" τα="" λιποσώματα="" cphg="" μπορούν="" να="" αναστείλουν="" την="" ενεργοποίηση="" των="" hscs="" και="" την="" ηπατική="" ίνωση="" προκαλώντας="" την="" απόπτωση="" των="">

Για να προσδιοριστεί η επίδραση των λιποσωμάτων CPhG στον κυτταρικό κύκλο των HSCs, τα HSC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τα λιποσώματα CPhG σε συγκεντρώσεις 29,45, 14,72 και 7,36 £/mL για 24 ώρες και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Εικόνα 4b). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αναλογία των κυττάρων στη φάση G0/G1 ήταν σημαντικά αυξημένη (p < {{{0}}.05),="" ενώ="" το="" ποσοστό="" των="" κυττάρων="" στη="" φάση="" s="" ήταν="" σημαντικά="" μειωμένη="" (p="">< 0,05).="" επιπλέον,="" η="" αναλογία="" των="" κυττάρων="" στη="" φάση="" g2/m="" μειώθηκε="" σημαντικά="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" ελέγχου=""><0.05). taken="" together,="" these="" results="" exhibit="" the="" cell="" cycle="" modulatory="" activity="" of="" the="" cphg="" liposomes="" in="" hscs,="" which="" may="" relate="" to="" their="" anti-proliferative="" and="" apoptosis-inducing="">

2.5. Μελέτη για τον μηχανισμό(-ους) δράσης των λιποσωμάτων C PhG In vitro

2.5.1. Τα λιποσώματα CPhG αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των HSC μέσω διέγερσης rrPDGF-BB

Για την περαιτέρω διερεύνηση των επιδράσεων των λιποσωμάτων CPhG στον πολλαπλασιασμό που διεγείρεται από τον rrPDGF-BB των HSCs, πραγματοποιήθηκε ανάλυση MTT για τη μέτρηση της βιωσιμότητας των HSC που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με προκαθορισμένες συγκεντρώσεις των λιποσωμάτων CPhG για 24, 48 και 72 ώρες ( Εικόνα 5).

Μετά από 24 ώρες θεραπείας με HSCs που διεγείρονται από rrPDGF-BB και 29,45,14,721 και 7,36 μ/mL των λιποσωμάτων CPhG, τα ποσοστά επιβίωσης των κυττάρων σε κάθε ομάδα δόσης ήταν 67,5 τοις εκατό, 75,3 τοις εκατό, και 89 τοις εκατό αντίστοιχα. Μετά από 48 ώρες, το ποσοστό επιβίωσης ήταν 49,2 τοις εκατό , 58,6 τοις εκατό και 73,5 τοις εκατό, αντίστοιχα, στα κύτταρα
για κάθε ομάδα δόσης. Μετά από 72 ώρες θεραπείας, τα ποσοστά επιβίωσης των κυττάρων σε κάθε ομάδα δόσης ήταν 45,3 τοις εκατό , 59,2 τοις εκατό και 79,2 τοις εκατό, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα λιποσώματα CPhG είχαν σημαντική ανασταλτική επίδραση στα HSCs που διεγείρονται από το rrPDGF-BB και αυτό το ανασταλτικό αποτέλεσμα έγινε πιο εμφανές καθώς αυξανόταν η δόση. Προτείνεται ότι η ανασταλτική δράση των λιποσωμάτων CPhG στα HSCs συμβάλλει στην αντι-πολλαπλασιαστική δράση του CPhGliposomo.

