Μέρος 1 Ανίχνευση φαρμακευτικών προϊόντων Cistanches Herba (Rou Cong Rong) με χρήση υπογραφών νουκλεοτιδίων ειδικών για τα είδη

Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε με:Joanna.jia@wecistanche.com

Xiao-Yue Wang 1, Rong Xu 1, Jun Chen 1, Jing-yuan Song 1, Steven-G Newmaster 2, Jian-ping Han 1*, Zheng Zhang 1* και Shi-lin Chen 3

1 Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Υπουργείο Παιδείας, Ινστιτούτο Ανάπτυξης Φαρμακευτικών Φυτών, Κινεζική Ακαδημία Ιατρικής Επιστήμης και Peking Union Medicinal College, Πεκίνο, Κίνα, 2 NHP Research Alliance, Biodiversity Institute of Ontario (BIO ), University of Guelph, Guelph, ON, Καναδάς,

3 Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Πεκίνο, Κίνα

Το Cistanche deserticola έχει πολλά αποτελέσματα, κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Cistanches Herbaείναι ένα φαρμακευτικό φυτό που έχει αποτοξινωτικές ιδιότητες και χρησιμοποιείται συνήθως στην Ασία. Λόγω της ανισορροπίας μεταξύ προσφοράς και ζήτησης, προστίθενται συχνά μοιχεία για κέρδος. Ωστόσο, δεν υπάρχει ρυθμιστική εποπτεία, επειδή τα εργαλεία ποιοτικού ελέγχου δεν επαρκούν για τον εντοπισμό προϊόντων υψηλής επεξεργασίας. Έτσι, αναπτύχθηκε ένα νέο μοριακό εργαλείο που βασίζεται σε υπογραφές νουκλεοτιδίων και εκκινητές ειδικούς για το είδος. Οι περιοχές ITS2 από 251Cistanches Herbaκαι τα δείγματα νοθείας αλληλουχήθηκαν. Με βάση τις θέσεις SNP, αναπτύχθηκαν τέσσερις υπογραφές νουκλεοτιδίων εντός 30-37 bp και έξι εκκινητές ειδικοί για τα είδη, και επικυρώθηκαν με τεχνητά πειραματικά μείγματα που αποτελούνται από έξι διαφορετικά είδη και διαφορετικές αναλογίες. Αυτή η μέθοδος εφαρμόστηκε επίσης για την ανίχνευση 66Cistanches Herbaπροϊόντα στην αγορά, συμπεριλαμβανομένων εκχυλισμάτων και κινεζικών φαρμάκων με διπλώματα ευρεσιτεχνίας. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν τη χρησιμότητα των νουκλεοτιδικών υπογραφών στην ταυτοποίηση μολυσματικών σε μείγματα. Η μελέτη αγοράς αποκάλυψε 36,4 τοις εκατό νοθεία: 19,7 τοις εκατό αφορούσαν νοθεία με Cynomorium songaricum ήCistancheSinensis, και το 16,7 τοις εκατό αφορούσε αντικατάσταση με Cy. songaricum, Ci. sinensis, ή Boschniakia rossica. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν επίσης ότι ο Cy. Το songaricum ήταν ο πιο κοινός μοιχός στην αγορά. Επομένως, συνιστούμε τη χρήση νουκλεοτιδικών υπογραφών για συγκεκριμένο είδος για τη ρύθμιση της νοθείας και την επαλήθευση της διασφάλισης ποιότητας των αλυσίδων εφοδιασμού φαρμακευτικών προϊόντων, ειδικά για τα επεξεργασμένα προϊόντα των οποίων το DNA έχει υποβαθμιστεί.

