Μέρος 1 Η δοξορουβικίνη βελτιώνει παραδόξως τη φλεγμονή που προκαλείται από όγκους σε νεαρά ποντίκια

Επικοινωνία: ali.ma@wecistanche.com

Ibrahim Y. Abdelgawad et al

Το Cistanche tubulosa αποτρέπει τη νεφρική νόσο, κάντε κλικ εδώ για να το λάβετεπροϊόντα και Cistanche herba

Αφηρημένη:

Δοξορουβικίνη(DOX) είναι ένας από τους πιο ευρέως χρησιμοποιούμενους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες στην παιδιατρική ογκολογία. Το DOX προκαλεί μια φλεγμονώδη απόκριση σε πολλαπλά όργανα, η οποία συμβάλλει σε ανεπιθύμητες ενέργειες που προκαλούνται από το DOX. Ο ίδιος ο καρκίνος προκαλεί φλεγμονή που οδηγεί σε πολλαπλές παθολογικές καταστάσεις. Η τρέχουσα μελέτη διερεύνησε τη φλεγμονώδη απόκριση στο DOX καιόγκουςχρησιμοποιώντας anEL4-λέμφωμα, ανοσοεπαρκές, μοντέλο νεανικού ποντικού. Αρσενικά ποντίκια C57BL/6N ηλικίας τεσσάρων εβδομάδων ενέθηκαν υποδόρια με κύτταρα λεμφώματος EL4 (5 × 104 κύτταρα/ποντικό) στην περιοχή των πλευρών, ενώόγκος-ελεύθερα ποντίκια έλαβαν ένεση με όχημα. Τρεις ημέρες μετά την εμφύτευση όγκου, τόσο σε ποντίκια χωρίς όγκο όσο και σε ποντίκια που φέρουν όγκο ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά είτε DOX (4 mg/kg/εβδομάδα) είτε φυσιολογικό ορό για 3 εβδομάδες. Μία εβδομάδα μετά την τελευταία ένεση DOX, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι καρδιές, τα συκώτια,νεφρά, και ο ορός συγκομίστηκε. Η γονιδιακή έκφραση και η συγκέντρωση των φλεγμονωδών δεικτών στον ορό ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας PCR σε πραγματικό χρόνο και ELISA, αντίστοιχα. Η θεραπεία με DOX καταστέλλεται σημαντικάόγκοςανάπτυξη σε ποντίκια που φέρουν όγκο και προκάλεσε σημαντική καρδιακή ατροφία σε ποντίκια χωρίς όγκο και ποντίκια που φέρουν όγκο. Οι όγκοι EL4 προκάλεσαν μια ισχυρή φλεγμονώδη απόκριση στην καρδιά, το ήπαρ καινεφρό. Εντυπωσιακά, η θεραπεία με DOX βελτίωσε τη φλεγμονή που προκαλείται από όγκους παράδοξα με την επίδραση του DOX σε ποντίκια χωρίς όγκο, επιδεικνύοντας μια ευρέως αποκλίνουσα επίδραση της θεραπείας με DOX σε ποντίκια χωρίς όγκο σε σχέση με ποντίκια που φέρουν όγκο.

