Ξεπερνώντας την Ανοσολογική Ανεπάρκεια με το Allogrooming

Απλή περίληψη:

Ερευνήσαμε εάν δύο στενά συγγενικά είδη τερμιτών διαφέρουν ως προς την εξάρτησή τους από την κοινωνική ή ατομική ανοσία έναντι δύο ειδών παθογόνων μυκήτων, τα οποία συλλέχθηκαν όλα από την ίδια τοποθεσία. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αμοιβαία περιποίηση (allogrooming) είναι εξαιρετικά αποτελεσματική στον περιορισμό των θανατηφόρων λοιμώξεων στο βαθμό που μπορεί να αντισταθμίσει τις σχετικά αδύναμες ατομικές ανοσοποιητικές άμυνες. Μετά την αντιμετώπιση παθογόνων μικροοργανισμών, οι τερμίτες χρησιμοποιούν μια εναλλακτική στρατηγική για την κοινωνική αποστασιοποίηση και τον περιορισμό της εξάπλωσης μεταδοτικών ασθενειών και αντ' αυτού συνέρχονται για να καθαρίσουν ο ένας τον άλλον. Η διακύμανση της έντασης αυτής της συμπεριφορικής απόκρισης υποδεικνύει μια διαφοροποιημένη απάντηση στο επίπεδο της απειλής.

Οφέλη συμπληρώματος cistanche-αύξηση της ανοσίας

Αφηρημένη:

Το allogrooming φαίνεται να είναι απαραίτητο σε πολλά κοινωνικά ζώα για προστασία από την έκθεση ρουτίνας σε παράσιτα. Στα κοινωνικά έντομα, φαίνεται να είναι κρίσιμο για την απομάκρυνση των παθογόνων πολλαπλασιαστών από την επιδερμίδα πριν ξεκινήσουν έναν μολυσματικό κύκλο. Για τους υπόγειους τερμίτες, αυτό περιλαμβάνει σπόρια μυκήτων που συναντώνται συνήθως στο έδαφος, όπως τα κονίδια Metarhizium, τα οποία μπορούν γρήγορα να βλαστήσουν και να διεισδύσουν στην επιδερμίδα. Ερευνήσαμε εάν υπάρχει διαφορά στην εξάρτηση από την κοινωνική και την έμφυτη ανοσία σε δύο στενά συγγενείς υπόγειους τερμίτες για προστασία από θανατηφόρες λοιμώξεις από δύο είδη Metarhizium που συναντώνται τοπικά. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η σχετικά ασθενής έμφυτη ανοσία σε ένα είδος τερμιτών αντισταθμίζεται από πιο παρατεταμένη αλλοπροσαρμογή. Αυτό περιλαμβάνει βελτιωμένη αλλοπροσαρμογή σε απόκριση σε συγκεντρώσεις κονιδίων που αντικατοπτρίζουν πιο συνηθισμένη μόλυνση της επιδερμίδας καθώς και σε βαριά επιδερμιδική μόλυνση που προκαλεί μια δικτυωμένη απόκριση έκτακτης ανάγκης.

Λέξεις-κλειδιά:

κοινωνική ανοσία? έμφυτη ανοσία? Εντομοπαθογόνα; συμπεριφορά συναγερμού? τέρμα

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1. Εισαγωγή

Οι κοινωνικοί μηχανισμοί άμυνας μπορούν να είναι εξαιρετικά αποτελεσματικοί στην εξουδετέρωση της ευαισθησίας σε μεταδοτικές ασθένειες, παρά το γεγονός ότι η κοινωνικότητα ευνοεί την εξάπλωσή της [1,2]. Στους τερμίτες και τα μυρμήγκια, η εξέλιξη των αποτελεσματικών κοινωνικών μηχανισμών ανοσολογικής άμυνας φαίνεται να έχει χαλαρή επιλεκτική πίεση στους μεμονωμένους έμφυτους ανοσολογικούς μηχανισμούς [3-6]. Μετά την αντιμετώπιση παθογόνων, η απειλή ασθενειών στα κοινωνικά έντομα θα εξαρτηθεί από την αποτελεσματικότητα των έμφυτων άμυνες πρώτης γραμμής, οι οποίες περιλαμβάνουν φυσικά εμπόδια στη μόλυνση. Πολλά μυκητιακά παθογόνα παράγουν άφυλα σπόρια (κονίδια) που μπορούν να διεισδύσουν άμεσα στην επιδερμίδα του εντόμου. Οι κοινωνικές ανοσοποιητικές άμυνες που βοηθούν στην προστασία της επιδερμίδας, συμπεριλαμβανομένης της αλλοπροστασίας και των εκκρινόμενων αντιμυκητιασικών, φαίνεται να είναι ιδιαίτερα σημαντικές στους τερμίτες για την άμυνα έναντι του Metarhizium spp [7-9]. Τα κονίδια Metarhizium είναι πανταχού παρόντα στο έδαφος από το οποίο μετακινούνται πολλοί τερμίτες ενώ αναζητούν τροφή και φτάνουν σε συγκεντρώσεις που διατηρούν μια συνεχή απειλή μόλυνσης [10]. Οι τερμίτες αναζήτησης τροφής, όπως τα είδη του γένους Reticulitermes, κινούνται μέσα στο έδαφος για να επεκτείνουν το εύρος των αποικιών τους και να αποκτήσουν πρόσβαση σε πολλαπλές τοποθεσίες τροφοδοσίας, οι οποίες είναι συνήθως πόροι ξύλου που στηρίζονται στην επιφάνεια του εδάφους [11]. Τα υπόγεια δίκτυα των αποικιών τους μπορεί να εκτείνονται σε δεκάδες μέτρα, να περιέχουν πάνω από εκατό χιλιάδες άτομα και να φτάσουν σε πυκνότητες πάνω από εκατό αποικίες ανά εκτάριο [12]. Εξελίχθηκαν από έναν πρόγονο με αποικίες περιορισμένες σε ένα μόνο κομμάτι ξύλου [13,14]. Αυτή η μετάβαση θα είχε ως αποτέλεσμα αυξημένες συναντήσεις με αρπακτικά, παθογόνα και ανταγωνιστές και συνέπεσε με την εξέλιξη μιας αφοσιωμένης αληθινής εργατικής κάστας που συνήθως παραιτείται από την άμεση αναπαραγωγή. Η βελτιωμένη υγιεινή είναι πιθανό να ήταν κρίσιμη για αυτή τη μετάβαση και την επακόλουθη ακτινοβολία και την τρέχουσα οικολογική επιτυχία των τερμιτών, των οποίων η συμβολή στην αποσύνθεση του ξύλου μπορεί να ξεπεράσει τη μικροβιακή αποσύνθεση [15,16] και οι οποίοι φαίνονται έτοιμοι να επεκταθούν γρήγορα παγκοσμίως καθώς αυξάνονται οι θερμοκρασίες [17] . Κατά τη μετάβαση στην αναζήτηση τροφής, μια χαλάρωση της επιλεκτικής πίεσης στα έμφυτα γονίδια του ανοσοποιητικού συνέπεσε με την ενίσχυσή της σε δύο γονίδια που παράγουν εκκρινόμενες αντιμυκητιακές πρωτεΐνες [6]. Αυτές οι πρωτεΐνες φαίνεται να είναι απαραίτητες για την απομάκρυνση των μυκητιακών κονιδίων με αλλοπροσαρμογή. Η αντίθετη επιλεκτική πίεση στα συστατικά των ατομικών έμφυτων και κοινωνικών μηχανισμών άμυνας στο παρελθόν υποδηλώνει ότι συνεχίζει να υπάρχει μια προσαρμοστική αντιστάθμιση στην εξάρτηση των τερμιτών στην ατομική έμφυτη και κοινωνική ανοσία για προστασία από μυκητιασικές ασθένειες. Αυτό υποστηρίζεται από την παρατήρηση ότι η έμφυτη έκφραση του ανοσοποιητικού γονιδίου είναι χαμηλότερη σε ομάδες από τα άτομα των εργαζομένων στο Reticulitermes που έχουν εκτεθεί σε κονίδια Metarhizium [18]. Το Allogrooming μειώνει την ανάγκη ενεργοποίησης του εσωτερικού ανοσοποιητικού συστήματος. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε διαφορές στην κοινωνική και έμφυτη ανοσία σε δύο είδη υπόγειων τερμιτών έναντι δύο τοπικών ειδών Metarhizium που συναντώνται φυσικά. Τα είδη Metarhizium απομονώθηκαν από το έδαφος κάτω ή δίπλα σε κορμούς στους οποίους συλλέχθηκαν τερμίτες. Τα δύο είδη τερμιτών, Reticulitermes virginicus και Reticulitermes flavipes συλλέχθηκαν από την ίδια τοποθεσία στο Μέριλαντ. Αν και φαίνεται να είναι αγωνιστικά, συχνά βρίσκονται να αναζητούν τροφή το ένα δίπλα στο άλλο ή ακόμη και περιστασιακά στο ίδιο κούτσουρο. Η διαειδική επιθετικότητα μεταξύ των εργαζομένων συχνά οδηγεί σε θανατηφόρα τραύματα σε προσδιορισμούς αγωνισμού τρυβλίων Petri [19]. Η αντιμυκητιακή δράση των δερματικών πλύσεων των εργαζομένων R. virginicus έχει αποδειχθεί προηγουμένως πιο αποτελεσματική στην αδρανοποίηση των κονιδίων Metarhizium από τις πλύσεις από εργάτες R. flavipes [20]. Αυτό υποδηλώνει ότι αν και αυτοί οι δύο τερμίτες συνδέονται στενά και συναντούν τα ίδια παθογόνα, μπορεί να διαφέρουν ως προς την εξάρτησή τους από την ατομική έμφυτη ή κοινωνική ανοσία. Χρησιμοποιήσαμε μια συγκριτική προσέγγιση για να διερευνήσουμε εάν υπάρχει διαφορά μεταξύ της εξάρτησης και της ενσωμάτωσης της κοινωνικής και της έμφυτης ανοσίας και εάν υπάρχει δυνητικός συμβιβασμός μεταξύ των δύο. Η ενισχυμένη κοινωνική ανοσία μπορεί να σχετίζεται με λιγότερο αποτελεσματικούς έμφυτους ανοσοποιητικούς μηχανισμούς, οι οποίοι μπορεί να περιλαμβάνουν την ισχύ των εκκρινόμενων αντιμυκητιασικών και αντίστροφα. Η ασθενέστερη ατομική ανοσία μπορεί να αντισταθμιστεί με πιο αποτελεσματική κοινωνική ανοσία. Η επιβίωση εργατών τερμιτών όψιμου σταδίου σε ομάδες των δώδεκα, ζευγαριών ή μονών τόνων διερευνήθηκε αφού είχαν προσβληθεί με μύκητες είτε από το Metarhizium robertsii είτε από το Metarhizium brunneum. Ομάδες 12 εργαζομένων εκτέθηκαν για λίγο σε υψηλή δόση του μύκητα. Αυτή η δυνητικά θανατηφόρα συγκέντρωση προκαλεί παρόμοιες συμπεριφορικές αποκρίσεις με αυτές που παρατηρούνται όταν οι τερμίτες συναντούν ένα σπορογόνο πτώμα, σε ορισμένες περιπτώσεις προκαλώντας σημαντική αύξηση στην απόκριση συναγερμού που οδηγεί σε γρήγορες διαμήκεις ταλαντωτικές κινήσεις, LOM [21-23]. Η συχνότητα των LOM στα πρώτα 12 λεπτά μετά την έκθεση των τερμιτών σε κονίδια διαφορετικών στελεχών και ειδών Metarhizium συσχετίζεται θετικά με τη συχνότητα κρίσεων αλλοπροστασίας. Τα LOM, τα οποία είναι πιο εύκολο να μετρηθούν από το allogrooming, μπορούν επομένως να χρησιμοποιηθούν ως έμμεσο μέτρο των επιπέδων allogrooming. Η ανίχνευση του μύκητα φαίνεται να καθυστερεί έως ότου οι επιφάνειες των τερμιτών μολυνθούν με κονίδια, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι υποδοχείς αναγνώρισης που σχετίζονται με τα στοματικά μέρη είναι κρίσιμοι για την έναρξη του αυξημένου συναγερμού και της αλλοίωσης. Τα ζευγάρια και τα μονότονα εκτέθηκαν σε μια χαμηλή δόση του μύκητα που είναι πιο πιθανό να αντικατοπτρίζει τα επίπεδα έκθεσης που συναντούν οι τερμίτες όταν κατασκευάζουν στοές μέσω του εδάφους, σε αντίθεση με τις άμεσες συναντήσεις με σποροειδή πτώματα. Σε αντίθεση με τους απλούς τερμίτες, τα ζεύγη τερμιτών είναι σχεδόν πλήρως ανθεκτικά σε θανατηφόρες λοιμώξεις σε αυτή τη δόση για 10 ημέρες. Για να διαχωριστεί η κοινωνική και η έμφυτη ανοσία σε αυτή τη χαμηλή δόση, ζεύγη τερμιτών διαχωρίστηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία λίγο μετά τις προκλήσεις με μυκητιακά κονίδια και η επιβίωση αυτών των ζευγών συγκρίθηκε με μοναχικά που δεν είχαν ευκαιρίες για κοινωνικές αλληλεπιδράσεις μετά από μυκητιακές προκλήσεις. Παρατηρήθηκαν Allogrooming και LOM πριν από τα χρονικά σημεία διαχωρισμού των ζευγών τερμιτών. Επιπλέον, η αντιμυκητιακή δράση των ακατέργαστων εκχυλισμάτων ολόκληρων τερμιτών δοκιμάστηκε για να αξιολογηθούν περαιτέρω οι διαφορές στην έμφυτη ανοσία μεταξύ των δύο ειδών τερμιτών σε απόκριση στα δύο είδη μυκήτων.

