ΜΕΡΟΣ 1 Η εχινακοσίδη αναστέλλει την απελευθέρωση γλουταμινικού άλατος καταστέλλοντας το εξαρτώμενο από τάση Ca2 συν την είσοδο και την πρωτεϊνική κινάση C στα άκρα των εγκεφαλοφλοιωδών νεύρων αρουραίου

Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 και Su Jane Wang 3,*

1 Τμήμα Αναισθησιολογίας, Νοσοκομείο Far-Eastern Memorial, Περιφέρεια Pan-Chiao, New Taipei City 22060, Taiwan; drluchengwei@gmail.com (CWL); drlin1971@gmail.com (TYL);nskh9450n@yahoo.com.tw (SKH)

2 Τμήμα Μηχανολόγων Μηχανικών, Πανεπιστήμιο Yuan Ze, Taoyuan 32003, Ταϊβάν

3 School of Medicine, Fu Jen Catholic University, No. 510, Zhongzheng Rd., Xinzhuang Dist., New Taipei 24205, Taiwan.

Αφηρημένη:Το γλουταμινεργικό σύστημα μπορεί να εμπλέκεται στα αποτελέσματα των νευροπροστατευτικών θεραπειών. Εχινακοσίδη, ένα φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιο που εξάγεται από το φαρμακευτικό κινέζικο βότανοHerba Cistanche,έχει νευροπροστατευτικά αποτελέσματα. Αυτή η μελέτη διερεύνησε τις επιδράσεις της εχινακοσίδης στην απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από {{0}αμινοπυριδίνη σε τερματικά εγκεφαλοφλοιώδη νεύρα αρουραίου (συναπτοσώματα). Η εχινακοσίδη ανέστειλε το Ca^{2 συν}-εξαρτώμενο, αλλά όχι Ca^{2 συν}-ανεξάρτητη, 4-προκαλούμενη από αμινοπυριδίνη απελευθέρωση γλουταμικού με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση. Η εχινακοσίδη μείωσε επίσης την 4-προκαλούμενη από την αμινοπυριδίνη αύξηση στο ελεύθερο κυτταροπλασματικό Ca^{2 συν}συγκέντρωση αλλά δεν άλλαξε το δυναμικό της συναπτοσωματικής μεμβράνης. Η ανασταλτική επίδραση της εχινακοσίδης στην απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από {{0}αμινοπυριδίνη αποτράπηκε από την cu-conotoxin MVIIC, έναν αποκλειστή ευρέως φάσματος των καναλιών Cav2.2 (τύπου N) και Cav2.1 (τύπου P/Q). , αλλά ήταν μη ευαίσθητο στο ενδοκυτταρικό Ca^{2 συν}αναστολείς απελευθέρωσης δαντρολένιο και 7-χλωρο-5-(2-χλωροφαινυλ)-1,5-διυδρο-4,1-βενζοδιαζεπίνη{{ 8}}(3Η)-όνη (CGP37157). Επιπλέον, η εχινακοσίδη μείωσε την 4-προκαλούμενη από την αμινοπυριδίνη φωσφορυλίωση της πρωτεϊνικής κινάσης C και οι αναστολείς της πρωτεϊνικής κινάσης C κατάργησαν την επίδραση της εχινακοσίδης στην απελευθέρωση γλουταμικού. Σύμφωνα με αυτά τα αποτελέσματα, προτείνουμε ότι η ανασταλτική επίδραση της εχινακοσίδης στην προκαλούμενη απελευθέρωση γλουταμικού σχετίζεται με μειωμένο Ca που εξαρτάται από την τάση^{2 συν}εισαγωγή και επακόλουθη καταστολή της δραστηριότητας της πρωτεϊνικής κινάσης C.