Λέξεις-κλειδιά:δοξορουβικίνη; όγκος; φλεγμονή

1. Εισαγωγή

Η δοξορουβικίνη (DOX), επίσης γνωστή ως Αδριαμυκίνη, είναι ένας από τους πιο ευρέως χρησιμοποιούμενους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες στην παιδιατρική κλινική ογκολογία. Παρά την αποτελεσματικότητά του σε ένα ευρύ φάσμα καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του λεμφώματος, της λευχαιμίας και άλλων παιδιατρικών καρκίνων, η κλινική χρησιμότητα του DOX είναι περιορισμένη λόγω της τοξικότητάς του σε πολλαπλά όργανα. Εκτός από την έντονη καρδιοτοξικότητά του [1], το DOX έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί νεφροτοξικότητα [2-5] και ηπατοτοξικότητα [6]. Σχεδόν το 50 τοις εκατό των παιδιατρικών ασθενών με καρκίνο λαμβάνουν DOX ως μέρος του θεραπευτικού τους πρωτοκόλλου [7]. Λόγω των αποτελεσματικών θεραπειών για τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένου του DOX, το ποσοστό επιβίωσης 5-ετών παιδιών που έχουν διαγνωστεί με καρκίνο έχει αυξηθεί από λιγότερο από 60 τοις εκατό τη δεκαετία του 1970 σε περισσότερο από 80 τοις εκατό τώρα [8,9]. Αυτό οδηγεί σε μεγάλο πληθυσμό επιζώντων από καρκίνο παιδικής ηλικίας (CCS), που υπολογίζεται ότι είναι περίπου 400,000. Δυστυχώς, τα CCS διατρέχουν υψηλό κίνδυνο να αναπτύξουν μακροχρόνιες ανεπιθύμητες ενέργειες λόγω της θεραπείας του καρκίνου ή/και του ίδιου του καρκίνου.

Το DOX έχει αποδειχθεί ότι πυροδοτεί συστηματική φλεγμονή [10-12] και φλεγμονώδη απόκριση σε πολλαπλά όργανα, συμπεριλαμβανομένης της καρδιάς [13],νεφρό[14] και το συκώτι [15]. Αυτή η φλεγμονώδης απόκριση έχει αποδειχθεί ότι προάγει τις ανεπιθύμητες ενέργειες που προκαλούνται από το DOX [16,17]. Η πλειονότητα αυτών των μελετών που αναφέρουν φλεγμονή που προκαλείται από DOX έχουν διεξαχθεί σεόγκος-ελεύθερα ζωικά μοντέλα που δεν μιμούνται το κλινικό σενάριο στο οποίο οι παιδιατρικοί ασθενείς με καρκίνο λαμβάνουν θεραπεία DOX μετά τη διάγνωση του καρκίνου. Ο καρκίνος από μόνος του έχει επίσης αποδειχθεί ότι προκαλεί φλεγμονή συμβάλλοντας σε πολλαπλές παθολογικές καταστάσεις που μπορεί να επιδεινώσουν τις τοξικότητες που προκαλούνται από το DOX [18,19]. Ως εκ τούτου, υπάρχει κρίσιμη ανάγκη να καθιερωθούν κλινικά σχετικά ζωικά μοντέλα για τη διερεύνηση των μηχανισμών της επαγόμενης από το DOX τοξικότητας πολλαπλών οργάνων σε νέους,όγκος-που φέρουν ποντίκια για να μελετήσουν την αλληλεπίδραση μεταξύ της θεραπείας με DOX και του ίδιου του καρκίνου για την πρόκληση τέτοιων τοξικοτήτων.