Λέξεις-κλειδιά: Cistanches Herba, Κινεζική ιατρική πατέντα, υπογραφή νουκλεοτιδίων, υποβαθμισμένο DNA, ποιοτικός έλεγχος φαρμάκων

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Cistanches HerbaΤο (Rou Cong Rong) είναι ένα πολύ γνωστό φάρμακο που έχει καταγραφεί στη Φαρμακοποιία στην Ασία (Chinese Pharmacopoeia Commission, 2015; Japan Pharmacopeial Convention, 2016). αυτό το φάρμακο προέρχεται από τα αποξηραμένα παχύφυτα στελέχη τουCistanche deserticolaYC Ma ήCistanche tubulosaτονωτικό, καθώς δεν είναι τοξικό και μπορεί να ληφθεί για μεγάλα χρονικά διαστήματα (Li et al., 2016). Επί πλέον,ΚιστάνουςΤο Herba είχε την τιμή να ονομαστεί "Desert Ginseng" λόγω της μεγάλης φαρμακευτικής του αξίας, ειδικά στην ενίσχυση της ανδρικής σεξουαλικής λειτουργίας (Zhang and Su, 2014; Gu et al., 2016). Υπάρχουν περισσότερα από 100 κινεζικά φάρμακα με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας που έχουν καταγραφεί στην Επιτροπή Κινεζικής Φαρμακοποιίας (2015) και σε άλλα τοπικά επίσημα κοινοποιημένα πρότυπα (Wang et al., 2012). Καθώς ο πληθυσμός των ηλικιωμένων αυξάνεται, υπάρχει σημαντική ζήτηση γιαCistanches Herbaκαι τα φαρμακευτικά προϊόντα της. Ωστόσο, οι πόροι πρώτων υλών γίνονται όλο και πιο σπάνιοι. Στην πραγματικότητα, τα δύο πρωτότυπα είδη τουCistanches Herbaέχουν προστεθεί στο Κόκκινο Βιβλίο των Φυτών της Κίνας ως προστατευόμενα από το κράτος άγρια ​​φυτά (κατηγορία II) (Fu, 1991). Τα φαρμακευτικά υλικά που κυκλοφορούν στην αγορά καλλιεργούνται κυρίως στη βορειοδυτική Κίνα.

Λόγω της σημαντικής ανισορροπίας μεταξύ της προσφοράς και της ζήτησης τουΚιστάνουςHerba, πολλοί μοιχοί έχουν μπει στην αγορά. αυτοί οι μοιχοί δεν συνάδουν με τα πρότυπα και μπορούν να απειλήσουν την ασφάλεια των ναρκωτικών. Οι γνωστοί μοιχοί περιλαμβάνουν τους αποξηραμένους χυμώδεις μίσχους του Cynomorium songaricum Rupr. (Cynomorii Herba, Suo Yang στα κινέζικα),Cistanchesinensis Beck, Orobanche coerulescens Stephan και Boschniakia rossica (Cham. et Schlecht.) Fedtsch. et Flerov (Sun et al., 2012). Αυτά τα νοθευτικά έχουν μορφολογικά χαρακτηριστικά παρόμοια με αυτά τωνΚιστάνουςHerba, καθιστώντας δύσκολη την παραδοσιακή ταξινομική ταυτοποίηση, ιδιαίτερα μετά την επεξεργασία του υλικού σε φαρμακευτικά προϊόντα. Η μικροσκοπική αναγνώριση δεν είναι διαθέσιμη γιατίΚιστάνουςHerbaδεν έχει οριστικά ή μοναδικά μικροσκοπικά χαρακτηριστικά. Τα τρέχοντα εργαλεία αναλυτικής χημείας δεν επαρκούν για την ανίχνευση νοθείας του Cistanches Herba επειδή παρόμοιες ενώσεις υπάρχουν και στα γνωστά μοσχευτικά Ci. salsa (Lei et al., 2001· Chen et al., 2007) και Ci. sinensis (Liu et al., 2013). Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη μιας ταχείας μοριακής μεθόδου για τον έλεγχο ταυτότητας του Cistanches Herba και των προϊόντων του απαιτείται επειγόντως για κατάλληλα συστήματα ποιοτικού ελέγχου στην κινεζική ιατρική διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας και σε άλλες βιομηχανίες φαρμακευτικών προϊόντων.

