Μέρος 1|Γλυκογονική συνθάση κινάση 3b Υπερκινητικότητα σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων προβλέπει την εξέλιξη της διαβητικής νεφρικής νόσου

Xianhui Liang, et al

1Κέντρο καθαρισμού αίματος, Ινστιτούτο Νεφρολογίας, το Πρώτο Συνεργαζόμενο Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Zhengzhou, Zhengzhou, Κίνα. 2 Department of Medicine, Division of Kidney Disease and Hypertension, Rhode Island Hospital, Brown University School of Medicine, Providence, RhodeIsland, Η.Π.Α. and 3Department of Medicine, Division of Nephrology, University of Toledo College of Medicine, Toledo, Ohio, USA

Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε με:emily.li@wecistanche.com

Το Cistanche tubulosa αποτρέπει τη νεφρική νόσο, κάντε κλικ εδώ για να λάβετε το δείγμα

Τα αυξανόμενα στοιχεία δείχνουν ότι η κινάση συνθάσης γλυκογόνου (GSK)3b είναι βασικός παράγοντας σε διάφορανεφρικές παθήσεις. Ωστόσο, ως βασικός μετατροπέας της οδού σηματοδότησης της ινσουλίνης, ο ρόλος της GSK3b στους διαβητικούςνεφρό νόσοςπαραμένει αβέβαιο. Σε ποντικούς DB/DB, η νεφρική έκφραση της ολικής και ενεργοποιημένης GSK3b ήταν ολοένα και πιο αυξημένη. Αυτό προηγήθηκε της ανάπτυξης του διαβητικούνεφρό νόσοςκαι συσχετίζεται με την εξέλιξη των σημείων τουδιαβητικόςνεφρότραυματισμό, συμπεριλαμβανομένης της λευκωματουρίας και της συσσώρευσης εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας στα σπειράματα και στο ενδιάμεσο σωληνάριο. In vitro, η έκθεση σπειραματικών ποδοκυττάρων, μεσαγγειακών κυττάρων και νεφρικών σωληναριακών κυττάρων σε διαβητικό περιβάλλον προκάλεσε υπερέκφραση και υπερκινητικότητα GSK3, τα οποία φαίνονται απαραίτητα και επαρκή για την πρόκλησηδιαβητικόςκυτταρικές βλάβες στα νεφρικά κύτταρα, επειδή η κυτταροπαθητική επίδραση του διαβητικού περιβάλλοντος μετριάστηκε από την καταστροφή του GSK3b, αλλά μιμήθηκε από την έκτοπη έκφραση του συστατικά ενεργού GSK3b ακόμη και στο φυσιολογικό περιβάλλον. Ασυνέπεια, τα δείγματα βιοψίας νεφρού που ελήφθησαν από ασθενείς με διάφορα στάδια διαβητικής νεφροπάθειας αποκάλυψαν ενισχυμένη έκφραση της ολικής και ενεργοποιημένης GSK3b στα σπειράματα και στα νεφρικά σωληνάρια, που σχετίζεται με τη σοβαρότητα της διαβητικής νεφροπάθειας. Επιπλέον, σε αναδρομικές κοόρτες ασθενών με διαβήτη τύπου 2 που παρακολουθήθηκαν για περισσότερα από πέντε χρόνια, η σχετική δραστηριότητα της GSK3b σε απολεπισμένα απολεπισμένα κύτταρα ούρων αντιπροσώπευε έναν ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη ή την εξέλιξη της νεφρικής δυσλειτουργίας. Επιπλέον, η ανάλυση χαρακτηριστικής καμπύλης λειτουργίας δέκτη έδειξε ότι η δραστηριότητα GSK3b σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων παρείχε πολύ καλύτερη ισχύ από τη λευκωματουρία στη διάκριση των διαβητικών ασθενών με προοδευτική νεφρική δυσλειτουργία από εκείνους με σταθερή νεφρική λειτουργία. Έτσι, η νεφρική έκφραση και η δραστηριότητα της GSK3b ενισχύονται σε πειραματική και κλινική διαβητική νεφροπάθεια. Ως εκ τούτου, η GSK3b σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων μπορεί να χρησιμεύσει ως νέος βιοδείκτης για την πρόβλεψη του διαβητικούνεφρόνόσοςπροχώρηση.

