Περίληψη

Cistanche tubulosa(Schenk) Το Wight, ένα πολύτιμο ομόλογο βότανο τροφίμων-φαρμάκων από την οικογένεια Orobanchaceae, καλλιεργείται ευρέως στο νότιο Xinjiang της Κίνας. Τα κύρια βιοενεργά φαινυλαιθανοειδή γλυκοσιδικά συστατικά του,εχινακοσίδηκαιακτεοσίδη (βερμπασκοσίδη), παρέχει πολλαπλές φαρμακολογικές δραστηριότητες, συμπεριλαμβανομένης της αντιοξειδωτικής, αντιφλεγμονώδους και ανοσολογικής ρύθμισης. Οι μη τυποποιημένες παραδοσιακές διαδικασίες επεξεργασίας συχνά προκαλούν σημαντικές απώλειες αυτών των βασικών δραστικών ενώσεων, περιορίζοντας τη φαρμακευτική και λειτουργική εφαρμογή στα τρόφιμαCistanche tubulosaκομμάτια αφέψημα. Αυτή η έρευνα είχε στόχο να βελτιστοποιήσει τις σύγχρονες παραμέτρους επεξεργασίας για φρέσκοCistanche tubulosaφέτες για τη μεγιστοποίηση της ανάκτησης της ακτεοσίδης και της εχινακοσίδης και για περαιτέρω αποσαφήνιση της αντιοξειδωτικής καταπόνησης και της αντιφλεγμονώδους βιοδραστικότητας καθώς και του υποκείμενου μοριακού μηχανισμού βέλτιστα επεξεργασμένων τεμαχίων αφέψημα σε κυτταρικό επίπεδο.

Πραγματοποιήθηκαν πειράματα ενός παράγοντα για την εξέταση κατάλληλων περιοχών για το πάχος της φέτας, τη διάρκεια στον ατμό και τη θερμοκρασία στεγνώματος σε φούρνο. Μια μεθοδολογία τριών παραγόντων τριών επιπέδων Box-Behnken-επιφάνειας απόκρισης υιοθετήθηκε για τη δημιουργία μοντέλων αλληλεπίδρασης πολλών παραγόντων, χρησιμοποιώντας την περιεκτικότητα σε ακτεοσίδη και εχινακοσίδη ως δείκτες διπλής αξιολόγησης. Στη συνέχεια, κατασκευάστηκε μοντέλο κυττάρων μακροφάγου ποντικού RAW264.7 που διεγείρεται από λιποπολυσακχαρίτες (LPS) για να προσομοιώνει την υπεροξείδωση των λιπιδίων και την οξεία φλεγμονώδη βλάβη. Μια σειρά βιοχημικών δοκιμασιών, συμπεριλαμβανομένων των MTT, ανίχνευσης φθορισμού ROS, ELISA και Western blot εφαρμόστηκαν για την αξιολόγηση της ισχύος του αντιοξειδωτικού στρες και τη διερεύνηση των οδών μετάδοσης σήματος.

Σύμφωνα με πειραματικά αποτελέσματα, οι βέλτιστες παράμετροι επεξεργασίας προσδιορίστηκαν ως πάχος φέτας 0,6 cm, επεξεργασία με ατμό για 6 λεπτά και θερμοκρασία ξήρανσης ρυθμισμένη στους 57 βαθμούς. Κάτω από αυτήν την πρακτική συνθήκη επεξεργασίας, οι μετρούμενες περιεκτικότητες σε ακτεοσίδη και εχινακοσίδη έφθασαν το 7,25 % και το 31,62 % αντίστοιχα, παρουσιάζοντας καλή συνέπεια με τις θεωρητικές τιμές πρόβλεψης. Οι κυτταρικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι επεξεργάστηκε βέλτισταCistanche tubulosaΤα εκχυλίσματα από αφέψημα μείωσαν σημαντικά τις συγκεντρώσεις μονοξειδίου του αζώτου (NO) και μηλονοδιαλδεΰδης (MDA) σε μακροφάγους RAW264.7 που προκλήθηκαν με LPS. Εν τω μεταξύ, αύξησε σημαντικά τις ενδοκυτταρικές αντιοξειδωτικές ενζυμικές δραστηριότητες της υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD), της καταλάσης (CAT), της γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH), μαζί με την αυξημένη περιεκτικότητα σε γλουταθειόνη (GSH). Τα επίπεδα έκκρισης των προφλεγμονωδών μεσολαβητών συμπεριλαμβανομένων των TNF-, IL-1 και IL-6 καταστέλλονταν επίσης με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Η ανίχνευση Western-blot το επικύρωσεCistanche tubulosaεκχυλίσματα περιόρισε την υπερβολική φωσφορυλίωση πρωτεϊνών-κλειδιά εντός των καταρράξεων σηματοδότησης p38/AKT/JNK/NF-κB.