Οι Chen et al. Πρώτη πρότεινε το εσωτερικό μεταγραμμένο διαχωριστικό 2 (ITS2) ως καθολικό γραμμωτό κώδικα για φαρμακευτικά φυτά (Chen et al., 2010). Sun et al. επαλήθευσε την περιοχή ITS2 ως προτιμώμενο γραμμωτό κώδικα DNA για αναγνώρισηΚιστάνουςΗ Herba και οι μοιχοί της (Sun et al., 2012). Ωστόσο, το ITS2 δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να διακρίνει το κινεζικό δίπλωμα ευρεσιτεχνίας από το υποβαθμισμένο DNA. Πρόσφατα, ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχει δείξει ότι ο «mini barcode» είναι μια χρήσιμη μέθοδος για την ενίσχυση του υποβαθμισμένου DNA (Hajibabaei et al., 2006; Meusnier et al., 2008; Dubey et al., 2011; Lo et al., 2015). Ωστόσο, οι υπογραφές νουκλεοτιδίων είναι πιο κατάλληλες από τους μίνι γραμμωτούς κώδικες, καθώς οι διαμορφωτές αναφέρονται σε ένα ή περισσότερα νουκλεοτίδια που είναι μοναδικά για ένα είδος και μπορούν να χρησιμοποιηθούν αποτελεσματικά από πολλές μοριακές τεχνικές, όπως ανιχνευτές DNA, μικρορευστοποίηση και ισοθερμική ενίσχυση μέσω βρόχου. de Boer et al., 2015). Οι Han et al. ανέπτυξε υπογραφές νουκλεοτιδίων για τα Panax ginseng, Angelica Sinensis και Lonicera japonica και εντόπισε επιτυχώς τα σχετικά κινεζικά φάρμακα με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας (Liu et al., 2016; Wang et al., 2016a; Gao et al., 2017).

λειτουργικά προϊόντα που περιέχουνΚιστάνουςHerba. Συγκεκριμένα, αναπτύξαμε (1) τέσσερις υπογραφές νουκλεοτιδίων και έξι συγκεκριμένα ζεύγη εκκινητών για τη διαφοροποίηση των αυθεντικώνΚιστάνουςΗ Herba και οι γνωστοί νοθευτές, (2) επικύρωσαν τις τέσσερις υπογραφές νουκλεοτιδίων σε πειράματα συμπεριλαμβανομένων μιγμάτων γνωστών ταξινομικών κουπονιών που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή προϊόντων Cistanches Herba που περιέχουν τόσο αυθεντικά όσο και νοθευμένα συστατικά και (3) πραγματοποίησαν έρευνα αγοράς 66ΚιστάνουςΠροϊόντα Herba μέσω των νουκλεοτιδικών τους υπογραφών.

Cistancheέχει πολλά αποτελέσματα και μπορεί να ενισχύσει τη λειτουργία των νεφρών

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Συλλογή και προετοιμασία δειγμάτων

Συνολικά, συλλέχθηκαν 251 δείγματα από την Εσωτερική Μογγολία, το Xinjiang και τη Ningxia, μεταξύ άλλων περιοχών. αυτά τα δείγματα περιελάμβαναν 214Cistanches Herbaκαι 37 νοθευτές και αναφέρονται αναλυτικά στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1. Αντίστοιχα δείγματα κουπονιών επικυρώθηκαν από ταξινομιστές και κατατέθηκαν στο Herbarium του Ινστιτούτου Ανάπτυξης Φαρμακευτικών Φυτών, Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών, Πεκίνο, Κίνα. Συνολικά 35 παρτίδες σκόνες, μπαχαρικά και εκχυλίσματα απόΚιστάνουςΤα Herba αγοράστηκαν από ηλεκτρονικά καταστήματα και φαρμακεία στο Πεκίνο και στο Τσενγκντού (Πίνακας 1). Συνολικά, 31 παρτίδες κινεζικού διπλώματος ευρεσιτεχνίας που περιέχουνΚιστάνουςΤο Herba αγοράστηκε από διαφορετικά φαρμακεία (Πίνακας 2) και οι δηλωμένες συνθέσεις διαφορετικών φαρμάκων με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας της Κίνας φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Τα διαφορετικά μορφολογικά χαρακτηριστικά διαφορετικών μορφών δόσης φαίνονται στο Σχήμα 1.

