Μέρος 1: Αντι-ινωτική επίδραση της 6-βρωμο-ινδιρουβίνης-3 ′ -οξίμης (6-BIO) μέσω της ρύθμισης της πρωτεΐνης ενεργοποιητή-1 (AP-1) και των παραγόντων μεταγραφής πρωτεΐνης ειδικότητας-1 (SP-1) στα νεφρικά κύτταρα

Αντι-ινωτική δράση της 6-βρωμο-ινδιρουβίνης-3′ -οξίμης (6-BIO) μέσω της ρύθμισης της πρωτεΐνης-ενεργοποιητή-1 (AP-1) και των παραγόντων μεταγραφής της πρωτεΐνης ειδικότητας-1 (SP-1) στα νεφρικά κύτταρα

Για περισσότερες information:ali.ma@wecistanche.com

Λέξεις κλειδιά:νεφρός,ΊνωσηΣΜΑΔ,Αντι-ινωτικό

ΑΦΗΡΗΜΈΝΟΣ

Το PAI-1 και το CTGF υπερεκφράζονται σενεφρόςΑσθένειεςκαι αιτίαΊνωσητων πνευμόνων, του ήπατος καιΝεφρά. Χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο αρουραίου μονομερούς απόφραξης του ουρητήρα (UUO) για να διερευνήσουμε εάν6-ΒΙΟ, ένας αναστολέας της κινάσης της συνθάσης του γλυκογόνου-3β, εξασθενημένοςΊνωσηαναστέλλοντας τον PAI-1 και τον CTGF in vivo. Επιπλέον, κυτταρικό που προκαλείται από TGFβΊνωσηπαρατηρήθηκε in vitro με τη χρήση του ανθρώπινουνεφρόςεγγύς σωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα (HK-2) και διάμεσοι ινοβλάστες αρουραίων (NRK49F). Έκφραση τουΊνωση-σχετιζόμενες πρωτεΐνες και μόρια σηματοδότησης όπως PAI-1, CTGF, TGFβ, α SMA,ΣΜΑΔκαι το MAPK προσδιορίστηκαν σε κύτταρα HK-2 και NRK49F χρησιμοποιώντας ανοσοπληξία. Για τον προσδιορισμό των παραγόντων μεταγραφής που ρυθμίζουν την έκφραση των PAI-1 και CTGF, οι δραστηριότητες υποκινητή των AP-1 και SP-1 αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασίες λουσιφεράσης. Η συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιήθηκε για την παρατήρηση του συν-εντοπισμού των AP-1 και SP-1 σε PAI-1 και CTGF. Η έκφραση των PAI-1, CTGF, TGFβ και α -SMA αυξήθηκε στο μοντέλο UUO καθώς και στα κύτταρα HK-2 και NRK49F που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με TGFβ. Επιπλέον, η θεραπεία με UUO και TGFβ προκάλεσε την ενεργοποίηση της P-ΣΜΑΔ2/3,ΣΜΑΔ4, μονοπάτια σηματοδότησης P-ERK 1/2, P-P38 και P-JNK MAPK. Η δραστηριότητα των υποκινητών PAI-1, CTGF, AP-1 και SP-1 αυξήθηκε ως απόκριση στη θεραπεία με TGFβ. Ωστόσο, η θεραπεία με6-ΒΙΟμείωσε την έκφραση των πρωτεϊνών και των οδών σηματοδότησης που σχετίζονται μεΊνωσηστο μοντέλο UUO καθώς και σε κύτταρα HK-2 και NRK49F που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία με TGFβ. Επιπλέον, η θεραπεία 6-BIO εξασθένησε την έκφραση των PAI-1 και CTGF καθώς και τις δραστηριότητες προώθησης των AP-1 και SP-1, ρυθμίζοντας έτσι τοΣΜΑΔκαι οδών σηματοδότησης MAPK, και στη συνέχεια άσκησηαντι-ινωτικάεπιδράσεις στηννεφρόςΚύτταρα.