Συνοπτικά, αυτό το βελτιστοποιημένο σύγχρονο πρωτόκολλο επεξεργασίας βελτιώνει αποτελεσματικά τις αποδόσεις των χαρακτηριστικών φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων (ακτεοσίδη και εχινακοσίδη)Cistanche tubulosaκομμάτια αφέψημα. Το επεξεργασμένο φυτικό υλικό ασκεί εξέχοντα αντιοξειδωτικό στρες και αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα στο μοντέλο τραυματισμού μακροφάγων που προκαλείται από LPS, του οποίου ο φαρμακολογικός μηχανισμός υλοποιείται εν μέρει μέσω της αναστολής της υπερενεργοποίησης του άξονα φλεγμονώδους σηματοδότησης p38/AKT/JNK/NF-κB. Αυτή η εργασία παρέχει αξιόπιστες τεχνικές παραμέτρους για τυποποιημένη βιομηχανική παραγωγή και παρέχει πειραματική υποστήριξη για την ανάπτυξη αντιοξειδωτικών λειτουργικών τροφίμων που προέρχονται απόCistanche tubulosa.

Λέξεις-κλειδιά: Cistanche tubulosa; τεχνολογία επεξεργασίας τεμαχίων αφεψήματος. ακτεοσίδη; εχινακοσίδη; αντιοξειδωτικό στρες· RAW264.7 μακροφάγοι; Διαδρομή σηματοδότησης p38/AKT/JNK/NF‑κB

1. Εισαγωγή

Cistanche tubulosa(Schenk) Το Wight ανήκει στην οικογένεια Orobanchaceae και το σαρκώδες φολιδωτό στέλεχος του είναι το επίσημο φαρμακευτικό μέρος. Αυτό το φαρμακευτικό φυτό της ερήμου φυτεύεται σε μεγάλο βαθμό στο άνυδρο νότιο Xinjiang της Κίνας. Στην παραδοσιακή κινεζική πρακτική με βότανα,Cistanche tubulosaχρησιμεύει ως ένα κλασικό τονωτικό βότανο με τεκμηριωμένες θεραπευτικές λειτουργίες τόνωσης των νεφρών-yang, αναπλήρωσης του ουσιώδους αίματος και χαλάρωσης της κινητικότητας του εντέρου. Κλινικά εφαρμόζεται για την ανακούφιση του πόνου-αδυναμίας του οσφυϊκού και των γονάτων, της στειρότητας που προκαλείται από ανεπάρκεια των νεφρών και της εντερικής ξηρότητας που προκαλείται από δυσκοιλιότητα维普期刊.

Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες αντιπροσωπεύουν τους πιο κρίσιμους βιοενεργούς δείκτεςCistanche tubulosa. Η Κινεζική Φαρμακοποιία ορίζει ότι η συνολική περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη συν ακτεοσίδη δεν πρέπει να είναι μικρότερη από 1,50 % για πιστοποιημένα φαρμακευτικά υλικά. Ωστόσο, η τρέχουσα κύρια παραγωγή τουCistanche tubulosaΤα κομμάτια αφεψήματος εξακολουθούν να ακολουθούν ως επί το πλείστον αρχαίες χειρωνακτικές ροές εργασίας: μούλιασμα φρέσκου ωμού βοτάνου, σχολαστική υγρασία, τεμαχισμός και φυσικό στέγνωμα ή επεξεργασία κρασιού στον ατμό. Αυτές οι συμβατικές προσεγγίσεις δεν διαθέτουν ακριβείς ποσοτικές τεχνικές προδιαγραφές. Η θερμική αστάθεια των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών οδηγεί συχνά σε σοβαρή αποικοδόμηση του δραστικού συστατικού κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας, η οποία μειώνει την ποιότητα του τελικού προϊόντος και περιορίζει τη μεγάλης κλίμακας παραγωγή υψηλής ποιότητας. Επί του παρόντος, μόνο περιορισμένη έρευνα συνδυάζει ταυτόχρονα τη βελτιστοποίηση της τεχνολογίας επεξεργασίας με την επικύρωση βιολογικής δραστηριότητας. οι περισσότερες μελέτες απλώς ανιχνεύουν περιεχόμενα χημικών συστατικών χωρίς κυτταρική λειτουργική επαλήθευση, δημιουργώντας κενά για βιομηχανικό μετασχηματισμόGoogle για....