Λέξεις-κλειδιά:εχινακοσίδη; απελευθέρωση γλουταμικού? εγκεφαλοφλοιώδη νευρικά τερματικά? εξαρτώμενο από την τάση Ca²συν κανάλια? πρωτεϊνική κινάση C της νόσου του Parkinson, της νόσου του Alzheimer και της απόφραξης της μέσης εγκεφαλικής αρτηρίας[9-12]. Ωστόσο, ο μηχανισμός μέσω του οποίου η εχινακοσίδη προκαλεί νευροπροστασία δεν είναι πλήρως κατανοητός.

Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε με:Joanna.jia@wecistanche.com

Εχινακοσίδηστο cistanche έχουν πολλές λειτουργίες

1. Εισαγωγή

Εχινακοσίδηείναι ένα κύριο φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιο που υπάρχει σεHerba Cistanche, μια πολύ γνωστή παραδοσιακή κινεζική ιατρική που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της λήθης, της ανικανότητας και της χρόνιας δυσκοιλιότητας [1].Εχινακοσίδηδιαθέτει διάφορες βιοδραστηριότητες όπως αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδης, αντικαρκινική, ηπατοπροστασία και ανοσορύθμιση [2-4]. Ιδιαίτερα,εχινακοσίδηέχει νευροπροστατευτικά αποτελέσματα. για παράδειγμα, μπορεί να προστατεύσει από τη νευροτοξικότητα που προκαλείται από οξειδωτικό στρες ή νευροτοξίνες σε πρωτογενείς φλοιώδεις νευρώνες αρουραίου, κύτταρα ανθρώπινου νευροβλαστώματος SH-SY5Y και κύτταρα φαιοχρωμοκυτώματος (PC12) [5-8]. Επί πλέον,εχινακοσίδημετριάζει τη βλάβη του εγκεφάλου και βελτιώνει τη γνωστική λειτουργία σε ζωικά μοντέλα της νόσου του Πάρκινσον, της νόσου του Αλτσχάιμερ και της απόφραξης της μέσης εγκεφαλικής αρτηρίας [9-12]. Ωστόσο, ο μηχανισμός μέσω του οποίουεχινακοσίδηπροκαλεί νευροπροστασία δεν είναι πλήρως κατανοητή.

Η νευροπροστασία είναι μια πολύπλοκη διαδικασία διατήρησης της νευρωνικής δομής και λειτουργίας σε τοξικές προσβολές. Η μείωση της διεγερτοτοξικότητας του γλουταμικού θεωρείται ένας πιθανός μηχανισμός που εμπλέκεται στη νευροπροστασία του εγκεφάλου. Το γλουταμικό, ένας διεγερτικός νευροδιαβιβαστής αμινοξέων, έχει κρίσιμο ρόλο σε αρκετές εγκεφαλικές λειτουργίες [13]. Ωστόσο, η υπερενεργοποίηση των υποδοχέων γλουταμικού κάτω από υψηλές συγκεντρώσεις γλουταμικού προκαλεί ενδοκυτταρικό Ca2 συν υπερφόρτωση, μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, παραγωγή ελεύθερων ριζών και νευρωνικό θάνατο [14,15]. Αυτή η παθολογική διαδικασία εμπλέκεται σε πολυάριθμες εγκεφαλικές διαταραχές, όπως η εγκεφαλική ισχαιμία, η τραυματική εγκεφαλική βλάβη, η επιληψία και η νευροεκφυλιστική νόσος [16,17]. Ως εκ τούτου, οι αναστολείς που εμποδίζουν την παθοφυσιολογική γλουταμινεργική μετάδοση θεωρούνται πιθανά νευροπροστατευτικά φάρμακα. Αξιοσημείωτα παραδείγματα αυτών είναι οι ανταγωνιστές υποδοχέα γλουταμικού [18,19]. Ωστόσο, οι κλινικές δοκιμές για αυτά τα φάρμακα απέτυχαν λόγω μικρότερης αποτελεσματικότητας και ανεπιθύμητων ή ακόμα και κυτταροτοξικών παρενεργειών [20,21]. Εκτός από τον άμεσο αποκλεισμό των υποδοχέων γλουταμικού, η αναστολή απελευθέρωσης γλουταμικού μπορεί να είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για νευροπροστασία. Αρκετά νευροπροστατευτικά (π.χ. μεμαντίνη και ριλουζόλη) μπορούν να μειώσουν την απελευθέρωση γλουταμικού στους ιστούς του εγκεφάλου του αρουραίου [22-24].

