ΜΕΡΟΣ 1: Τα εκχυλίσματα Cistanche βελτιώνουν τη νευροτοξικότητα που προκαλείται από το υπεροξείδιο του υδρογόνου σε νέα μεταλλαγμένα κυτταρικά μοντέλα νευροβλαστώματος που έχουν μολυνθεί από DJ‐1

Επαφή:joanna.jia@wecistanche.com

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Οι κύριες νευροεκφυλιστικές ασθένειες περιλαμβάνουνΑλτσχάιμεραρρώστια, η νόσος του Πάρκινσον (PD), η νόσος του Huntington και άλλα. Μεταξύ αυτών των διαταραχών, το ποσοστό επίπτωσης του PD(Νόσος του Πάρκινσον) είναι δεύτερη στον κόσμο και επιτυγχάνει 1%-2% σε άτομα άνω των 60 ετών (Burke &O'Malley, 2013; Mullard, 2017; Σεν &Τζι, 2013). Ως το κύριο νευρολογικό χαρακτηριστικό της ΝΠ, οι ντοπαμινεργικοί νευρώνες στη μέλαινα ουσία nigra pars compacta είναι προοδευτικοί εκφυλιστικοί (Glizer &MacDonald, 2016), ο οποίος συνοδεύεται από την εμφάνιση α-συνουκλεϊνικών εγκλεισμάτων που ονομάζονται σώματα Lewy (Zhang, An, Zhang, &&Pu, 2010). Στην παθογένεση της ΝΠ, οι τρόμοι ανάπαυσης, η ακαμψία, η βραδυκινησία και οι ανωμαλίες της στάσης του σώματος διαγιγνώσκονται ως τα κύρια συμπτώματα της ΝΠ στην κλινική. Αν και οι ακριβείς προοδευτικοί εκφυλιστικοί μηχανισμοί των ντοπαμινεργικών νευρώνων δεν είναι κατανοητοί, είτε περιβαλλοντικές αιτίες, συμπεριλαμβανομένης της έκθεσης σε εντομοκτόνα, νευροτοξικούς παράγοντες και βαρέα μέταλλα, είτε γενετικές αιτίες όπως μεταλλάξεις του Parkin (Kitada et al., 1998), της α-συνουκλεΐνης (Polymeropoulos et al., 1997) και του DJ‐1 (Biosa et al., 2017; Bonifati et al., 2003), πιστεύεται ότι οδηγούν στην εμφάνιση του PD. Μέχρι σήμερα, ο αριθμός των μεταλλάξεων missense, των μεταλλάξεων αλλαγής πλαισίου και των διαγραφών μεγάλων θραυσμάτων που προκαλούνται από μεταλλάξεις γονιδίων DJ‐1 υπερβαίνει τις 10 (Andres-Mateos et al., 2007; Bonifati et al., 2003; Χάγη κ.ά., 2003). Μέσα στην πρωτεΐνη DJ‐1, η υποκατάσταση της Λευκίνης166Προλίνης (L166P) ξεχωρίζει ως σημαντική. Επιπλέον, έχει επίσης αποδειχθεί ότι το οξειδωτικό στρες εμφανίζεται στην PD (Dexter et al., 1989, 1994; Nikam, Nikam, Ahaley, &sontakke, 2009) και εμπλέκεται στην παθογένειά του (Hague et al., 2003).

Το γονίδιο DJ‐1 που περιέχει οκτώ εξώνια κατανεμημένα σε 24 kb, εντοπίζει στο χρωμόσωμα 1p36 στους ανθρώπους (Bonifati et al., 2003) και κωδικοποιεί μια εξαιρετικά διατηρημένη πρωτεΐνη που περιέχει 189 αμινοξέα. Η πρωτεΐνη ανήκε στην οικογένεια ThiJ/PfpI, υπάρχει σε ομοδιμερή μορφή. Τα νευρογλοιακά κύτταρα εντός του φλοιού και της μέλαινας ουσίας και το ραβδωτό σώμα είναι τα κύρια που βρίσκονται σε περιοχές της πρωτεΐνης DJ‐1 (Olzmann et al., 2007). Σε αυτά τα κύτταρα, ο DJ‐1 παίζει τους ακόλουθους ρόλους, όπως το ογκογονίδιο (Nagakubo et al., 1997), η μεταγραφική ρύθμιση (Kim et al., 2005; Niki, Takahashi‐ Niki, Taira, Iguchi-Ariga, && Agria, 2003), αντιοξειδωτικό στρες (Taira et al., 2004; Zhou &Freed, 2005), συνοδός (Σεντέλμαν, Τζόνασον, Μάρλινατ, Λίτε, &Αμπέλιοβιτς, 2004; Zhou, Zhu, Wioson, Petsko, && Fink, 2006), και πρωτεάση (Abou-Sleiman, Healy, Quinn, Lees, &wood, 2003).

