Μέρος 1: Ολοκληρωμένη φαρμακολογία δικτύου και μοντέλο Zebrafish για τη διερεύνηση των συστατικών διπλών επιδράσεων του Cistanche Tubulosa για τη θεραπεία τόσο της οστεοπόρωσης όσο και της νόσου του Αλτσχάιμερ
Mar 30, 2022
Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ying-Qi Li 1, Yi Chen 1, Jia-Yi Fang 1, Si-Qi Jiang 1, Ping Li 1, * και Fei Li 1, 2, *
ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ
Εθνοφαρμακολογική συνάφεια:Η οστεοπόρωση (OP) και η νόσος Alzheimer (AD) είναι κοινές γηριατρικές ταυτόχρονες ασθένειες και πολλές μελέτες δείχνουν τη σύνδεση της παθογένειάς τους. Το Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη παραδοσιακή κινεζική ιατρική και έχει εφαρμοστεί εκτενώς για τη θεραπεία της OP και της AD, αντίστοιχα. Ωστόσο, τα ενεργά συστατικά τόσο για ταυτόχρονες ασθένειες όσο και για τους υποκείμενους μηχανισμούς είναι περιορισμένα.
Σκοπός της μελέτης:Αυτή η εργασία στόχευε στην καθιέρωση μιας αποτελεσματικής και αξιόπιστης μεθόδου διαλογής δικτύου για την εύρεση ενώσεων διπλής επίδρασης στην αξονική τομογραφία που μπορούν να προστατεύσουν την AD και την OP ταυτόχρονα. Και θα παρέχει νέες προοπτικές για τη σύνδεση μεταξύ OP και AD στους μοριακούς μηχανισμούς.
Υλικό και μέθοδοι:Οι διπλές επιδράσεις της CT αναλύθηκαν συστηματικά με την ενσωμάτωση πολλαπλών βάσεων δεδομένων και εκτεταμένη ανάλυση σε επίπεδο φαρμακολογίας δικτύου. Κατασκευάστηκε ένα ταξινομημένο δίκτυο αλληλεπίδρασης φαρμάκου-στόχου για να αποκαλύψει διαφορές στα αποτελέσματα μεταξύ διαφορετικών τύπων ενώσεων. Για να αποδειχθεί η αποτελεσματικότητα αυτού του δικτύου, επιλέχθηκαν ορισμένες ενώσεις για επαλήθευση στο μοντέλο προ-επαγώμενης ΟΡ και στο μοντέλο AD που προκαλείται από AlCl3-ζεβρόψαρο σύμφωνα με τις τοπολογικές παραμέτρους.
Λέξεις-κλειδιά:Φαρμακολογία Δικτύου; Οστεοπόρωση;Η ασθένεια Αλτσχάϊμερ; Cistanche tubulosa; Ζέβραψαρο.
Το Cistanche έχει δράση κατά του Alzheimer.
1. Εισαγωγή
Η τάση γήρανσης του πληθυσμού έχει ως αποτέλεσμα τον αυξημένο επιπολασμό της οστεοπόρωσης (OP) και της νόσου του Alzheimer (AD) με τα χρόνια (Parnetti et al., 2019; Rizzoli, 2018). Σήμερα, τόσο το OP όσο και το AD έχουν αναγνωριστεί ως μείζονες απειλές για τη δημόσια υγεία, καθώς μπορεί να εξελιχθούν χωρίς συμπτώματα και να επιφέρουν τεράστια κοινωνικά βάρη (Erkkinen et al., 2018; Jonsson et al., 2018). Ως ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία, συχνά θεωρείται ότι συνυπάρχουν στην κλινική πράξη με υψηλό ποσοστό αναπηρίας και θνησιμότητας (Dengler-Crish and Elefteriou, 2019). Το OP είναι μια συστηματική σκελετική νόσος που χαρακτηρίζεται από χαμηλή οστική μάζα και εξασθενημένη μικροαρχιτεκτονική του οστικού ιστού, με αυξημένη ευθραυστότητα των οστών και αυξημένο κίνδυνο καταγμάτων (Rizzoli, 2018). Η ΝΑ είναι ο πιο συχνός εκφυλισμός του εγκεφάλου που χαρακτηρίζεται από προοδευτική απώλεια μνήμης και άλλων γνωστικών λειτουργιών (Bondi et al., 2017). Μέχρι τώρα, δεν υπάρχουν ακόμη επαρκώς ισχυρές επιλογές για την πρόληψη ή τη θεραπεία των δύο ασθενειών της πολύπλοκης αιτιολογίας και παθογένειάς τους. Και το χειρότερο είναι ότι ο ασθενής έχει πιο συχνά παρενέργειες (Brown, 2017; Huang and Mucke, 2012).