Κάντε κλικ στο Cistanche herba για νεφρική νόσο

1. Εισαγωγή

Νεφρόςη ίνωση προκαλείται από διάφορους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένου του διαβήτη, της υψηλής αρτηριακής πίεσης, της σπειραματονεφρίτιδας και της χρόνιας που σχετίζονται με την ηλικίανεφρόςασθένεια [1-3]. Σκλήρυνση των σπειραμάτων και διάμεσος σωληνάριοςΊνωσηείναι τα τελικά παθολογικά χαρακτηριστικά τουνεφρόςασθένειες [4,5]. Η υπερβολική παραγωγή και εναπόθεση πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) προκαλεί δομική και λειτουργική βλάβη στηνΝεφρά, με αποτέλεσμα τη σταδιακή απώλεια της λειτουργίας του που κορυφώνεται στο τελικό στάδιονεφρόςασθένεια [5]. ΟΝεφράέχουν πολύπλοκη δομή που χωρίζεται σε σπειράματα, σωληναριοδιαμεσοσταλτικά και αγγειοσυσκευάσματα. Κάθε διαμέρισμα έχει διαφορετικό τύπο εξωκυτταρικής μήτρας και μπορεί να επηρεαστεί απόΊνωση[6,7]. Η ECM των διάμεσων σωληνωτών κυττάρων περιέχει διάφορα συστατικά, όπως κολλαγόνο, γλυκοζαμινογλυκάνη, ελαστίνη, λαμινίνη και γλυκοπρωτεΐνες. Τα ενεργοποιημένα εγγύς σωληνοειδή κύτταρα μπορούν να ενεργοποιήσουν το σωληνοειδές διάμεσο [6–10]. Η κινάση της συνθάσης του γλυκογόνου (GSK3) προάγεινεφρόςΊνωσημε την ενεργοποίηση της σηματοδότησης TGF-β σε εγγύς σωληνοειδή και σωληναριοδιαμεσοσταλτικά κύτταρα [11]. Σε αυτή τη μελέτη, στοχεύαμε να προσδιορίσουμε τα αποτελέσματα του αναστολέα GSK3,6-ΒΙΟ, σε εγγύς σωληνοειδή και διάμεσα κύτταρα ινοβλαστών στοχεύοντας τον αναστολέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου-1 (PAI-1) και τον αυξητικό παράγοντα του συνδετικού ιστού (CTGF), οι οποίοι διαδραματίζουν καίριο ρόλο στην προοδευτικήνεφρόςβλάβη και σωληναριακή διάμεσοςΊνωση.

6-ΒΙΟείναι ένα κυτταρικό διαπερατό παράγωγο ενός αναλόγου ινδιρουβίνης, της 6-βρω-ινδιρουμπίνης, το οποίο απομονώνεται από τα θαλάσσια μαλάκια και έχει υψηλή ειδικότητα και επιλεκτικότητα για το GSK-3 [12,13].6-ΒΙΟείναι ένας ανταγωνιστικός αναστολέας του ΑΤΡ και παρουσιάζει ομοιότητα με την περιοχή δέσμευσης ΑΤΡ της εξαρτώμενης από την κυκλίνη πρωτεϊνικής κινάσης (CDK) που ρυθμίζει την αντικαρκινική δραστηριότητα [14–16]. Η μη φυσιολογική δραστηριότητα της GSK3 σχετίζεται με διάφορες ανθρώπινες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του διαβήτη, της φλεγμονής, των νευροεκφυλιστικών ασθενειών και της ψύχωσης [17,18]. Έχει αποδειχθεί σε προηγούμενες μελέτες ότι οι αναστολείς GSK3 μπορούν να επιδιορθώσουν τα κατεστραμμένα σωληνάρια και να μειώσουν τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις, την επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση (EMT) που σχετίζεται με τη σηματοδότηση TGFβ1 και τη συσσώρευση ινονεκτίνης σε καλλιεργημένα σπειραματικά ενδιάμεσα κύτταρα [11,19–21]. Επιπλέον6-ΒΙΟμπορεί να ασκήσει πιθανά θεραπευτικά αποτελέσματα σε διάφορες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του διαβήτη, των νευροεκφυλιστικών διαταραχών και του καρκίνου ρυθμίζοντας τη φλεγμονή, το οξειδωτικό στρες, την επιβίωση των κυττάρων καθώς και τον πολλαπλασιασμό και τον κυτταρικό θάνατο [22–24]. Ωστόσο, τα πιθανά θεραπευτικά αποτελέσματα του6-ΒΙΟεπίνεφρόςΊνωσηπου σχετίζονται με την εγγύς σωληναριακή και σωληναριακή διάμεση βλάβη είναι ακόμα άγνωστες.