2.5.2. Τα λιποσώματα CPhG αναστέλλουν την ενεργοποίηση του HSC in vitro

Τα HSC στον χώρο του Disse παράγουν συστατικά ECM όπως το κολλαγόνο-1,(s-SMA και το κολλαγόνο III. Άλλοι παράγοντες που ρυθμίζουν την ανάπτυξη των ECM, όπως τα MMPs και TIMPs, παράγονται επίσης από τα HSC [5]. Για να διερευνήσουμε περαιτέρω τους μηχανισμούς που προκαλούνται από το rrPDGF-BB στα HSCs, αξιολογήσαμε την έκφραση πρωτεϊνών που σχετίζονται με ECM, συμπεριλαμβανομένων του κολλαγόνου-1, του Cosma, του κολλαγόνου III, του MMP-1 και του TIMP{{8} Το Σχήμα 6α δείχνει ότι οι ομάδες λιποσωμάτων CPhG (29.45, 14.72, 7.36 4g/mL) θα μπορούσαν να μειώσουν τα επίπεδα έκφρασης mRNA του κολλαγόνου-1, του a-SMA και του TIMP{{18} } και να αυξήσει το επίπεδο έκφρασης mRNA του MMP-1 περισσότερο από την ομάδα rrPDGF-BB.

Εικόνα 6. Επιδράσεις των λιποσωμάτων CPhG στις εκφράσεις κολλαγόνου-1, a-SMA, TIMP-1 και MMP-1 σε HSCs. (α) Η έκφραση mRNA του κολλαγόνου-1, a-SMA, TIMP-1 και MMP-1 σε HSC (δοκιμασία RT-PCR). (β) Η έκφραση πρωτεΐνης του κολλαγόνου{{1{0}} και του a-SMA. Α, η ομάδα ελέγχου. Β, η ομάδα που υποβλήθηκε σε αγωγή με rrPDGF-BB. C, η ομάδα που υποβλήθηκε σε αγωγή με rrPDGF-BB συν λιπόσωμα CphG 29,45 g/mL. D, το rrPDGF-BB συν CPhG λιπόσωμα 14,72(_ig/mL ομάδα που έχει υποστεί αγωγή· E, το rrPDGF-BB συν CPhG λιπόσωμα 7.3 6 卩g/m L αγωγή d ομάδα· Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση 土 SD . ** p < 0.01,="" σημαντικά="" διαφορετική="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" hsc="" που="" ενεργοποιείται="" με="" rrpdgf-bb.="" #="" p="">< 0,05,="" σημαντικά="" διαφορετική="" σε="" σχέση="" με="" την="" ομάδα="" ελέγχου.="" 6-ακτίνη.="" χρησιμοποιήθηκε="" ως="" εσωτερικός="">

Τα λιποσώματα CPhG αύξησαν επίσης τα επίπεδα mRNA του MMP-1. Τα επίπεδα του a-SMA και του κολλαγόνου-1 εκφράστηκαν σε μεγάλο βαθμό στα ενεργοποιημένα με rrPDGF-BB HSCs. Αντίθετα, τα λιποσώματα CPhG μείωσαν τα επίπεδα του a-SMA και του κολλαγόνου-1 (Εικόνα 6β). Ειδικά σε υψηλή συγκέντρωση (29,45 ^g/mL), το λιπόσωμα CPhG μείωσε την αυξημένη έκφραση κολλαγόνου-1 και a-SMA μέσω rrPDGF-BB.

2,53 λιποσώματα CPhG αναστέλλουν την οδό σηματοδότησης PI3K/Akt

Το PI3K/Akt είναι μια σημαντική οδός μεταγωγής σήματος που διαμεσολαβείται από υποδοχείς κινάσης τυροσίνης. Η οδός σηματοδότησης PI3K/Akt δρα ως αισθητήρας ως απόκριση σε εξωκυτταρικά ερεθίσματα και μεσολαβεί στα κυτταρικά σήματα, διαδραματίζοντας έτσι κρίσιμο ρόλο στην απόπτωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων επηρεάζοντας τη δραστηριότητα των μορίων τελεστών κατάντη [13]. Προκειμένου να επαληθευτεί εάν η οδός PI3K/Akt συμμετέχει στις επιδράσεις κατά του πολλαπλασιασμού των λιποσωμάτων CPhG στα HSCs, η έκφραση και τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του PI3K/Akt εξετάστηκαν με ανάλυση western blot. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα του p-PI3K και του p-Akt μειώνονταν σταθερά στα HSCs μετά από 24 ώρες θεραπείας με τα λιποσώματα CPhG, υποδεικνύοντας ότι τα αποτελέσματα κατά του πολλαπλασιασμού των λιποσωμάτων CPhG έναντι των HSC σχετίζονται με την απενεργοποίηση της οδού PI3K/Akt. , όπως φαίνεται στο Σχήμα 7.

