ΜΕΡΟΣ 1 Αντιοστεοπορωτική δραστηριότητα μιας βρώσιμης παραδοσιακής κινέζικης ιατρικής Cistanche Deserticola στον μεταβολισμό των οστών αρουραίων με ωοθηκεκτομή μέσω διαμεσολαβούμενων οδών σηματοδότησης RANKL/RANK/TRAF6-

Bo Zhang 1†, Ling-Ling Yang 1†, Shu-Qin Ding 1†, Jing-Jing Liu 1, Yan-Hong Dong 1,

Yan-Ting Li 1, Nan Li 1, Xiao-Jun Zhao 1, Chang-Ling Hu 2, Yiping Jiang 3* και Xue-Qin Ma 1*

1 Key Laboratory of Hui Ethnic Medicine Modernization, Department of Pharmaceutical Analysis, Ministry of Education, School of Pharmacy, Ningxia Medical University, Yinchuan, China, 2 Laboratory for Functional Foods and Human Health, Center for Excellence in Post-Harvest Technologies, Βόρεια Καρολίνα Ερευνητική Πανεπιστημιούπολη, North Caroline A&T State University, Greensboro, NC, Ηνωμένες Πολιτείες, 3 Department of Pharmacognosy, The Second Military Medical University, Shanghai, China

κιστανάκιμπορεί να θεραπεύσειοστεοπόρωση

Δεδομένων των περιορισμών των υπαρχόντων θεραπευτικών παραγόντων για τη θεραπεία της μετεμμηνοπαυσιακής οστεοπόρωσης, εξακολουθεί να υπάρχει ανάγκη για περισσότερες επιλογές τόσο με αποτελεσματικότητα όσο και με λιγότερες ανεπιθύμητες ενέργειες.Cistanche deserticolaΤο YC Ma είναι γνωστό ως ένα δημοφιλές τονωτικό βότανο που χρησιμοποιείται παραδοσιακά για τη θεραπεία της ανεπάρκειας της νεφρικής ενέργειας, συμπεριλαμβανομένης της μυϊκής αδυναμίας σε μειονοτικές περιοχές των ασιατικών κομητειών. Με βάση τη θεωρία του «νεφρού κυρίαρχου οστού», χρησιμοποιήθηκε ένα μοντέλο μετεμμηνοπαυσιακής οστεοπόρωσης αρουραίου με ωοθηκεκτομή (OVX) για την αξιολόγηση της θεραπευτικής επίδρασης τηςC. deserticolaεκχύλισμα (CDE) για την οστική απώλεια. Σαράντα οκτώ θηλυκοί αρουραίοι Sprague-Dawley, ηλικίας περίπου 12 εβδομάδων, χωρίστηκαν τυχαία σε έξι ομάδες συμπεριλαμβανομένης της ψευδούς ομάδας που χορηγήθηκε από το στόμα με νατριούχο καρβοξυμεθυλοκυτταρίνη (CMC-Na) (sham), η θετική ομάδα έλαβαν θεραπεία με 1 mg/kg βαλερικής οιστραδιόλης (EV), ομάδες χαμηλής, μέτριας και υψηλής δόσης που χορηγήθηκαν από το στόμα με 200, 400 και 800 mg/kg/ημέρα CDE, αντίστοιχα. Μετά από 3 μήνες συνεχούς παρέμβασης, η CDE εμφάνισε σημαντική αντι-οστεοπορωτική δράση που αποδεικνύεται από την ενισχυμένη ολική οστική πυκνότητα, τη βελτιωμένη οστική μικροαρχιτεκτονική. αυξημένη δραστηριότητα αλκαλικής φωσφατάσης. Μειωμένα επίπεδα δεοξυπυριδινολίνης, καθεψίνης Κ, όξινης φωσφατάσης ανθεκτικής σε τρυγικό και μηλονοδιαλδεΰδης. ενώ το βάρος του σώματος, της μήτρας και του κόλπου σε αρουραίους OVX δεν επηρεάστηκε από την παρέμβαση CDE. Επιπλέον, παρατηρήθηκε και αποσαφηνίστηκε ένα φαινομενικά αντιφατικό φαινόμενο στα επίπεδα ασβεστίου και φωσφόρου μεταξύ OVX και εικονικών αρουραίων. Μηχανιστικά, το CDE μείωσε σημαντικά τα επίπεδα των εκφράσεων TRAF6, RANKL, RANK, NF-κB, IKK, NFAT2 και ρύθμισε προς τα πάνω τις εκφράσεις κινάσης 3-φωσφατιδυλινοσιτόλης (PI3K), AKT, οστεοπρωτεγερίνης και c-Fos, που υπονοούσε ότι το CDE θα μπορούσε να καταστείλει την επαγόμενη από το RANKL/RANK ενεργοποίηση των κατάντη οδών NF-κB και PI3K/AKT και, τελικά, να αποτρέψει τη δραστηριότητα των βασικών οστεοκλαστογονικών πρωτεϊνών NFAT2 και c-Fos. Όλα τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η CDE είχε πιθανή αντι-οστεοπορωτική δράση και αυτή η επίδραση, τουλάχιστον εν μέρει, εμπλέκεται στη διαμόρφωση της σηματοδότησης NF-κB και PI3K/AKT με τη μεσολάβηση RANKL/RANK/TRAF6-, καθώς και Επίπεδα Fos και NFAT2. Επομένως, η CDE μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα χρήσιμο υποσχόμενο φάρμακο για τη θεραπεία της μετεμμηνοπαυσιακής οστεοπόρωσης.