Στη θεωρητική βάση της διαφοροποίησης του συνδρόμου (Sucher, 2013), τα παραδοσιακά κινέζικα φάρμακα (TCM) με πολλαπλά συστατικά που στοχεύουν περισσότερους από έναν παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς έχουν μοναδική υπεροχή στη θεραπεία ορισμένων γνωστών πολύπλοκων ασθενειών. Ως τονωτικό των νεφρών, το Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) χρησιμοποιείται ευρέως κατά της απώλειας μνήμης και της ατροφικής αδυναμίας των οστών από παραδοσιακούς Κινέζους γιατρούς (Fu et al., 2018). Εκτός από την παραδοσιακή του αποτελεσματικότητα, σημαντική έρευνα έδειξε ότι είχε διάφορες φαρμακολογικές δραστηριότητες, όπως βελτίωση γνωστικών και συμπεριφορικών ελλειμμάτων (Wu et al., 2014), αντιφλεγμονώδη (Fu et al., 2018), προαγωγή του σχηματισμού οστών και καταστολή των οστών απορρόφηση (Li et al., 2013; Li et al., 2012), καθώς και αντιοξειδωτική δράση (Zhang et al., 2016). Όμως, η πολυπλοκότητα των ενεργών συστατικών και η μεταβολική διαδικασία δημιούργησαν δυσκολίες τόσο στην εξερεύνηση στόχων στους ανθρώπινους ιστούς όσο και στην εξήγηση του μηχανισμού δράσης.
Πάνω απ 'όλα, είναι απαραίτητη μια αξιόπιστη συζήτηση των θεραπευτικών στόχων της OP/AD. Ειδικά με βάση τη σκέψη της "ίδιας θεραπείας για διαφορετικές ασθένειες" στα TCM και τις μεθοδολογίες "θεραπείας πολλαπλών συστατικών, βιολογικό δίκτυο" εντός δικτύου φαρμακολογίας, οι προσπάθειες αναζήτησης σημαντικών κοινών στόχων μεταξύ των δύο ασθενειών μπορεί να έχουν μια ιδιαίτερα πρακτική που σημαίνει στην παροχή καθοδήγησης για την πρόληψη και τον έλεγχο των ΕΠ και AD. Τα ψάρια ζέβρα έχουν ισχυρές ομοιότητες στη σκελετική τους φυσιολογία με τα θηλαστικά και πολύ ομόλογα γονίδια με τον άνθρωπο. Είναι ένα διαθέσιμο και ελκυστικό ζωικό μοντέλο in vivo για έρευνα OP και AD (Bergen et al., 2019; Newman et al., 2014). Έτσι, αυτή η δικτυακή φαρμακολογική έρευνα στόχευε στον έλεγχο των ενεργών συστατικών διπλής επίδρασης της CT, στη διερεύνηση των κοινών πιθανών στόχων της OP και της AD, καθώς και στην αποκάλυψη της δυνατότητας χρήσης CT για τη θεραπεία δύο ασθενειών ταυτόχρονα. Σε αυτή τη μελέτη, οι πληροφορίες των στόχων για τα ενεργά συστατικά CT, τα γονιδιώματα και οι πρωτεομικές πληροφορίες του OP και AD συλλέχθηκαν αντίστοιχα από διαφορετικές βάσεις δεδομένων για τη δημιουργία ενός διαδραστικού δικτύου και η ανάλυση εμπλουτισμού κατασκευάστηκε για την ανακάλυψη συνεργιστικών μηχανισμών CT για τη θεραπεία της OP και της AD . Επιπλέον, δημιουργήσαμε μοντέλα OP και AD zebrafish αντίστοιχα και καταγράψαμε τις βασικές ενώσεις στο δίκτυο για να επαληθεύσουμε την αποτελεσματικότητά τους και τους στόχους τους για δύο ασθένειες.