PAI-1, μια πολυλειτουργική γλυκοπρωτεΐνη στοΝεφρά, είναι ένας αναστολέας πρωτεάσης σερίνης, ο οποίος αναστέλλει τον ενεργοποιητή πλασμινογόνου ουροκινάσης (uPA) και τον ενεργοποιητή πλασμινογόνου ιστού (tPA) που διασπά το πλασμινογόνο σε πλασμίνη [25,26]. Η υπερέκφραση του PAI-1 αναστέλλει την ινωδόλυση και την αποικοδόμηση της ECM, αυξάνοντας έτσι τη συσσώρευση ECM [27]. Επιπλέον, το PAI-1 ρυθμίζει το MAPK (πρωτεϊνικές κινάσες που ενεργοποιούνται με μιτογόνα),ΣΜΑΔ, και RhoA / ROCK (Rho-σχετιζόμενη πρωτεϊνική κινάση) σηματοδοτώντας μονοπάτια στον διαβήτη και τη χρόνιανεφρόςασθένεια [28-30]. Παράγοντες μεταγραφής, όπως AP-1, SP-1,ΣΜΑΔ3/4, USF2 (ανάντη μεταγραφικός παράγοντας 2) και CTF/NF (οικογένεια δέσμευσης DNA για συγκεκριμένες τοποθεσίες

πρωτεΐνες), ενεργοποιούνται επίσης από το MAPK και τοΣΜΑΔσηματοδότηση [30,31]. Η συνδυασμένη ενεργοποίηση αυτών των οδών σηματοδότησης και των παραγόντων μεταγραφής αυξάνει την έκφραση του PAI-1 και οδηγεί στη συσσώρευση ecm. Ο CTGF είναι μια πρωτεΐνη δέσμευσης ηπαρίνης που σχετίζεται με το ECM και περιλαμβάνει τομείς, όπως η πρωτεΐνη δέσμευσης αυξητικού παράγοντα που μοιάζει με ινσουλίνη (IGFBP), οι επαναλήψεις τύπου C von Willebrand (VWC), η επανάληψη θρομβοσπονδίνης τύπου 1 (TSR) και μια C-τερματική περιοχή (CT) με μοτίβο κόμβου κυστεΐνης. Από αυτούς τους τέσσερις τομείς, ο τομέας CT αλληλεπιδρά με την υπεροικογένεια TGFβ, την ινονεκτίνη και την περλεκάνη [32–34]. Κατά συνέπεια, ο CTGF αυξάνει το MAPK,ΣΜΑΔ, η σηματοδότηση PI3K και YAP με την πρόκληση TGFβ και αυτές οι οδοί σηματοδότησης ενεργοποιούν παράγοντες μεταγραφής, όπως AP-1, SP-1, NF-kB καιΣΜΑΔ2/3. Έτσι, η ρύθμιση του CTGF επάγει τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό και τη φλεγμονή των κυττάρων, προκαλώντας έτσι συσσώρευση ECM [35-37].