Οφέλη από το σωληνίσκο cistanche- ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματος

2. Μέθοδοι

2.1. Οργανισμοί Μελέτης

Οι τερμίτες R. flavipes και R. virginicus, και οι μύκητες M. brunneum και M. Roberts, συλλέχθηκαν από φυλλοβόλα δάση δευτερεύουσας ανάπτυξης στην κομητεία Baltimore (Pleasant Hills και Monkton), Maryland. Τα είδη τερμιτών ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμές ενδο- και διαειδικών αγωνιστικών δοκιμών [19] και μιτοχονδριακών αλληλουχιών rRNA [4]. Τα είδη Metarhizium απομονώθηκαν από δείγματα εδάφους κοντά σε χώρους συλλογής τερμιτών (<30 cm) using a baiting technique with Tenebrio molitor larvae [24]. The conidia and mycelia of two clonal lines of the species were used for DNA purification with a QIAGEN DNeasy Blood and Tissue kit. The 50 regions of translation elongation factor 1-alpha were PCR-amplified using PCR primers EF1T and EF2T [25]. These regions were Sanger-sequenced (Psomagen, Rockville, MD) for species identification. Foraging groups of R. flavipes and R. virginicus (>1000) και το ξύλο με το οποίο τρέφονταν συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν σε πλαστικά δοχεία σε σκοτεινές, υγρές συνθήκες στους 25 ◦C. Οι τερμίτες που ανήκουν στο ίδιο είδος συλλέχθηκαν από τοποθεσίες που απέχουν τουλάχιστον 60 μέτρα, κάτι που συνήθως αρκεί για να διασφαλιστεί ότι οι συλλογές προέρχονται από διαφορετικές αποικίες [12]. Αυτές οι ξεχωριστές συλλογές αναφέρονται παρακάτω ως αποικίες. Οι τερμίτες συλλέχθηκαν το καλοκαίρι του 2018 και του 2019 για τα πειράματα με τις ομάδες των 12 καθώς και για πειράματα in vitro με ακατέργαστα εκχυλίσματα τερμιτών και το 2021 και 2022 για τα πειράματα με ζεύγη και μονότονα. Οι τερμίτες χρησιμοποιήθηκαν στα αντίστοιχα πειράματά τους εντός 4 μηνών από τη συλλογή. Οι εργάτες αφαιρέθηκαν απαλά από κομμάτια ξύλου και διατηρήθηκαν σε ομάδες τρυβλίων Petri διαμέτρου 12 55 mm επενδεδυμένα με βρεγμένο διηθητικό χαρτί (Whatman 1) για 24 ώρες σε ατμοσφαιρικό φως προτού χρησιμοποιηθούν για τα πειράματά μας. Αυτό τους επέτρεψε να εγκλιματιστούν στο φως και να καθαρίσουν τις επιδερμίδες τους από σωματιδιακά υπολείμματα πριν από την έκθεση σε μύκητες. Δεν συμπεριλάβαμε στρατιώτες, καθώς δεν καλλωπίζουν τους συντρόφους τους, αντιπροσωπεύουν το 1-2% της αποικίας και δεν βρίσκονται σταθερά σε ομάδες αναζήτησης τροφής.