Το Cistanche ενισχύει την ανάπτυξη της σκληροτίνης.
2. Υλικά και μέθοδοι
2.1 Αντιδραστήρια
Χημικά πρότυπα γενιστεΐνης (GE), κερκετίνης (QU), αβιετικού οξέος (AA), -σιτοστερόλης (BSS) (καθαρότητα Μεγαλύτερη ή ίση με 98 τοις εκατό) αγοράστηκαν από την Chroma Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Κίνα). Οι πλάκες καλλιέργειας ελήφθησαν από την Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. (Wuxi, Κίνα). Πρεδνιζολόνη (Pre), Etidronate Disodium (Ed), Donepezil HCL (DPZ), AlCl3·6H2O αγοράστηκαν από την Aladdin Reagent Inc. Zebrafish αλκαλική φωσφατάση (ALP), όξινη φωσφατάση ανθεκτική σε τρυγικό άλας (TRAP), ακετυλχολινεστεράση (AChE), Το κιτ ανοσοπροσροφητικού προσδιορισμού (ELISA) συνδεδεμένο με ένζυμο ακετυλοτρανσφεράσης (ChAT) παρασχέθηκε από την Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Σαγκάη, Κίνα). Το Trizol ελήφθη από την Nanjing KeyGen Biotech. Co., Ltd. (Nanjing, Κίνα). Το Transtar Top Green qPCR SuperMix αγοράστηκε από την TransGen Biotech. Co., Ltd. (Πεκίνο, Κίνα).
εκχύλισμα κιστάνι
2.2 Ζώα
Τα ενήλικα ζέβρα (στέλεχος ΑΒ, ηλικίας 4 μηνών) διατηρήθηκαν στους 28 βαθμούς σε κύκλο φωτός/σκότους 14/10 ωρών σε ένα ενυδρείο που τροφοδοτήθηκε με την ανταλλαγή γλυκού νερού. Διατηρούνταν δύο φορές την ημέρα με μια νέα δίαιτα με γαρίδες άλμης (Chen et al., 2018). Τα κανονικά γονιμοποιημένα έμβρυα επιλέχθηκαν και καλλιεργήθηκαν έως 3 ημέρες μετά τη γονιμοποίηση (dpf) σε επωαστήρα ελαφριάς ανάπτυξης. Όλα τα πειράματα σε ζώα ήταν σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος και της κυβέρνησης για πειράματα σε ζώα.
2.3 Δικτυακή Φαρμακολογική Διαδικασία
2.3.1 Υπολογισμός Χημικού Χώρου και Έλεγχος Υποψήφιων Ενώσεων
Όλα τα δεδομένα χημικών συστατικών της αξονικής τομογραφίας συλλέχθηκαν από τη βάση δεδομένων και την πλατφόρμα ανάλυσης φαρμακολογικών συστημάτων παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής. Το TCMSP είναι μια πλατφόρμα φαρμακολογίας συστημάτων κινεζικών φυτικών φαρμάκων που καταγράφει τις σχέσεις μεταξύ φαρμάκων, στόχων και ασθενειών (Ru et al., 2014). Εν τω μεταξύ, τέσσερις βασικές παράμετροι που σχετίζονται με τη φαρμακολογία στο TCMSP αποκτήθηκαν για την ανάλυση του κύριου συστατικού (PCA), συμπεριλαμβανομένου του μοριακού βάρους (MW), του συντελεστή κατανομής μεταξύ οκτανόλης και νερού (AlogP), του αριθμού δότη υδρογόνου (Hdon) και του αριθμού δέκτη υδρογόνου ( Hacc). Η χημική κατανομή του CT κατασκευάστηκε με τις παραπάνω παραμέτρους χρησιμοποιώντας το λογισμικό SIMCA (Έκδοση 14.1, Umetrics). Και μικρομοριακά φάρμακα που εγκρίθηκαν για AD/OP από την DrugBank υποβλήθηκαν σε επεξεργασία στην ίδια πορεία. Τα συστατικά από την CT διηθήθηκαν με ομοιότητα φαρμάκου (DL). Το DL είναι μια ποιοτική έννοια που χρησιμοποιείται στο σχεδιασμό φαρμάκων για μια εκτίμηση του πόσο "φαρμάκου" είναι μια πιθανή ένωση. Αυτή η ζωτική ιδιότητα χρησιμοποιείται ως κριτήριο επιλογής για τις ενώσεις που μοιάζουν με φάρμακα στα παραδοσιακά κινέζικα βότανα και βοηθά στη βελτιστοποίηση της φαρμακοκινητικής και των φαρμακευτικών ιδιοτήτων (Tao et al., 2013). Με βάση προτάσεις στη βιβλιογραφία και το TCMSP, επιλέξαμε DL μεγαλύτερο ή ίσο με 0.18 ως συνθήκες φίλτρου. Τα συστατικά που συμμορφώνονται με την προϋπόθεση εξήχθησαν για μεταγενέστερη ανάλυση. Οι 2-διαστάσεις (2D) και οι 3D δομές τους ζωγραφίστηκαν από το λογισμικό ChemDraw Professional 16.0. Και οι τρισδιάστατες δομές βελτιστοποιήθηκαν με τη λειτουργία ελαχιστοποίησης της ενέργειας στο Chem3D 16.0.