Το οξειδωτικό στρες δρα ως βασικός παθολογικός παράγοντας για πολλαπλές χρόνιες μεταβολικές και φλεγμονώδεις ασθένειες. Η υπερβολική συσσώρευση ειδών αντιδραστικού οξυγόνου (ROS) διαταράσσει την οξειδοαναγωγική ομοιόσταση, προκαλώντας περαιτέρω υπερενεργοποίηση μακροφάγων και μαζική απελευθέρωση προφλεγμονώδους κυτοκίνης, σχηματίζοντας έναν φαύλο κύκλο μεταξύ οξείδωσης και φλεγμονής. Οι υπάρχουσες φαρμακολογικές έρευνες το έχουν αποδείξειCistancheΟι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες προέλευσης διαθέτουν αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες. Προηγούμενα πειράματα σε ζώα το έδειξαν αυτόCistanche tubulosaΟι ολικές γλυκοσίδες βελτίωσαν την ηπατική βλάβη σε μοντέλα τρωκτικών σήψης ενεργοποιώντας την αντιοξειδωτική σηματοδότηση Nrf2/HO‑1. Συστατικά λιγνάνης-γλυκοσίδης που απομονώθηκαν απόCistanche tubulosaθα μπορούσε να μετριάσει τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις που προκαλούνται από LPS μέσω της τροποποίησης της οδού PI3K/AKT σε μακροφάγους RAW264.7. Ωστόσο, το εάν τα τεμάχια αφεψήματος που κατασκευάζονται υπό πρόσφατα βελτιστοποιημένες συνθήκες επεξεργασίας διατηρούν ισχυρή βιοδραστικότητα αντιοξειδωτικού στρες δεν έχει αξιολογηθεί συστηματικά. Ο μηχανισμός μοριακής ρύθμισης του σκυροδέματος απαιτεί ακόμη βαθύτερη εξερεύνηση.

Το διεγερμένο με LPS μακροφάγο RAW264.7 είναι ένα καλά αποδεκτό in vitro μοντέλο φλεγμονής-οξειδωτικής βλάβης, που υιοθετείται ευρέως για την αξιολόγηση των αντιοξειδωτικών και αντιφλεγμονωδών επιδράσεων φυσικού προϊόντος. Σε αυτήν τη μελέτη, πραγματοποιούμε πρώτα διαλογή ενός παράγοντα που ακολουθείται από βελτιστοποίηση επιφάνειας απόκρισης Box-Behnken για να λάβουμε τυποποιημένες τεχνικές παραμέτρους τεμαχισμού-ατμίσματος-ξήρανσης που στοχεύουν σε υψηλές αποδόσεις ακτεοσίδης και εχινακοσίδης. Αφού λάβουμε βελτιστοποιημένα προϊόντα από αφέψημα, παρασκευάζουμε εκχυλίσματα βοτάνων και υιοθετούμε το μοντέλο κυτταρικού τραυματισμού RAW264.7 που προκαλείται από LPS. Πολλαπλές πειραματικές πλατφόρμες, συμπεριλαμβανομένης της μέτρησης οξειδωτικού στρες, βιοχημικών δεικτών, ποσοτικοποίησης ELISA κυτοκίνης και ανάλυσης μονοπατιού Western-blot χρησιμοποιούνται για την αποσαφήνιση της αποτελεσματικότητας του αντιοξειδωτικού στρες και του μηχανισμού μεταγωγής σήματος. Αυτή η έρευνα παρέχει πρακτικές παραμέτρους διαδικασίας για παραγωγή πιλοτικής κλίμακας υψηλής ποιότηταςCistanche tubulosaκομμάτια αφεψήματος με σταθερή αντιοξειδωτική δράση του στρες και θέτει πειραματικά θεμέλια για την επακόλουθη ανάπτυξη λειτουργικών προϊόντων τροφής και συμπληρωμάτων διατροφής που προέρχονται από το XinjiangCistanche tubulosaπόροι.