Με βάση αυτά τα αποτελέσματα προηγούμενων μελετών, υποθέσαμε ότι η MAPK και ηΣΜΑΔσηματοδότηση, καθώς και παράγοντες μεταγραφής AP-1 και SP-1, ίσως οι κοινές συνδέσεις μεταξύ της συσσώρευσης ECM που προκαλείται από το PAI-1 και του CTGF σε προοδευτικήνεφρόςνόσος και σωληναριακή διάμεσηΊνωση. Έτσι, διερευνήσαμε κατά πόσον6-ΒΙΟθα μπορούσε να αποτρέψει τη χρόνια προοδευτικήνεφρόςασθένεια με τη ρύθμιση του PAI-1 και του CTGF.

2. Υλικό και μέθοδοι

2.1. Αντισώματα και αντιδραστήρια

Τα κύρια αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αντισώματα κατά του κουνελιού έναντι του PAI-1 (11907), του TGFβ (3711), του φωσφορυλιωμένουΣΜΑΔ2/3 (8828),ΣΜΑΔ4 (38454), φωσφορυλιωμένο ERK (P-ERK) (9101), φωσφορυλιωμένο P38 (P-P38) (4631), φωσφορυλιωμένο JNK (P-JNK) (9251), φωσφορυλιωμένο C-JUN (P-C-JUN) (3270), φωσφορυλιωμένο C-FOS (P-C-FOS) (5348) και ιστόνη H3 (9715), τα οποία ελήφθησαν όλα από την τεχνολογία κυτταρικής σηματοδότησης. CTGF (sc-365970), SP-1 (sc-17824),ΣΜΑΔ6 (sc-25321) αποκτήθηκαν από τη Βιοτεχνολογία Σάντα Κρουζ. Αντισώματα β-ακτίνης ποντικού (a5316) και (2'Z,3'E)-6-Bromo ινδιρουβιν-3-οξίμη (6-ΒΙΟ) (B1686) ελήφθησαν από το Sigma-Aldrich.

2.2. Πειράματα σε ζώα

Όλα τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις σχετικές κατευθυντήριες γραμμές και κανονισμούς. Το πειραματικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Κανονισμών Φροντίδας Ζώων (ACR) της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού Πανεπιστημίου Chonnam (CNUH IACUC-18010, 19 Απριλίου 2019). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αρσενικούς αρουραίους Sprague-Dawley (180-200 g, Samtako, Κορέα) [38]. Οι αρουραίοι διατηρήθηκαν υπό ελεγχόμενη θερμοκρασία (21 ± 2 ◦ C) σε έναν κύκλο φωτός-σκότους 12 ωρών. Οι αρουραίοι χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες: έλεγχος (n = 6), μονομερής απόφραξη του ουρητήρα (UUO, n = 6) και UUO με6-ΒΙΟθεραπεία (n = 6).6-ΒΙΟ(0,2 mg/kg/ημέρα) ενίθηκε ενδοπεριτοναϊκά (i.p.) για 6 ημέρες. Για την ανάπτυξη ενός μοντέλου επιδραστικής νεφροπάθειας αρουραίου, η επέμβαση πραγματοποιήθηκε ως εξής: Η UUO προκλήθηκε από την απολίνωση του αριστερού ουρητήρα για επτά ημέρες. Η κοιλιακή κοιλότητα ανοίχτηκε και τοποθετήθηκαν 2-0 μεταξωτά δίψηφα στον αριστερό εγγύς ουρητήρα. Η ομάδα μαρτύρων έλαβε την ίδια θεραπεία για επτά ημέρες, εκτός από την απολίνωση. Οι αρουραίοι είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τυποποιημένη τροφή αρουραίων και νερό βρύσης και θυσιάστηκαν την 7η ημέρα μετά την επέμβαση. ΟΝεφράαφαιρέθηκαν ταχέως και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανοσοϊστοχημεία και δυτική στάλλωση.