Λέξεις-κλειδιά:Cistanche deserticola, αντιοστεοπορωτικό, TRAF6, RANKL, RANK

Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε με:Joanna.jia@wecistanche.com

Το Cistanche deserticola έχει πολλά αποτελέσματα, κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Δεδομένου ότι η οστεοπόρωση δεν έχει θεωρηθεί ως μέρος της φυσιολογικής γήρανσης, έχουν επιτευχθεί εκτεταμένες πρόοδοι στον τομέα της οστεοπόρωσης. Σήμερα, η οστεοπόρωση έχει γίνει ένας σημαντικός κίνδυνος για την υγεία που πλήττει περισσότερους από 200 εκατομμύρια πληθυσμούς σε όλο τον κόσμο, με συνέπεια 10 δισεκατομμύρια δολάρια δαπανώνται κάθε χρόνο σε αυτά τα άτομα (Ma et al., 2015). Η οστεοπόρωση, συμπεριλαμβανομένης της μετεμμηνοπαυσιακής και της γεροντικής οστεοπόρωσης, χαρακτηρίστηκε από μικροαρχιτεκτονική επιδείνωση και χαμηλή πυκνότητα οστικής μάζας (BMD) ως αποτέλεσμα ανισορροπίας μεταξύ του σχηματισμού οστού που προκαλείται από οστεοβλάστες και της οστικής απορρόφησης που προκαλείται από οστεοκλάστες, αντίστοιχα (Kanis et al., 2015 ). Λαμβάνοντας υπόψη τους περιορισμούς των τρεχουσών θεραπευτικών επιλογών και ορισμένες ανεπιθύμητες παρενέργειες των συνθετικών παραγόντων (Ye et al., 2015) για τη θεραπεία της νόσου της οστεοπόρωσης, είναι απαραίτητο να υπάρχουν εναλλακτικές λύσεις τόσο με αποτελεσματικότητα όσο και με ελάχιστες παρενέργειες (Tan et al., 2017). Ως ένας αξιοσημείωτος συμπληρωματικός και εναλλακτικός τρόπος θεραπείας για τη θεραπεία διαφόρων παθήσεων, συμπεριλαμβανομένης της μετεμμηνοπαυσιακής οστεοπόρωσης, το φυσικό φαρμακευτικό βότανο, ειδικά τα παραδοσιακά κινέζικα φάρμακα (TCM) σταδιακά αναγνωρίστηκαν και κατοχυρώθηκαν ιδιαίτερα (Czerwinska and Melzig, 2018; Ma et al., 2018). Πριν από δύο χιλιάδες χρόνια,Cistanche deserticolaΤο YC Ma βρέθηκε ευεργετικό για την ανθρώπινη υγεία και καταγράφηκε στο κινεζικό κλασικό ιατρικό βιβλίο με το όνομα Shen Nong Herbal (Anonymous, 1981). Τώρα, είναι ένα σημαντικό TCM που καταγράφεται επίσημα στην κινεζική φαρμακοποιία (Chinese and Pharmacopoeia, 2015) και επίσης ως ένα διάσημο τονωτικό βότανο που χρησιμοποιείται σε ασιατικές κομητείες, συμπεριλαμβανομένης της Κίνας και της Ιαπωνίας για αιώνες χρόνια (Wong et al., 2006) .C. deserticolaβρέθηκε να έχει ένα ευνοϊκό προφίλ ασφάλειας (Liao et al., 2018) και ευρείες ιατρικές λειτουργίες: στη λαϊκή, χρησιμοποιήθηκε ευρέως για το μαγείρεμα με είδη φυτικής κουζίνας για τη θεραπεία της νεφρικής ανεπάρκειας, της μυϊκής αδυναμίας και της οσφυϊκής αδυναμίας ; Σήμερα, έχει δοθεί αυξανόμενη προσοχή για τις διάφορες φαρμακολογικές του λειτουργίες, όπως η αντιφλεγμονώδης, η αντι-κόπωση, η αντικαρκινική, η αντιοξειδωτική δράση, η ενίσχυση της ανοσίας και ούτω καθεξής (Gu et al., 2016; Fu et al., 2018). Είναι επίσης γνωστό ως «τζινσενγκ της ερήμου» στην Κίνα λόγω της εξαιρετικής κλινικής ιατρικής θεραπευτικής του δράσης. Τόσο η παραδοσιακή όσο και η σύγχρονη εφαρμογή τουC. deserticolaέκανε αυτό το βότανο δημοφιλές τόσο στην ιατρική όσο και στη βιομηχανία υγιεινής διατροφής, έχοντας έτσι εξελιχθεί σε φαρμακευτικό και θρεπτικό υγρό εγκεκριμένο από την Κρατική Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων. ΔεδομένοςC. deserticolaχρησιμοποιήθηκε συνήθως για την αντιμετώπιση της ανεπάρκειας των νεφρών στην κινεζική λαϊκή ιατρική, κάτι που υπονοούσε ότι αυτό το εδώδιμο φαρμακευτικό βότανο μπορεί να θεωρηθεί ως ένας πολλά υποσχόμενος εναλλακτικός παράγοντας για την παρέμβαση της οστεοπόρωσης με βάση τη θεωρία του «νεφρικού οστού που κυριαρχεί» (Wang et al., 2016). Δημοσιευμένα δεδομένα είχαν αποδείξει την αντι-οστεοπορωτική δράση των εκχυλισμάτων C. deserticola τόσο in vivo όσο και in vitro (Liang et al., 2011; Li et al., 2012; Liang