2. Υλικά και Μέθοδοι

2.1 Πρώτες ύλες, αντιδραστήρια και όργανα

ΦρέσκοCistanche tubulosaΟι σαρκώδεις μίσχοι συγκομίστηκαν το φθινόπωρο από το Χοτάν, στην Αυτόνομη Περιοχή των Ουιγούρων Xinjiang, στην Κίνα. Η κυτταρική σειρά λευχαιμίας μονοκυττάρου-μακροφάγου ποντικού RAW264.7 αγοράστηκε από την Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, Κίνα). Το ακετονιτρίλιο και η μεθανόλη χρωματογραφικής ποιότητας παρασχέθηκαν από τη Merck (Γερμανία). Οι ουσίες αναφοράς εχινακοσίδη και ακτεοσίδη (καθαρότητα μεγαλύτερη από ή ίση με 98 %) ελήφθησαν από το Beijing North Weiye Metrology Technology Research Institute. Το διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) αγοράστηκε από τη Sigma-VETEC (ΗΠΑ). Το κιτ ανάλυσης μέσου υψηλής γλυκόζης DMEM, BCA ολικής πρωτεΐνης ήταν προϊόντα της Thermo Fisher Scientific (ΗΠΑ). Ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) αγοράστηκε από την BI (Ισραήλ). Το διάλυμα διπλού αντισώματος πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης προήλθε από την HyClone (ΗΠΑ). Εμπορικά κιτ ανάλυσης για NO, MDA, SOD, CAT, GSH αποκτήθηκαν από την Beyotime Biotechnology (Σαγκάη, Κίνα). Κιτ ανίχνευσης LDH και λιποπολυσακχαρίτης (LPS,Ε. coli055:B5) ελήφθησαν από τη Solarbio (Πεκίνο, Κίνα).

Τα βασικά εργαστηριακά όργανα περιελάμβαναν σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης Shimadzu (HPLC), περιστροφικό εξατμιστή LabTech, κονιοποιητή κινέζικου βοτάνου υψηλής ταχύτητας τύπου swing, φούρνο με θερμοστατικό ξήρανση με έκρηξη, εξοπλισμό πολλαπλών δοχείων ατμού, BioNERo συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας, ηλεκτρονικός αναλυτικός ζυγός FA1204N, φυγόκεντρος ψύξης CF1524R, ντουλάπι βιοασφάλειας BSC‑1300IIA2 και ανεστραμμένο οπτικό μικροσκόπιο BDS200‑PH.

2.2 Πειράματα επεξεργασίας ενός παράγοντα

ΦρέσκοCistanche tubulosaΟι σαρκώδεις μίσχοι κόπηκαν σε φέτες διαφορετικού πάχους (0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm, 1,2 cm). Οι φέτες μαγειρεύτηκαν στον ατμό για ποικίλες διάρκειες (3 λεπτά, 6 λεπτά, 9 λεπτά, 12 λεπτά, 15 λεπτά, 18 λεπτά, 21 λεπτά). Στη συνέχεια τα υλικά ξηράνθηκαν κάτω από διαφορετικές θερμοκρασιακές διαβαθμίσεις (περιβάλλον 25 μοίρες, 40 μοίρες, 50 μοίρες, 60 μοίρες, 70 μοίρες, 80 μοίρες). Τα πλήρως αποξηραμένα δείγματα τεμαχίου αφεψήματος κονιοποιήθηκαν και κοσκινίστηκαν μέσω κόσκινου 40 mesh για τον επακόλουθο ποσοτικό προσδιορισμό του συστατικού HPLC.

2.3 Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε ακτεοσίδη και εχινακοσίδη

Προετοιμασία διαλύματος δείγματος: Ζυγίστε με ακρίβεια 1,0 g κονιοποιημένης σκόνης τεμαχίου αφεψήματος σε πωματισμένη κωνική φιάλη. Προσθέστε με ακρίβεια 100 mL διαλύματος μεθανόλης 50%. Εκτελέστε εμποτισμό 30 λεπτών ακολουθούμενο από εξαγωγή με υπερήχους 40 λεπτών. Αφού κρυώσει, συμπληρώστε την απώλεια βάρους του διαλύτη με 50 % μεθανόλη, ανακατέψτε ομοιόμορφα και αφήστε το στατική καθίζηση. Το υπερκείμενο διηθήθηκε μέσω μικροπορώδους μεμβράνης 0,22 μm για έγχυση HPLC.

Παρασκευή διαλύματος αναφοράς προτύπου: Ζυγίστε με ακρίβεια την κατάλληλη ποσότητα ουσιών αναφοράς ακτεοσίδη και εχινακοσίδη, διαλύστε με μεθανόλη 50 % μέσα σε ογκομετρικές φιάλες, παρασκευάστε πρότυπα διαλύματα σειριακής διαβάθμισης, διηθήστε με μεμβράνη φίλτρου 0,22 μm.