2.3. Ιστολογία

Νεφρόςοι ιστοί σταθεροποιήθηκαν με παραφορμαλδεΰδη 4%, ενσωματωμένοι σε παραφίνη και κόπηκαν σε τμήματα πάχους 5 μm. Η αιματοξυλίνη και η ηωσίνη (H&E), το περιοδικό οξύ-Schiff (PAS), το κόκκινο του Σείριου και οι τρίχρωμες (MT) διαδικασίες χρώσης του Masson πραγματοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της ιστολογικής μορφολογίας. H&E, PAS, Sirius κόκκινη χρώση πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για χρώση MT, μετά από αποπαραφινίωση με ξυλόλιο, τα τμήματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάλυμα Bouin στους 56 ◦ C για 30 λεπτά και πλύθηκαν κάτω από τρεχούμενο νερό βρύσης έως ότου τα τμήματα ήταν καθαρά. Στη συνέχεια, τα τμήματα χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη του Weigert (Α: Β = 1:1), ακολουθούμενη από χρώση με διάλυμα Biebrich Scarlet/Acid Fuchsin για 10 λεπτά και έκπλυση με απεσταγμένο νερό. Τα τμήματα επωάστηκαν με διάλυμα φωσφοτουνγκστικού οξέος/φωσφομολυβδικού οξέος για 10 λεπτά και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάλυμα κυανού ανιλίνης για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, τα τμήματα επωάστηκαν με οξικό οξύ για 1 λεπτό και αφυδατώθηκαν με αιθανόλη και ξυλόλιο. Οι εναποθέσεις κολλαγόνου, οι πυρήνες και οι μυϊκές ίνες χρωματίστηκαν μπλε, μαύρο και κόκκινο, αντίστοιχα. Η ποσοτική ανάλυση του χρωματισμένου τμήματος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

2.4. Ανάλυση της δυτικής κηλίδας

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο φυσιολογικό ορό (PBS), επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και υπερήχησαν για λίγο. Το ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης πρωτεΐνης αποτελούνταν από 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,1% SDS, κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης (GenDEPOT, P3100–001) και κοκτέιλ αναστολέων φωσφατάσης

(GenDEPOT, P3200–001). Μετά τη φυγοκέντρηση, συλλέχθηκαν υπερκείμενα που περιείχαν τα εκχυλίσματα πρωτεΐνης και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα pierce® BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 12% πηκτές δωδεκυλοθειικού-πολυακρυλαμιδίου του νατρίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι κηλίδες μπλοκαρίστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε PBS που περιείχε 0,1% Tween-20 (PBST). Στη συνέχεια, η κηλίδα επωάστηκε κατά τη διάρκεια της νύχτας με το κύριο αντίσωμα (1;2000) στους 4 ◦ C, ακολουθούμενη από επώαση με το δευτερεύον αντίσωμα (1:2500) και τέλος με αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου κατά του κουνελιού, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [39]. Συγκεκριμένες ζώνες πρωτεΐνης απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο σύστημα χημειοφωταύγειας. Ποσοτική ανάλυση της

Η ένταση της μπάντας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ (Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, Bethesda, MD, ΗΠΑ).

2.5. νοκ-άουτ siRNA

Για την εξόντωση του SP-1, το SP-1 siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-29487) και το siRNA ελέγχου (Santa Cruz, sc-37007) μεταδόθηκαν για 24 ώρες σε κύτταρα HK-2 και NRK49F σε 60% συμβολή χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διακλάδωσης Dhar-maFECT 1 (Dharmacon, T-2001–02) σε τελική συγκέντρωση 30 nM. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο χωρίς ορό για μία ημέρα σε 37^◦Ο επωαστήρας C κάτω από μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO 2, προεπεξεργάστηκε με 6-BIO για 1 ώρα και διεγείρεται με TGF-β για 24 ώρες. Η αποτελεσματικότητα του knockdown καθορίστηκε από την ανάλυση της δυτικής κηλίδας.