et al., 2013; Xu et al., 2017; Song et al., 2018) και αρκετές απομονωμένες ενώσεις, όπως η εχινακοσίδη (Li et al., 2013), η ακτεοσίδη (Lee et al., 2013) και η σιστανοζίδη Α (Xu et al., 2017) που επίσης είχαν αναφερθεί ότι επεξεργάζονται αντι -οστεοπορωτικές δραστηριότητες. και άλλες ενώσεις όπως η 2'-ακετυλακτεοσίδη επιβεβαιώθηκε ότι διαθέτουν αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, νευροπροστατευτικές, ηπατοπροστατευτικές, ανοσοενισχυτικές (Li et al., 2016) και δυνατότητες αντιγήρανσης (Peng et al., 2016). Μέχρι σήμερα, δεκάδες βιοενεργοί φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες έχουν ταυτοποιηθεί από τοΒότανο Cistanche(Wang et al., 2012), η εχινακοσίδη και η ακτεοσίδη είναι οι κύριες ενώσεις που υπάρχουν στα περισσότερα από τα είδη Cistanche με τα περιεχόμενα ήταν 1,83–41,49 και 0,27–8,28 mg/kg , αντίστοιχα? ενώ οι άλλοι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίτες, συμπεριλαμβανομένων των 2'-ακετυλολακτεοσίδη, 6'-ακετυλολακτεοσίδη, κιστανοσίδη Α, κιστανοσίδη C και ισοακτεοσίδη ήταν 1,56–3,16 mg/g, 0.49–1,66 mg/kg, 11{41{4. 29}}.11 mg/kg, 0,33–2,24 mg/kg και 0,08–5.00 mg/kg, αντίστοιχα (Dong et al., 2018). Με βάση τα παραπάνω δημοσιευμένα δεδομένα, διαπιστώσαμε ότι οι υποκείμενοι αντι-οστεοπορωτικοί μοριακοί μηχανισμοί τουC. deserticolaειδικά η ανάντη σηματοδότηση παρέμενε ασαφής. Και η ίδια η ένωση δεν μπορεί να αντιπροσωπεύει την επίδραση του βοτάνου που περιείχε την ιδιότητα συνεργίας που συνεισφέρουν διαφορετικοί τύποι συστατικών. Επιπλέον, οι συγκεκριμένοι στόχοι των μονοπατιών σηματοδότησης ήταν εντελώς διαφορετικοί μεταξύ διαφορετικών στοιχείων. Η τρέχουσα εργασία στοχεύει στη διερεύνηση της πιθανής προστατευτικής επίδρασης τουC. deserticolaκατά in vivo επίμυων που έχουν υποστεί ωοθηκεκτομή (OVX) με έμφαση στη ρύθμιση του παράγοντα 6 που σχετίζεται με τον υποδοχέα παράγοντα νέκρωσης όγκου (TRAF6), του ενεργοποιητή υποδοχέα του συνδέτη πυρηνικού παράγοντα κάπα Β (RANKL), των εκφράσεων RANK και του RANKL/RANK/TRAF{{3} } επαγόμενες σηματοδοτήσεις πυρηνικού παράγοντα κάπα Β (NF-κB) και φωσφοϊνοσιτιδικής 3-κινάσης (ΡΙ3Κ)/πρωτεϊνικής κινάσης (ΑΚΤ). Η αναδιαμόρφωση των οστών, συμπεριλαμβανομένης της αναδόμησης και επιδιόρθωσης, είναι μια περίπλοκη διαδικασία που διέπεται από την ισορροπία μεταξύ σχηματισμού οστεοβλαστικού οστού και οστεοκλαστικής απορρόφησης οστού, και η αυξημένη οστική απορρόφηση που προκαλείται κυρίως από ενισχυμένη οστεοκλαστογένεση συνήθως οδηγεί σε οστεοπόρωση ακόμη και κατάγματα οστών. Τα περισσότερα από τα κυτταρικά σήματα, ορμόνες και αυξητικούς παράγοντες που ήταν απαραίτητα για τη διαφοροποίηση και τη λειτουργία των οστεοκλαστών ελέγχονταν από το RANK και τους δύο συνδέτες του, το RANKL και την οστεοπρωτεγερίνη (OPG) (Lacey et al., 1998). Και τα πρόσφατα ευρήματα ανακάλυψαν περαιτέρω ότι το TRAF6 ήταν ένας βασικός ρυθμιστικός παράγοντας στους καταρράκτες σηματοδότησης που ενεργοποιούνται από το RANKL/RANK (Tan et al., 2017). Με τη στρατολόγηση του TRAF6, το RANKL δεσμεύτηκε στον υποδοχέα του RANK, και στη συνέχεια ενεργοποιήθηκαν οι καταρράκτες σηματοδότησης κατάντη συμπεριλαμβανομένων των NF-κB και PI3K/AKT, και στη συνέχεια οι βασικές οστεοκλαστογονικές πρωτεΐνες του c-Fos και ο πυρηνικός παράγοντας των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων c2 (NFAT2) Takayanagi, 2007) ρυθμίστηκαν προς τα πάνω και τελικά ξεκίνησε η διαφοροποίηση των οστεοκλαστών. Στην παρούσα μελέτη, διερευνάται και συζητείται ο υποκείμενος αντι-οστεοπορωτικός μηχανισμός της CDE στην οστική απορρόφηση που προκαλείται από RANKL/RANK/TRAF{19}}.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Ζώα, κύτταρα, αντισώματα και αντιδραστήρια