Διαβητική νεφρική νόσο(DKD) εξακολουθεί να είναι η κύρια αιτία νεφρικής ανεπάρκειας τελικού σταδίου στις Ηνωμένες Πολιτείες και σε άλλες ανεπτυγμένες χώρες.1,2 Ωστόσο, δεν αναπτύσσει κάθε ασθενής με σακχαρώδη διαβήτη διαβητική νεφροπάθεια (ΔΝ), όπως αποδεικνύεται από μια σειρά από μακροχρόνιες όροι επιδημιολογικές μελέτες παρακολούθησης.3 Ο λόγος για αυτό το ετερογενές αποτέλεσμα δεν είναι πλήρως κατανοητός, αλλά φαινομενικά πολυπαραγοντικός, που περιλαμβάνει διάφορους αιτιολογικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων γενετικών, περιβαλλόντων, προϋπάρχοντοςνεφρόνόσοςκαι τη σοβαρότητα του διαβήτη.4,5 Ο ανεπαρκής γλυκαιμικός έλεγχος ήταν ένας πολύ γνωστός παράγοντας κινδύνου για λευκωματουρία και DN. Ωστόσο, ένα σημαντικό μέρος των ασθενών εξακολουθεί να αναπτύσσει DN παρά τον αυστηρό γλυκαιμικό έλεγχο.6 Στην κλινική πράξη, είναι απαραίτητο να υιοθετηθεί ένας ευαίσθητος και ακριβής βιοδείκτης για τη διαστρωμάτωση των διαβητικών ασθενών που διατρέχουν κίνδυνο εξέλιξης σε νεφρική δυσλειτουργία. Για χρόνια, η λευκωματουρία θεωρείται υποκατάστατος δείκτης των επιπλοκών του διαβητικού νεφρού.7,8 Ωστόσο, ένας αυξανόμενος όγκος στοιχείων υποδηλώνει ότι η λευκωματουρία μπορεί να μην είναι ακριβής.9,10 Έχει σημειωθεί σημαντική ασυμφωνία μεταξύ λευκωματουρίας και νεφρικής δυσλειτουργίας στο DN. 11,12 Σύμφωνα με τα δεδομένα της Μελέτης Προοπτικής Διαβήτη του Ηνωμένου Βασιλείου, 13 από αυτούς τους ασθενείς που ανέπτυξαν νεφρική δυσλειτουργία, το 61 τοις εκατό δεν είχαν λευκωματουρία εκ των προτέρων και το 39 τοις εκατό δεν ανέπτυξαν ποτέ λευκωματουρία κατά τη διάρκεια της μελέτης. Ομοίως, από εκείνους τους ασθενείς που ανέπτυξαν λευκωματουρία, μόνο το 24 τοις εκατό ανέπτυξαν στη συνέχεια νεφρική δυσλειτουργία κατά τη διάρκεια της μελέτης. Με άλλα λόγια, για ασθενείς με μικρολευκωματινουρία ή μακρολευκωματινουρία, η επικρατούσα πλειοψηφία μπορεί να μην αναπτύξει νεφρική δυσλειτουργία. Αυτά τα δεδομένα αμφισβητούν έτσι το κλασικό παράδειγμα της λευκωματουρίας που πάντα προηγείται της νεφρικής δυσλειτουργίας κατά την εξέλιξη της DKD. Ως εκ τούτου, είναι επιτακτική η αναγνώριση νέων βιοδεικτών.