2.5.4. Τα λιποσώματα CPhG μπορούν να μειώσουν-ρυθμίσουν την έκφραση των πρωτεϊνών της οδού PI3K / Akt στα HSC του πλασμιδίου υπερέκφρασης FAK με τη μεσολάβηση rrPDGF-BB

Το FAK είναι ένα κρίσιμο γονίδιο που ρυθμίζει το μονοπάτι σηματοδότησης PI3K/Akt. Το ενεργοποιημένο FAK μπορεί να φωσφορυλώσει το PI3K, το οποίο οδηγεί περαιτέρω στη φωσφορυλίωση του Akt. Το FAK μεσολαβεί στη μεταγωγή σήματος του υποδοχέα της τυροσίνης-πρωτεϊνικής κινάσης, της ιντεγκρίνης και άλλων οδών προς τα κύτταρα, τα οποία αποτελούν τη διασταύρωση και το κέντρο πολλών ενδοκυτταρικών οδών κατά την ενεργοποίηση των HSCs. Ως εκ τούτου, κάναμε εικασίες

ότι τα λιποσώματα CPhG μπορεί να καταστέλλουν τη δραστηριότητα της οδού σηματοδότησης PI3K/Akt μειώνοντας την ενεργοποίηση του FAK. Στη συνέχεια επιβεβαιώσαμε αυτήν την υπόθεση αποδεικνύοντας την υπερέκφραση του γονιδίου FAK.

(pEX{0}}NC) συν ομάδα λιποσώματος CPhG 29,45 Lg/mL μειώθηκε σημαντικά (ρ < 0,01).

estern blotting με ειδικά πρωτογενή αντισώματα. ** p < 0.01,="" σημαντικά="" διαφορετικό="" σε="" σύγκριση="">

η διέγερση rrPDGF-BB συν ομάδα pEX-3-FAK. συν p < 0.05,="" σημαντικά="" διαφορετική="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" που="" έλαβε="" θεραπεία="" με="" rrpdgf-bb.="" &="" p="">< 0,01,="" σημαντικά="" διαφορετική="" σε="" σύγκριση="" με="" τη="" διέγερση="">

συν ομάδα pEX-3-NC. -η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Το cistanche μπορεί να αντικαρκινικό

3. Συζήτηση

Τα CPhGs έχουν αποδειχθεί ότι έχουν μια ποικιλία βιολογικών δράσεων, συμπεριλαμβανομένης της αντιφλεγμονώδους δράσης [14,15], της δράσης κατά της οστεοπόρωσης [16,17], της καταπραϋντικής δράσης [18], της δράσης κατά της κόπωσης [19], μιας νευροπροστατευτικής δράσης 20] και ηπατοπροστατευτική δραστηριότητα [21,22]. Οι Yang et al. διαπίστωσε ότι ένα απόσπασμα απόC. tubulosaθα μπορούσε να καθυστερήσει σημαντικά την πρόοδο της πειραματικής χημικής ηπατικής ίνωσης αναστέλλοντας τη σύνθεση κολλαγόνου και μειώνοντας το οξειδωτικό στρες [22]. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα των CPhGs ως

Τα θερμοπροστατευτικά περιορίζονται από την κακή τους διαπερατότητα και τη χαμηλή βιοδιαθεσιμότητα [23]. Ως εκ τούτου, είναι απαραίτητο να επεκταθεί η εφαρμογή των CPhG με την ανάπτυξη ενός αποτελεσματικού συστήματος παράδοσης για να ξεπεραστούν αυτά τα εμπόδια.