Θηλυκοί ενήλικοι αρουραίοι Sprague-Dawley (Ιατρικό Πανεπιστήμιο Ningxia, Yinchuan, Κίνα). κύτταρα RAW264.7 (Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd., Σαγκάη, Κίνα); παράγοντας διέγερσης αποικίας μακροφάγων (M-CSF) και RANKL (PerroTech, Inc. USA); βαλερική οιστραδιόλη [βαλερική οιστραδιόλη (EV), Delpharm Lille SAS, Παρίσι, Γαλλία]; κιτ ELISA καθεψίνης K (CK) (BioVision, American); Κιτ ELISA διασυνδέσεων δεοξυπυριδινολίνης (DPD) και οστικής γλα-πρωτεΐνης (BGP) (Xinyu Biological Engineering Co., Ltd, Σαγκάη, Κίνα). κιτ αντιδραστηρίων μηλονοδιαλδεΰδης (MDA), γλουταθειόνης (GSH) και υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD) (Jianchen Biological Engineering, Nanjing, Κίνα). πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη (Gibco, ΗΠΑ); μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Millipore Life Sciences, Η.Π.Α.); πρωτογενή αντισώματα που περιλαμβάνουν GAPDH (18AF0401), -ακτίνη (17AV0411), κινάση ΙκΒ (IKK) (AD01134589), TRAF6 (2), RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), NFκBIA (32K26), AC09021266), OPG (AG06292776), c-Fos (AG12059411), AKT (AF05173234), NFAT2 (AO11015648) και δευτερογενή αντισώματα (συζευγμένη υπεροξειδάση χρένου (συζευγμένη με υπεροξειδάση κατσίκας αντι-κουνελιού, GB4Beijing) , Κίνα); Το τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (DMEM), το κιτ ποσοτικοποίησης πρωτεϊνών δικινχονικού οξέος, ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) και το ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών Dulbecco (PBS) αγοράστηκαν από την Hylcone (Logan, UT, USA). εχινακοσίδη [υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) Μεγαλύτερη ή ίση με 98 τοις εκατό , 11167-200503, Εθνικά Ινστιτούτα Ελέγχου Τροφίμων και Φαρμάκων, Κίνα]; ακτεοσίδη (HPLC Μεγαλύτερη ή ίση με 98 τοις εκατό, AB0497, ALFA, Κίνα). ισοακτεοζίτης (HPLC Μεγαλύτερο ή ίσο με 98 τοις εκατό, AB17021202, ALFA, Κίνα); 2'-ακετυλο ακτεοσίδιο (HPLC Μεγαλύτερο ή ίσο με 98 τοις εκατό, PRF7081243, Chengdu Pu Rui Fa Technology, Co., Ltd. China); κιστανοσίδη Α, κιστανοσίδη C και 6'-ακετυλο ακτεοσίδιο (HPLC Μεγαλύτερο ή ίσο με 95 τοις εκατό, απομονώθηκε και καθαρίστηκε στο εργαστήριό μας) (Xu et al., 2017).