Θεραπεία για νευροεκφυλιστικές ασθένειες: εκχύλισμα cistanche

Σιστάντσεείναι παραδοσιακή κινεζική ιατρική και έχει χρησιμοποιηθεί κυρίως για τη θεραπεία της ανδρολογικής νόσου κατά τη διάρκεια των αιώνων. Τα κύρια δραστικά συστατικά τουΣιστάντσεείναι φαινυλογλυκοσίδες που περιλαμβάνουν 34 ενώσεις, όπως acteoside, echinacoside κ.λπ. Οι φαρμακολογικές επιδράσεις τουΕκχυλίσματα Cistancheπεριλαμβάνουν τη βελτίωση της σεξουαλικής λειτουργίας, αντιγήρανση, την αύξηση της μάθησης και της ικανότητας μνήμης, νευροπροστασία, ανοσοδιαμόρφωση, αντιφλεγμονώδη, αντιισχημική, και την προστασία του ήπατος (Tu et al., 2011). Το καφεϊκό οξύ είναι ένας από τους σημαντικότερους μεταβολίτες του Cistanche (Yan, 2018).

Τα κοινώς χρησιμοποιούμενα κυτταρικά μοντέλα της PD περιλαμβάνουν κύτταρα PC12 που προκαλούνται από 1-μεθυλο‐μεθυλο‐4‐ φαινυλοπυριδίνιο (SH-SY5Y) (Abou-Sleiman et al., 2003) και κύτταρα νευροβλαστώματος που προκαλούνται από υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) (SH-SY5Y) (Zhang et al., 2009). Ωστόσο, τα τυπικά παθολογικά χαρακτηριστικά του PD δεν υπάρχουν σε αυτά τα μοντέλα. Για να αναπτύξουμε ένα πιο φυσιολογικά σχετικό κυτταρικό μοντέλο PD, σε αυτή τη μελέτη δημιουργήσαμε H2O2 επαγόμενα κύτταρα L166P και C106S DJ‐1-transfected SH-SY5Y και διερευνήσαμε τις επιδράσεις τωνΕκχυλίσματα Cistancheκαι βασικές βιοδραστικές ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων των acteoside, echinacoside, caffeic acid, καιΟλικές γλυκοσίδες Cistancheσε αυτά τα δύο μοντέλα, για πρώτη φορά.

Εκχύλισμα Cistanche αντι-νευροεκφυλιστικές ασθένειες

2. ΥΛΙΚΑ S ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

2.1 | Πλασμίδια, φάρμακα, χημικά και κύτταρα

FLAG‐L166P DJ‐1, FLAG‐C106S DJ‐1 πλασμίδια, και αντι-DJ‐1 πολυκλωνικά αντισώματα προμηθεύτηκαν ευγενικά από τον Δρ Hiroyoshi Ariga, Μεταπτυχιακή Σχολή Φαρμακευτικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Hokkaido. Το αφυδατωμένο ελάχιστο απαραίτητο μέσο (MEM) και το μέσο F‐12 αγοράστηκαν από την Gibco. Η λιποφεκτίνη ήταν από το Invitrogen. FastDigest Xho I και FastDigest EcoR Ήμουν από Ζυμώνοντας. Το κιτ παρασκευής πλασμιδίου χωρίς ενδοτοξίνες ήταν από τη βιοτεχνολογία. Η κυτταρική σειρά SH-SY5Y ήταν από την Τράπεζα Κυττάρων της Κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών. Το κιτ αντιδραστηρίου ανάλυσης πρωτεϊνών BCA ήταν από το Pierce. Οι μεμβράνες PVDF ήταν από το Millipore. Το πολυκλωνικό αντίσωμα Anti-FLAG ήταν από το GeneTex.Εκχυλίσματα Cistanche, συμπεριλαμβανομένων των acteoside, echinacoside, caffeic acid και Cistanche ολικών γλυκοσίδων, παρασχέθηκαν από το Τμήμα Φυσικής Ιατρικής, Σχολή Φαρμακευτικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο του Πεκίνου.