Μικτά δείγματα: Σκόνες Ci.deserticola, Ci.σωληνοειδής, Cy. songaricum, Ci. sinensis, B. rossica και O. coerulescens αναμίχθηκαν τεχνητά σε διαφορετικούς συνδυασμούς (σε αναλογία 1:1) πριν από την εκχύλιση. Οι λεπτομέρειες αυτών των μικτών δειγμάτων φαίνονται στο υπόμνημα του Σχήματος 3. Επιπλέον, οι σκόνες τεσσάρων νοθευτών αναμίχθηκαν με το γνήσιο Ci. deserticola σε διαφορετικές αναλογίες βάρους: 10:1, 50:1, 100:1, 200:1, 500:1, 1000:1,

2000:1, 5000:1, 10000:1, 15000:1, 20000:1, 25000:1, 30000:1,

40000:1, 50000:1 και 60000:1 (Πίνακας 3). Και τα δύο γνήσια προϊόντα αναμειγνύονται στις ίδιες αναλογίες.

Αφέψημα: Φέτες Ci. deserticola και Cy. το songaricum χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή του αφεψήματος. Οι φέτες (10 g) βράστηκαν σε 300 mL διπλής απεσταγμένου νερού για 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 και 240 λεπτά και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για εκχύλιση DNA.

Εκχύλιση DNA, Ενίσχυση Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (PCR) και Αλληλουχία

Δείγματα, αφέψημα και μικτά δείγματα: Τα δείγματα (40–50 mg) αλέστηκαν σε λεπτές σκόνες μέσω ενός εργαστηριακού μύλου ανάμιξης Retsch MM400 (Retsch Co., Γερμανία) σε συχνότητα 30 Hz. Το γονιδιωματικό DNA στη συνέχεια εκχυλίστηκε με ένα κιτ Plant Universal Genomic DNA (Tiangen Biotech Beijing Co., Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το ITS2 ενισχύθηκε από τους γενικούς εκκινητές 2F/3R (Chen et al., 2010).

παράλληλα ανά παρτίδα. Η σκόνη φαρμάκου του κινεζικού διπλώματος ευρεσιτεχνίας πλύθηκε με 700 μL ρυθμιστικού διαλύματος πρόπλυσης [100 mM Tris-HCl, ρΗ 8,0. 20 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA), ρΗ 8,0;

700 mM NaCl; 2 τοις εκατό πολυβινυλοπυρρολιδόνη (PVP)-40; και 0,4 τοις εκατό -μερκαπτοαιθανόλη] αρκετές φορές μέχρις ότου το υπερκείμενο ήταν διαυγές και άχρωμο, και μετά το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στα 7500 χ g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το ίζημα στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση του γονιδιωματικού DNA μέσω του Plant Universal Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co.) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στο τέλος, το DNA από κάθε παρτίδα συγκεντρώθηκε σε έναν σωλήνα. Έξι ζεύγη εκκινητών ειδικά για είδη—SYF1/SYR1, HMRCF/HMRCR, GHRCF/GHRCR, CCRF/CCRR,

Τα SCRF/SCRR και LDF/LDR—σχεδιάστηκαν μέσω Primer Premier

6.0 λογισμικό (Premier Co., Καναδάς) για την ενίσχυση της Cistanches Herba και των νοθευτών της (οι λεπτομέρειες φαίνονται στον Πίνακα 4). Η PCR πραγματοποιήθηκε σε μια αντίδραση όγκου 50 μL που περιείχε 1 μL

KOD FX (Toyobo Co., Ιαπωνία), 25 μL ρυθμιστικού διαλύματος 2 × PCR, 10 μL dNTPs (2 mM), 1,5 μL από κάθε εκκινητή (10 μΜ) και 4 μL (~50 ng) μήτρας DNA. ο υπόλοιπος όγκος αποτελούνταν από διπλά αποσταγμένο νερό. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν από