2.2. Survivorship και απάντηση συναγερμού για ομάδες των δώδεκα

Ομάδες 12 εργαζομένων R. flavipes ή R. virginicus εκτέθηκαν σε υψηλή δόση 10 6 κονιδίων mL−1 0.05% Tween 80 (MilliporeSigma) , Burlington, MA, USA) ή 0,05% Tween 80 για μάρτυρες. Το Tween 80 συμπεριλήφθηκε για να βοηθήσει στη διάσπαση συστάδων κονιδίων κατά την προετοιμασία των εναιωρημάτων. Την ημέρα πριν από αυτές τις θεραπείες, και οι 12 τερμίτες επισημάνθηκαν με μια μικρή κουκκίδα έγχρωμης βαφής σμάλτου στη ραχιαία πλευρά της κοιλιάς τους, ώστε να μπορούν να αναγνωριστούν μεμονωμένα. Το Allogrooming όντως αφαίρεσε το χρώμα από μερικά άτομα, αλλά αυτά τα άτομα μπορούσαν ακόμα να αναγνωριστούν μεμονωμένα τη στιγμή του θανάτου ερευνώντας τους επιζώντες και με φυσική ατομική διαφοροποίηση στους εργαζόμενους, όπως ο βαθμός σκούρου χρωματισμού στην κοιλιά. Οι τερμίτες που χρησιμοποιήθηκαν για κάθε αντίγραφο 12 προσβεβλημένων τερμιτών και οι μάρτυρες ήταν από διαφορετικές αποικίες. Χρησιμοποιήθηκαν πέντε αποικίες τόσο για το R. flavipes όσο και για το R. virginicus (n=480 εργάτες). Τα πειράματα με τις αποικίες του M. Roberts επαναλήφθηκαν μετά από τρεις μήνες για να ελεγχθεί η συνέπεια στην επιβίωση. Συνολικά, υπήρχαν 60 αντίγραφα 12 ή 11 τερμιτών (n=709). Σε 11 επαναλήψεις ένας τερμίτης πέθανε πριν από την έκθεση σε μύκητες, κάτι που φάνηκε να οφείλεται στον χειρισμό κατά τη σήμανση της βαφής. Οι τερμίτες εκτέθηκαν σε κονίδια που παρασκευάστηκαν από μια κλωνική καλλιέργεια είτε του M. Roberts είτε του M. brunneum. Οι εργαζόμενοι προστέθηκαν σε σωλήνες 1,5 mL που περιείχαν 500 µL των αραιώσεων κονιδίων, ή 0,05% Tween 80 για τους ελέγχους, με μια μικρή πλαστική χοάνη και αναδεύτηκαν απαλά για 10 δευτερόλεπτα για να εξασφαλιστεί η πλήρης βύθιση. Οι εργάτες στη συνέχεια εναποτέθηκαν σε διηθητικό χαρτί για να απορροφηθεί η περίσσεια υγρού, μεταφέρθηκαν σε τρυβλία Petri διαμέτρου 55 mm επενδεδυμένα με υγρό διηθητικό χαρτί (Whatman 1) και καταγράφηκε βίντεο για 12 λεπτά. Η θνησιμότητα παρακολουθούνταν καθημερινά για δύο εβδομάδες. Τα νεκρά άτομα απομακρύνθηκαν, η επιφάνεια αποστειρώθηκε με αιθανόλη 70% και τοποθετήθηκαν σε υγρό διηθητικό χαρτί σε τρυβλία Petri (55 mm) που διατηρήθηκαν στους 24 ◦C και 100% υγρασία για επιβεβαίωση της μόλυνσης από Metarhizium (ανάπτυξη πράσινης μουσκαρδίνης μετά από 3-4 ημέρες). Ο συνολικός αριθμός των LOM που παρατηρήθηκαν στα βίντεο πάνω από 12 λεπτά βαθμολογήθηκε για κάθε τερμίτη. Τα LOM διήρκεσαν μεταξύ 2 και 7 δευτερολέπτων και έπρεπε να έχουν σταματήσει και στη συνέχεια να συνεχίσουν να βαθμολογούνται ως ξεχωριστά γεγονότα [23].

2.3. Survivorship και Allogrooming για ζευγάρια και singletons

Η επιβίωση των ζευγών τερμιτών συγκρίθηκε με τα μονότονα μετά από έκθεση σε χαμηλή δόση (104 κονίδια mL−1) κονιδίων που δεν προκάλεσε υπερβολική θνησιμότητα και πιθανότατα αντανακλά τις συγκεντρώσεις που συναντούν οι τερμίτες όταν κινούνται στο έδαφος [10] . Τα ζευγάρια και τα μονότονα συγκρίθηκαν για τη μέτρηση της επιβίωσης που παρέχεται από τους κοινωνικούς μηχανισμούς άμυνας. Ομάδες 12 εργαζομένων αρχικά προκλήθηκαν με ή χωρίς μύκητες όπως περιγράφεται παραπάνω, εκτός από το ότι παρασκευάστηκαν εναιωρήματα κονιδίων περίπου 107 κονιδίων mL−1 σε 0,1% Tween 80 και στροβιλίστηκαν έντονα πριν από αραιώσεις με στείρο νερό σε 104 κονίδια mL−1. Το Tween 80 δεν συμπεριλήφθηκε στις αραιώσεις επειδή τα εναιωρήματα μεμονωμένων κονιδίων μπορούσαν να διατηρηθούν σε χαμηλές συγκεντρώσεις και επειδή το επιφανειοδραστικό μπορεί να παρεμποδίσει την προσκόλληση των κονιδίων στην επιδερμίδα. Αυτά τα άτομα δεν είχαν σήμανση με μπογιά. Αμέσως μετά τις θεραπείες και προτού οι τερμίτες έχουν την ευκαιρία να αλληλεπιδράσουν, χωρίστηκαν σε ζεύγη ή μονότονα στα φρεάτια 24-πλακών πλαστικής κυτταροκαλλιέργειας φρεατίων (CELLTREAT Scientific, Pepperell, MA). Κάθε φρεάτιο ήταν επενδεδυμένο με βρεγμένο διηθητικό χαρτί (Whatman 1). Για κάθε συνδυασμό τερμιτών/μυκήτων (n {= 4), τέσσερα ζεύγη τερμιτών διαχωρίστηκαν σε μονούς τόνους μετά από 15 λεπτά, 2 ώρες, 5,5 ώρες, 8 ώρες και 27 ώρες (n=160) και για κάθε Συνδυασμός τερμιτών/μυκήτων 12 τερμίτες που δεν είχαν ποτέ την ευκαιρία να αλληλεπιδράσουν διαχωρίστηκαν σε μονότονα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μύκητες ή σε μάρτυρες (n=96). Αυτοί οι μεμονωμένοι τερμίτες χωρίστηκαν επίσης σε 24-πλάκες με οπές επενδεδυμένες με διηθητικό χαρτί. Η θνησιμότητα των τερμιτών παρακολουθήθηκε στη συνέχεια για δέκα ημέρες και τα νεκρά άτομα απομακρύνθηκαν για επιβεβαίωση της μόλυνσης από το Metarhizium. Χρησιμοποιήθηκε μία μεμονωμένη αποικία και για τους R. flavipes που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με M. robertsii ή M. brunneum και για R. virginicus που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με M. robertsii ή M. brunneum (n=256). Έξι μη επεξεργασμένα ζεύγη διατηρήθηκαν επίσης σε 24-πλάκες φρεατίου για 10 ημέρες για κάθε είδος. Ένα ξεχωριστό πείραμα με τις ίδιες αποικίες επικεντρώθηκε στην καταγραφή του αλλοφροντισμού πριν από τους χρόνους διαχωρισμού των ζευγών στα 15 λεπτά, 2 ώρες, 5,5 ώρες, 8 ώρες και 27 ώρες. Έξι διαφορετικά ζεύγη από κάθε είδος τερμιτών υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κάθε μύκητα ή νερό για μάρτυρες και βαθμολογήθηκαν για τον διαχωρισμό για 15 λεπτά πριν από τα χρονικά σημεία διαχωρισμού (n=180). Τα συμβάντα αλλοπροσαρμογής βαθμολογήθηκαν όταν η επαφή στόμα με σώμα μεταξύ δύο τερμιτών περιλάμβανε την κίνηση των στοματικών μερών (παλμών) και καταγράφηκε η διάρκεια κάθε αδιάλειπτου συμβάντος αλλοπροστασίας. Το Allogrooming βαθμολογήθηκε από έναν μόνο παρατηρητή που ήταν τυφλός για την οποία είχαν λάβει θεραπεία οι τερμίτες. Τα LOM βαθμολογήθηκαν επίσης αλλά ήταν αμελητέα και δεν χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση. Η αυτο-περιποίηση δεν τηρήθηκε.