2.2 | Ενίσχυση, εκχύλιση και καθαρισμός πλασμιδίων

Μετά την καλλιέργεια κυττάρων Escherichia coli JM109 σε υγρό μέσο LB μέχρι OD600 = 0,5, παρασκευάστηκαν αρμόδια κύτταρα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο χλωριούχου ασβεστίου. Τα αρμόδια E. coli στη συνέχεια μετασχηματίστηκαν με πλασμιδιακό DNA χρησιμοποιώντας τη μέθοδο θερμικού σοκ, μετά την οποία οι μετασχηματιστές καλλιεργήθηκαν σε πλάκες LB που περιείχαν αμπικιλλίνη για 16-24 ώρες στους 37 °C. Στη συνέχεια, επιλέχθηκε μια επιτυχώς μετασχηματισμένη μονοκλωνική αποικία και καλλιεργήθηκε σε υγρό μέσο LB που περιείχε 50 μg/mL αμπικιλλίνης για επιπλέον 12 ώρες στους 37°C. Τα πλασμίδια εξήχθησαν και καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ προετοιμασίας πλασμιδίων χωρίς ενδοτοξίνες σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

2.3 | Ταυτοποίηση πλασμιδίου

Τα εξαγόμενα πλασμίδια υποβλήθηκαν σε ενζυματική πέψη, μετά την οποία εξετάστηκαν τα πλασμίδια και τα αφομοιωμένα θραύσματα χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 1%. Το προκύπτον πήκτωμα χρωματίστηκε σε διάλυμα EB για 20-25 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και φωτογραφήθηκε.

2.4 | Μετατόπιση πλασμιδίου σε κύτταρα SH-SY5Y

Το καθαρισμένο πλασμιδιακό DNA μεταμολύνθηκε σε κύτταρα SH-SY5Y καλλιεργημένα σε μέσο MEM/F‐12 που περιείχε 10% εμβρυϊκό ορό βοοειδών. Στη συνέχεια, τα μεταμολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν σε ένα μέσο που περιείχε 400 μg/mL G418, μετά το οποίο χρησιμοποιήθηκαν 200 μg/mL G418 για τη διατήρηση της σταθερά μεταμολυμένης κυτταρικής σειράς.

2,5 | Ταυτοποίηση των μεταμολυμένων κυττάρων με δυτική κηλίδα

Τα μεταμολυμένα κύτταρα SH-SY5Y διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA. Μετά τη φυγοκέντρηση του λυσίματος, η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης στο υπερκείμενο υγρό προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ αντιδραστηρίου δοκιμής πρωτεΐνης BCA. Ίσες ποσότητες πρωτεϊνικού εκχυλίσματος υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου 12,5% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF. Η μεμβράνη PVDF αποφράχθηκε με 5% μη λιπαρό ξηρό γάλα σε διάλυμα TBST και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για ανοσοδιάπλαση. Το Anti-FLAG και το anti-DJ‐1 χρησιμοποιήθηκαν ως κύρια αντισώματα και η συζευγμένη με HRP IgG ήταν το δευτερεύον αντίσωμα. Ένα ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας εφαρμόστηκε για την ανίχνευση των πρωτεϊνών-στόχων.

2.6 | Ανοσοκυτταροχημική ταυτοποίηση διαμολυνόμενων κυττάρων

Τα διαμολυμένα κύτταρα SH-SY5Y σταθεροποιήθηκαν με διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 4%, διαπερατίστηκαν με διάλυμα 0,3% Triton X‐100 και αποκλείστηκαν με 10% ορό κατσίκας. Στη συνέχεια, τα μπλοκαρισμένα κύτταρα επωάστηκαν πρώτα με πολυκλωνικό αντίσωμα anti-FLAG και anti-DJ‐1 και στη συνέχεια με δευτεροπαθές αντίσωμα κατσίκας συζευγμένο με FITC. Οι πυρήνες των κυττάρων χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 και τα κύτταρα απεικονίστηκαν κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού (IX‐71, Olympus).