2.3.2 Συλλογή OP και AD Associated Targets
Όλες οι συσχετίσεις γονιδίων για OP και AD συλλέχθηκαν ανεξάρτητα από το DisGeNET και το GeneCards. Η βάση δεδομένων DisGeNET είναι μια από τις μεγαλύτερες δημοσίως διαθέσιμες πλατφόρμες ανακάλυψης γονιδίων και παραλλαγών που σχετίζονται με ανθρώπινες ασθένειες (Pinero et al., 2017). Το GeneCards είναι μια ολοκληρωμένη βάση δεδομένων ανθρώπινων γονιδίων που περιλαμβάνει γονιδιωματικές, μεταγραφικές, πρωτεομικές, γενετικές, κλινικές και λειτουργικές πληροφορίες (Safran et al., 2010).
2.3.3 Συλλογή σύνθετων στόχων και πρόβλεψη αντίστροφης σύνδεσης
Η βάση δεδομένων GeneCards και η βάση δεδομένων Swiss TargetPrediction συνδυάστηκαν για την πρόβλεψη σχετικών στόχων ενεργών συστατικών στο CT. Το GeneCards υποδεικνύει τους γνωστούς ενεργούς στόχους των ενώσεων, ενώ η βάση δεδομένων Swiss TargetPrediction μπορεί να εκτιμήσει τους πιο πιθανούς μακρομοριακούς στόχους μικρών μορίων (Daina et al., 2019). Πριν από την πρόβλεψη, οι δομές των υποψηφίων μορίων μετατράπηκαν από μορφή mol2 σε μορφή SMILES χρησιμοποιώντας το Open Babel (Έκδοση 2.4.1).
2.3.4 Ανάλυση αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης
Η βάση δεδομένων STRING εφαρμόστηκε για να ανακαλύψει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ μιας ομάδας κοινόχρηστων στόχων CT-OP-AD. Μετά από αναζήτηση με το πρότυπο "Homo sapiens", το δίκτυο αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (PPI) οπτικοποιήθηκε από το λογισμικό Cytoscape (Έκδοση 3.7.2). Το STRING είναι μια βάση δεδομένων γνωστών και προβλεπόμενων PPI, που προέρχονται από προβλέψεις γονιδιωματικού πλαισίου, πειράματα εργαστηρίου υψηλής απόδοσης, (συντηρημένη) συνέκφραση, αυτοματοποιημένη εξόρυξη κειμένου και προηγούμενες γνώσεις σε βάσεις δεδομένων (Szklarczyk et al., 2017).
Το Cistanche είναι καλό για τη νόσο του Αλτσχάιμερ.