Στην τρέχουσα μελέτη, διερευνήσαμε τη φλεγμονώδη απόκριση στο DOX και τον όγκο σε ένα κλινικά σχετικό συγγενικό EL4-λέμφωμα, ανοσοεπαρκές, μοντέλο νεανικού ποντικού. Αυτό το μοντέλο είναι καλά εδραιωμένο στην έρευνα για τον καρκίνο [20] και είναι κλινικά σχετικό με παιδιατρικούς ασθενείς με καρκίνο, καθώς το λέμφωμα είναι ένας από τους πιο συνηθισμένους τύπους παιδικού καρκίνου [21]. Η χρήση συγγενικών ποντικών είναι κρίσιμη για τη μελέτη της φλεγμονώδους απόκρισης τόσο στο DOX όσο και στον όγκο λόγω του κρίσιμου ρόλου του ανοσοποιητικού συστήματος στην παθογένεση της φλεγμονής [22]. Η ηλικία των ποντικών ήταν 5 εβδομάδες μετά τη χορήγηση DOX, η οποία ισοδυναμεί με την εφηβική ηλικία των 10-12 ετών στους ανθρώπους [23]. Επιπλέον, οι χορηγούμενες δόσεις DOX είναι κλινικά σχετικές με τις δόσεις που λαμβάνουν οι παιδιατρικοί ασθενείς με καρκίνο [24]. Προσδιορίσαμε αρχικά τις επιδράσεις του DOX στην καρδιακή λειτουργία σε ποντίκια χωρίς όγκο και ποντίκια που φέρουν όγκο, καθώς η επαγόμενη από DOX καρδιοτοξικότητα θεωρείται η πιο σχετική κλινικά ανεπιθύμητη ενέργεια του DOX, μεταξύ άλλων τοξικοτήτων πολλαπλών οργάνων. Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε την επίδραση του DOX, του όγκου και του συνδυασμού τους σε αρκετούς φλεγμονώδεις δείκτες στην καρδιά, το ήπαρ καινεφρόεκτός από δείκτες ορού συστηματικής φλεγμονής. Βρήκαμε ότι η παρουσία του όγκου EL4 προκάλεσε ισχυρή φλεγμονώδη απόκριση σε πολλαπλά όργανα. Εντυπωσιακά, η θεραπεία με DOX βελτίωσε τη φλεγμονή που προκαλείται από όγκους παράδοξα με την προηγουμένως αναφερθείσα επίδραση του DOX σε ποντίκια χωρίς όγκο.

2. Αποτελέσματα

2.1. Επιδράσεις του DOX στο σωματικό βάρος και την ανάπτυξη του όγκου

Η τρέχουσα μελέτη καθιερώθηκε σε νεαρά ποντίκια για να μιμηθεί το κλινικό σενάριο σε παιδιατρικούς ασθενείς με καρκίνο όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1Α. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική νοσηρότητα ή θνησιμότητα είτε σε ποντίκια χωρίς όγκο είτε σε ποντικούς που φέρουν όγκο μετά από έκθεση σε DOX (4 mg/kg/εβδομάδα για 3 εβδομάδες), κάτι που συμφωνεί με την προηγούμενη μελέτη μας που χρησιμοποιούσε την ίδια δόση [25]. Ωστόσο, η νεανική έκθεση σε DOX είχε ως αποτέλεσμα σημαντικά μειωμένο κέρδος σωματικού βάρους σε σύγκριση με ποντίκια που έλαβαν φυσιολογικό ορό (Εικόνα 1Β). Για να αξιολογήσουμε την αντικαρκινική επίδραση του DOX σε αυτό το μοντέλο λεμφώματος EL4, μετρήσαμε τα βάρη του όγκου μετά από νεκροψία ποντικών. Η χρόνια χορήγηση DOX σε ποντικούς που φέρουν όγκο ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου EL4, καταδεικνύοντας την αντικαρκινική δράση αυτού του δοσολογικού σχήματος του DOX (Εικόνα 1C).

2.2. Επίδραση της χορήγησης DOX στην καρδιακή λειτουργία και τη μορφομετρία σε ποντίκια χωρίς όγκους και ποντίκια που φέρουν όγκο

Το DOX προκάλεσε καρδιακή ατροφία όπως αποδεικνύεται από μια σημαντική μείωση του βάρους της καρδιάς ως το μήκος της κνήμης (HW/TL) (Εικόνα 1D). Αξιοσημείωτα, η καρδιακή ατροφία που προκαλείται από το DOX αυξήθηκε σε ποντίκια που φέρουν όγκο (Εικόνα 1D). Οι επιδράσεις του DOX, του όγκου και του συνδυασμού και των δύο στην καρδιακή λειτουργία και μορφολογία αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας διαθωρακικό υπερηχοκαρδιογράφημα. Αντιπροσωπευτικές εικόνες M-Mode από κάθε ομάδα εμφανίζονται στο Σχήμα 2Α. Ούτε το DOX ούτε ο όγκος προκάλεσαν σημαντικές αλλαγές στο κλάσμα εξώθησης (Εικόνα 2Β), στην καρδιακή παροχή (Εικόνα 2C), στην κλασματική βράχυνση (Εικόνα 2D), στη μάζα της αριστερής κοιλίας (LV) (Εικόνα 2Ε), στο πάχος του οπίσθιου τοιχώματος LV στη διαστολή (LVPW' δ) (Εικόνα 2F), ή πάχος οπίσθιου τοιχώματος LV στη συστολή (LVPW's) (Εικόνα 2G).