Τα τελευταία χρόνια, τόσο η φαρμακευτική έρευνα όσο και η κλινική έρευνα έχουν επιβεβαιώσει ότι η χρήση νανοσωματιδίων ως φορείς φαρμάκων μπορεί να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου in vivo. Τα λιποσώματα είναι μερικά από τα πιο σημαντικά νανοσωματίδια [24].

Τα λιποσώματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φορείς φαρμάκων για την επιτυχή παροχή αντιφλεγμονωδών φαρμάκων, αντικαρκινικών φαρμάκων, αντιβιοτικών, αντιμυκητιασικών φαρμάκων και άλλων διαφορετικών κατηγοριών φαρμάκων [25]. Τα λιποσώματα μπορούν επίσης να βελτιώσουν τη σταθερότητα του φαρμάκου, να αυξήσουν τη διαλυτότητα του φαρμάκου και να προάγουν τη βιοσυμβατότητα [26]. Από την άλλη πλευρά, μελέτες έχουν δείξει ότι το σύστημα χορήγησης φαρμάκου των στερεών νανοσωματιδίων (στην περιοχή των 10-1000 nm) μπορεί να συγκεντρώσει το 80 τοις εκατό της δόσης του φαρμάκου στο ήπαρ, επιτρέποντας στο φάρμακο να εισέλθει τα ηπατικά κύτταρα [27]. Οι Jing Zhu et al. διαπίστωσαν ότι τα λιποσώματα γαλανίνης είχαν καλά αποτελέσματα στόχευσης του ήπατος [28]. Επομένως, η παθητική στόχευση των νανο-κινεζικών φαρμάκων μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία ηπατικών ασθενειών ή άλλων ασθενειών. Το μέγεθος σωματιδίων των λιποσωμάτων CPhG που παρασκευάστηκαν στην παρούσα μελέτη, το οποίο έχει ορισμένο βαθμό στόχευσης ήπατος, είναι (216,7 ± 3,47) nm. Η συμπεριφορά απελευθέρωσης φαρμάκων είναι μια σημαντική ιδιότητα των συστημάτων χορήγησης νανοφαρμάκων. Επειδή τα CPhG έχουν καλή υδατοδιαλυτότητα, ένα ρυθμιστικό διάλυμα PBS (pH=6.0) χρησιμοποιείται ως μέσο απελευθέρωσης. Από την καμπύλη απελευθέρωσης, μπορεί να φανεί ότι πριν από 2 ώρες, το ποσοστό της απελευθέρωσης των λιποσωμάτων CPhG ήταν μικρότερο από 40 τοις εκατό, δεν εμφανίστηκε ξαφνική απελευθέρωση και υπήρχε μια ορισμένη επίδραση παρατεταμένης αποδέσμευσης σε σύγκριση με την απελευθέρωση των CPhG. Από την προσαρμοσμένη εξίσωση καμπύλης απελευθέρωσης, η απελευθέρωση των λιποσωμάτων CPhG στο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών σε pH=6.0 είναι σύμφωνη με την εξίσωση Higuchi.