για πρόβλεψη DN ή για έγκαιρη διάγνωση DN. Την τελευταία δεκαετία, έχουν δοκιμαστεί πολλά νέα μόρια.14–16 Μεταξύ αυτών, η κινάση συνθάσης γλυκογόνου 3 (GSK3) έχει αναδειχθεί ως ελκυστικό υποψήφιο. Η GSK3 είναι μια εξαιρετικά διατηρημένη, πανταχού εκφρασμένη κινάση σερίνης/θρεονίνης-πρωτεΐνης που αρχικά είχε χαρακτηριστεί ως βασικός μετατροπέας του καταρράκτη σηματοδότησης της ινσουλίνης και διέπει τη γλυκογένεση. Το ενδιαφέρον για το GSK3 αυξήθηκε σημαντικά με τη συνειδητοποίηση ότι λειτουργεί επίσης ως σημείο σύγκλισης για πολλαπλές οδούς σηματοδότησης κυττάρων που εμπλέκονται σεφλεγμονή, ανοσοτροποποίηση, εμβρυογένεση, τραυματισμός ιστού, επιδιόρθωση και αναγέννηση.17–19 Η GSK3 υπάρχει ως 2 ισομορφές: GSK3a και GSK3b. Σε διαφορετικούς ιστούς οργάνων, οι 2 ισομορφές εκφράζονται διαφορετικά. Στον φλοιό των νεφρών, η ισομορφή b εκφράζεται κυρίως και εντοπίζεται στα σπειράματα και στα εγγύς σωληναριακά κύτταρα.20,21 Η νεφρική υπερδραστηριότητα της GSK3b έχει συσχετιστεί με ένα ευρύ φάσμα νεφρικών παθήσεων, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνουρικών σφαιρονευροπαθειών και της προοδευτικής χρόνιας νεφρικής νόσου.22 Ωστόσο , ως βασικός μετατροπέας της οδού σηματοδότησης της ινσουλίνης, ο ρόλος του GSK3b στην παθογένεση του DN είναι ακόμη άγνωστος. Μένει να οριοθετηθεί εάν η απορρύθμιση του GSK3b στο νεφρό εμπλέκεται στη DN. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, η παρούσα μελέτη εξέτασε τα προφίλ έκφρασης της ολικής και ενεργοποιημένης GSK3b σε δείγματα νεφρών που προμηθεύτηκαν από μοντέλα ποντικών dB/dB μη ινσουλινοεξαρτώμενης DN και σε ιστούς βιοψίας νεφρού από ασθενείς με διαφορετικά στάδια τύπου 2 DN. Επιπλέον, σε αναδρομικές κοόρτες ασθενών με διαβήτη τύπου 2, τα επίπεδα έκφρασης της ολικής και της ενεργοποιημένης GSK3b μετρήθηκαν σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων, τα οποία ελήφθησαν ως δείγματα υγρής βιοψίας νεφρού με βάση τα ούρα. Εξετάσαμε τη σχέση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης της GSK3b ή της ενεργοποιημένης μορφής της σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων κατά την έναρξη και της ανάπτυξης ή εξέλιξης της νεφρικής δυσλειτουργίας σε διαβητικούς ασθενείς.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Η GSK3b είναι υπερεκφρασμένη και υπερδραστήρια σε νεφρικά παρεγχυματικά κύτταρα σε ποντικούς db/db, που σχετίζεται με την εξέλιξη της λευκωματουρίας και της διαβητικής νεφρικής βλάβης

Τα ποντίκια db/db με ανεπάρκεια υποδοχέα λεπτίνης είναι καθιερωμένα μοντέλα για σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 και DN. Ξεκινώντας ήδη από την ηλικία των 10 εβδομάδων, τα ποντίκια db/db αναπτύσσουν αυθόρμητα πρώιμα σημάδιατραυματισμοί των νεφρών, που χαρακτηρίζεται από προοδευτική λευκωματουρία και συσσώρευση θεμέλιας ουσίας στα σπειράματα.23 Αντίθετα, τα ποντίκια ελέγχου που ταιριάζουν με την ηλικία (db/m) έχουν φυσιολογική γλυκαιμία και δεν υπάρχουν αξιοσημείωτες ενδείξειςΝεφρική Νόσος. Σε ένα πείραμα που ξεκίνησε στην ηλικία των 10 εβδομάδων, η νεφρική έκφραση της συνολικής (Εικόνα 1) και της ενεργοποιημένης (Εικόνα 2) GSK3b (φωσφορυλιωμένη στο Y216 [p-GSK3B]) σε ποντικούς db/db έναντι ποντικών ελέγχου db/m ήταν προοδευτικά αυξημένη ( Εικόνα 1β και 2β). Αυτό εντοπίστηκε κυρίως στα ποδοκύτταρα και τα μεσαγγειακά κύτταρα στα σπειράματα (Εικόνα 1a) και στα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα στο σωληναριακό διάμεσο (Εικόνα 2α), όπως φαίνεται από χρώση ανοσοϊστοχημείας. Τα μορφολογικά ευρήματα επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση ανοσοστύπωσης ολόκληρων ομογενοποιημένων νεφρών (Εικόνα 1c και 2c). Η ανάλυση παλινδρόμησης έδειξε ότι η ένταση χρώσης του ολικού (Εικόνα 1δ) και της ενεργοποιημένης (Εικόνα 2δ) GSK3b στα σπειράματα συσχετίστηκε θετικά με την απέκκριση λευκωματουρίας στα ούρα σε ποντικούς db/db σε διαφορετικές ηλικίες. Ακόμη και στο πρώιμο στάδιο του διαβήτη σε ποντικούς db/db, όπως στην ηλικία των 10 ή 14 εβδομάδων, η δραστηριότητα του GSK3b ήταν εμφανώς αυξημένη στους νεφρούς, όπως αντικατοπτρίζεται από μια σημαντική επαγωγή του p-GSK3b (Εικόνα 2). Φαίνεται ότι η υπερδραστηριότητα GSK3b στους νεφρούς ποντικών db/db στο πρώιμο στάδιο αποδόθηκε σε μεγάλο βαθμό σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, όπως η φωσφορυλίωση στο Y216, αλλά σε μεταγενέστερο στάδιο, οφειλόταν κυρίως στην αυξημένη έκφραση της ολικής GSK3b.