2.3. Επίδραση της χορήγησης DOX στη γονιδιακή έκφραση φλεγμονωδών δεικτών στην καρδιά ποντικών που φέρουν όγκο και χωρίς όγκο

Οι καρδιές συλλέχθηκαν τόσο από νεανικά ποντίκια C57BL/6N χωρίς όγκο όσο και από λέμφωμα EL4 που φέρουν όγκο μια εβδομάδα μετά τη χορήγηση 4 mg/kg/εβδομάδα DOX ή ισοδύναμου όγκου στείρου ορού για 3 εβδομάδες (n=8 ανά ομάδα). Μετά την εξαγωγή του ολικού RNA, έκφραση του καρδιακού mRNA των φλεγμονωδών δεικτών ιντερλευκίνη-1 άλφα (IL-1 ), ιντερλευκίνη-1 βήτα (IL{-1 ), ιντερλευκίνη{{12} } (IL-6), παράγοντας-άλφα νέκρωσης όγκου (TNF-), χημειοελκυστική πρωτεΐνη μονοκυττάρων φλεγμονωδών χημειοκινών-1 (Mcp-1) και χημειοκίνες με μοτίβο CX (Cxcl1, Cxcl9, και Cxcl10) προσδιορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου. Η γονιδιακή έκφραση πολλαπλών φλεγμονωδών δεικτών στην καρδιά ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω σε ποντίκια που φέρουν όγκο σε σύγκριση με ποντίκια χωρίς όγκο, συμπεριλαμβανομένων των προφλεγμονωδών κυτοκινών IL-1 (Εικόνα 3Α), IL-1 ( Σχήμα 3Β), IL-6 (Εικόνα 3C) και TNF- (Εικόνα 3D) και οι φλεγμονώδεις χημειοκίνες Mcp-1 (Εικόνα 3Ε), Cxcl1 (Εικόνα 3F) και Cxcl10 (Εικόνα 3Η). Ενώ η χορήγηση DOX σε ποντίκια χωρίς όγκο δεν οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές στην έκφραση φλεγμονωδών δεικτών στην καρδιά, η χορήγηση DOX ακύρωσε σημαντικά την επαγόμενη από τον όγκο ανοδική ρύθμιση της IL-1 (Εικόνα 3B), Mcp{{44} } (Εικόνα 3Ε), Cxcl9 (Εικόνα 3G) και Cxcl10 (Εικόνα 3Η). Είναι σημαντικό ότι η αμφίδρομη ANOVA έδειξε σημαντική επίδραση αλληλεπίδρασης σε όλους τους δείκτες εκτός από τους Cxcl1, Cxcl9 και Cxcl10, καταδεικνύοντας τις αποκλίνουσες επιδράσεις που έχει το DOX στους καρδιακούς φλεγμονώδεις δείκτες σε ποντίκια που φέρουν όγκο σε σύγκριση με ποντίκια χωρίς όγκο.