2.7| Δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας

Τα μη μεταδιδόμενα και μεταμολυμένα κύτταρα SH-SY5Y επιστρώθηκαν σε 96‐ εκχυλίσματα, συμπεριλαμβανομένων των acteoside, echinacoside, caffeic acid και Cistanche ολικών γλυκοσίδων (και οι 10, 20 και 40 μg/mL, αντίστοιχα), προστέθηκαν και τα κύτταρα επωάστηκαν για 6 ώρες πριν από τη θεραπεία με 0,2 mM H2O2 για επιπλέον 1 ώρα. Το θρεπτικό μέσο απορρίφθηκε και η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμάστηκε με τη χρήση MTT όπως περιγράφεται παραπάνω.

2.8 | Επιδράσεις των εκχυλισμάτων Cistanche στη βιωσιμότητα των κυττάρων

προστέθηκαν εκχυλίσματα, συμπεριλαμβανομένων των acteoside, echinacoside, caffeic acid και Cistanche ολικών γλυκοσίδων (και τα 10, 20 και 40 μg/mL, αντίστοιχα), και τα κύτταρα επωάστηκαν για 6 ώρες πριν από τη θεραπεία με 0,2 mM H2O2 για επιπλέον 1 ώρα. Το θρεπτικό μέσο απορρίφθηκε και η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμάστηκε με τη χρήση MTT όπως περιγράφεται παραπάνω.

2,9 | Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως ο μέσος όρος ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομο ANOVA και τη μέθοδο LSD με λογισμικό SPSS 22.0. Τιμές p< 0.05="" were="" considered="">

Σιστάντσεβοτάνι

3 | ΑΠΟΤΕΛΈΣΜΑΤΑ

3.1 | Τα πλασμίδια μετασχηματίστηκαν και καθαρίστηκαν με επιτυχία. Μετά από ξεχωριστή έκφραση στο E. coli JM109, τα πλασμίδια εξήχθησαν και εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 1% μετά την πέψη με ένα ένζυμο περιορισμού (Εικόνα 1). Τα πλασμίδια των 6,2 kb χωρίστηκαν σε γραμμικά θραύσματα DNA 5,4 και 0,8 kb, γεγονός που επιβεβαίωσε ότι τα πλασμίδια L166P και C106S DJ‐1 εκφράστηκαν και καθαρίστηκαν με επιτυχία.

3.2 | Ταυτοποίηση των μεταμολυνόμενων κυττάρων με δυτική στύπωση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, εντοπίσαμε ζώνες FLAG‐L166P DJ‐1 και FLAG‐C106S DJ‐1 σε περίπου 70 kDa. Τα υψηλά επίπεδα πρωτεΐνης flag-tagged στα μεταμολυμένα κύτταρα SH-SY5Y δείχνουν ότι οι μεταλλάξεις L166P και C106S DJ‐1 εκφράστηκαν έντονα στις αντίστοιχες transfectants τους.

3.3 | Ανοσοκυτταροχημική ταυτοποίηση των διαμολυνόμενων κυττάρων. Δείχνει τα ισχυρά φθορίζοντα σήματα από τα μεταμολυμένα κύτταρα SH‐ SY5Y μετά την επώαση με αντισώματα anti-DJ‐1 ή anti-FLAG. Αυτό επιβεβαιώνει τα υψηλά επίπεδα L166P και C106S DJ‐1 που εκφράζονται στα transfectants.

3.4 | Τα μεταμολυμένα κύτταρα ήταν πιο ευαίσθητα στο H2O2 από τα μη μεταδιδόμενα κύτταρα. Μετά από επώαση για 1 ώρα παρουσία διαβαθμισμένων συγκεντρώσεων H2O2 (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 και 1 mM, αντίστοιχα), οι βιαιότητες των κυττάρων SH-SY5Y που μεταμολύνθηκαν με L166P ή C106S DJ‐1 μειώθηκαν δοσοεξαρτώμενα σε σύγκριση με τα μη μεταδιδόμενα κύτταρα

3,5 | Τα εκχυλίσματα Cistanche ανέστειλαν τις επαγόμενες από το H2O2 μειώσεις της βιωσιμότητας των κυττάρων SH-SY5Y που αναστέλλονται δοσοεξαρτώμενα από τη θεραπεία μεΕκχυλίσματα Cistanche, συμπεριλαμβανομένων των ολικών γλυκοσίδων acteoside, echinacoside, caffeic acid και Cistanche (όλες οι 10, 20 και 40 μg/mL, αντίστοιχα).

Σιστάντσε