κιστανάκιμπορώαντι-απόπτωση

Σε χρόνιες ηπατικές παθήσεις, η συνεχής ενεργοποίηση των HSC οδηγεί σε ηπατική ίνωση [29]. Επομένως, η αναστολή της ενεργοποίησης, του πολλαπλασιασμού και του κυτταρικού κύκλου των HSC ή η πρόκληση απόπτωσης HSC, μπορεί να είναι ένα νέο σημείο εκκίνησης για τη στοχευμένη θεραπεία της ηπατικής ίνωσης [30-33]. Πολλές μελέτες έχουν βρει ότι η απόπτωση είναι το κλειδί για την αναστροφή της ηπατικής ίνωσης προάγοντας την απόπτωση [34]. Η ανάπτυξη ηπατικής ίνωσης εξαρτάται από την ενεργοποίηση των HSC, τα οποία μπορεί να προσφέρουν τη δυνατότητα να αναστέλλουν την ενεργοποίηση του HSC και να προκαλέσουν απόπτωση για την πρόληψη ή τη θεραπεία της ηπατικής ίνωσης [35,36]. Η LDH είναι ένα ένζυμο στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου, το οποίο απελευθερώνεται στο μέσο καλλιέργειας όταν η κυτταρική μεμβράνη είναι κατεστραμμένη. Για αυτούς τους λόγους, πραγματοποιήσαμε in vitro μελέτες σχετικά με τα ποσοστά βιωσιμότητας των κυττάρων, την περιεκτικότητα σε LDH στα κύτταρα και την απόπτωση και τον κυτταρικό κύκλο των HSC που εκτέθηκαν στα λιποσώματα CPhG. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα λιποσώματα CPhG αναστέλλουν έντονα τη βιωσιμότητα και τον πολλαπλασιασμό των HSCs και αυξάνουν το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση. Επιπλέον, τα αποτελέσματα του κυτταρικού κύκλου υποδεικνύουν ότι τα λιποσώματα CPhG θα μπορούσαν να προκαλέσουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το κλειδί για τα λιποσώματα CPhG για την πρόληψη και τη θεραπεία της ηπατικής ίνωσης είναι η ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, της απόπτωσης και του κυτταρικού κύκλου. Σε σύγκριση με την τυφλή ομάδα ελέγχου, η περιεκτικότητα σε LDH μεταξύ κάθε ομάδας έχει μια σταδιακή αυξητική τάση. Ωστόσο, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά (p > 0.05), υποδεικνύοντας ότι παρόλο που η δραστηριότητα μειώνεται για τα HSC που επηρεάζονται από τα λιποσώματα CPhG, οι περισσότερες κυτταρικές μεμβράνες παραμένουν ανέπαφες. Η αναστολή του πολλαπλασιασμού των HSC από τα λιποσώματα CPhG δεν οφείλεται στην τοξικότητα των φαρμάκων στα κύτταρα.

Ο PDGF είναι ο πιο κρίσιμος παράγοντας που επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των HSC. Οι υποδοχείς PDGF (PDGF-Ra και -p) ανήκουν στην οικογένεια των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης. Ο PDGF-AA συνδέεται αποκλειστικά με τον PDGF-Ra, ενώ οι αλυσίδες PDGF-B συνδέονται και διμερίζονται τόσο με τον PDGF-Ra όσο και με τον -p [37]. Μετά τη δέσμευση του συνδέτη στον PDGF-R, οι υποδοχείς διμερίζονται, γεγονός που στη συνέχεια οδηγεί σε φωσφορυλίωση ενός εσωτερικού υπολείμματος τυροσίνης και στην ενεργοποίηση αρκετών κατάντη οδών σηματοδότησης, προκαλώντας τελικά τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ενεργοποιημένων HSC. Αυτή η διαδικασία έχει ως αποτέλεσμα την υπερβολική παραγωγή και εναπόθεση κολλαγόνου και άλλων ECM, προάγοντας έτσι την ανάπτυξη και την εξέλιξη της ηπατικής ίνωσης [38]. Οι Breitkopf et al. έδειξε ότι η ηπατική υπερέκφραση του PDGF-BB οδηγεί σε πολλαπλασιασμό HSC και ηπατική ίνωση [39]. Στη μελέτη μας, χρησιμοποιήσαμε το rrPDGF-BB ως διεγέρτη για την ενεργοποίηση των HSCs και κάθε ομάδα λιποσώματος CPhG που χορηγήθηκε σε δόση θα μπορούσε να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό των HSCs και να παρουσιάσει μια προφανή σχέση δόσης-αποτελέσματος. Προτείνεται ότι η ανασταλτική δράση των λιποσωμάτων CPhG στα HSCs συμβάλλει στην αντι-πολλαπλασιαστική δράση των λιποσωμάτων CPhG.