2.6. Παροδική μετάγγιση του πλασμιδίου και της δομής αναφοράς

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν μέχρι 60-70% συρρέοντα, πλύθηκαν με μέσα DMEM-F-12 (κύτταρα HK-2) ή DMEM (κύτταρα NRK49F) και στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες σε αντίστοιχα μέσα χωρίς ορό και αντιβιοτικά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μολύνθηκαν με κυρίαρχο αρνητικό C-JUN κατασκεύασμα, καθώς και με ρεπόρτερ PAI-1, CTGF, AP-1 και SP-1 που μετέφερε φορέα pGL3 χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο FuGene HD. Η συγκέντρωση του πλασμιδίου του ανταποκριτή που χρησιμοποιήθηκε στην παροδική μετάγγιση ήταν 2 μ g (1 μ g/ μ L). Τα κύτταρα που έχουν μολυνθεί από ρεπόρτερ υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 6-BIO για 1 ώρα και επωάστηκαν με 10 ng/mL TGFβ για 16 ώρες.

2.7. Δοκιμασία προωθητών δημοσιογράφων

Οι κατασκευές δημοσιογράφων PAI-1 και CTGF παρήχθησαν από την BIO FACT (Yuseong-gu, Daejeon, Δημοκρατία της Κορέας). Οι κατασκευές δημοσιογράφων pGL3-AP-1 και pGL3-SP-1 παρασχέθηκαν ευγενικά από τον καθηγητή Young Do Jung (Εθνικό Πανεπιστήμιο Chonnam). Η μεταγραφική ρύθμιση των PAI-1, CTGF, AP-1 και SP-1 διερευνήθηκε με παροδική μετάγγιση των αντίστοιχων δομών αναφοράς pGL3-luciferase. Τα κύτταρα HK-2 και NRK49F (5 × 10 5 ) σπάρθηκαν και καλλιεργήθηκαν μέχρι να επιτευχθεί συρροή 60-70%. Στη συνέχεια, οι δομές του υποκινητή και οι άδειοι από pGL3 φορείς μεταδόθηκαν στα κύτταρα χρησιμοποιώντας το FuGene HD, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το pRL-null πλασμίδιο που κωδικοποιεί τη Renilla luciferase συμπεριλήφθηκε σε όλα τα δείγματα για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της μετάγγισης. Στις 24 ώρες μετά τη μετά τη μετάγγιση, τα επίπεδα των δραστηριοτήτων της πυγολαμπίδας και της λουσιφεράσης Renilla μετρήθηκαν διαδοχικά από ένα μόνο δείγμα χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας Dual-Glo Luciferase (Promega). Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης της firefly ομαλοποιήθηκε στη δραστηριότητα της Renilla και στη σχετική ποσότητα δραστηριότητας της λουσιφεράσης στα κύτταρα που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία.

2.8. Συνεστιακή μικροσκοπία λέιζερ

Αρουραίοςνεφρόςτα δείγματα σταθεροποιήθηκαν σε παραφορμαλδεΰδη 4%, ενσωματωμένα σε παραφίνη και κόπηκαν σε τμήματα πάχους 3 μ m.Νεφρόςτμήματα αποπαραφινώθηκαν και ενυδατώθηκαν, αποφράχθηκαν, πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με αντισώματα anti-PAI-1, anti-CTGF, anti-P-C-JUN, anti-P-C-FOS, anti-SP-1 και anti-AQP1 αραιωμένα σε ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού, για 24 ώρες σε

4^◦Γ. Μετά το πλύσιμο, τα τμήματα επωάστηκαν με αντι-ποντίκια αίγας Alexa Fluor 488 (πράσινος φθορισμός) κατσίκας (Life Technologies, Carlsbad, CA, ΗΠΑ), Cy3 (κόκκινος φθορισμός) αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού κατσίκας (Invitrogen, Όρεγκον) αντισώματα για 2 h. Τα κύτταρα HK-2 και NRK49F (3 ×10 5 ) σπάρθηκαν σε θαλάμους 4 φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες σε 37 ◦ C. Τα κύτταρα προεπεξεργάστηκαν με 5 μ M 6-BIO για 1 ώρα και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε 10 ng/ mL TGFβ για 16 ώρες. Μετά το πλύσιμο με 1X PBS, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με παραφορμαλδεΰδη 4% σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά και μπλοκαρίστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με 1X PBS που περιείχε 1% BSA και 0,2% Triton X-100. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με μονοκλωνικά αντισώματα κουνελιού ή ποντικού έναντι των PAI-1, CTGF, P-C-JUN, P-C-FOS και SP-1 (αραιωμένα 1:200 σε ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού) στους 4 °C για 24 ώρες. Μετά το πλύσιμο, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίστοιχα δευτερογενή αντισώματα (αντισώματα Cy3 goat κατά του κουνελιού και κατά του ποντικού, Alexa Fluor 488 αντισώματα κατά του κουνελιού και κατά του ποντικού, αραιωμένα 1:200) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το πλύσιμο, τα καλύμματα τοποθετήθηκαν σε μικρο-διαφάνειες χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ProLong Gold Antifade με την DAPI (Life Technologies Corporation). Οι εικόνες αναλύθηκαν κάτω από το συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ Leica TCS SP8 (Leica Microsystems, Μάνχαϊμ, Γερμανία).