Η εξέλιξη του DN χαρακτηρίζει την αυξανόμενη συσσώρευση της εξωκυτταρικής μήτρας τόσο στα σπειράματα όσο και στο διάμεσο. Πράγματι, όπως φαίνεται από τη χρώση φθορίζουσας ανοσοϊστοχημείας FL, οι νεφροί ποντικού db/db έδειξαν προοδευτικά αυξημένη έκφραση ινονεκτίνης τόσο στα σπειράματα όσο και στα διάμεση (Εικόνα 3α). Αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ανάλυση ανοσοστύπωσης ομογενοποιημένων νεφρών για φιμπρονεκτίνη και κολλαγόνο IV (Εικόνα 3b και c). Επιπλέον, η έκφραση της ολικής και ενεργοποιημένης GSK3b συσχετίστηκε θετικά με αυτή της φιμπρονεκτίνης σειστούς των νεφρών(Εικόνα 3δ).

Για να προσδιοριστεί περαιτέρω εάν η ενισχυμένη ενεργοποίηση GSK3b προηγείται της ανάπτυξης της DKD, τα ποντίκια db/db και db/m παρακολουθήθηκαν σε ένα ξεχωριστό πείραμα ξεκινώντας από την ηλικία των 4 εβδομάδων κατά το στάδιο του προδιαβήτη. Την εβδομάδα 7, τα ποντίκια db/db εμφάνισαν εμφανή υπεργλυκαιμία (Συμπληρωματικό Σχήμα S1A), που υποδηλώνει διαβήτη, αλλά όχι σημεία DKD, όπως φαίνεται από τη φυσιολογική λευκωματουρία (Συμπληρωματικό Σχήμα S1B). Αξίζει να σημειωθεί ότι ακόμη και σε ένα τόσο πρώιμο στάδιο διαβήτη, η νεφρική έκφραση των GSK3b και p-GSK3b καθώς και η σχετική δραστηριότητα της GSK3b που εκφράζεται ως αναλογία p-GSK3b/GSK3b, είχαν αυξηθεί μεταβλητά, όπως μετρήθηκε με ανάλυση ανοσοστύπωσης ιστών νεφρικής βιοψίας ακολουθούμενη από πυκνομετρία (Συμπληρωματικό Σχήμα S1C και D). Επιπλέον, η ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης έδειξε ότι η νεφρική δραστηριότητα GSK3b την εβδομάδα 7 συσχετίστηκε θετικά με την ανάπτυξη λευκωματουρίας και DKD την εβδομάδα 13 (Συμπληρωματικό Σχήμα S1E). Επιπλέον, η ανάλυση καμπύλης χαρακτηριστικής λειτουργίας δέκτη (ROC) έδειξε ότι η νεφρική δραστηριότητα GSK3b σε ποντικούς db/db σε ηλικία 7 εβδομάδων, όταν δεν υπήρχαν σημεία DKD, παρείχε εξαιρετική ακρίβεια και δύναμη στην πρόβλεψη της ανάπτυξης λευκωματουρίας και DKD (Συμπληρωματικό Σχήμα S1F).