Φυτικά Υλικά και Παρασκευή

Αποξηραμένοι μίσχοι απόC. deserticolaΤο YC Ma αγοράστηκαν από την κομητεία Yongning, στην επαρχία Ningxia στις 2015 Σεπτεμβρίου, οι συγκεκριμένες συντεταγμένες συλλογής φυτών ήταν (106.026597, 38.262816). Το βότανο αναγνωρίστηκε από τον καθηγητή Ling Dong (τμήμα φαρμακογνωσίας, Ιατρικό Πανεπιστήμιο Ningxia), με ένα δείγμα κουπονιού (#20150901) ήταν διαθέσιμο στο ερμπάριο φαρμακευτικής ανάλυσης. Συνολικά 10,0 kg αποξηραμένα και κονιοποιημέναC. deserticolaεκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της αναρροής θερμότητας, η λεπτομερής διαδικασία ήταν η εξής: ο διαλύτης ήταν 75 τοις εκατό αιθανόλη, η αναλογίαC. deserticolaυλικό προς διαλύτη ήταν 1:8, ο χρόνος αναρροής διήρκεσε 2 ώρες και τα υλικά ανέρρευσαν για τρεις φορές. στη συνέχεια όλα τα διηθήματα αναμίχθηκαν μαζί και συμπυκνώθηκαν υπό συνθήκες μειωμένης πίεσης για να δώσουν 6,5 kgC. deserticolaεκχυλίσματα αιθανόλης (CDE). Για το πείραμα σε ζώα, χρησιμοποιήθηκε {{0}},5 τοις εκατό νατριούχος καρβοξυμεθυλοκυτταρίνη (CMC-Na) για την εναιώρηση του CDE και η από του στόματος χορηγούμενη δόση ορίστηκε ως 200, 400 και 800 mg/kg/ημέρα, με όγκο 1 ml/100 g σωματικού βάρους κάθε ζώου. Για ανάλυση στυπώματος western, χρησιμοποιήθηκε διμεθυλοσουλφοξείδιο για τη διάλυση CDE και στη συνέχεια αραιώθηκε με DMEM για να αποκτηθεί η τελική συγκέντρωση 0,01, 0.1 1 mg/ml. για ανάλυση HPLC, εφαρμόστηκε μεθανόλη για να διαλυθεί CDE, ακολουθούμενη από διήθηση και αραίωση με αρχική κινητή φάση για να ληφθεί η κατάλληλη συγκέντρωση.

Ανάλυση Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης τουΕκχύλισμα Cistanche deserticola

Τα κύρια χημικά συστατικά του CDE ταυτοποιήθηκαν με χρήση HPLC με τις αντίστοιχες ουσίες αναφοράς. Οι συνθήκες χρωματογραφίας ορίστηκαν ως εξής: Agilent 1220 όργανο RP-HPLC με στήλη C18 (4,6 id × 250 mm· 5 μm), μια κινητή φάση έκλουσης βαθμίδωσης που περιείχε κυρίως νερό και χρησιμοποιήθηκε ακετονιτρίλιο για να ληφθούν καλά διαχωρισμένες κορυφές: διαλύτης Α (νερό που περιέχει 0,5 τοις εκατό οξικό οξύ) και Β (ακετονιτρίλιο): 0–4 λεπτά, 85–83 τοις εκατό Α. 4–10 λεπτά, 83–80 τοις εκατό Α; 10–30 λεπτά, 80–75 τοις εκατό Α; 30–40 λεπτά, 75–70 τοις εκατό Α. Ο όγκος έγχυσης του δείγματος ήταν 5 ul, η θερμοκρασία ελεγχόταν στους 30 βαθμούς και η ανίχνευση UV πραγματοποιήθηκε στα 333 nm (Dong et al., 2018). Ουσίες αναφοράς που περιλαμβάνουν εχινακοσίδη, ακτεοσίδη, ισοακτεοσίδη, κιστανοσίδη Α, κιστανοζίτη C, 2'-ακετυλ ακτεοζίτη και 6'-ακετυλ ακτεοζίτη χρησιμοποιήθηκαν για την αναγνώριση της αντίστοιχης κορυφής.

κιστανάκιμπορώαντι-απόπτωση

Πειράματα σε ζώα

Για τα πειράματα σε ζώα, όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν αυστηρά σύμφωνα με το πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από τον οδηγό της επιτροπής περίθαλψης και χρήσης ζώων του ιδρύματος του Ιατρικού Πανεπιστημίου Ningxia (NXMU{{0}}). Σαράντα οκτώ ενήλικες θηλυκοί αρουραίοι Sprague-Dawley με βάρος περίπου 237 ± 25 g ελήφθησαν (Ningxia Medical University, Yinchuan, Κίνα) και διατηρήθηκαν για 1 εβδομάδα με μια τυπική δίαιτα σφαιριδίων και νερό βρύσης υπό περιβαλλοντικά ελεγχόμενες συνθήκες. Στη συνέχεια, κάθε αρουραίος υποβλήθηκε είτε σε αναισθησία (ένυδρη χλωράλη, 100 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκώς), είτε σε εικονική ωοθηκεκτομή (ψευδή), είτε αφαιρέθηκαν και οι δύο ωοθήκες και στη συνέχεια χωρίστηκαν τυχαία σε πέντε ομάδες: η ομάδα μοντέλου (OVX) χορηγήθηκε από το στόμα με 0,5 τοις εκατό CMC-Na; θετική ομάδα (EV) με 1 mg/kg/ημέρα βαλερικής οιστραδιόλης. ομάδες χαμηλής (CDEL), μέτριας (CDEM) και υψηλής (CDEH) δόσης με 200, 400 και 800 mg/kg/ημέρα CDE, αντίστοιχα. Τα πειράματα διήρκεσαν για 12 εβδομάδες. Το σωματικό βάρος κάθε αρουραίου μετρήθηκε κάθε δύο εβδομάδες με τη δόση χορήγησης προσαρμοσμένη ανάλογα. Μετά την τελευταία ημέρα της παρέμβασης, συλλέχθηκαν ούρα 24 ωρών, ορός, μηρός, κνήμη και μήτρα και αποθηκεύτηκαν στους -80 βαθμούς για περαιτέρω διαφορετική ανάλυση.