Χρωματογραφική διάταξη: COSMOSIL C18 αναλυτική στήλη. σύστημα κινητής φάσης: κινητή φάση Α: υδατικό διάλυμα φωσφορικού οξέος 0,1 %. κινητή φάση Β: ακετονιτρίλιο. Το μήκος κύματος ανίχνευσης ορίστηκε ως 330 nm. θερμοκρασία στήλης 35 βαθμοί ; ρυθμός ροής 1 mL/min. Εφαρμόστηκε μέθοδος εξωτερικού προτύπου για τον ποσοτικό υπολογισμό της περιεκτικότητας σε ακτεοσίδη και εχινακοσίδη. Συνολική βαθμολογία αξιολόγησης=(περιεκτικότητα εχινακοσίδης × 50 %) + (περιεκτικότητα σε ακτεοσίδη × 50 %). Οι ολοκληρωμένες βαθμολογίες χρησίμευσαν ως σύνθετος δείκτης αξιολόγησης για την απόδοση των συνθηκών επεξεργασίας.

2.4 Πειραματικός σχεδιασμός Box-Behnken Response-Surface

Με βάση τα πειραματικά αποτελέσματα ενός παράγοντα, το λογισμικό Design-Expert 13.0 χρησιμοποιήθηκε για την υλοποίηση πειραματικής διάταξης τριών παραγόντων τριών επιπέδων Box-Behnken. Το πάχος της φέτας (X1, cm), ο χρόνος επεξεργασίας στον ατμό (X2, min), η θερμοκρασία στεγνώματος (X3, βαθμός) επιλέχθηκαν ως ανεξάρτητες μεταβλητές. Η περιεκτικότητα σε ακτεοσίδη (Υ1, %) και η περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη (Υ2, %) ήταν τιμές απόκρισης. Διεξήχθησαν δεκαεπτά ομάδες πειραμάτων. Το μηδενικό επίπεδο για κάθε παράγοντα επιλέχθηκε σύμφωνα με τη βέλτιστη παράμετρο που αποκτήθηκε σε δοκιμές ενός παράγοντα. Μετά την ολοκλήρωση των δοκιμών απόκρισης-επιφάνειας, ολοκληρώθηκαν η ανάλυση διακύμανσης μοντέλων, η τρισδιάστατη γραφική παράσταση απόκρισης-επιφάνειας και η πρόβλεψη συνθήκης. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα επαλήθευσης μετά την προσαρμογή των θεωρητικών προβλεπόμενων παραμέτρων σε λειτουργικές πραγματικές τιμές παραγωγής.

2.5 Κυτταρική καλλιέργεια και προετοιμασία δειγμάτων

Η πρώτη ύλη από κομμάτια αφεψήματος κατασκευάστηκε υπό βελτιστοποιημένες συνθήκες επεξεργασίας. Η φυτική σκόνη εκχυλίστηκε σύμφωνα με το προαναφερθέν πρωτόκολλο παρασκευής δείγματος, συμπυκνώθηκε με περιστροφική εξάτμιση και ξηράνθηκε σε κενό για να ληφθεί στερεή σκόνη εκχυλίσματος. Το μητρικό διάλυμα παρασκευάστηκε με διάλυση σκόνης εκχυλίσματος σε DMSO, περαιτέρω αραιωμένο με πλήρες μέσο DMEM (που περιέχει 10 % FBS και 1 % πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη) για κυτταρικά πειράματα. Η τελική συγκέντρωση εργασίας DMSO ελέγχθηκε κάτω από 0,1 % (ν/ν). Τα μακροφάγα RAW264.7 καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο DMEM υπό 37 βαθμούς, 5% CO2 υγροποιημένο περιβάλλον επωαστήρα.

2.6 Δοκιμασία Κυτταροτοξικότητας ΜΤΤ

Τα κύτταρα RAW264.7 σπάρθηκαν σε μικροπλάκες 96 φρεατίων σε κυτταρική πυκνότητα 8 χ 104 κύτταρα/mL. Οι πειραματικές ομάδες περιελάμβαναν ομάδα ελέγχου διαλύτη (0,1 % μέσο DMSO), ομάδα μοντέλου LPS (τελική συγκέντρωση LPS 1 ug/mL) και πολλαπλέςCistanche tubulosaομάδες συγκέντρωσης εκχυλίσματος (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/mL). Μετά από 2 ώρες προεπώασης με δείγμα βοτάνων, συμπληρώθηκε LPS (τελική συγκέντρωση 1 ug/mL) σε κάθε ομάδα εκτός από την ομάδα ελέγχου διαλύτη. Η επώαση συνεχίστηκε για 24 ώρες. Στη συνέχεια προστέθηκε αντιδραστήριο ΜΤΤ (5 mg/mL) και επωάστηκε για 4 ώρες. Απορρίψτε το υπερκείμενο, προσθέστε 150 μL DMSO ανά φρεάτιο, ανακινήστε στους 37 βαθμούς για 15 λεπτά. Η τιμή απορρόφησης σε μήκος κύματος 490 nm διαβάστηκε στον αναγνώστη μικροπλακών και υπολογίστηκε ο ρυθμός επιβίωσης των κυττάρων. Το εύρος ασφαλούς συγκέντρωσης εργασίας-συγκέντρωσης καθορίστηκε για τις λειτουργικές δοκιμές παρακολούθησης.