ένας θερμικός κυκλοποιητής (VeritiTM 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems Co., ΗΠΑ)· τα θερμικά προγράμματα παρατίθενται στον Πίνακα 4. Τα προϊόντα PCR εξετάστηκαν μέσω ηλεκτροφόρησης γέλης αγαρόζης 3 τοις εκατό και καθαρίστηκαν για αμφίδρομη αλληλούχιση με έναν προσδιοριστή αλληλουχίας ABI 3730XL (Applied Biosystems Co.) σύμφωνα με τη μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger. Στη συνέχεια, η ευαισθησία των έξι εκκινητών δοκιμάστηκε μέσω της ποσοτικής ανάλυσης PCR σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR) με ένα σύστημα πραγματικού χρόνου CFX96 (Bio-rad Lab., ΗΠΑ). Τα κατώφλια κύκλου υπολογίστηκαν αυτόματα από το σύστημα μέσω του μοντέλου "PCR Baseline Subtracted Curve Fit". Το qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε μια αντίδραση όγκου 15 μL που περιείχε 7,5 μL SYBRⓍR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)

(Takara Bio Co., Ιαπωνία), 1,0 µL από κάθε εκκινητή (10 µΜ) και 1,0 µL εκμαγείου DNA με τον υπόλοιπο όγκο να αποτελείται από διπλά απεσταγμένο νερό. Η qRT-PCR πραγματοποιήθηκε με τρεις τεχνικές επαναλήψεις βάσει των οποίων υπολογίστηκε το τυπικό σφάλμα.

Ανάλυση αλληλουχίας: Οι αλληλουχίες επεξεργάστηκαν και συναρμολογήθηκαν χειροκίνητα μέσω του CodonCode Aligner 5.1.4 (CodonCode Co., ΗΠΑ).

Οι αλληλουχίες ITS από την GenBank σχολιάστηκαν μέσω του μοντέλου Hidden Markov (HMM) για να ληφθούν οι ακολουθίες ITS2 (Keller et al., 2009). Οι αλληλουχίες στη συνέχεια ευθυγραμμίστηκαν με λογισμικό MEGA 5.0 μέσω της μεθόδου ευθυγράμμισης «Muscle» (Edgar, 2004· Tamura et al., 2011).

Cistancheέχει πολλά αποτελέσματα και μπορεί να ενισχύσεινεφρόλειτουργία

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Ανάπτυξη νουκλεοτιδικών υπογραφών και ζευγών εκκινητών ειδικών για τα είδη για Cistanches Herba και Adulterants

Τα ποσοστά επιτυχίας της ενίσχυσης PCR και του προσδιορισμού αλληλουχίας των 251 δειγμάτων ήταν 100 τοις εκατό όταν χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος εκκινητών 2F/3R. Το ευθυγραμμισμένο μήκος του Cy. Οι ακολουθίες songaricum ITS2 ήταν 229 bp (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Η ανάλυση των αλληλουχιών από τα είδη ερμπαριού και εκείνων των στενά συγγενών ειδών που ανακτήθηκαν από την GenBank (Συμπληρωματικός Πίνακας S2) αποκάλυψε δύο θέσεις πολυμορφισμού απλού νουκλεοτιδίου (SNP) για το Cy. songaricum. Με βάση τα SNPs, ένα Cy. Αναπτύχθηκε ειδική για το songaricum 30- υπογραφή νουκλεοτιδίου bp (5'-caattatttg aggtgcattg taagaagcgt-3') (Εικόνα 2Α). Τα αποτελέσματα του Βασικού Εργαλείου Αναζήτησης Τοπικής Ευθυγράμμισης (BLAST) στο NCBI έδειξαν ότι αυτή η υπογραφή νουκλεοτιδίου ήταν μοναδική στο Cy. songaricum (Πίνακας 5). Με παρόμοια ανάλυση των αλληλουχιών από στενά συγγενικά είδη, ανακαλύφθηκαν ένα έως δύο SNP από το Ci. sinensis, Β. rossica και Ο. coerulescens. Με βάση τα SNPs, οι υπογραφές νουκλεοτιδίων για τα άλλα τρία νοθευτικά αναπτύχθηκαν επίσης παρόμοια, συμπεριλαμβανομένης μιας υπογραφής 34 bp (5'-cgatggtctc ccgtgcgcga,ggatgcacgg ccgg-3') για το Ci. Sinensis, μια υπογραφή 37 bp (5'- acactggcct cccgtgcgca acgacgtgcg gccggtc-3') για το B. rossica και μια υπογραφή 31 bp (5'-gtctgtcgtg tcggatggtg ttgcttgttg'{26}gtg) (Εικόνες 2ΒΔ). Η ανάλυση BLAST στο NCBI αποκάλυψε επίσης ότι αυτές οι υπογραφές νουκλεοτιδίων ήταν ειδικές και δεν υπήρχαν σε κανένα άλλο είδος (Πίνακας 5).