2.4. Επίδραση της χορήγησης DOX στη γονιδιακή έκφραση φλεγμονωδών δεικτών στο ήπαρ ποντικών χωρίς όγκο και φέροντα όγκο

Συλλέχθηκαν συκώτια από νεαρά ποντίκια C57BL/6N χωρίς όγκο και από νεανικά ποντίκια C57BL/6N χωρίς όγκο και από λέμφωμα EL4 μία εβδομάδα μετά τη χορήγηση 4 mg/kg/εβδομάδα DOX ή ισοδύναμου όγκου στείρου ορού για 3 εβδομάδες (n=8 ανά ομάδα). Μετά την εξαγωγή του ολικού RNA, έκφραση ηπατικού mRNA των φλεγμονωδών δεικτών IL-1 , IL-1 , IL{-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 και Cxcl10 προσδιορίστηκαν με PCR σε πραγματικό χρόνο. Τα ποντίκια που φέρουν όγκο είχαν σημαντικά αυξημένη ηπατική έκφραση των προφλεγμονωδών κυτοκινών IL-1 (Εικόνα 4Α), IL-1 (Εικόνα 4Β), TNF- (Εικόνα 4D), Cxcl9 (Εικόνα 4G), και Cxcl10 (Εικόνα 4Η) σε σύγκριση με ποντίκια χωρίς όγκο. Αν και λιγότερο αξιοσημείωτη, η αμφίδρομη ANOVA καταδεικνύει μια σημαντική επίδραση του όγκου στην ηπατική γονιδιακή έκφραση της IL-6 (Εικόνα 4C). Η αμφίδρομη ANOVA έδειξε σημαντική επίδραση αλληλεπίδρασης μεταξύ του όγκου και της DOX στο Cxcl10 (Εικόνα 4Η). Η χορήγηση DOX μείωσε την επαγόμενη από όγκο ρύθμιση προς τα πάνω της IL-1 και του TNF- (Εικόνα 4Β, Δ). Ούτε το DOX ούτε ο όγκος είχαν σημαντική επίδραση στην ηπατική έκφραση των φλεγμονωδών χημειοκινών Mcp-1 και Cxcl1 (Εικόνα 4Ε, ΣΤ).

2.5. Επίδραση της χορήγησης DOX στη γονιδιακή έκφραση φλεγμονωδών δεικτών στο νεφρό ποντικών χωρίς όγκο και φέροντα όγκο

Τα νεφρά συλλέχθηκαν τόσο από νεανικά ποντίκια C57BL/6N χωρίς όγκο όσο και από λέμφωμα EL4 που φέρουν όγκο μία εβδομάδα μετά τη χορήγηση 4 mg/kg/εβδομάδα DOX ή ισοδύναμου όγκου στείρου φυσιολογικού ορού για 3 εβδομάδες (n=8 ανά ομάδα). Μετά την εξαγωγή ολικού RNA, έκφραση νεφρικού mRNA των φλεγμονωδών δεικτών IL-1 , IL-1 , IL{-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 και Cxcl10 προσδιορίστηκαν με PCR σε πραγματικό χρόνο. Σύμφωνα με τις παρατηρούμενες αλλαγές στην καρδιά και το ήπαρ, τα ποντίκια που φέρουν όγκο είχαν σημαντικά αυξημένη νεφρική έκφραση των προφλεγμονωδών κυτοκινών IL-1 (Εικόνα 5Α), IL-1 (Εικόνα 5Β), TNF- (Εικόνα 5D) και Mcp-1 (Εικόνα 5Ε) σε σύγκριση με ποντίκια χωρίς όγκο. Επιπλέον, η αμφίδρομη ANOVA καταδεικνύει μια σημαντική επίδραση του όγκου στη νεφρική γονιδιακή έκφραση των Cxcl1 (Εικόνα 5F), Cxcl9 (Εικόνα 5G) και Cxcl10 (Εικόνα 5Η). Η χορήγηση DOX σε ποντικούς που φέρουν όγκο βελτίωσε σημαντικά την επαγόμενη από τον όγκο ανοδική ρύθμιση της IL-1 (Εικόνα 5Β), της IL-6 (Εικόνα 5C), του TNF- (Εικόνα 5D) και της Mcp{{43} } (Εικόνα 5Ε). Μέσα σε αυτούς τους δείκτες, η αμφίδρομη ANOVA έδειξε επίσης μια σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ του DOX και του όγκου, καταδεικνύοντας τις διαφορετικές επιδράσεις που έχει το DOX στους δείκτες νεφρικής φλεγμονής σε ποντίκια που φέρουν όγκο σε σύγκριση με ποντίκια χωρίς όγκο.