2.3.5 Ανάλυση εμπλουτισμού διαδρομής GO και KEGG
Η ανάλυση εμπλουτισμού Gene Ontology (GO) πραγματοποιήθηκε σε λογισμικό Funrich. Το FunRich (Έκδοση 3.1.3) είναι ένα λειτουργικό λογισμικό που χρησιμοποιείται κυρίως για την ανάλυση εμπλουτισμού γονιδίων και πρωτεϊνών (Pathan et al., 2015). Η βάση δεδομένων ConsensusPathDB-human χρησιμοποιήθηκε για τη διεξαγωγή της ανάλυσης εμπλουτισμού μονοπατιού. Ο ληφθέντος κατάλογος γονιδίων υποβλήθηκε στη βάση δεδομένων με τη ρύθμιση "p-value cutoff" ως 0,01. Μετά τη λήψη των αποτελεσμάτων, επιλέχθηκαν μόνο αυτές οι οδοί που σχετίζονται με OP και/ή AD και χωρίστηκαν σε ομάδες σύμφωνα με τις κατηγορίες συναρτήσεων KEGG. Το CPDB είναι ένα απρόσκοπτο δίκτυο αλληλεπίδρασης που περιέχει δυαδικές και σύνθετες αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, γενετικές, μεταβολικές, σηματοδοτικές, ρυθμιστικές γονιδίων και φαρμάκων-στόχων, καθώς και βιοχημικές οδούς στον Homo sapiens (Kamburov et al., 2013).
2.4 Πειραματικές διαδικασίες για το μοντέλο OP Zebrafish
2.4.1 Ομαδοποίηση Μοντέλων
Οι προνύμφες Zebrafish χωρίστηκαν σε διάφορες ομάδες: ομάδα ελέγχου, ομάδα μοντέλου, ομάδα μοντέλου συν Ed, ομάδες μοντέλου συν ενώσεων, καθεμία από τις οποίες περιείχε 30 προνύμφες. Η ομάδα ελέγχου διατηρήθηκε στο μέσο με 0,2 τοις εκατό DMSO. Η ομάδα μοντέλου υποβλήθηκε σε αγωγή με Pre (25 μΜ) από 3 dpf έως 8 dpf. Το μοντέλο συν Ed ομάδα υποβλήθηκε σε συν-κατεργασία με Pre και Ed (30 μg/mL).
2.4.2 Κόκκινη χρώση Alizarin
Μετά από 5 ημέρες καλλιέργειας με διαφορετικές ενώσεις, οι προνύμφες αναισθητοποιήθηκαν, σταθεροποιήθηκαν και λευκάνθηκαν με τη σειρά τους. Το κόκκινο αλιζαρίνης χρησιμοποιήθηκε για να χρωματίσει τα οστά της κεφαλής του ψαριού ζέβρα. Εφαρμόστηκαν 1 τοις εκατό ΚΟΗ και γλυκερόλη (αναλογίες 3:1, 1:1 και 1:3) για την απομάκρυνση της περίσσειας. Τέλος, χρησιμοποιήθηκε ένα στερεομικροσκόπιο (Olympus SZX16) για τη λήψη των εικόνων χρώσης ψαριών ζέβρα κάτω από την πρηνή θέση. Η περιοχή χρώσης και η ολοκληρωμένη οπτική πυκνότητα (IOD) υπολογίστηκαν από το Image-Pro Plus 6.{11}}.
2.4.3 Προσδιορισμός δραστηριότητας ALP και TRAP
Οι προνύμφες του Zebrafish στα 3 dpf υποκαλλιεργήθηκαν σε 6-πλάκες φρεατίων και επωάστηκαν με Pre παρουσία ή απουσία ενώσεων για 5 ημέρες. Στη συνέχεια συλλέχθηκαν για τη μέτρηση της δραστηριότητας ALP. Η δραστηριότητα ALP προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ALP ELISA ψαριών ζέβρα με βάση το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η μέθοδος για την αξιολόγηση της δραστηριότητας TRAP ήταν η ίδια με την ALP.
2.5 Πειραματικές διαδικασίες για το μοντέλο AD Zebrafish
2.5.1 Ομαδοποίηση Μοντέλων
Οι προνύμφες Zebrafish χωρίστηκαν σε διάφορες ομάδες: ομάδα ελέγχου, ομάδα μοντέλου, ομάδα μοντέλου συν DPZ, ομάδες μοντέλου συν ενώσεων, καθεμία από τις οποίες περιείχε 3 0 προνύμφες. Η ομάδα ελέγχου διατηρήθηκε στο μέσο με 0,2 τοις εκατό DMSO. Η ομάδα μοντέλου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με AlCl3 (150 μΜ, ρΗ 5,8) από 3 dpf έως 6 dpf. Το μοντέλο και η ομάδα DPZ υποβλήθηκαν σε συν-κατεργασία με AlCl3 και DPZ (8 μΜ).