2.7 Ενδοκυτταρική μέτρηση ROS

Τα μακροφάγα RAW264.7 εμβολιάστηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε πυκνότητα 4 χ 105 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά την προσκόλληση των κυττάρων, πραγματοποιήθηκε θεραπεία ομαδοποίησης: ομάδα ελέγχου διαλύτη, ομάδα μοντέλου LPS και ομάδες θεραπείας εκχυλίσματος CT (12,5, 25, 50, 100 ug/mL). Μετά από 2 ώρες προεπεξεργασίας με δείγμα, προστέθηκε LPS 1 ug/mL εκτός από την ομάδα ελέγχου διαλύτη, επώαση 24 ώρες. Το ενδοκυττάριο επίπεδο ROS ανιχνεύθηκε με τη χρήση της μεθόδου φόρτωσης με ανιχνευτή φθορισμού σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ. Η ένταση φθορισμού μετρήθηκε με συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας φθορισμού (διέγερση 488 nm, εκπομπή 525 nm).

2.8 Ανίχνευση NO, MDA, SOD, CAT, LDH και GSH

Μετά την αντίστοιχη κυτταρική επεξεργασία, το υπερκείμενο κυτταροκαλλιέργειας συλλέχθηκε για μέτρηση του ΝΟ, υιοθετώντας την αντίδραση Griess. Τα προσκολλημένα κύτταρα πλύθηκαν με προψυγμένο PBS, λύθηκαν σε πάγο, το υπερκείμενο κυτταρόλυμα συλλέχτηκε μετά από φυγοκέντρηση (10 000 r/min, 4 βαθμοί, 5 λεπτά). Το κιτ BCA προσδιόρισε τη συγκέντρωση ολικής πρωτεΐνης σε κάθε δείγμα. Το περιεχόμενο των δεικτών MDA, GSH και ενζυματικής δραστηριότητας SOD, CAT, LDH προσδιορίστηκε αυστηρά σύμφωνα με τα εγχειρίδια λειτουργίας του κιτ.

2.9 ELISA Προσδιορισμός Προφλεγμονωδών Κυτοκινών

Τα κύτταρα RAW264.7 έλαβαν προεπεξεργασία δείγματος και διέγερση LPS για συνολικά 16 ώρες. Το υπερκείμενο κυτταροκαλλιέργειας συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε. Οι συγκεντρώσεις των TNF-, IL-1, IL-6 στο υπερκείμενο υγρό ποσοτικοποιήθηκαν με εμπορικά κιτ ELISA.

2.10 Ανάλυση Western-Blot

Μετά από 45 λεπτά LPS και συνεπώαση δείγματος, τα κύτταρα RAW264.7 λύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA συμπληρωμένο με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης-φωσφατάσης. Το κυτταρόλυμα φυγοκεντρήθηκε με 10 000 r/min κάτω από 4 βαθμούς για 5 λεπτά. Το κιτ BCA ποσοτικοποίησε τη συγκέντρωση ολικής πρωτεΐνης. Οι πρωτεΐνες δειγμάτων (50 ug ανά λωρίδα) μετουσιώθηκαν σε μεταλλικό λουτρό 100 μοιρών για 5 λεπτά. Η ηλεκτροφόρηση γέλης SDS-PAGE διαχώρισε τις πρωτεΐνες-στόχους, οι οποίες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν για 1 ώρα με διάλυμα TBST 5% αποβουτυρωμένου γάλακτος. Πρωτογενή αντισώματα που στοχεύουν τα p38, p-p38, AKT, p-AKT, JNK, p-JNK, NF-κB p65, p-NF-κB p65 και GAPDH επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Μετά την πλύση TBST, τα αντίστοιχα δευτερεύοντα αντισώματα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Μετά από επαναλαμβανόμενες πλύσεις, το υπερευαίσθητο αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας ECL εφαρμόστηκε για απεικόνιση της ζώνης πρωτεΐνης. Εφαρμόστηκε ποσοτική ανάλυση σε κλίμακα του γκρι ζώνης για την αξιολόγηση του σχετικού επιπέδου έκφρασης πρωτεΐνης φωσφορυλίωσης.