2.9. Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ο μέσος όρος ± SEM. Πολλαπλές συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων πραγματοποιήθηκαν με μονόδρομη δοκιμή ANOVA και Tukey's ειλικρινά σημαντική διαφορά (HSD). Αποτελέσματα με p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">

3. Αποτελέσματα

3.1. Το 6-BIO εξασθενεί τις μορφολογικές μεταβολές και την έκφραση των δεικτών που σχετίζονται με την ίνωση στο μοντέλο UUO αρουραίων

Αξιολογήσαμε τις επιδράσεις του 6-BIO σεΊνωσηστην καρτέλαΝεφράενός μοντέλου αρουραίων UUO. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, το μοντέλο UUO παρουσίασε σημαντικά αυξημένηνεφρόςσωληναριακή διάμεση βλάβη, σπειραματική σκλήρυνση, διάμεση διήθηση μονοπύρηνων κυττάρων, εναπόθεση διάμεσου κολλαγόνου καιΊνωσησε σύγκριση με τα χειριστήρια, όπως καθορίζονται από τη χρώση H&E, PAS, Sirius Red και MT. Επιπλέον, οι πρωτεΐνες που σχετίζονται με το EMT και επάγουννεφρόςΊνωσηκαθώς και το κολλαγόνο Ι και -IV που αυξάνουν τη συσσώρευση ECM αυξήθηκαν σε UUO σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Σχ. S1A και C). Ωστόσο, αυτές οι αλλαγές μετριάστηκαν από τη θεραπεία 6-BIO. Το σχήμα 1Β δείχνει ότι μετά από 7 ημέρες απόφραξης, η έκφραση των πρωτεϊνών PAI-1, CTGF, α -SMA και TGFβ αυξήθηκε στα νεφρά των αρουραίων του μοντέλου UUO σε σύγκριση με εκείνη στους μάρτυρες και αυτή η αύξηση μετριάστηκε από τη θεραπεία με 6-BIO. Η έκφραση τουινωτικάοι δείκτες αυξήθηκαν σημαντικά σε UUO σε σύγκριση με τους μάρτυρες, γεγονός που εξουδετερώθηκε από την6-ΒΙΟθεραπεία (Εικ. 1Γ). Η χρώση ανοσοφθορισμού (Εικ. 1D) αποκάλυψε ότι η έκφραση του PAI-1 και του CTGF (κόκκινος φθορισμός) αυξήθηκε στα αποφραγόμεναΝεφράτην ημέρα-7 σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Ωστόσο, η έκφραση των PAI-1 και CTGF μειώθηκε κατά τη θεραπεία με 6-BIO (Σχήμα 1D). Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι το 6-BIO εξασθενεί τη διάμεση βλάβη των σωληναρίων αναστέλλοντας την έκφραση PAI-1 και CTGF.