Οφέλη από το σωληνίσκο cistanche- ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματος

2.4. Αντιμυκητιακή δράση in vitro

Δώδεκα εργαζόμενοι από 5 αποικίες R. flavipes ή R. virginicus ακινητοποιήθηκαν εν ψυχρώ σε σωλήνες Eppendorf 1,5 mL και προστέθηκαν 120 μL κρύου, αποστειρωμένου νερού σε κάθε σωλήνα. Οι εργαζόμενοι και από τα δύο είδη που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν περίπου το ίδιο μέγεθος (μήκος 4–5 mm). Οι τερμίτες ομογενοποιήθηκαν με ένα πλαστικό γουδοχέρι και το εκχύλισμα φυγοκεντρήθηκε στα 16,000 g για 2 λεπτά. Το υπερκείμενο αποστειρώθηκε με φίλτρο με φίλτρα Ultrafree 0,22 μm (MilliporeSigma, Burlington, ΜΑ, ΗΠΑ). Δέκα µL του διηθήματος επωάστηκαν για 24 ώρες με δέκα µL που περιείχαν 100 κονίδια M. robertsii ή M. brunneum και 20 µL 100 µg mL−1 αμπικιλλίνης για περαιτέρω αποφυγή βακτηριακής μόλυνσης. Οι έλεγχοι περιελάμβαναν 10 μL αποστειρωμένου νερού στη θέση του ακατέργαστου εκχυλίσματος. Δύο αντίγραφα για κάθε επωασμένο μίγμα απλώθηκαν σε άγαρ δεξτρόζης πατάτας (PDA) συμπληρωμένο με 50 μg mL−1 αμπικιλλίνη (60 mm τρυβλία Petri) και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι για 4-5 ημέρες. Η αντιμυκητιακή δράση μετρήθηκε συγκρίνοντας τις μονάδες σχηματισμού αποικιών (CFUs) σε επεξεργασίες ακατέργαστου εκχυλίσματος με μάρτυρες.

2.5. Στατιστική

Οι εκτιμήσεις Kaplan-Meier των μέσων χρόνων επιβίωσης χρησιμοποιήθηκαν για συγκρίσεις κατά ζεύγη επιβίωσης. Οι αναλογίες κινδύνου θανάτου (HRs) υπολογίστηκαν με ανάλυση παλινδρόμησης Cox. Χρησιμοποιήσαμε την παλινδρόμηση Cox για να διερευνήσουμε τις διαφορές στη θνησιμότητα μεταξύ ατόμων που εμφανίζουν LOM ή δεν παρουσιάζουν LOM ενώ ελέγχαμε για άλλες κατηγορικές μεταβλητές (θεραπεία ή έλεγχος μυκήτων, είδη μυκήτων, είδη τερμιτών, αποικία προέλευσης). Τα LOM κατηγοριοποιήθηκαν ως απόντα ή παρόντα σε άτομα λόγω της συχνότητας των ακραίων τιμών και της έλλειψης κανονικότητας. Στην ανάλυση επιβίωσης με ζεύγη τερμιτών και μονών τόνων, το HR βασίστηκε σε σύγκριση μεταξύ των ζευγών που υποβλήθηκαν σε αγωγή με κονίδια (που χωρίστηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία) και των μονών που υποβλήθηκαν σε αγωγή με κονίδια. Αυτά τα HR, επομένως, παρέχουν ένα μέτρο επιβίωσης που παρέχεται από κοινωνικούς μηχανισμούς άμυνας, ενώ ελέγχουν τους μεμονωμένους μηχανισμούς άμυνας. Η συσχέτιση μεταξύ του χρόνου που δαπανάται ως ζεύγος και της αλλαγής στο HR μετρήθηκε με συσχετίσεις Pearson. Η κατανομή των LOM μεταξύ διαφορετικών θεραπειών συγκρίθηκε με μια δοκιμή Kruskal–Wallis με διορθώσεις Bonferroni για πολλαπλές δοκιμές για συγκρίσεις ανά ζεύγη. Η μέση CFU ή η διάρκεια των συμβάντων αλλοπροσαρμογής συγκρίθηκαν με μια δοκιμή ANOVA με διορθώσεις Bonferroni για συγκρίσεις ανά ζεύγη. Χρησιμοποιήσαμε το IBM SPSS Statistics (έκδοση 28) για τις στατιστικές δοκιμές.

3. Αποτελέσματα

3.1. Survivorship και συναγερμός αμφισβητούμενων ομάδων των δώδεκα

The Cox regression model of survivorship that included categorical variables for fungal treatment, LOMs, termite species, fungi species, and a colony of origin was significant (Chi-square = 246.29, df = 12, p < 0.001). Challenged termites were 9.28 times more likely to die than untreated termites (Wald = 143.05, p < 0.001) while controlling for the other variables. Termites that displayed LOMs (n = 422) were 1.52 times more likely to survive (Wald = 8.30, p = 0.004) than individuals that did not display LOMs (n = 286). R. virginicus workers were 2.08 times more likely to die than R. flavipes workers (Wald = 6.31, p = 0.012). Fungal species did not contribute significantly to the model (Wald = 0.841, p = 0.359). The colony of origin contributed significantly to the model (Wald = 50.16, p < 0.001), which is consistent with previously reported colony variation in Reticulitermes resistance to Metarhizium infections [24]. Survivorship did not differ between the same colony when the experiment was repeated 3 months later with workers that were exposed to M. Roberts (Breslow pairwise comparison, Chi-square = 0.342, p = 0.559). Most deaths in the challenged termites were attributable to Metarhizium infection (>90% επιβεβαίωση). Για τους τερμίτες που προσβλήθηκαν με M. Roberts, παρατηρήθηκαν 129 θάνατοι μεταξύ 237 ατόμων και ο μέσος χρόνος επιβίωσης για το R. virginicus (9,10 ημέρες) ήταν σημαντικά χαμηλότερος από τον R. flavipes (10). 98 ημέρες)(Breslow=10.05, df=1, p=0.002) (Εικόνα 1). Για τους προσβεβλημένους τερμίτες με M. brunneum, παρατηρήθηκαν 79 θάνατοι μεταξύ 120 ατόμων και ο μέσος χρόνος επιβίωσης για το R. flavipes (9,70 ημέρες) ήταν χαμηλότερος από τον R. virginicus (10,68 ημέρες) αλλά όχι σημαντικά (Breslow=2 .74, df=1, p=0.098). Η κατανομή των LOM (Εικόνα 2) μεταξύ των θεραπειών μυκήτων και μαρτύρων ήταν σημαντικά διαφορετική (Kruskal–Wallis=176.897, df=5, p <0,001). Η συχνότητα των LOM δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ των θεραπειών με M. brunneum και των αντίστοιχων μαρτύρων τους για το R. flavipes (προσαρμοσμένο p=0.097) και το R. virginicus (προσαρμοσμένο p=1.000 ). Ωστόσο, η συχνότητα των LOM ήταν σημαντικά μεγαλύτερη για τις θεραπείες M. Roberts σε σύγκριση με τους αντίστοιχους ελέγχους για το R. flavipes (προσαρμοσμένο p < 0,001) και το R. virginicus (προσαρμοσμένο p < 0,001) (Εικόνα 2). Για τη θεραπεία με M. Roberts, η συχνότητα των LOM R. flavipes ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από την R. virginicus LOM (προσαρμοσμένη p <0,001). Ωστόσο, για τη θεραπεία M. brunneum, η συχνότητα των LOM του R. flavipes δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από τα LOM του R. virginicus (προσαρμοσμένη p=1.000). Σε αντίθεση με το M. brunneum, ομάδες 12 τερμιτών που προκλήθηκαν με κονίδια M. Roberts οδήγησαν σε σημαντική συμπεριφορά συμπεριφοράς.