Λαμβάνοντας υπόψη το ρόλο του γλουταμικού στην διεγερτική τοξικότητα και το νευροπροστατευτικό προφίλ τουεχινακοσίδη, η παρούσα μελέτη χρησιμοποίησε απομονωμένα νευρικά άκρα (συναπτοσώματα) που καθαρίστηκαν από τον εγκεφαλικό φλοιό αρουραίου για να διερευνήσει την επίδραση τουεχινακοσίδησχετικά με την απελευθέρωση γλουταμικού και περαιτέρω διερεύνησε πιθανούς μηχανισμούς. Το παρασκεύασμα απομονωμένου τερματικού νεύρου είναι ένα καθιερωμένο μοντέλο για τη μελέτη της προσυναπτικής ρύθμισης της απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστών από τα φάρμακα απουσία οποιωνδήποτε μετασυναπτικών επιδράσεων [25]. Χρησιμοποιώντας αυτό το μοντέλο, αξιολογήσαμε την επίδραση τουεχινακοσίδησχετικά με την απελευθέρωση γλουταμικού, το δυναμικό της μεμβράνης, την προσυναπτική εισροή Ca2 συν και τη δραστηριότητα πρωτεϊνικής κινάσης C. Σύμφωνα με την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας, αυτή είναι η πρώτη αναφορά που τεκμηριώνει τον μηχανισμό μέσω του οποίουεχινακοσίδηαναστέλλει την ενδογενή απελευθέρωση γλουταμικού σε προσυναπτικό επίπεδο.

Η εχινακοσίδη μπορεί να αντιοξειδωτικά

2. Αποτελέσματα

2.1. ΕχινακοσίδηΑναστέλλει την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από την αμινοπυριδίνη από τα εγκεφαλοφλοιώδη νευρικά άκρα αρουραίου μειώνοντας την φυσαλιδώδη εξωκυττάρωση