2.5.2 Ανάλυση συμπεριφοράς
Μετά από 3 ημέρες παράδοσης φαρμάκου, η κίνηση των προνυμφών καταγράφηκε από τον αναλυτή συμπεριφοράς ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.). Όλα τα πειράματα ολοκληρώθηκαν σε 60 λεπτά στους 28°C, που περιείχαν 3 κύκλους φωτεινής/σκοτεινής φάσης (10 λεπτά ο καθένας για το φως και το σκοτάδι). Σύμφωνα με τις μεθόδους της προηγούμενης αναφοράς, η μέση ταχύτητα (AS), η αλλαγή ταχύτητας (ΔS), ο ρυθμός ανάκτησης δυσκινησίας (DRR, εξίσωση α) και η αποτελεσματικότητα απόκρισης (RE, εξίσωση β) επιλέγονται ως η αποτελεσματικότητα του φαρμάκου κατά της AD δείκτης αξιολόγησης σε αυτό το μοντέλο (Pan et al., 2019; Wenhai et al., 2016).
AS (mm/sec)=D / T, DRR (%)=100 × (ASDrug - ASModel) / (ASControl - ASModel), a
όπου D είναι η απόσταση κίνησης του zebrafish για 60 λεπτά, T είναι ο πειραματικός χρόνος.
RE (%)=100 × (∆SDrug - ∆SMmodel) / (∆SControl - ∆SMmodel), β
όπου ΔS είναι η αλλαγή ταχύτητας του ψαριού ζέβρα σε κύκλους φωτός/σκότους.
2.5.3 Μέτρηση δραστηριότητας AChE και ChAT
Οι προνύμφες του Zebrafish στα 3 dpf υποκαλλιεργήθηκαν σε 6-πλάκες φρεατίων και επωάστηκαν με AlCl3 παρουσία ή απουσία ενώσεων για 3 ημέρες. Στη συνέχεια συλλέχθηκαν για τη δραστηριότητα της AChE. Η δραστηριότητα της AChE ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ AChE ELISA ψαριού ζέβρα με βάση το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η μέθοδος αξιολόγησης της δραστηριότητας ChAT ήταν η ίδια με την AChE.
2.6 Ποσοτική ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο
Οι προνύμφες ψαριών ζέβρα χωρίστηκαν σε ομάδες OP και AD. Οι ομάδες ΟΡ αποτελούνταν από την ομάδα ελέγχου, την ομάδα Pre και τις ομάδες ενώσεων Pre plus, που καλλιεργήθηκαν από 3 dpf έως 8 dpf. Οι ομάδες AD περιελάμβαναν την ομάδα ελέγχου, την ομάδα AlCl3 και τις ομάδες ενώσεων AlCl3 συν, καλλιεργημένες από 3 dpf έως 5 dpf. Κάθε ομάδα περιείχε 30 προνύμφες. Ολικό RNA εκχυλίστηκε αντίστοιχα από αυτά τα δείγματα προνυμφών ζέβρα ψαριού με Trizol. Τα δείγματα RNA μεταγράφηκαν αντίστροφα σε cDNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή του κιτ cDNA. Το επίπεδο έκφρασης mRNA ανιχνεύθηκε με φθορίζουσα ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (Roche LightCycler96). Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν σε έκφραση -ακτίνης και ποσοτικοποιήθηκαν με τη συγκριτική μέθοδο (2−∆∆Ct). Οι μπροστινοί και οι ανάστροφοι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν συντέθηκαν από την Sangon Biotech (Σαγκάη, Κίνα) και καταγράφηκαν στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1.
cistanche και σκόνη Tongkat aliβοηθά στη βελτίωση της ανοσίας.
Για περισσότερες πληροφορίες, παρακαλώ κάντε κλικ εδώ.
2.7 Στατιστική Ανάλυση
GraphPad Prism έκδοση 8.00 χρησιμοποιήθηκε για περιγραφικές στατιστικές αναλύσεις. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± SD και αναλύθηκαν με τη μέθοδο ANOVA για να ελεγχθεί η μεταβλητότητα μεταξύ κάθε δοκιμής θεωρώντας το P μικρότερο ή ίσο με 0,05 ως σημαντικό.