3.2. Survivorship of Challengeed Pairs and Singletons

Η επιβίωση των ζευγών τερμιτών που χωρίστηκαν σε διαφορετικούς χρόνους λίγο μετά την πρόκληση του παθογόνου συγκρίθηκε με την επιβίωση των προσβεβλημένων μεμονωμένων τόνων με αναλογίες κινδύνου θανάτου (HRs). Ένα HR 1 αντιστοιχεί με ίση επιβίωση στα χωρισμένα ζευγάρια και τα μονότονα για δέκα ημέρες. Τιμές μικρότερες του ενός υποδεικνύουν ότι υπάρχει μειωμένη θνησιμότητα στα διαχωρισμένα ζευγάρια σε σύγκριση με τα μονότονα. Η συσχέτιση μεταξύ του χρόνου που δαπανήθηκε ως ζευγάρι και της μείωσης του HR ήταν σημαντική μόνο για τα R. flavipes που έλαβαν θεραπεία είτε με M. Roberts (r=−0.978, p=0.{ {7}}04) ή M. brunneum (r=−0.983, p=0.003), και όχι για το R. virginicus που υποβλήθηκε σε αγωγή με M. Roberts (r=−0.643, p=0.242) ή M. brunneum (r=−0.812, p=0.095). Αυτό αντανακλάται επίσης στις τιμές R2 από γραμμικές παλινδρομήσεις που φαίνονται στο Σχήμα 3 (ο χρόνος μετασχηματίστηκε λογαριθμικά για τον υπολογισμό των συσχετισμών Pearson και των τιμών R2). Δεν παρατηρήθηκε θάνατος σε ζεύγη που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία (6 ζεύγη για κάθε είδος τερμιτών) και ένας θάνατος στα 16 ζεύγη που υποβλήθηκαν σε θεραπεία (4 ζεύγη για κάθε συνδυασμό τερμιτών/μύκητων) που δεν διαχωρίστηκαν ποτέ σε διάστημα 10 ημερών.

Εικόνα 1. Επιβίωση για ομάδες των 12. Το Rf αντιστοιχεί με το R. flavipes, το Rv με το R. virginicus, το Mr με το M. robertsii και το Mb με το M. brunneum. Σημαντικές διαφορές επιβίωσης για συγκρίσεις ανά ζεύγη βασίστηκαν στις δοκιμές Breslow (γενικευμένες δοκιμές Wilcoxon). * Σημαντική διαφορά μεταξύ των θεραπειών, NS καμία σημαντική διαφορά μεταξύ των θεραπειών (σελ< 0.025 Bonferroni adjusted α). The distribution of LOMs (Figure 2) among fungal and control treatments was significantly different (Kruskal–Wallis = 176.897, df = 5, p < 0.001). The frequency of LOMs was not significantly different between M. brunneum treatments and their respective controls for R. flavipes (adjusted p = 0.097) and R. virginicus (adjusted p = 1.000). However, the frequency of LOMs was significantly greater for M. robertsii treatments compared to their respective controls for R. flavipes (adjusted p < 0.001) and R. virginicus (adjusted p < 0.001) (Figure 2). For the M. robertsii treatment, the frequency of R. flavipes LOMs was significantly greater than R. virginicus LOMs (adjusted p < 0.001). However, for the M. brunneum treatment, the frequency of R. flavipes LOMs was not significantly different from R. virginicus LOMs (adjusted p = 1.000). In contrast to M. brunneum, groups of 12 termites challenged with M. robertsii conidia resulted in a significant behavioral response. 

Εικόνα 1. Επιβίωση για ομάδες των 12. Το Rf αντιστοιχεί με το R. flavipes, το Rv με το R. virginicus, το Mr με το M. robertsii και το Mb με το M. brunneum. Σημαντικές διαφορές επιβίωσης για συγκρίσεις ανά ζεύγη βασίστηκαν στις δοκιμές Breslow (γενικευμένες δοκιμές Wilcoxon). * Σημαντική διαφορά μεταξύ των θεραπειών, NS καμία σημαντική διαφορά μεταξύ των θεραπειών (σελ< 0.025 Bonferroni adjusted α). For the survivorship of pathogen-challenged single termites (Figure 4), 47 deaths were observed among 48 individuals, and the mean survival time for R. flavipes (4.21 days) was significantly lower than for R. virginicus (6.17 days)(Breslow, chi-square = 33.927, df = 1, p < 0.001). This relationship held for both species of fungi: For M. robertsii exposure, the mean survival time for R. flavipes (4.25 days) was significantly lower than for R. virginicus (5.83 days) (chi-square = 16.133, df = 1, p < 0.001); For M. brunneum exposure, the mean survival time for R. flavipes (4.17 days) was significantly lower than for R. virginicus (6.50 days) (chi-square = 20.994, df = 1, p < 0.001). 3.3. Antifungal Activity of Crude Extracts The two species of fungi were analyzed separately (the viability of conidia on PDA differs between the two species). For M. robertsii, mean colony-forming units (CFUs) among fungal and control treatments were significantly different (F = 18.08, df = 2, p < 0.001) (Figure 5a). Crude extracts of R. virginicus but not R. flavipes workers showed significant antifungal activity against M. robertsii compared to the control (adjusted p < 0.001 and p = 1.000, respectively). The antifungal activity of R. virginicus extracts against M. robertsii was significantly greater than the antifungal activity of R. flavipes extracts against M. robertsii (adjusted p < 0.001). For M. brunneum, mean CFUs (Figure 5b) among fungal and control treatments were significantly different (F = 27.26, df = 2, p < 0.001). Crude extracts of R. virginicus but not R. flavipes showed significant antifungal activity against M. brunneum compared to the control (adjusted p < 0.001 and p = 0.072, respectively). The antifungal activity of R. virginicus extracts against M. brunneum was significantly greater than the antifungal activity of R. flavipes against M. brunneum (adjusted p < 0.001).

3.3. Αντιμυκητιακή δράση ακατέργαστων εκχυλισμάτων

Τα δύο είδη μυκήτων αναλύθηκαν χωριστά (η βιωσιμότητα των κονιδίων σε PDA διαφέρει μεταξύ των δύο ειδών). Για το M. robertsii, οι μέσες μονάδες σχηματισμού αποικιών (CFUs) μεταξύ των θεραπειών μυκήτων και μαρτύρων ήταν σημαντικά διαφορετικές (F=18.08, df=2, p < 0 .001) (Εικόνα 5α). Τα ακατέργαστα εκχυλίσματα του R. virginicus αλλά όχι των εργαζομένων του R. flavipes έδειξαν σημαντική αντιμυκητιακή δράση έναντι του M. robertsii σε σύγκριση με τον έλεγχο (προσαρμοσμένο p < 0.001 και p=1.{{{{ 10}}, αντίστοιχα). Η αντιμυκητιακή δράση των εκχυλισμάτων R. virginicus έναντι του M. robertsii ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από την αντιμυκητιακή δράση των εκχυλισμάτων R. flavipes έναντι του M. robertsii (προσαρμοσμένη p < 0,001). Για το M. brunneum, οι μέσες CFUs (Εικόνα 5β) μεταξύ των θεραπειών με μύκητες και ελέγχου ήταν σημαντικά διαφορετικές (F=27.26, df=2, p <0,001). Τα ακατέργαστα εκχυλίσματα του R. virginicus αλλά όχι του R. flavipes έδειξαν σημαντική αντιμυκητιακή δράση έναντι του M. brunneum σε σύγκριση με τον έλεγχο (προσαρμοσμένο p <0,001 και p=0,072, αντίστοιχα). Η αντιμυκητιακή δράση των εκχυλισμάτων R. virginicus έναντι του M. brunneum ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από την αντιμυκητιακή δράση του R. flavipes έναντι του M. brunneum (προσαρμοσμένη p < 0,001).

Εικόνα 2. Απόκριση συναγερμού σε πρόκληση μυκήτων. Τα τετραγωνίδια αντιπροσωπεύουν την κατανομή των LOM (τα LOM βαθμολογούνται σε 709 άτομα με σήμανση χρώματος). Τα κουτιά αντιστοιχούν στην απόσταση μεταξύ άνω και κάτω τεταρτημορίου από τη διάμεσο (IQR). Τα μουστάκια αντιστοιχούν με 1,5 × IQR. Οι κύκλοι και οι αστερίσκοι απεικονίζουν ακραίες τιμές πέρα ​​από 1,5 × IQR ή 3 × IQR, αντίστοιχα. Διαφορετικά γράμματα υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των κατανομών για θεραπείες μυκήτων και ελέγχου (προσαρμοσμένο Bonferroni). Το Rf αντιστοιχεί με το R. flavipes, το Rv με το R. virginicus, το Mr με το M. robertsii και το Mb με το M. brunneum.