3.2. Το 6-BIO εξασθενεί την έκφραση των P-C-JUN, P-C-FOS, SP-1 και αναστέλλει τις οδούς σηματοδότησης που σχετίζονται με την ίνωση στο μοντέλο UUO αρουραίων

Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε αν6-ΒΙΟεπηρεάζει τις οδούς σηματοδότησης που σχετίζονται μενεφρόςΊνωση. Πρώτον, επιβεβαιώσαμε ότι6-ΒΙΟ, ο οποίος είναι γνωστός αναστολέας του GSK3β, αναστέλλει τη φωσφορυλίωση GSK3β. Σύκο. Τα S1A και B δείχνουν τη μείωση του GSK3β κατά 6-BIO. Το σχήμα 2A δείχνει το TGFβ/ΣΜΑΔοδός σηματοδότησης. Η ανάλυση της δυτικής κηλίδας έδειξε ότι η έκφραση του φωσφορυλιωμένουΣΜΑΔ2/3 καιΣΜΑΔ4 πρωτεΐνες αυξημένες σε UUOΝεφρά, η οποία μετριάστηκε από τη θεραπεία 6-BIO (Εικ. 2Α). ΌμωςΣΜΑΔ6, η οποία αναστέλλει τη φωσφορυλίωση του SMAD 2 και τη δραστικότητα τουΣΜΑΔ4 [40], είχε αντίθετα αποτελέσματα. Επιπλέον, η σηματοδότηση MAPK διαδραματίζει βασικό ρόλο στηννεφρόςίνωση [41,42]. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση δυτικής κηλίδας για να προσδιορίσουμε εάν το 6-BIO επηρεάζει τη σηματοδότηση MAPK. Τα επίπεδα φωσφορυλιωμένων ERK, JNK και P38 αυξήθηκαν σε UUOΝεφράσε σύγκριση με εκείνους που έχουν τον έλεγχοΝεφρά(Εικ. 2Β). Η έκφραση των φωσφορυλιωμένων ERK και JNK μειώθηκε σημαντικά από την επεξεργασία 6-BIO, ενώ η μείωση του φωσφορυλιωμένου επιπέδου p38 ήταν αμελητέα (Εικ. 2Β).ΣΜΑΔκαι οι οδοί σηματοδότησης MAPK ρυθμίστηκαν στην ομάδα UUO, η οποία αντιστράφηκε από την6-ΒΙΟθεραπεία (Εικ. 2Γ). Πολλοί παράγοντες μεταγραφής εμπλέκονται σενεφρόςΊνωσηκαι παίζουν βασικούς ρόλους στη ρύθμιση της κατάντη γονιδιακής έκφρασης. Το σχήμα 2D δείχνει ότι μετά από 7 ημέρες απόφραξης, η έκφραση των πρωτεϊνών P-C-JUN, P-C-FOS και SP-1 αυξήθηκε στοΝεφράτων αρουραίων με UUO σε σύγκριση με εκείνη στους μάρτυρες, και αυτή η αύξηση μετριάστηκε από τη θεραπεία με 6-BIO. Ομοίως, η έκφραση των AP-1 και SP-1, οι σημαντικοί μεταγραφικοί παράγοντες που ρυθμίζουννεφρόςτα γονίδια που σχετίζονται με την ίνωση, αυξήθηκαν σημαντικά σεΝεφράαρουραίων με UUO αλλά εξασθένησε κατά τη διάρκεια της θεραπείας με 6-BIO (Εικ. 2Ε). Το σχήμα 2F δείχνει τη χρώση ανοσοφθορισμού των P-C-JUN, P-C-FOS. και SP-1. Ο ερυθρός φθορισμός της χρώσης P-C-JUN, P-C-FOS και SP-1 αυξήθηκε σημαντικά στην αποφραγμένηΝεφρά, σε σύγκριση με τους μάρτυρες, και μειώθηκε κατά τη θεραπεία 6-BIO. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι τα AP-1 και SP-1 είναι σημαντικοί παράγοντες μεταγραφής που εμπλέκονται στηννεφρόςίνωση, και6-ΒΙΟενδέχεται να μειωθείνεφρόςίνωση με εξασθένηση της μεταγραφικής τους δραστηριότητας.

Για το Μέρος 2, κάντε κλικ στο κουμπίΕδώ.