Η έκθεση των νεφρικών κυττάρων σε ένα διαβητικό περιβάλλον προκαλεί υπερέκφραση και υπερδραστηριότητα του GSK3b, με αποτέλεσμα διαβητικές κυτταροπαθητικές αλλαγές

Για να προσδιοριστεί εάν η διαβητική κατάσταση ενισχύει άμεσα την ενεργοποίηση του GSK3b στονεφρικά κύτταρα, in vitro καλλιέργειες διαφορετικών κυτταρικών γραμμών νεφρού, συμπεριλαμβανομένων των ποδοκυττάρων ποντικού, των μεσαγγειακών κυττάρων και των σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων, χρησιμοποιήθηκαν και εκτέθηκαν σε ένα διαβητικό περιβάλλον που αποτελείται από υψηλή περιβαλλοντική γλυκόζη και αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού (TGF) b1. Η έκθεση των ποδοκυττάρων στο διαβητικό περιβάλλον οδήγησε σε εντυπωσιακό τραυματισμό των ποδοκυττάρων, που χαρακτηρίζεται από απώλεια της πρωτεΐνης δείκτη ποδοκυττάρου συναπτοποδίνη. Αυτό συνδυάστηκε με την εμφανή επαγωγή του ολικού και ενεργοποιημένου GSK3b, όπως φαίνεται από τη χρώση φθορίζουσας ανοσοκυτταροχημείας FL (Εικόνα 4α και β) και επιβεβαιώθηκε με ανάλυση ανοσοστύπωσης

(Εικόνα 4γ και δ). Σε καλλιεργημένα μεσαγγειακά κύτταρα, η έκφραση της ολικής (Εικόνα 5α) και της ενεργοποιημένης (Εικόνα 5β) GSK3b αυξήθηκε επίσης μετά από έκθεση στο διαβητικό περιβάλλον, παράλληλα με αυξημένη έκφραση μορίων εξωκυτταρικής μήτρας όπως η φιμπρονεκτίνη (Εικόνα 5). Ομοίως, τα καλλιεργημένα νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα υπερέκφρασαν το συνολικό και ενεργοποιημένο GSK3b μετά τη θεραπεία του διαβητικού περιβάλλοντος, και αυτό συνοδεύτηκε από δυσλειτουργία και αποδιαφοροποίηση των σωληναριακών κυττάρων, που χαρακτηρίστηκε από μειωμένη και διαταραγμένη έκφραση μορίων σφιχτής σύνδεσης του επιθηλίου όπως η αποφρακτική ζώνη (Z{O{6} -1) (Εικόνα 6α–δ). Αντίθετα, ως έλεγχος ωσμωτικότητας, η επεξεργασία με μαννιτόλη όλων των νεφρικών κυττάρων είχε ως αποτέλεσμα ένα αποτέλεσμα που δεν ήταν διαφορετικό από αυτό που μεταφέρθηκε από το φυσιολογικό περιβάλλον που περιείχε φυσιολογική γλυκόζη περιβάλλοντος. Ο ανθρώπινος διαβήτης δεν περιλαμβάνει μόνο υπεργλυκαιμία αλλά και αντίσταση στην ινσουλίνη. Αν και είναι αδύνατο να διαχωριστεί πλήρως η υπεργλυκαιμία από την αντίσταση στην ινσουλίνη σε ζωικά μοντέλα ή σε ασθενείς, μοντέλα in vitro έχουν αξιοποιηθεί για να εξεταστεί η μεμονωμένη επίδραση της υψηλής γλυκόζης έναντι της αντίστασης στην ινσουλίνη. Για να μιμηθεί την κατάσταση της αντίστασης στην ινσουλίνη, η ισομορφή b του υποδοχέα ινσουλίνης καταρρίφθηκε σε καλλιεργημένα ποδοκύτταρα, μεσαγγειακά κύτταρα και νεφρικά σωληναριακά κύτταρα (Συμπληρωματικό Σχήμα S2A-C) και αυτό ενίσχυσε την έκφραση και τη δραστηριότητα του GSK3b ακόμη και στο φυσιολογικό περιβάλλον, όπως φαίνεται από την ανάλυση ανοσοστύπωσης και την πυκνομετρία. Αυτή η δράση ενισχύθηκε μετά από έκθεση στο διαβητικό περιβάλλον, υποδηλώνοντας μια συνεργική επίδραση της αντίστασης στην ινσουλίνη και της υψηλής γλυκόζης στην ενεργοποίηση του GSK3b.