Βιοχημικές Παράμετροι

Τα επίπεδα SOD, GSH, MDA, καθεψίνης Κ, BGP και ουρικής DPD ορού προσδιορίστηκαν από τα αντίστοιχα κιτ αντιδραστηρίων, ενώ η δραστικότητα της ανθεκτικής σε τρυγικό οξύ όξινης φωσφατάσης (TRAP) αξιολογήθηκε σύμφωνα με αναφορά (Jiao et al., 2009). Η δραστικότητα της αλκαλικής φωσφατάσης (ALP) και τα επίπεδα Ca και P υπολογίστηκαν με τη χρήση αυτόματης μηχανής αναλυτή (Ciba-Corning 550, USA).

Ανάλυση Οστικής Πυκνότητας και Μικρο-Υπολογιστικής Τομογραφίας

Χρησιμοποιήθηκε μηχάνημα απορρόφησης ακτίνων Χ διπλής ενέργειας (Lunar, ΗΠΑ) για την εκτίμηση της οστικής πυκνότητας (BMD, g/cm2) του δεξιού μηριαίου οστού κάθε αρουραίου με τη λειτουργία σάρωσης που ορίστηκε ως μικρό ζώο. Στη συνέχεια, το ίδιο μηριαίο οστό χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της τρισδιάστατης εικόνας της μικροαρχιτεκτονικής του δοκιδωτού οστού με την εφαρμογή μιας συσκευής σαρωτή μικρο-CT (GE, American), η περιοχή ενδιαφέροντος (ROI) επιλέχθηκε με τον καθορισμό των ίδιων συντεταγμένων στην πλάκα ανάπτυξης του μηριαίο οστό κάθε δείγματος, οι παράμετροι μικροαρχιτεκτονικής συμπεριλαμβανομένης της περιεκτικότητας σε ορυκτά οστών (BMC), της περιεκτικότητας σε ανόργανα ιστού (TMC), της πυκνότητας ορυκτών ιστών (TMD), του διαχωρισμού του δοκιδωτού (Tb. Sp), του αριθμού δοκιδωτών (Tb. N) και του πάχους της δοκιδωτής ( Tb. Th) ελήφθησαν με ανάλυση του ROI.

Προσδιορισμός Western Blot

Οι οστεοκλάστες προκλήθηκαν χρησιμοποιώντας κύτταρα RAW 264.7 που προστέθηκαν με MCSF (25 ng/ml) και RANKL (20 ng/ml) (Yang et al., 2019). Μετά από 6 ημέρες διαρκούς διέγερσης, τα ώριμα κύτταρα οστεοκλαστών που ταυτοποιήθηκαν για δραστηριότητα TRAP υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς CDE (0,01, 0,1 και 1 mg/ml, αντίστοιχα) για 48 ώρες, και στη συνέχεια τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και Τα υπερκείμενα φυγοκεντρήθηκαν και διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου 10 τοις εκατό και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Η μεμβράνη αποκλείστηκε με 5 τοις εκατό άπαχο γάλα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκε με κύρια αντισώματα κατά TRAF6 (1:400), RANKL (1:400), RANK (1:400), IKK (1:400 ), NFκBIA (1:400), OPG (1:400), PI3K (1:400), AKT (1:400), c-Fos (1:400), NFAT2 (1:400), -ακτίνη και GAPDH (1:1,000). Οι ίδιες μεμβράνες αφαιρέθηκαν και ανιχνεύθηκαν ξανά με αντίστοιχα αντισώματα, τα οποία ανιχνεύθηκαν από το λογισμικό Image Lab στο τέλος. Κάθε ένα από τα πειράματα επαναλήφθηκε τρεις φορές, με -ακτίνη ή GAPDH ως εσωτερικό μάρτυρα.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα των πειραμάτων μας, που περιγράφονται ως ο μέσος όρος ± SD, αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης ακολουθούμενη από τη δοκιμή Dennett (SPSS 22.0 λογισμικό, SPSS, ΗΠΑ), p < {{3} }.05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική.

κιστανάκινα είναι επίσης γνωστή ωςέρημοςΤζίνσενγκ

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Κύρια χημικά συστατικά τουCistanches deserticola

Εκχύλισμα Με τη χρήση αντίστοιχων ουσιών αναφοράς, επτά κυρίως φαινυλαιθανοειδείς ενώσεις γλυκοσιδίων, συμπεριλαμβανομένης της εχινακοσίδης,σιστανοζίτηA, ακτεοσίδη, ισοακτεοσίδη,σιστανοζίτηC, 2'-ακετύλιοακτεοσίδη,και 6'-ακετύλιοακτεοσίδηεντοπίστηκαν ότι υπάρχουν σε αυτό το εκχύλισμα, οι αντίστοιχες χρωματογραφικές κορυφές και οι δομές τους φαίνονται στο Σχήμα 1.