3.4. Allogrooming μεταξύ των Προκλημένων Ζευγών

Η συχνότητα των περιόδων αλλοίωσης μειώθηκε σημαντικά με τις προκλήσεις με μύκητες (μέση πρόκληση {{0}}.55, μέσος όρος ελέγχου=8.80, t=−4.461, p < {{20}}.001). Ωστόσο, η μέση διάρκεια αλλοπροσαρμογής αυξήθηκε σημαντικά με τις μυκητιακές προκλήσεις (μέσος όρος πρόκλησης=19.01 s, μέσος όρος ελέγχου=5.62 s, t=4.876, p <0.001). Η διάρκεια των περιόδων αλλοπροσαρμογής για κάθε αλληλεπίδραση μεταξύ ζευγών τερμιτών διέφερε σημαντικά μεταξύ των θεραπειών και των μαρτύρων (F=7.166, df=5, p <0,001) (Εικόνα 6). Η διάρκεια αλλοπροσαρμογής ανά συμβάν ήταν σημαντικά αυξημένη στα ζεύγη R. flavipes που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με M. robertsii (προσαρμοσμένο p < 0,001) ή M. brunneum (προσαρμοσμένο p=0,037) σε σχέση με τους ελέγχους, αλλά όχι στα ζεύγη R. virginicus που έλαβαν θεραπεία με M. robertsii (προσαρμοσμένο p=1.000) ή M. brunneum (προσαρμοσμένο p=1.000) σε σχέση με τα στοιχεία ελέγχου.

Εικόνα 3. Η επιβίωση δύο τερμιτών έναντι ενός συγκρίθηκε με αναλογίες κινδύνου θανάτου (n=80 ζεύγη, 96 μονότονα). Το Rf αντιστοιχεί με το R. flavipes, το Rv με το R. virginicus, το Mr με το M. robertsii και το Mb με το M. brunneum. Ο χρόνος μετασχηματίστηκε log για τον υπολογισμό των τιμών R2.

Εικόνα 4. Επιβίωση μεμονωμένων τερμιτών μετά από πρόκληση μυκήτων (n=96). Το Rf αντιστοιχεί με το R. flavipes, το Rv με το R. virginicus, το Mr με το M. robertsii και το Mb με το M. brunneum. Δείτε το κείμενο για λεπτομέρειες σχετικά με τις στατιστικές διαφορές μεταξύ των θεραπειών. Σημαντικές διαφορές επιβίωσης για συγκρίσεις ανά ζεύγη βασίστηκαν στις δοκιμές Breslow (γενικευμένες δοκιμές Wilcoxon). * Σημαντική διαφορά μεταξύ των θεραπειών (p < 0.025 Προσαρμοσμένη Bonferroni ).

Εικόνα 5. Αντιμυκητιακή δράση ακατέργαστου εκχυλίσματος έναντι του M. robertsii (a) και του M. brunneum (b). Οι τιμές πάνω από τις ράβδους αντιπροσωπεύουν τις μέσες τιμές CFU (±SD) και τα διαφορετικά γράμματα υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές (προσαρμοσμένο Bonferroni). Το Rf αντιστοιχεί με το R. flavipes και το Rv με το R. virginicus. Η ανάλυση χρησιμοποίησε δύο αντίγραφα από 5 αποικίες από κάθε είδος τερμιτών, 6 επαναλήψεις για τον έλεγχο Rf και 2 επαναλήψεις για τον έλεγχο Rv.

Σχήμα 6. Διάρκεια αλλοπροσαρμογής ανά αλληλεπίδραση (n=161 συμβάντα αλλοπροσαρμογής). Οι τιμές πάνω από τις γραμμές αντιπροσωπεύουν τη μέση διάρκεια των αλληλεπιδράσεων αλλοπροσαρμογής (±SD) και οι διακριτοί συνδυασμοί γραμμάτων υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές (προσαρμοσμένο Bonferroni). Το Rf αντιστοιχεί με το R. flavipes, το Rv με το R. virginicus, το Mr με το M. robertsii και το Mb με το M. brunneum.

4. Συζήτηση

Το R. flavipes βασίζεται σε κοινωνικούς μηχανισμούς άμυνας έναντι των τοπικών παθογόνων μυκήτων σε μεγαλύτερο βαθμό από το R. virginicus. Για τους εργάτες του R. flavipes που προσβλήθηκαν με οποιοδήποτε από τα είδη Metarhizium, υπήρχε ισχυρή αρνητική συσχέτιση μεταξύ του χρόνου που πέρασαν δύο τερμίτες μαζί και της πιθανότητας θανάτου τους σε σχέση με τους προσβεβλημένους μεμονωμένους τερμίτες. Η αναλογία κινδύνου θανάτου σε σχέση με τους προσβεβλημένους μεμονωμένους τερμίτες μειώθηκε στο μισό σε περίπου δύο ώρες (Εικόνα 3). Ως εκ τούτου, οι πρώιμες κοινωνικές αλληλεπιδράσεις φαίνεται να είναι κρίσιμες για την επιβίωση όταν οι εργαζόμενοι στο R. flavipes αντιμετωπίζουν χαμηλές συγκεντρώσεις κονιδίων Metarhizium. Αντίθετα, οι εργάτες του R. virginicus έδειξαν ασθενή συσχέτιση μεταξύ του χρόνου που πέρασαν δύο τερμίτες μαζί και της πιθανότητας θανάτου τους. Επίσης, σε αντίθεση με το R. virginicus, τα ζεύγη εργαζομένων R. flavipes αύξησαν σημαντικά τη διάρκεια των περιπτώσεων αλλοπροστασίας μετά από πρόκληση μυκήτων (Εικόνα 6). Η ανίχνευση κονιδίων στην επιδερμίδα των φωλιών είναι πιθανό να έχει οδηγήσει σε αυτήν την αύξηση. Η πιο αποτελεσματική αφαίρεση των κονιδίων από τις επιφάνειες της επιδερμίδας αυξάνοντας τη διάρκεια των περιόδων αλλοπροστασίας φαίνεται να ευθύνεται για την ανώτερη κοινωνική ανοσία του R. flavipes. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν επίσης ότι το R. virginicus βασίζεται σε μεμονωμένους έμφυτους μηχανισμούς άμυνας έναντι τοπικών παθογόνων μυκήτων σε μεγαλύτερο βαθμό από το R. flavipes. Η θνησιμότητα των μεμονωμένων εργαζομένων R. flavipes που προσβλήθηκαν με οποιοδήποτε από τα είδη Metarhizium ήταν σημαντικά υψηλότερη από τη θνησιμότητα των εργαζομένων R. virginicus (Εικόνα 4). Η αντιμυκητιασική δράση του R. virginicus worker cuticular washes έναντι των κονιδίων Metarhizium έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι σημαντικά ισχυρότερη από τη δραστηριότητα των εργαζομένων R. flavipes [20]. Η αντιμυκητιακή δράση των ακατέργαστων εκχυλισμάτων ολόκληρων τερμιτών ήταν επίσης ισχυρότερη στο R. virginicus από ότι στο R. flavipes (Εικόνα 5). Αυτά τα εκχυλίσματα περιλαμβάνουν ενώσεις από εντερικές συμβιώσεις, οι οποίες, μαζί με αντιμυκητιασικές ενώσεις τερμιτών, μπορεί επίσης να συμβάλλουν στην εξάλειψη των κονιδίων που έχουν καταποθεί [26]. Η διακύμανση των αναλογιών κινδύνου θανάτου και η ασθενής συσχέτισή τους με τους χρόνους αποχωρισμού στους εργαζομένους του R. virginicus συνάδει με μια μεγαλύτερη εξάρτηση από τους έμφυτους αμυντικούς μηχανισμούς του ανοσοποιητικού που ποικίλλουν μεταξύ των ατόμων παρά στους κοινωνικούς ανοσοποιητικούς μηχανισμούς. Το R. flavipes έδειξε επίσης μεγαλύτερη εξάρτηση από την κοινωνική ανοσία όταν ομάδες 12 εργαζομένων εκτέθηκαν για λίγο σε υψηλές συγκεντρώσεις κονιδίων M. robertsii. Αμέσως μετά την έκθεση στο M. robertsii conidia, και τα δύο είδη τερμιτών εμφάνισαν αυξημένα LOM. Αυτή η δραστηριότητα συναγερμού ήταν σημαντικά υψηλότερη στο R. flavipes από ότι στο R. virginicus (Εικόνα 2), και η αντίσταση σε θανατηφόρες λοιμώξεις ήταν επίσης σημαντικά υψηλότερη στο R. flavipes από ότι στο R. virginicus (Εικόνα 1). Αντίθετα, υπήρξε αυξημένη αλλά ασθενής απόκριση συναγερμού στα κονίδια M. brunneum. Σε συμφωνία με αυτό το αποτέλεσμα, έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι ο αυξημένος συναγερμός στο R. flavipes ως απόκριση στα κονίδια διαφορετικών στελεχών και ειδών Metarhizium συσχετίζεται με αυξημένη αλλοπρόσαλψη και επιβίωση [23]. Οι εργαζόμενοι του R. flavipes μπορεί να έχουν χαμηλότερο όριο από τους εργαζόμενους του R. virginicus για αναγνώριση και συλλογική και αποτελεσματική απόκριση στην επιδερμιδική μόλυνση με κονίδια M. robertsii. Το M. robertsii, το οποίο είναι το πιο διαδεδομένο είδος Metarhizium στην περιοχή μελέτης μας [24], μπορεί να αντιπροσωπεύει μια απειλή για το R. flavipes που απαιτεί ισχυρή κοινωνική ανοσολογική απόκριση επειδή αυτός ο τερμίτης έχει σχετικά αδύναμη έμφυτη ανοσολογική άμυνα εναντίον του. Η αποτελεσματικότητα των αντιμυκητιασικών ενώσεων που σχετίζονται με τις εκκρίσεις των σιελογόνων αδένων είναι πιθανό να είναι απαραίτητη για τις ατομικές άμυνες που παρατηρήθηκαν σε αυτή τη μελέτη [20]. Αυτές οι ενώσεις είναι παρούσες στην επιφάνεια των εργαζομένων πριν από μυκητιακές προκλήσεις, καθώς εκφράζονται συστατικά και διαδίδονται συνεχώς από βασικά επίπεδα αλλοπροσαρμογής, η οποία επομένως ενσωματώνει ατομικές και κοινωνικές άμυνες. Αυτό το gestalt πιθανότατα περιλαμβάνει το μικρό αντιμυκητιασικό πεπτίδιο τερμικίνη που μοιάζει με ντεφενσίνη, το οποίο εκκρίνεται στον σιελογόνο αδένα και είναι εξαιρετικά σημαντικό για την άμυνα έναντι θανατηφόρων λοιμώξεων από το Metarhizium [27]. Μια μελέτη των R. flavipes και R. virginicus από την ίδια τοποθεσία συλλογής στο Μέριλαντ που χρησιμοποιήθηκε σε αυτήν τη μελέτη αποκάλυψε ότι τα τερμιτσίνια αντιμετώπισαν πρόσφατα μια επιλεκτική σάρωση που είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του πολυμορφισμού των νουκλεοτιδίων και αυτή η μείωση ήταν μεγαλύτερη στο R. flavipes από το R. virginicus [28].