2.11 Στατιστική Ανάλυση

Το λογισμικό GraphPad Prism 8.0.2 χρησιμοποιήθηκε για στατιστικούς υπολογισμούς και γραφική παράσταση. Τα αποτελέσματα των πειραματικών ποσοτικών δεδομένων εκφράστηκαν ως μέση ± τυπική απόκλιση (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Εφαρμόστηκε μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από post-hoc δοκιμές πολλαπλής σύγκρισης για σύγκριση μεταξύ των ομάδων. \\(Π<0.05\) represented statistically significant difference; \(P<0.01\) highly significant difference; \(P<0.001\) extremely significant difference.

3. Πειραματικά Αποτελέσματα

3.1 Αποτελέσματα πειραμάτων ενός παράγοντα

Slice thickness exerted obvious influence over the contents of acteoside and echinacoside. Slices at 0.2 cm thickness were easily over‑steamed, leading to thermal degradation of phenylethanoid‑glycoside active components. Excessively thick slices (>0,4 cm) παρεμπόδισε την εσωτερική απελευθέρωση της ουσίας, μειώνοντας το τελικό ανιχνεύσιμο περιεχόμενο συστατικών. Υπό σταθερό χρόνο ατμού (10 λεπτά) και θερμοκρασία στεγνώματος (60 μοίρες), το πάχος φέτας 0,4 cm πέτυχε την υψηλότερη συνολική βαθμολογία αξιολόγησης.

Αποτελέσματα διάρκειας επεξεργασίας στον ατμό: όταν το πάχος της φέτας καθορίστηκε στα 0,4 cm και η θερμοκρασία ξήρανσης διατηρήθηκε στους 60 βαθμούς, ο ανεπαρκής χρόνος στον ατμό δεν μπορούσε να καταστρέψει επαρκώς τη δομή των φυτικών κυττάρων, έτσι ώστε οι δραστικές ενώσεις να ήταν δύσκολο να διαλυθούν. Μόλις ο χρόνος ατμού ξεπέρασε τα 6 λεπτά, ο υπερβολικός ατμός κατέστρεψε τον φυτικό ιστό και προκάλεσε αποικοδόμηση της εχινακοσίδης και της ακτεοσίδης. Ως εκ τούτου, τα 6 λεπτά προσδιορίστηκαν προκαταρκτικά ως προτιμώμενη διάρκεια επεξεργασίας στον ατμό.

Για πειράματα βαθμίδωσης θερμοκρασίας στεγνώματος σε φούρνο: καθορίστηκαν πάχος φέτας 0,4 cm και χρόνος ατμού 6 λεπτά. Η περιεκτικότητα των συστατικών αυξήθηκε με την αύξηση της θερμοκρασίας στεγνώματος εντός ορισμένου εύρους. Μόλις η θερμοκρασία στεγνώματος ξεπέρασε τους 60 βαθμούς, η θερμική αποσύνθεση σε υψηλή θερμοκρασία προκάλεσε αξιοσημείωτη μείωση των περιεχομένων της ουσίας στόχου. Ως εκ τούτου, οι 60 μοίρες επιλέχθηκαν ως αρχική βέλτιστη συνθήκη θερμοκρασίας στεγνώματος για επακόλουθη βελτιστοποίηση επιφάνειας απόκρισης.

3.2 Βελτιστοποίηση και επαλήθευση Box-Behnken Response-Surface

Δεκαεπτά ομάδες πειραματικών δοκιμών Box-Behnken ολοκληρώθηκαν σύμφωνα με τη μήτρα σχεδίασης. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης διακύμανσης έδειξαν ότι τα μοντέλα παλινδρόμησης τόσο για την περιεκτικότητα σε ακτεοσίδη όσο και για εχινακοσίδη πέτυχαν στατιστική σημασία (\\(Ρ<0.05\)). The lack‑of‑fit terms were non‑significant (\(P>0.05\)), demonstrating satisfactory model‑fitting quality. Coefficient of determination \(R^2\) values were close to 1, illustrating high consistency between predicted values and practical measured experimental data. Factor‑influence rank for acteoside yield: slice thickness > drying temperature > steaming time. Factor‑influence rank for echinacoside yield: steaming time > drying temperature >πάχος φέτας.