Αποτελέσματα τουCistanches deserticolaΕκχύλισμα για τα βάρη του σώματος, της μήτρας και του κόλπου

Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο αρχικό μέσο σωματικό βάρος πριν από την επέμβαση. Ωστόσο, 3 μήνες μετά την επέμβαση με ωοθηκεκτομή, τα σωματικά βάρη των αρουραίων στην ομάδα μοντέλων OVX αυξήθηκαν σημαντικά κατά 35,7 τοις εκατό, ενώ τα υγρά βάρη της μήτρας και του κόλπου μειώθηκαν απότομα κατά 91,2 και 61,8 τοις εκατό, αντίστοιχα, σε σύγκριση με την εικονική αρουραίους (p < 0.001).="" το="" cde,="" με="" τη="" δόση="" των="" 200–800="" mg/kg/ημέρα,="" δεν="" έδειξε="" καμία="" επίδραση="" σε="" αυτά="" τα="" σημαντικά="" αυξημένα="" σωματικά="" βάρη="" και="" μειωμένα="" υγρά="" βάρη="" της="" μήτρας="" και="" του="" κόλπου,="" όπως="" δείχνει="" το="" σχήμα="" 2.="" ωστόσο,="" εντελώς="" διαφορετικό="" από="" το="" cde,="" 1="" mg/kg/ημέρα="" ev="" εμφάνισε="" σημαντική="" οιστρογονική="" επίδραση,="" από="" την="" οποία="" το="" αυξημένο="" σωματικό="" βάρος="" και="" τα="" μειωμένα="" βάρη="" της="" μήτρας="" και="" του="" κόλπου="" σε="" αρουραίους="" ovx="" αντιστράφηκαν="" σημαντικά="" με="" συμπλήρωμα="">

Αποτελέσματα τουCistanches deserticolaΕκχύλισμα για την οστική πυκνότητα και τη μικροαρχιτεκτονική των οστών

Μια διαισθητικά πτωτική τάση παρατηρήθηκε στην ομάδα OVX με BMD ήταν {{0}}.158 ± 0.016 g/cm2 σε σύγκριση με τους εικονικούς αρουραίους με BMD ήταν {{0}}}. {{10}}.180 ± 0.010 g/cm2 (p < 0,001),="" που="" υποδηλώνει="" ότι="" η="" bmd="" των="" αρουραίων="" στην="" ομάδα="" μοντέλων="" ovx="" μειώθηκε="" περίπου="" 12,2="" τοις="" εκατό="" μετά="" 12="" εβδομάδες="" της="" χειρουργικής="" επέμβασης="" με="" ωοθηκεκτομή="" σε="" σύγκριση="" με="" τους="" εικονικούς="" αρουραίους.="" όπως="" έδειξε="" το="" σχήμα="" 3,="" όλοι="" οι="" αρουραίοι="" που="" έλαβαν="" cde="" εμφάνισαν="" αυξημένη="" bmd="" κατά="" 15,1="" τοις="" εκατό="" (ρ="">< 0,001),="" 8,1="" τοις="" εκατό="" (ρ="">< 0,05)="" και="" 9,2="" τοις="" εκατό="" (ρ="">< 0,05),="" αντίστοιχα,="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" μοντέλων="" ovx.="" η="" τρισδιάστατη="" εικόνα="" και="" τα="" αντίστοιχα="" ποσοτικά="" αποτελέσματα="" της="" μικροαρχιτεκτονικής="" των="" δοκιδωτών="" οστών="" των="" αρουραίων="" φαίνονται="" στο="" σχήμα="" 4.="" σε="" συμφωνία="" με="" τα="" αποτελέσματα="" της="" bmd,="" μια="" προφανής="" μείωση="" της="" δοκιδωτής="" περιοχής="" επιτεύχθηκε="" στην="" ομάδα="" μοντέλου="" ovx="" σε="" σύγκριση="" με="" τους="" εικονικούς="" αρουραίους.="" ωστόσο,="" η="" επιδείνωση="" του="" δοκιδωτού="" οστού="" βελτιώθηκε="" εν="" μέρει="" με="" την="" παρέμβαση="" cde,="" εκτός="" από="" την="" tmd="" και="" τη="" tb.="" th,="" οι="" άλλες="" παράμετροι="" του="" δοκιδωτού="" οστού="" περιλαμβάνουν="" bmc,="" tmc="" και="" tb.="" το="" ν="" αυξήθηκε="" σημαντικά="" και="" η="" tb.="" η="" sp="" μειώθηκε="" σημαντικά="" μετά="" τη="" θεραπεία="" με="">

Αποτελέσματα τουCistanches deserticolaΕκχύλισμα για βιοχημικές παραμέτρους ούρων και ορού