Η υπερκινητικότητα GSK3b είναι απαραίτητη και επαρκής για τραυματισμό και δυσλειτουργία των νεφρικών κυττάρων που προκαλείται από το διαβητικό περιβάλλον

Για να διερευνηθεί εάν η υπερδραστηριότητα GSK3b εμπλέκεται σε κυτταροπαθητικές αλλαγές στα νεφρικά κύτταρα, η δραστηριότητα της GSK3b σεκαλλιεργημένο νεφρότα κύτταρα χειραγωγήθηκαν τεχνητά με παρεμβολή RNA

(RNAi) ή γονιδιακή υπερέκφραση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7α, το RNAi που χρησιμοποιεί το scramble small, παρεμβαλλόμενο RNA μόλις και μετά βίας επηρεάζει την κυτταροπαθητική επίδραση του διαβητικού περιβάλλοντος σε όλα τα νεφρικά κύτταρα. Αντίθετα, η σίγαση του GSK3b ακύρωσε ουσιαστικά την υποκινούμενη από το διαβητικό περιβάλλον καταστολή της συναπτοποδίνης στα ποδοκύτταρα, την επαγωγή ινονεκτίνης στα μεσαγγειακά κύτταρα και τη διαταραχή του ZO-1 στα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι το GSK3b είναι πιθανόν απαραίτητο για την πρόκληση αλλαγών που σχετίζονται με διαβήτη. νεφρικά κύτταρα. Για να διακριθεί εάν η υπερέκφραση και η υπερδραστηριότητα του GSK3b επαρκούν για τα κυτταροπαθητικά αποτελέσματα που προκαλούνται από το διαβητικό περιβάλλον, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με έναν κενό φορέα είτε με έναν φορέα που κωδικοποιεί το συστατικά ενεργό μετάλλαγμα του GSK3b (S9A). Αν και η διαμόλυνση κενού φορέα δεν άσκησε σχεδόν καμία επίδραση, η έκτοπη υπερέκφραση του S9A είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια της έκφρασης συναπτοποδίνης στα ποδοκύτταρα, αυξημένη παραγωγή φιμπρονεκτίνης στα μεσαγγειακά κύτταρα και μειωμένη έκφραση ZO-1 σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα ακόμη και στο φυσιολογικό περιβάλλον (Εικόνα 7β), που θυμίζει την κυτταροπαθητική επίδραση του διαβητικού περιβάλλοντος.

Η εξέλιξη της ανθρώπινης DN συμπίπτει με την υπερέκφραση και υπερδραστηριότητα GSK3b σε νεφρικά σπειράματα και σωληνάρια

Για να επικυρωθεί περαιτέρω εάν τα παραπάνω ευρήματα σε μοντέλα ζωικής και κυτταρικής καλλιέργειας ισχύουν επίσης για κλινική DN, αρχειοθετημένοι ιστοί βιοψίας νεφρού από φυσιολογικά άτομα και ασθενείς με διαφορετικά στάδια DN υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για χρώση ανοσοϊστοχημείας υπεροξειδάσης για GSK3b και p-GSK3b. Τα χαρακτηριστικά των ατόμων ελέγχου και των ασθενών συνοψίζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8α, νεφρική

Η έκφραση της ολικής και ενεργοποιημένης GSK3b αυξανόταν ολοένα και περισσότερο μαζί με την εξέλιξη της DN όπως βαθμολογήθηκε σύμφωνα με την παθολογική ταξινόμηση με βάση τη χρώση με περιοδικό οξύ-Schiff. Αυτό είναι σύμφωνο με τα δεδομένα Nephroseq, τα οποία καταδεικνύουν επίσης μια σημαντικά αυξημένη έκφραση GSK3b σε ιστούς βιοψίας νεφρού από ασθενείς με DN (Συμπληρωματικό Σχήμα S3). Η αυξημένη έκφραση της ολικής και ενεργοποιημένης GSK3b εντοπίστηκε κυρίως στα ποδοκύτταρα και τα μεσαγγειακά κύτταρα στα σπειράματα και στα νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα σε σωληναριστήριο (Εικόνα 8α), σε συμφωνία με τα ευρήματα σε ποντικούς db/db. Τα μορφολογικά αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με ηλεκτρονική μορφομετρική ανάλυση, η οποία αποκάλυψε μια θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του ολικού (Εικόνα 8β) ή του ενεργοποιημένου (Εικόνα 8γ) GSK3b και της σοβαρότητας του DN.