Το Σχήμα 1 απεικονίζει την εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση επίδραση τουεχινακοσίδησχετικά με την απελευθέρωση γλουταμικού {{0}}που προκαλείται από αμινοπυριδίνη από καθαρισμένα συναπτοσωμάτια εγκεφαλοφλοιώδους αρουραίου. Σε συναπτοσώματα που επωάστηκαν με 1 mM CaCl2, 1 mM 4-αμινοπυριδίνης προκάλεσε απελευθέρωση γλουταμικού 7,4 ˘ 0,1 nmol/mg/5 min, η οποία μειώθηκε κατά 1, 5, 10, 30 και 50 μΜεχινακοσίδηέως 6,5 ˘ 0.2, 5,8 ˘ 0.3, 4,8 ˘ {{10}}.2, 4,1 ˘ 0.1 ή 2,3 ˘ 0,4 nmol/mg/5 λεπτά, αντίστοιχα (F(5,24)=67.1, p=0.000). Η τιμή IC50 γιαεχινακοσίδη-η μεσολαβούμενη αναστολή της απελευθέρωσης γλουταμικού που προκαλείται από {{1}αμινοπυριδίνη, που προέρχεται από μια καμπύλη δόσης-απόκρισης, ήταν 24 μΜ. Επιπλέον, η απελευθέρωση γλουταμικού προκαλείται από 1 mM 4-αμινοπυριδίνης σε ένα εξωκυτταρικό διάλυμα χωρίς Ca2 συν που περιέχει 300 μΜ αιθυλενογλυκόλη δις(-αμινοαιθυλαιθέρας)-N,N,N1,N{{ 13}}τετραοξικό οξύ (EGTA) ήταν 2,1 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min (F(2,12)=310.65, p=0.000), και αυτό το Ca2 συν-ανεξάρτητο συστατικό της απελευθέρωσης γλουταμικού που προκαλείται από 4-αμινοπυριδίνη δεν επηρεάστηκε από 20 μΜεχινακοσίδη(1,8 ˘ 0.2 nmol/mg/5 min· p=0.58· Εικόνα 1). Σε συναπτοσώματα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0.1 μM βαφιφιλομυκίνη Α1, έναν αναστολέα φυσαλιδώδους μεταφορέα [26], η απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από την {{12}αμινοπυριδίνη μειώθηκε σημαντικά (2,2 ˘ 0,2 nmol/mg/ 5 λεπτά, F (2,12)=249.518, p=0.000). Παρουσία μπαφιφιλομυκίνης Α1, 20 μΜ εχινακοσίδη απέτυχε να αναστείλει σημαντικά την απελευθέρωση γλουταμικού (2,1 ˘ 0,2 nmol/mg/5 λεπτά· p=0}.94· Εικόνα 1). Αντίθετα, 10 μM DL-θρεο-βήτα-βενζυλ-οξυασπαρτικό (DL-TBOA, ένας αναστολέας επαναπρόσληψης γλουταμικού) [27], αύξησε την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από {{42}αμινοπυριδίνη σε 11,8 ˘ 0,4 nmol/mg/5 min t(8)='11,31, p=0.000). Ακόμη και παρουσία DL-TBOA, 20 μΜεχινακοσίδηανέστειλε σημαντικά την {{0}}προκαλούμενη από την αμινοπυριδίνη απελευθέρωση γλουταμικού (7,7 ˘ 0,2 nmol/mg/5 λεπτά, F(2,12)=87.23, p=0.{{{ 12}}; Εικόνα 1)

2.2. ΕχινακοσίδηΜειώνει το κυτοσολικό Ca²συνΣυγκέντρωση αλλά δεν αλλάζει το συναπτοσωμικό

Δυνατότητα μεμβράνης

Η εκπόλωση των συναπτοσωμάτων που προκαλείται από 1 mM 4-αμινοπυριδίνης αύξησε το Ca²συν συγκέντρωση(p= 0.000; Τραπέζι 1). Η εφαρμογή των 20 |vMεχινακοσίδηδεν επηρέασε σημαντικά το baral Ca²συν συγκέντρωση (t(8) = 0.06, p= 0.95) αλλά μείωσε σημαντικά την 4-επαγόμενη από την αμινοπυριδίνη αύξηση iia Ca²συν συγκέντρωση (t(10) = 6.16, p =0.000). Επιπλέον, 1 mM 4-αμινοπυριδίνης αυξήθηκε σε ιωδιούχο 3',3',3'-διπροπυλθειαδικαρβοκυανίνη [DiSC₃(5)] φθορισμός (p= 0.000). Η προσθήκη ο⁽20 fdM εχινακοσίδη δεν άλλαξε το δυναμικό ηρεμίας της μεμβράνης (t(8)=0.976,p= 0.36) ή να αλλάξει σημαντικά την 4-προκαλούμενη από την αμινοπυριδίνη αύξηση στο DiSC₃(5) φθορισμός (t(8) = —0.014, p= 0.99; Τραπέζι 1).

Cistancheεχινακοσίδημπορεί να θεραπεύσει νεφρική νόσο

2.3. Μειωμένο- CO2 συνΗ εισροή μέσω των καναλιών Cav2.2 (N-Type) και Cav2.1 (P/Q-Type) μπορεί να συσχετιστεί με την αναστολή της απελευθέρωσης γλουταμικού που προκαλείται από την 4-αμινοπυριδίνη απόΕχινακοσίδη

Εικόνα 2 δείχνει ότι η 2 cu-conotoxin MVIIC, ένα N-και P/Q τύπου Ca²συν αποκλειστής καναλιών,