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Η σάρωση μπορεί να ήταν και πιθανώς συνεχίζει να είναι πιο σοβαρή για το R. flavipes επειδή το R. virginicus έχει πιο αποτελεσματικούς έμφυτους ανοσοποιητικούς μηχανισμούς που μείωσαν την εξάρτησή του από τερμιξίνες για άμυνα έναντι μιας πρόσφατης επιδημίας μυκήτων. Εναλλακτικά, οι προσαρμοστικοί περιορισμοί στην εξέλιξη των τερμιτών (έλλειψη γενετικής παραλλαγής) μπορεί να έχουν αφήσει τους R. flavipes με πιο αδύναμα όπλα μπροστά σε μια νέα επιδημία μυκήτων. Ο περιορισμός στην προσαρμοστική αλλαγή στις τερμικίνες υπό ισχυρή επιλεκτική πίεση είναι επίσης εμφανής στο αυστραλιανό Nasutitermes [29]. Η στοχαστική διαδικασία του διπλασιασμού των γονιδίων φαίνεται να απελευθέρωσε αυτόν τον περιορισμό σε διαφορετικές ρινικές γενεές, γεγονός που είχε ως αποτέλεσμα την επαναλαμβανόμενη εξέλιξη δύο τερμικινών με διαφορετικά μοριακά φορτία. Αυτό μπορεί να έχει ωφελήσει την αντιμυκητιασική άμυνα επειδή δύο τερματικά με διαφορετικές ιδιότητες φορτίου περιορίζουν τις ευκαιρίες για την εξέλιξη της μυκητιακής αντοχής σε αυτά. Οι τερμίτες που εμφανίζουν συναγερμό (LOMs) μετά από έκθεση σε υψηλή δόση κονιδίων είχαν λιγότερες πιθανότητες να πεθάνουν σε διάστημα δύο εβδομάδων από τα άτομα που δεν έδειχναν συναγερμό. Τα LOM συσχετίζονται θετικά με τη συνάθροιση εργαζομένων του R. flavipes [23], γεγονός που υποδηλώνει ότι τα άτομα που εμφανίζουν συναγερμό σε αυτή τη μελέτη ζήτησαν περισσότερη περιποίηση από τους συντρόφους. Τα LOM σπάνια αναφέρονται στην έρευνα που διερευνά τις λοιμώξεις από Metarhizium στους τερμίτες και έχει απορριφθεί ότι παίζουν ρόλο στη σηματοδότηση της έκθεσης στα παθογόνα [30]. Ωστόσο, μπορεί να παραλείπονται επειδή δεν εμφανίζονται σε μεμονωμένα άτομα, δεν προκαλούνται ουσιαστικά από ορισμένα στελέχη και είδη Metarhizium, χρειάζονται περίπου 3 λεπτά μετά από μια πρόκληση προτού κλιμακωθούν και υποχωρούν μετά από περίπου 30 λεπτά [22,23]. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι τα LOM επικοινωνούν μια ειδοποίηση έκτακτης ανάγκης μετά από έκθεση σε υψηλή δόση κονιδίων, τα οποία ανιχνεύονται κατά την αλλοπροσπάθεια. Ωστόσο, οι LOM δεν είναι απαραίτητες για μια προληπτική συμπεριφορική απόκριση, καθώς η διάρκεια του allogrooming αυξήθηκε μετά από έκθεση σε χαμηλή δόση όταν τα LOM ήταν αμελητέα.

5. Συμπεράσματα

Τα LOM φαίνεται να αποτελούν μέρος μιας επείγουσας απόκρισης σε βαριά επιδερμιδική μόλυνση που χρησιμοποιεί δικτυωμένη επικοινωνία για να κλιμακώσει γρήγορα την απομάκρυνση και την καταστροφή των περισσότερων κονιδίων προτού έχουν την ευκαιρία να προσκολληθούν σταθερά και να βλαστήσουν, κάτι που διαρκεί περίπου 12 ώρες [31]. Αυτή η απόκριση έκτακτης ανάγκης είναι πιθανό να είναι ενεργειακά δαπανηρή. Η ενισχυμένη κοινωνική ανοσία στο R. flavipes ως απόκριση στο M. robertsii μπορεί να είναι μια προσαρμοστική αντιστάθμιση που το R. virginicus δεν χρειάζεται να κάνει στον ίδιο βαθμό επειδή έχει πιο αποτελεσματικούς έμφυτους ανοσοποιητικούς μηχανισμούς. Όταν έρχονται αντιμέτωποι με χαμηλά επίπεδα έκθεσης σε παθογόνα που πρέπει να αντέχουν οι εργαζόμενοι που αναζητούν τροφή, το allogrooming φαίνεται επίσης να αντισταθμίζει τους αδύναμους έμφυτους ανοσοποιητικούς μηχανισμούς.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Cremer, S.; Τραβήξτε, CD; Fuerst, MA Κοινωνική ανοσία: Εμφάνιση και εξέλιξη της προστασίας από ασθένειες σε επίπεδο αποικίας. Annu. Rev. Entomol. 2018, 63, 105–123. [CrossRef] [PubMed] 2. Cremer, S.; Armitage, SA; Schmid-Hempel, P. Κοινωνική ανοσία. Curr. Biol. 2007, 17, R693–R702. [CrossRef] [PubMed]

3. Evans, JD; Aronstein, Κ.; Chen, YP; Hetru, C.; Imler, JL; Jiang, Η.; Kanost, Μ.; Thompson, GJ; Ζου, Ζ.; Hultmark, D. Ανοσοποιητικά μονοπάτια και αμυντικοί μηχανισμοί σε μέλισσες Apis mellifera. Εντόμου ΜοΙ. Biol. 2006, 15, 645–656. [CrossRef] [PubMed]

4. Harpur, BA; Zayed, A. Επιταχυνόμενη εξέλιξη πρωτεϊνών έμφυτης ανοσίας σε κοινωνικά έντομα: Προσαρμοστική εξέλιξη ή χαλαρός περιορισμός; ΜοΙ. Biol. Evol. 2013, 30, 1665–1674. [CrossRef] [PubMed]

5. Αυτός, S.; Sieksmeyer, Τ.; Che, Υ.; Mora, MAE; Stiblik, Ρ.; Banasiak, R.; Harrison, MC; Šobotník, J.; Wang, Ζ.; Johnston, PR; et al. Στοιχεία για μειωμένη γονιδιακή ποικιλομορφία και δραστηριότητα του ανοσοποιητικού κατά την εξέλιξη των τερμιτών. Proc. R. Soc. Ser. B 2021, 288, 20203168. [CrossRef]

6. Bulmer, MS; Stefano, AM Τερμιτική ευκοινωνικότητα και αντίθετη επιλεκτική πίεση στην κοινωνική και έμφυτη ανοσία. Συμπεριφορά. Ecol. Sociobiol. 2022, 76, 1–12. [CrossRef]

7. Yanagawa, Α.; Shimizu, S. Αντίσταση του τερμίτη, Coptotermes formosanus Shiraki έως Metarhizium anisopliae λόγω περιποίησης. BioControl 2007, 52, 75–85. [CrossRef]

8. Rosengaus, RB; Traniello, JF; Bulmer, MS Οικολογία, συμπεριφορά και εξέλιξη της αντοχής σε ασθένειες στους τερμίτες. In Biology of Termites: A Modern Synthesis; Bignell, DE, Roisin, Υ., Lo, Ν., Eds.; Springer: Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο, 2011; σελ. 165–192.