Το GSK3b είναι υπερδραστήριο σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων που συλλέγονται από διαβητικούς ασθενείς και προβλέπει την εξέλιξη της νεφρικής ανεπάρκειας τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε ασθένειες, η εναλλαγή και η απόρριψη των νεφρικών επιθηλιακών κυττάρων, όπως τα σπειραματικά ποδοκύτταρα και τα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα, συμβαίνει συνεχώς, οδηγώντας σε συνεχή απέκκριση των νεφρικών παρεγχυματικών κυττάρων στα ούρα. Τα απολεπισμένα ούρα κύτταρα έχουν αξιοποιηθεί επιτυχώς ως μη επεμβατική υγρή βιοψία νεφρού με βάση τα ούρα για ερευνητικούς και διαγνωστικούς σκοπούς.24,25 Με την προϋπόθεση τα προαναφερθέντα ευρήματα ότι η έκφραση της ολικής και ενεργοποιημένης GSK3b είναι αυξημένη στα νεφρικά παρεγχυματικά κύτταρα σε ασθενείς με DN και σε DB/DB ποντίκια ακόμη και στο πρώιμο στάδιο πριν εκδηλωθεί η λευκωματουρία, αναρωτηθήκαμε εάν η μέτρηση της GSK3b σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την πρόβλεψη

την ανάπτυξη ή την εξέλιξη της ανθρώπινης DKD. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε τη βιοτράπεζα του διαβήτη και πραγματοποιήσαμε μια αναδρομική μελέτη κοόρτης. Συνολικά, 127 ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2, οι οποίοι παρακολουθούνταν στο First Affiliated Hospital του Πανεπιστημίου Zhengzhou από το 2010 με δεσμευμένα δείγματα κλασματοποιημένων ούρων, εξετάστηκαν για συμπερίληψη σε αυτή τη μελέτη. Από αυτούς τους ασθενείς, 67 αποκλείστηκαν, με 10 να έχασαν την παρακολούθηση, 52 είχαν νεφρική δυσλειτουργία ή εμφανή πρωτεϊνουρία κατά την έναρξη της νόσου και 5 αργότερα διαγνώστηκαν ως άλλες νεφρικές παθήσεις με βιοψία νεφρού ή απεικόνιση. Τελικά, 60 ασθενείς εγγράφηκαν σε αυτήν την αναδρομική μελέτη κοόρτης (Εικόνα 9). Τα δημογραφικά και κλινικά χαρακτηριστικά αυτών των ασθενών κατά την έναρξη συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Κανένας από τους ασθενείς δεν είχε νεφρική δυσλειτουργία ή εμφανή πρωτεϊνουρία κατά την έναρξη και κανένας δεν ξεκίνησε θεραπεία αιμοκάθαρσης κατά την περίοδο παρακολούθησης. Σύμφωνα με το μέγεθος της λευκωματουρίας, οι ασθενείς κατηγοριοποιήθηκαν σε 2 υποομάδες: ομάδες φυσιολογικής αλβουμινουρίας και μικρολευκωματινουρίας. Εκτός από τα επίπεδα απέκκρισης λευκωματίνης στα ούρα (ΗΑΕ), οι 2 υποομάδες ασθενών δεν ήταν στατιστικά διαφορετικές κατά την έναρξη σε όλες τις άλλες κλινικές, βιοχημικές και φυσιολογικές παραμέτρους, συμπεριλαμβανομένης της διάρκειας του διαβήτη, του επιπέδου γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης, της νεφρικής λειτουργίας, της αρτηριακής πίεσης και των συνταγογραφούμενων θεραπειών . Μετά από παρακολούθηση 5 ετών, 29 από τους 60 ασθενείς εμφάνισαν την εξέλιξη της νεφρικής δυσλειτουργίας, η οποία ορίστηκε είτε ως μείωση $25 τοις εκατό στον εκτιμώμενο ρυθμό σπειραματικής διήθησης (eGFR) είτε ως εξέλιξη της κατάστασης λευκωματουρίας, όπως υποδεικνύεται από την κλιμάκωση της σοβαρότητας λευκωματουρίας κατά μήκος διαφόρων κλινικών σταδίων του DN, δηλαδή, φυσιολογική λευκωματουρία, μικρολευκωματινουρία, μικρολευκωματινουρία ή εμφανής πρωτεϊνουρία. Αντίθετα, οι υπόλοιποι 31 ασθενείς δεν εμφάνισαν σημάδια εξέλιξης της νεφρικής νόσου (Εικόνα 9). Τα βασικά δεδομένα των ασθενών στρωματοποιήθηκαν σύμφωνα με την κατάσταση εξέλιξης της νεφρικής δυσλειτουργίας μετά από παρακολούθηση 5 ετών (Πίνακας 2). Οι ασθενείς με εξέλιξη της νεφρικής δυσλειτουργίας, σε σύγκριση με εκείνους χωρίς εξέλιξη, εμφάνισαν σημαντική μείωση του eGFR και αξιοσημείωτη αύξηση στα ΗΑΕ. Για να προσδιοριστεί εάν η GSK3b υπερεκφράστηκε ή υπερενεργοποιήθηκε σε νεφρικά κύτταρα και