2.6. Επίδραση της χορήγησης DOX στα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά στην καρδιά, το ήπαρ και το νεφρό ποντικών χωρίς όγκο και ποντίκια που φέρουν όγκο

Οι καρδιές, τα συκώτια και οι νεφροί συλλέχθηκαν από μία ομάδα νεανικών ποντικών C57BL/6N χωρίς όγκο και λεμφώματος EL4 που φέρουν όγκους μία εβδομάδα μετά τη χορήγηση 4 mg/kg/εβδομάδα DOX ή ισοδύναμου όγκου στείρου ορού για 3 εβδομάδες ( n=4 ανά ομάδα). Η ιστοπαθολογική αξιολόγηση δεν έδειξε σημαντικές παθολογικές αλλαγές στην καρδιά (Εικόνα 6Α). Μόνο ελάχιστη διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων, που αποδεικνύεται ως σπάνιες εστίες ελάχιστα κυτταρικής μικτής (μονοπύρηνης και ουδετερόφιλης) φλεγμονής, παρατηρήθηκε στους ιστούς του ήπατος που συλλέχθηκαν από αγωγή με DOX χωρίς όγκο (τρία στα τέσσερα ποντίκια), που έφεραν όγκο δύο στα τέσσερα ποντίκια) και ποντίκια που φέρουν όγκους που έλαβαν θεραπεία με DOX (τρία στα τέσσερα ποντίκια) (Εικόνα 6Β). Η ιστοπαθολογική αξιολόγηση των νεφρών δεν έδειξε σημαντικές παθολογικές αλλαγές σε όλες τις ομάδες εκτός από τα ποντίκια που φέρουν όγκους που έλαβαν θεραπεία με DOX (Εικόνα 6Γ), με δύο από τα τέσσερα ποντίκια αυτής της ομάδας να παρουσιάζουν περιοχές πλήρους πάχους σωληναριακής αναγέννησης, ίνωσης και ήπιας διάμεσης φλεγμονή που επηρεάζει περίπου το 5 τοις εκατό της συνολικής επιφάνειας των ιστών.

2.7. Αποκλίνουσες επιδράσεις του DOX στις φλεγμονώδεις κυτοκίνες ορού σε ποντίκια χωρίς όγκους σε σχέση με ποντίκια που φέρουν όγκο

Έχουμε αναφέρει προηγουμένως ότι η οξεία χορήγηση DOX προκάλεσε συστηματική φλεγμονώδη απόκριση σε ενήλικα ποντίκια C57BL/6N [11]. Εδώ, προσδιορίσαμε την επίδραση της χρόνιας χορήγησης DOX στα επίπεδα ορού των φλεγμονωδών δεικτών IL-6 και TNF-, σε νεαρά ποντίκια χωρίς όγκο και ποντίκια που φέρουν όγκο. Τα ποντίκια που έφεραν όγκο που έλαβαν αγωγή με αλατούχο διάλυμα κατέδειξαν αξιοσημείωτη, αν και στατιστικά ασήμαντη, αύξηση της IL-6 ορού (Εικόνα 7Α) και του TNF- (Εικόνα 7Β) σε σύγκριση με ποντίκια χωρίς όγκους. Είναι σημαντικό ότι η αμφίδρομη ANOVA έδειξε μια σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ της χορήγησης DOX και του όγκου στα επίπεδα ορού της IL-6 και του TNF- . Πράγματι, η χορήγηση DOX ομαλοποίησε την επαγόμενη από όγκους ανοδική ρύθμιση της IL-6 σε παρόμοιο επίπεδο με τα ποντίκια ελέγχου χωρίς όγκο (Εικόνα 7Α).