9. Zhukovskaya, Μ.; Yanagawa, Α.; Forschler, BT Η συμπεριφορά καλλωπισμού ως μηχανισμός άμυνας από τις ασθένειες των εντόμων. Insects 2013, 4, 609–630. [CrossRef]

10. Milner, RJ Επιλογή και χαρακτηρισμός στελεχών Metarhizium anisopliae για τον έλεγχο των εντόμων του εδάφους στην Αυστραλία. Στο Βιολογικό Έλεγχο Ακρίδων και Ακρίδων. Lomer, CJ, Prior, C., Eds.; CAB International: Wallingford, UK, 1991; σελ. 200–207.

11. Traniello, JF; Leuthold, RH Συμπεριφορά και οικολογία της αναζήτησης τροφής στους τερμίτες. Στους Τερμίτες: Εξέλιξη, Κοινωνικότητα, Συμβιώσεις, Οικολογία. Abe, Τ., Bignell, DE, Higashi, Μ., Higashi, Τ., Abe, Υ., Eds.; Springer: Dordrecht, Ολλανδία, 2000; σελ. 141–168.

12. Vargo, Ε.; Husseneder, C. Biology of subterranean Termites: Insights from molecular studies of Reticulitermes and Coptotermes. Annu. Rev. Entomol. 2009, 54, 379-403. [CrossRef]

13. Abe, T. Εξέλιξη τύπων ζωής στους τερμίτες. Στην Εξέλιξη και Συνπροσαρμογή στις Βιοτικές Κοινότητες. Kowana, S., Connell, JH, Hidaka, Τ., Eds.; University of Tokyo Press: Τόκιο, Ιαπωνία, 1987; σελ. 128–148.

14. Shellman-Reeve, JS Το φάσμα της ευκοινωνικότητας στους τερμίτες. Στο The Evolution of Social Behavior in Insects and Arachnids; Choe, JC, Crespi, BJ, Eds.; Cambridge University Press: Cambridge, UK, 1997; σελ. 52–93.

15. Griffiths, HM; Eggleton, Ρ.; Hemming-Schroeder, Ν.; Swinfield, Τ.; Woon, JS; Allison, SD; Coomes, DA; Ashton, LA; Parr, CL Ροή άνθρακα και δυναμική δασών: Αυξημένη αποσύνθεση νεκρού ξύλου σε κενά θόλου τροπικών δασών-πτώσεων δέντρων. Glob. Chang. Biol. 2001, 27, 1601–1613. [CrossRef]

16. Guo, C.; Tuo, Β.; Ci, Η.; Yan, ER; Cornelissen, JH Dynamic ανατροφοδοτήσεις μεταξύ λειτουργικών χαρακτηριστικών δέντρων, πληθυσμών τερμιτών και κύκλου εργασιών νεκρού ξύλου. J. Ecol. 2021, 109, 578–1590. [CrossRef]

17. Zanne, AE; Flores-Moreno, Η.; Powell, JR; Cornwell, WK; Dalling, JW; Austin, AT; Classen, AT; Eggleton, Ρ.; Okada, KI; Parr, CL; et al. Η ευαισθησία των τερμιτών στη θερμοκρασία επηρεάζει τους παγκόσμιους ρυθμούς αποσύνθεσης του ξύλου. Science 2022, 377, 1440–1444. [CrossRef] [PubMed]

18. Liu, L.; Wang, W.; Liu, Υ.; Sun, Ρ.; Lei, C.; Huang, Q. Η επίδραση της συμπεριφοράς αλλοπροσαρμογής στην ατομική έμφυτη ανοσία στον υπόγειο τερμίτη Reticulitermes chinensis (Isoptera: Rhinotermitidae). J. Insect Sci. 2019, 19, 6. [CrossRef] [PubMed]

19. Polizzi, JM; Forschler, BT Ενδο-και ενδοειδικός αγωνιστισμός σε Reticulitermes flavipes (Kollar) και R. virginicus (Banks) και επιδράσεις του μεγέθους της αρένας και της ομάδας σε εργαστηριακούς προσδιορισμούς. Insectes Sociaux 1998, 45, 43-49. [CrossRef]

20. Hamilton, C.; Lay, F.; Bulmer, MS Υπόγειοι τερμιτικοί προφυλακτικές εκκρίσεις και εξωτερική αντιμυκητιακή άμυνα. J. Insect Physiol. 2011, 57, 1259–1266. [CrossRef]

21. Rosengaus, RB; Jordan, C.; Lefebvre, ML; Traniello, Συμπεριφορά συναγερμού παθογόνου JFA σε τερμίτη: Μια νέα μορφή επικοινωνίας στα κοινωνικά έντομα. Sci. Nat. 1999, 86, 544–548. [CrossRef]

22. Συναγερμός Myles, TG, συσσωμάτωση και άμυνα από Reticulitermes flavipes σε απόκριση σε μια φυσική απομόνωση Metarhizium anisopliae. Sociobiology 2002, 40, 243–256.

23. Bulmer, MS; Franco, BA; Πεδία, EG Υπόγειος τερμιτικός κοινωνικός συναγερμός και υγιεινές αντιδράσεις σε μυκητιακά παθογόνα. Insects 2019, 10, 240. [CrossRef]

24. Denier, D.; Bulmer, MS Παραλλαγή στην ευαισθησία των υπόγειων τερμιτών σε θανατηφόρες λοιμώξεις από τοπικά εδάφη απομόνωσης Metarhizium. Insectes Sociaux 2015, 62, 219-226. [CrossRef]

25. Bischoff, JF; Rehner, SA; Humber, RA Μια πολύτοπη φυλογένεση της γενεαλογίας Metarhizium anisopliae. Mycologia 2018, 101, 512–530. [CrossRef]

26. Rosengaus, RB; Schultheis, KF; Yalonetskaya, Α.; Bulmer, MS; DuComb, WS; Benson, RW; Thottam, JP; Godoy-Carter, V. Symbiont-derived -1, 3-glucanases in a social insect: Mutualism πέρα ​​από τη διατροφή. Εμπρός. Microbiol. 2014, 5, 607. [CrossRef] [PubMed]

27. Hamilton, C.; Bulmer, MS Μοριακές αντιμυκητιακές άμυνες σε υπόγειους τερμίτες: Η παρεμβολή RNA αποκαλύπτει in vivo ρόλους του άκρου και των GNBP έναντι ενός παθογόνου που συναντάται φυσικά. Dev. Comp. Immunol. 2012, 36, 372-377. [CrossRef] [PubMed]

28. Bulmer, MS; Lay, F.; Hamilton, C. Προσαρμοστική εξέλιξη σε υπόγεια αντιμυκητιακά πεπτίδια τερμιτών. Εντόμου ΜοΙ. Biol. 2010, 19, 669-674. [CrossRef] [PubMed]

29. Bulmer, MS; Crozier, RH Διπλασιασμός και διαφοροποιητική επιλογή μεταξύ των αντιμυκητιασικών πεπτιδίων τερμιτών. ΜοΙ. Biol. Evol. 2004, 21, 2256–2264. [CrossRef]

30. Moran, MN; Aguero, CM; Eyer, PA; Vargo, EL Στρατηγική διάσωσης σε τερμίτη: Εργαζόμενοι που εκτίθενται σε μυκητιακό παθογόνο επανενσωματώνονται στην αποικία. Εμπρός. Ecol. Evol. 2022, 10, 840223. [CrossRef]

31. Davis, HE; Meconcelli, S.; Radek, R.; McMahon, DP Οι τερμίτες διαμορφώνουν τη συλλογική τους συμπεριφορά συμπεριφοράς με βάση το στάδιο της μόλυνσης. Sci. Απ. 2018, 8, 14433. [CrossRef]