μείωσε την απελευθέρωση γλουταμικού {{0}}προκαλούμενη από αμινοπυριδίνη από 7,4 ✟ 0,2 σε 2.0 土 0,1 nmol/mg/5 λεπτά (t(9) = 25.35, p{{0}}.000). Παρουσία cu-κωνοτοξίνης MVIIC, η επίδραση της εχινακοσίδης 20 pM στην απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από {{4}αμινοπυριδίνη ήταν μη σημαντική (1,8 έως 0,2 nmol/mg/5 min.t(8) = 1.06, p= 0.32). Dantrolene (10^M), ένας αναστολέας του ενδοκυτταρικού Ca²συν απελευθέρωση Από το ενδοπλασματικό δίκτυο [28], μειωμένη 4-προκαλούμενη από αμινοπυριδίνη απελευθέρωση γλουταμικού (5,6 土 0,3 nmol/mg/5 λεπτά, F(2,14)=104. 95,p= 0.000). Ωστόσο, παρουσία dantrolene, 20 pJMεχινακοσίδηθα μπορούσε ακόμα να αναστείλει σημαντικά την απελευθέρωση γλουταμικού (3,3 土 0,2 nmol/mg/5 min;p= 0.000). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας 100 pM 7-χλωρο-5-(2-χλωροφαινυλ)-1,5-διυδρο-4,1-βενζοθειαζεπίνη -2(3H)-one (CGP37157), ένας αναστολέας της διαπερατότητας μεμβράνης του μιτοχονδριακού Na^συν/Ca²συν ανταλλαγή. Στα πέντε συναπτοσωματικά σκευάσματα που εξετάστηκαν, 20 pMεχινακοσίδησε συνδυασμό με 100 pM CGP37157 μείωσε την 4-προκαλούμενη από αμινοπυριδίνη απελευθέρωση γλουταμικού κατά 48,3 τοις εκατό έως 5,2 τοις εκατό (F(2,13) ​​= 136.79,p= 7.000), παρόμοια με την αναστολή μόνο από την εχινακοσίδη (46,2 τοις εκατό 土 2,3 τοις εκατό ;p = 0.89;

2.4. ΕχινακοσίδηΑναστέλλει 4-Προκαλούμενη από αμινοπυριδίνη (απελευθέρωση γλουταμικού μέσω σηματοδότησης μέσω της πρωτεϊνικής κινάσης C

Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 3, 10 βαθμοί jlM 2-[1-(3-διμεθυλαμινοπροπυλ)ινδολ-3-υλ]-3-(ινδολ-3-υλ) μαλεϊμίδιο (GF109203X), ένας γενικός αναστολέας πρωτεϊνικής κινάσης C [29], μειωμένη έκλυση γλουταμικού που προκαλείται από αμινοπυριδίνη (F(2,13) ​​= 19.46, p=0 .000). Στα συναπτοσώματα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με GF109203X, η εχινακοσίδη 20 pM μείωσε την απελευθέρωση γλουταμικού 4-που προκαλείται από αμινοπυριδίνη μόνο κατά 5,5 τοις εκατό έως 1,8 τοις εκατό (ρ=0,89), λιγότερο από αυτό μόνο από την εχινακοσίδη (42,4 τοις εκατό 土3). τοις εκατό ; p=στ.000). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με 5,6,7,13-τετραϋδρο-13-μεθυλ-5-οξο-12Η-ινδολο[2,3-a]πυρρολο[3 ,4-c]καρβαζόλη-12-προπανιτρίλιο (Go6976), ένα εκλεκτικό για ισόμορφες εξαρτώμενες από Ca2 συν πρωτεΐνη κινάσης C (a, |3I, |3II, y) [29]. Παρουσία 3 μ.μ. Go6976, 20 μ.μεχινακοσίδημείωσε την απελευθέρωση γλουταμικού κατά 11,9 τοις εκατό 土 2,9 τοις εκατό (ρ=0,59), που σημαίνει σημαντική μείωση σε σύγκριση με αυτή μόνο από την εχινακοσίδη (42,4 τοις εκατό 土 2,3 τοις εκατό ; p=0.000; Εικόνα 3). Αντίθετα, 3 pM rottlerin, ένας αναστολέας C6 πρωτεϊνικής κινάσης ανεξάρτητος από Ca2 συν [30], δεν άλλαξε σημαντικά την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από 4-αμινοπυριδίνη (1 mM) (ρ=0.45). Παρόλα αυτά, παρουσία ροττερίνης, εχινακοσίδη 20 pM προκάλεσε αποτελεσματικά μια μέση αναστολή 37,1 τοις εκατό έως 5,6 τοις εκατό της απελευθέρωσης (F(2,13) ​​= 19}.72, p=0.{{33 }}), παρόμοιο με αυτό μόνο από την εχινακοσίδη (ρ=0.41· Εικόνα 3). Επιπλέον, ο ενεργοποιημένος από μιτογόνο αναστολέας πρωτεϊνικής κινάσης 2-(2-αμινο-3-μεθοξυφαινυλ)-4H-1-βενζοπυράνη-4-one) (PD98059 ) (50 pM) και ο αναστολέας πρωτεϊνικής κινάσης Α Ν-[2-(ρ-βρωμοκινναμυλαμινο)αιθυλ]-5-ισοκινολινοσουλφοναμίδιο (H89) (100 pM) μείωσαν την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από 4-αμινοπυριδίνη (σ=0.000). Ακόμη και παρουσία PD98059 ή H89, 20 pMεχινακοσίδημείωσε αποτελεσματικά την απελευθέρωση (F(2,13) ​​= 52.3, p=0.000· Εικόνα 3).

Το σχήμα 4 δείχνει ότι η 11 mM 4-αμινοπυριδίνη αύξησε τη φωσφορυλίωση της πρωτεϊνικής κινάσης C στα συναπτοσώματα (t(4) = —6.871, p= 0.002). Όταν τα συναπτοσώματα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με εχινακοσίδη 20 pM για 10 λεπτά πριν από την προσθήκη 4-αμινοπυριδίνης, η φωσφορυλίωση της πρωτεϊνικής κινάσης C προκάλεσε η 4-αμινοπυριδίνη μειώθηκε σημαντικά (F(2_a6) = 29.202, p = 0.00 1).

Εχινακοσίδησεκιστανάκιμπορεί να τονώσει τοανοσοποιητικό σύστημα

2.5. Εχινακοσίδη-Η διαμεσολαβούμενη αναστολή της απελευθέρωσης γλουταμικού δεν περιλαμβάνει ένα γάμμα-αμινοβουτυρικό οξύ τύπου Α (GAB³A_A) Υποδοχέας

Στο Σχήμα 5, η επίδραση της εχινακοσίδης στην απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από {{1}αμινοπυριδίνη απουσία ή παρουσία του SR95531 (ανταγωνιστής του GABA_Aυποδοχέα) συγκρίθηκε. Επιπλέον, 100 pM SR95531 δεν άλλαξε σημαντικά την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από 4-αμινοπυριδίνη (1 mM). Στο

Συναπτοσώματα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με SR95531-, η εφαρμογή εχινακοσίδης 20 pM είχε ως αποτέλεσμα 43 τοις εκατό αναστολή της απελευθέρωσης γλουταμικού που προκαλείται από 4-αμινοπυριδίνη (F(2,12)=42.63,p= 0.000), το οποίο δεν διέφερε σημαντικά από την αναστολή που παράγεται μόνο από την εχινακοσίδη (40 τοις εκατό ;p= 0.000). Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα λήφθηκε με έναν άλλο ανταγωνιστή υποδοχέα GABAa, τη μπικουκουλλίνη (50 ρΜ). Η απελευθέρωση μετρήθηκε παρουσία μπικουκουλίνης και