Δώδεκα εβδομάδες μετά την επέμβαση με ωοθηκεκτομή, παρατηρήθηκε μια πτωτική αλλά μη στατιστικά τάση του επιπέδου απέκκρισης Ca στα ούρα στην ομάδα μοντέλου OVX, όπως έδειξε το Σχήμα 5, ενώ το επίπεδο P ούρων σε αρουραίους της ομάδας μοντέλου OVX μειώθηκε περίπου τρεις φορές λιγότερο από τους εικονικούς αρουραίους (p < 0.001).="" μετά="" από="" θεραπεία="" με="" cde="" (200–400="" mg/kg/ημέρα)="" για="" 12="" εβδομάδες,="" η="" μείωση="" του="" ca="" και="" p="" του="" ορού="" αποτράπηκε="" σημαντικά="" (p="">< 0,05)="" και="" το="" μειωμένο="" επίπεδο="" απέκκρισης="" p="" στα="" ούρα="" ανεστάλη="" επίσης="" σε="" όλα="" τα="" cde="" που="" έλαβαν="" θεραπεία="" ομάδες="" (p=""><>

Αποτελέσματα τουCistanches deserticolaΕκχύλισμα για δείκτες σχηματισμού οστών και απορρόφησης

Όσον αφορά τους δείκτες σχηματισμού οστού των ALP και BGP (Εικόνα 6), η δραστηριότητα της ALP, όχι της BGP, βελτιώθηκε σημαντικά και στις τρεις δόσεις των ομάδων που έλαβαν CDE (200–800 mg/kg/ημέρα) σε σύγκριση με τους ψευδείς επίμυες. Όσον αφορά τους δείκτες οστικής απορρόφησης των TRAP, DPD και καθεψίνης Κ (Εικόνα 7), τις δραστηριότητες και των τριών οστικής απορρόφησης

Οι δείκτες αυξήθηκαν σημαντικά κατά περίπου 20,9~74,8 τοις εκατό στους αρουραίους της ομάδας μοντέλων OVX σε σύγκριση με τους εικονικούς αρουραίους. και αναμενόμενα, η CDE παρουσίασε μεγάλες δυνατότητες στην καταστολή όλων αυτών των δεικτών, εκ των οποίων η δραστηριότητα της καθεψίνης Κ μειώθηκε κατά 49,9-66,7 τοις εκατό (p < 0.001),="" το="" επίπεδο="" της="" dpd="" ήταν="" μειώθηκε="" κατά="" 22,9~39,3="" τοις="" εκατό="" (p=""><0,01) και="" η="" ιδιότητα="" του="" trap="" αποτράπηκε="" κατά="" 20,1~27,6="" τοις="" εκατό="" (p="">< 0,01),="" αντίστοιχα,="" σε="" σύγκριση="" με="" τους="" αρουραίους="" της="" ομάδας="" μοντέλων="">

Επιδράσεις του εκχυλίσματος Cistanches deserticola στις δραστηριότητες της γλουταθειόνης και της υπεροξειδικής δισμουτάσης καθώς και στην περιεκτικότητα σε μαλονδιαλδεΰδη

Δεν υπήρξαν σημαντικές διαφορές στις δραστηριότητες των SOD και GSH μεταξύ των ομάδων OVX και εικονικής επέμβασης μετά από 3 μήνες επέμβασης με ωοθηκεκτομή, όπως έδειξε το Σχήμα 8, ενώ η περιεκτικότητα σε MDA ήταν προφανώς ενισχυμένη σε αρουραίους με OVX

ομάδα μοντέλου κατά 68,2 τοις εκατό σε σύγκριση με τους ψεύτικους αρουραίους και αυτά τα αυξημένα επίπεδα MDA καταστέλλονται σημαντικά από χαμηλή, μέτρια και υψηλή δόση ομάδων που έλαβαν CDE με τα ποσοστά αναστολής ήταν 66,1, 44.0 και 62,8 τοις εκατό. , αντίστοιχα, σε σύγκριση με τους αρουραίους της ομάδας μοντέλων OVX.

Αποτελέσματα τουCistanches deserticolaΑπόσπασμα για τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης των TRAF6, RANKL, RANK, NFκBIA, IKK , PI3K, AKT, OPG, c-Fos και NFAT2

Όπως έδειξε το Σχήμα 9, οι εκφράσεις των TRAF6, RANKL, RANK, IKK, NFκBIA και NFAT2 ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα κάτω, ενώ τα επίπεδα των PI3K, AKT, OPG και c-Fos ήταν προφανώς αυξημένα ρυθμισμένα μετά από θεραπεία με CDE σε σύγκριση στον έλεγχο. Υποθετικός μηχανισμός (Εικόνα 10) με τον οποίο το CDE μπορούσε να ρυθμίσει προς τα κάτω τα επίπεδα των RANKL, RANK και TRAF6 και να ρυθμίσει προς τα πάνω την έκφραση του OPG, επομένως οι ποσότητες δέσμευσης του RANKL με το RANK μειώθηκαν. Κατά συνέπεια, οι κατάντη οδοί συμπεριλαμβανομένου του σήματος NF-κB κατεστάλησαν και διεγέρθηκε το PI3K/AKT, και αυτοί οι καταρράκτες σηματοδότησης μαζί οδήγησαν την ενεργοποίηση του c-Fos και το NFAT2 ανεστάλη και τελικά η οστεοκλαστική οστική απορρόφηση αποτράπηκε. ΣΥΖΗΤΗΣΗ