Cistanches Herbaκαι οι νοθευτές του θα μπορούσαν να ενισχυθούν ταυτόχρονα από μείγματα μέσω του ζεύγους εκκινητών γενικής χρήσης 2F/3R. Έτσι, σχεδιάσαμε ειδικούς για είδος εκκινητές για ενίσχυση υπογραφής νουκλεοτιδίων ευθυγραμμίζοντας τις αλληλουχίες ITS2. Τέσσερα συγκεκριμένα ζεύγη εκκινητών—SYF1/SYR1, CCRF/CCRR, SCRF/SCRR και LDF/LDR—σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν τις νουκλεοτιδικές υπογραφές του Cy. songaricum, B. rossica, Ci. sinensis, και O. coerulescens, αντίστοιχα (Πίνακας 4). Τα μήκη των αμπλικονίων ήταν 123, 72, 131 και 71 bp, αντίστοιχα.

Επιπλέον, αναλύθηκαν συνολικά 214 αλληλουχίες ITS2 από πειραματικά υλικά Cistanches Herba. Δύο σύντομοι ειδικοί εκκινητές—HMRCF/HMRCR και GHRCF/GHRCR για Ci. deserticola και Ci. tubulosa, αντίστοιχα — σχεδιάστηκαν για να ενισχύουν τις μικρές περιοχές των υποβαθμισμένων δειγμάτων (Πίνακας 4). Τα μήκη των αμπλικονίων ήταν 132 και 134 bp, αντίστοιχα.

Επικύρωση της μεθόδου εκκινητή για την υπογραφή νουκλεοτιδίου και το είδος με βάση τεχνητά μείγματα και αφέψημα

Οι αποτελεσματικότητες ενίσχυσης των νέων ζευγών εκκινητών επικυρώθηκαν από το μείγμα. Τα προϊόντα PCR ελήφθησαν μέσω κάθε ζεύγους εκκινητών για κάθε στοχευόμενο είδος, όπως φαίνεται

Οι τιμές cq του B. rossica ή του O. coerulescens μπορούσαν να ληφθούν ακόμη και η αναλογία των δειγμάτων ήταν 30000:1 ή 40000:1 και τα αποτελέσματα ενίσχυσης του Ci. sinensis, Ci.σωληνοειδής, και το Ci deserticola μπορούσε να ανιχνευθεί όταν η αναλογία ήταν 20000:1. Αλλά δεν μπόρεσαν να ληφθούν ανιχνεύσιμα αποτελέσματα για το Cy. songaricum όταν αποτελούσε την αναλογία 20000:1.

Για να επαληθευτεί εάν η μέθοδος υπογραφής νουκλεοτιδίων λειτουργεί με επεξεργασμένα υλικά, αφεψήματα Ci. deserticola και Cy. ετοιμάστηκαν songaricum. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο σύντομος γραμμωτός κώδικας από το Ci. deserticola θα μπορούσε να ενισχυθεί, ακόμη και μετά από βρασμό των δειγμάτων για 210 λεπτά. Επιπλέον, η νουκλεοτιδική υπογραφή του Cy. Το songaricum θα μπορούσε να ενισχυθεί αφού τα δείγματα βράστηκαν για 150 λεπτά, ενώ δεν ανιχνεύθηκαν προϊόντα PCR αφού τα δείγματα βράστηκαν για 210 ή 240 λεπτά (Εικόνα 4). Τα αποτελέσματα της αλληλουχίας έδειξαν ότι η σύντομη νουκλεοτιδική υπογραφή ελήφθη επιτυχώς από το αφέψημα.