Η ενεργοποίηση των HSC σχετίζεται με πολλές αλλαγές στα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων. Συγκεκριμένα, οι αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση του κολλαγόνου-1 και του a-SMA συσχετίζονται περισσότερο με τις ιδιότητες ίνωσης των ενεργοποιημένων HSC [40]. Οι MMPs είναι εξαρτώμενες από ψευδάργυρο ενδοπεπτιδάσες που παίζουν σημαντικό ρόλο στην αποικοδόμηση όλων των πρωτεϊνικών συστατικών της ECM υπό φυσιολογικές και παθολογικές συνθήκες. Τα MMP και TIMP μεσολαβούν στη σύνθεση και την υποβάθμιση του ECM, αντίστοιχα. Τα MMP μπορούν να προάγουν την υποβάθμιση της ECM. Η λεπτή ισορροπία μεταξύ των MMPs και των TIMPs καθορίζει την εμφάνιση ηπατικής ίνωσης [29]. Σε σύγκριση με την ομάδα rrPDGF-BB, η έκφραση του TIMP{-1, του a-SMA και του κολλαγόνου-1 στις ομάδες λιποσωμάτων CPhG αυξήθηκε σημαντικά, ενώ η έκφραση του MMP-9 μειώθηκε. Η θεραπεία με λιπόσωμα CPhG ανέστρεψε σημαντικά τις ανώμαλες εκφράσεις που προκλήθηκαν από το rrPDGF-BB σε HSCs. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα λιποσώματα CPhG πιθανώς αναστέλλουν τη δημιουργία ECM αποκαθιστώντας την ισορροπία μεταξύ MMP και TIMP, αυξάνοντας έτσι τα επίπεδα MMP-1 και μειώνοντας την έκφραση των TIMP-1, a-SMA και κολλαγόνο-1 και πιθανώς προάγοντας την αποικοδόμηση της εξωκυτταρικής μήτρας.

Το FAK είναι ένα είδος συμπλέγματος εστιακής πρόσφυσης. Το PDGF μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει το FAK αλληλεπιδρώντας με την πρωτεΐνη ECM μέσω της ιντεγκρίνης [41]. Το σύμπλεγμα εστιακής πρόσφυσης παρέχει έναν άμεσο αισθητήρα για την ακεραιότητα του εξωκυτταρικού περιβάλλοντος. Η ενεργοποίηση του FAK έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του PI3K. Το PI3K έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό πολλών τύπων κυττάρων [42]. Ο κρίσιμος ρόλος του στα HSCs φάνηκε μέσω της χρήσης ειδικών για το PI3K αναστολέων LY294002 και wortmannin για τον αποκλεισμό της μιτογένεσης και της χημειοταξίας που προκαλείται από PDGF χωρίς να επηρεάζεται η αυτοφωσφορυλίωση του υποδοχέα PDGF [43]. Το PI3K στρατολογείται σε διμερισμένους φωσφορυλιωμένους υποδοχείς PDGF, οι οποίοι ενεργοποιούν τις κινάσες πρωτεΐνης C (PKC), Akt και p70S6 (p70S6K) [44]. Έχει αναφερθεί ότι ένα κυρίαρχο-αρνητικό FAK (Ad-FAKCD) χρησιμοποιήθηκε για τον αποκλεισμό της δραστηριότητας του FAK και την αναστολή της ενεργοποίησης του PI3K που προκαλείται από τον πολλαπλασιασμό του PDGF και των HSCs μετά τη θεραπεία με PDGF [45]. Επομένως, υποθέσαμε ότι η οδός FAK/PI3K/Akt είναι ένας πιθανός στόχος για τα λιποσώματα CPhG.

Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι σε σύγκριση με την ομάδα διέγερσης rrPDGF-BB συν X-3-FAK, τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης του FAK, του φωσφορυλιωμένου PI3K και του φωσφορυλιωμένου Akt ήταν μειωμένα στη διέγερση rrPDGF-BB συν X-3-FAK συν ομάδα λιποσώματος CPhG 29,45 Lg/mL. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επεξεργασία λιποσώματος CPhG 29,45 Lg/mL θα μπορούσε να μειώσει την έκφραση της πρωτεΐνης FAK και των φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών PI3K και Akt κατάντη του FAK.

Με την εμβάθυνση της έρευνας για τη χημεία και τη φαρμακολογία των παραδοσιακών κινεζικών φαρμάκων, όλο και περισσότερα δραστικά συστατικά των παραδοσιακών κινεζικών φαρμάκων έχουν βρεθεί και επιβεβαιωθεί. Η πακλιταξέλη, η αρτεμισινίνη και άλλα φάρμακα έχουν αναγνωριστεί ευρέως ως φάρμακα πρώτης γραμμής θεραπείας για σχετικές ασθένειες σε όλο τον κόσμο. Ωστόσο, την ίδια στιγμή, διαπιστώθηκε ότι αν και η in vitro φαρμακολογική δράση πολλών κινεζικών ιατρικών συστατικών είναι πολύ ισχυρή, έχουν κακή υδατοδιαλυτότητα, μικρό χρόνο ημιζωής, κακή σταθερότητα, χαμηλή βιοδιαθεσιμότητα, τοξικές παρενέργειες και πολλά άλλα προβλήματα που περιορίζουν σοβαρά τη φαρμακευτική και κλινική τους εφαρμογή. Το σύστημα χορήγησης νανο-φαρμάκων είναι ένα νέο σύστημα χορήγησης φαρμάκων με μεγάλες δυνατότητες ανάπτυξης και αποτελεί hotspot στη σύγχρονη φαρμακευτική έρευνα. Η εφαρμογή του στην έρευνα και ανάπτυξη νέων μορφών παραδοσιακών κινεζικών φαρμάκων όχι μόνο βελτιώνει τις παραδοσιακές μορφές κινεζικών φαρμάκων αλλά βελτιώνει επίσης τη θεραπευτική δράση των παραδοσιακών κινεζικών φαρμάκων σε κάποιο βαθμό και αυξάνει τη σταθερότητα των φαρμάκων in vivo. Επιπλέον, τα μη τροποποιημένα λιποσώματα απορροφώνται ως επί το πλείστον από τις ΑΠΕ, ανάλογα με το μέγεθος των σωματιδίων, τις ιδιότητες της επιφάνειας και άλλους παράγοντες. Επίσης στοχεύουν παθητικά στο συκώτι. Προκειμένου να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα στόχευσης του ήπατος των συνηθισμένων λιποσωμάτων, η συγκέντρωση του ιστού στόχου μπορεί να αυξηθεί συνδέοντας ειδικούς συνδέτες ή συγκεκριμένες λειτουργικές ομάδες.

Επομένως, σε μελλοντική έρευνα, θα πρέπει να δώσουμε σημασία στις φυσικές και χημικές ιδιότητες της εκχύλισης και καθαρισμού CPhG, όπως η διαλυτότητα, η σταθερότητα, η οξύτητα και η αλκαλικότητα, καθώς και η μελέτη βιοφαρμακευτικών και φαρμακοκινητικών. Θα πρέπει να δημιουργήσουμε μια μοναδική θεωρία σχεδιασμού σκευασμάτων, πλατφόρμα τεχνολογίας προετοιμασίας και μέθοδο αξιολόγησης ποιότητας για CPhG και επίσης να αναπτύξουμε μια ποικιλία συστημάτων φόρτωσης νανοφαρμάκων για CPhG, για να διασφαλίσουμε ότι τα CPhG χρησιμοποιούνται όσο το δυνατόν πληρέστερα. Η πλήρης χρήση αυτών των πλεονεκτημάτων θα είναι η κατεύθυνση της μελλοντικής μας έρευνας.