μετρήθηκε για την αξιολόγηση της ευαισθησίας και της ειδικότητας της δραστηριότητας της GSK3b σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων σε σχέση με την αρχική λευκωματουρία για την πρόβλεψη της εξέλιξης της νεφρικής δυσλειτουργίας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 11, η σχετική δραστηριότητα της GSK3b σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων, εκφρασμένη ως αναλογία p-GSK3b/GSK3b, έδειξε εξαιρετική ακρίβεια και δύναμη στη διάκριση ασθενών με προοδευτική νεφρική δυσλειτουργία από αυτούς με σταθερή νεφρική λειτουργία, με την περιοχή κάτω από το ROC η καμπύλη είναι 0.844 (95 τοις εκατό διάστημα εμπιστοσύνης, 0.747–0.941; P ¼ 0.001. ), η οποία ήταν πολύ καλύτερη από την περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC για τη γραμμή βάσης Ln(ΗΑΕ) ({{20}}.750; 95 τοις εκατό διάστημα εμπιστοσύνης, 0,626–0,874). Η αποκοπή που μεγιστοποίησε τον δείκτη Youden ήταν 1,24 για την αναλογία p-GSK3b/GSK3b και 76 mg/24 ώρες για τα ΗΑΕ. Σε αυτά τα όρια, η ευαισθησία και η ειδικότητα ήταν 69 τοις εκατό και 87,1 τοις εκατό για την αναλογία p-GSK3b/GSK3b και 69 τοις εκατό και 77,4 τοις εκατό για το Ln (ΗΑΕ). Επιπλέον, ο συνδυασμός της αναλογίας p-GSK3b/GSK3b με το συνολικό επίπεδο GSK3b σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων βελτίωσε σημαντικά τη διακριτική ισχύ, με την περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC να είναι 0,971 (95 τοις εκατό διάστημα εμπιστοσύνης, 0,931–1.{{48} }). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι μετρήσεις της δραστηριότητας της GSK3b σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων μπορεί να παρέχουν πολύ καλύτερη ακρίβεια από τα ΗΑΕ στην πρόβλεψη της εξέλιξης της νεφρικής δυσλειτουργίας σε διαβητικούς ασθενείς.

To further explore whether enhanced GSK3b activation also predicts the development of DKD, a separate cohort of patients with type 2 diabetes but no signs of kidney disease, who started follow-up between 2010 and 2013, were retrospectively screened and examined (Supplementary Table S2). The baseline characteristics of patients were stratified according to the presence or absence of renal impairment or DKD after 5 years' follow-up (Supplementary Table S3), which was defined as either a $25% reduction in eGFR or the persistent presence of albuminuria (>30 mg/24 h). Τα απολεπισμένα ούρα κύτταρα που συσσωρεύτηκαν κατά την έναρξη ανακτήθηκαν και εξετάστηκαν με ανάλυση ανοσοστύπωσης για GSK3b και p-GSK3b (Συμπληρωματικό Σχήμα S4A και B). Η δραστηριότητα του GSK3b υπολογίστηκε από τις πυκνομετρικές αναλογίες του p-GSK3b προς το συνολικό GSK3b για κάθε δείγμα σε σχέση με την τιμή των δειγμάτων ελέγχου (Συμπληρωματικό Σχήμα S4C).

Μεταξύ των διαφορετικών κλινικών/βιοχημικών μεταβλητών, η δραστηριότητα GSK3b (αναλογία p-GSK3b/GSK3b) στα απολεπισμένα κύτταρα ούρων κατά την έναρξη της μελέτης σημειώθηκε ότι ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ασθενείς που ανέπτυξαν DKD από ό,τι σε εκείνους που δεν ανέπτυξαν (Συμπληρωματικός Πίνακας S3). Επιπλέον, η ανάλυση της καμπύλης ROC υποδηλώνει ότι η σχετική δραστηριότητα του GSK3b (αναλογία p-GSK3b/GSK3b) σε απολεπισμένα κύτταρα ούρων παρείχε εξαιρετική ακρίβεια και δύναμη στην πρόβλεψη της ανάπτυξης της DKD σε διαβητικούς ασθενείς πρώιμου σταδίου (Συμπληρωματικό Σχήμα S4D).