Έρευνα Αγοράς Νόθειας μέσω Νουκλεοτιδικής Υπογραφής και Ειδικών Εκκινητών

Η παραπάνω μέθοδος εφαρμόστηκε για την ανίχνευσηΚιστάνουςΠροϊόντα Herba στην αγορά. Τριάντα πέντε παρτίδες απόΚιστάνουςΟι φέτες, οι σκόνες και τα εκχυλίσματα Herba ενισχύθηκαν και αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας έξι σχεδιασμένους ειδικούς εκκινητές (τα αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης γέλης αγαρόζης φαίνονται στο Συμπληρωματικό Σχήμα S2 και οι αλληλουχίες παρατίθενται στο Συμπληρωματικό Φύλλο Δεδομένων 1). Η ανάλυση των αλληλουχιών μέσω των νουκλεοτιδικών τους υπογραφών αποκάλυψε ότι πέντε παρτίδες φετών ήταν αυθεντικές. Μία παρτίδα φέτας και μία παρτίδα σκόνης αντικαταστάθηκαν με Cy. songaricum και ένα εκχύλισμα αντικαταστάθηκαν με Ci. sinensis. Οι άλλες έξι παρτίδες σκόνης ήταν μείγματα: πέντε ήταν νοθευμένες με Cy. songaricum και Ci. sinensis και ένας νοθευτηκαν με Cy. songaricum (Πίνακας 1). Επιπλέον, μία παρτίδα φέτας αντικαταστάθηκε με Salvia miltiorrhiza.

Το Cistanches Herba στα κινεζικά φάρμακα με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας υπόκειται σε διάφορες διαδικασίες που δυσκολεύουν τον έλεγχο ταυτότητας. Η ικανότητα των έξι ζευγών εκκινητών να ενισχύουν τις ειδικές για το είδος περιοχές υπογραφής νουκλεοτιδίων από τα κινεζικά φάρμακα διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας δοκιμάστηκε (τα αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης γέλης αγαρόζης φαίνονται στο Συμπληρωματικό Σχήμα S2). Τα περισσότερα κινέζικα φάρμακα με διπλώματα ευρεσιτεχνίας περιέχουν συστατικά διαφορετικών τύπων ειδών. Για παράδειγμα, τα χάπια Shihu Yeguang (ZCY34) περιέχουν 25 συστατικά, συμπεριλαμβανομένων των Cistanches Herba (Rou Cong Rong), Dendrobii Caulis (Shi Hu) και Ginseng Radix et Rhizoma (Ren Shen). Από αυτά τα συστατικά, το Cistanches Herba θα μπορούσε να ενισχυθεί ειδικά μέσω του ζεύγους εκκινητών GHRCF/GHRCR. Η άμεση αλληλούχιση των προϊόντων PCR αποκάλυψε πολύ καθαρά ίχνη. Ωστόσο, δεν μπορούσε να ληφθεί ορατή ζώνη με το ζεύγος εκκινητών HMRCF/HMRCR.

Ένα άλλο παράδειγμα είναι τα χάπια Kangguzhi Zengsheng (ZCY44). Υπάρχουν οκτώ συστατικά επιπλέονΚιστάνουςHerba σε αυτό το κινεζικό δίπλωμα ευρεσιτεχνίας, αλλά δεν υπήρχαν ορατές ζώνες που ελήφθησαν είτε από το GHRCF/GHRCR είτε από το HMRCF/HMRCR, πράγμα που σήμαινε ότι όχιCistanches Herbaήταν παρών. Ωστόσο, η μοιχαλική περιοχή του Κυ. Το songaricum ενισχύθηκε με επιτυχία από το συγκεκριμένο ζεύγος εκκινητών SYF1/SYR1. Τα αποτελέσματα της αλληλουχίας κατέδειξαν τη σύντομη νουκλεοτιδική υπογραφή του Cy. Το songaricum αποκτήθηκε με επιτυχία.

Cistancheέχει πολλές λειτουργίες και έχειαντιφλεγμονώδηυπάρχοντα