Μέσω του μαθηματικού υπολογισμού του μοντέλου, οι θεωρητικές βέλτιστες παράμετροι επεξεργασίας ήταν: πάχος φέτας 0,600 cm, χρόνος επεξεργασίας στον ατμό 5,685 λεπτά, θερμοκρασία στεγνώματος 57,009 μοίρες. Λαμβάνοντας υπόψη την πραγματική σκοπιμότητα της βιομηχανικής λειτουργίας, οι παράμετροι προσαρμόστηκαν σε πάχος φέτας 0,6 cm, χρόνος ατμού 6 λεπτά, θερμοκρασία στεγνώματος 57 βαθμούς. Πραγματοποιήθηκαν τρία παράλληλα πειράματα επικύρωσης. Υπό αυτές τις πρακτικές συνθήκες, η μετρούμενη περιεκτικότητα σε ακτεοσίδη ήταν 7,25 %, η περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη έφτασε το 31,62 %. Η απόκλιση μεταξύ των μετρούμενων τιμών και της θεωρητικής πρόβλεψης παρέμεινε κάτω από το 5%, αποδεικνύοντας ότι αυτό το μοντέλο επιφάνειας απόκρισης ήταν αξιόπιστο και εφαρμόσιμο για την καθοδήγηση της παραγωγής τεμαχίων αφεψήματος στον πραγματικό κόσμο.

3.3 Έλεγχος κυτταροτοξικότητας του Optimized-ProcessedCistanche tubulosaΕξαγωγή σε κελιά RAW264.7

Τα αποτελέσματα κυτταροτοξικότητας του ΜΤΤ αποκάλυψαν ότι η συγκέντρωση του εκχυλίσματος που κυμαίνεται από 0-100 ug/mL δεν άσκησε εμφανή τοξική επίδραση στα μακροφάγα RAW264.7 και ακόμη και παρουσίαζε ήπια τάση προώθησης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Όταν η συγκέντρωση της θεραπείας ανέβηκε στα 200 ug/mL και στα 400 ug/mL, το ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου με διαλύτη, δείχνοντας κυτταροτοξικότητα εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση. Επομένως, διαβαθμίσεις συγκέντρωσης 12,5 ug/mL, 25 ug/mL, 50 ug/mL, 100 ug/mL επιλέχθηκαν ως ασφαλείς συγκεντρώσεις εργασίας για επακόλουθες κυτταρικές δοκιμασίες που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες και τη φλεγμονή.

3.4 Cistanche tubulosaΕξαγωγή μειωμένου ενδοκυτταρικού επιπέδου ROS σε μακροφάγα που διεγείρονται από LPS

Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου διαλύτη, η ενδοκυτταρική ένταση φθορισμού ROS της ομάδας μοντέλου LPS αυξήθηκε εξαιρετικά σημαντικά (\\(Ρ<0.001\)), confirming successful construction of cellular oxidative‑damage model. After intervention with gradient‑concentration Cistanche tubulosaεκχύλισμα, η ενδοκυτταρική συσσώρευση ROS μειώθηκε με τρόπο δοσοεξαρτώμενο. Κάθε ομάδα θεραπείας με φάρμακα έδειξε στατιστικά σημαντική μείωση του ROS έναντι της ομάδας του μοντέλου LPS (\\(Ρ<0.001\)). This finding demonstrated that processed‑herb extract could effectively restrain excess ROS generation under inflammatory stimulation.

3.5 Επιδράσεις στο περιεχόμενο NO και MDA

Το ΝΟ χρησιμεύει ως κλασικός φλεγμονώδης μεσολαβητής που απελευθερώνεται από ενεργοποιημένα μακροφάγα. Το MDA είναι βιοδείκτης χρυσού προτύπου που αντανακλά οξειδωτική βλάβη από υπεροξείδωση λιπιδίων. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου με διαλύτη, η διέγερση LPS αύξησε σημαντικά την περιεκτικότητα σε NO και MDA στα κύτταρα RAW264.7 (\\(P<0.001\)). Different dosages of Cistanche tubulosaΗ επεξεργασία με εκχύλισμα θα μπορούσε να μειώσει σημαντικά τη συγκέντρωση ΝΟ. Για τον δείκτη MDA: Η ομάδα 12,5 ug/mL δεν έφερε στατιστικά σημαντική βελτίωση. Οι ομάδες συγκέντρωσης 25-100 ug/mL μείωσαν αισθητά το επίπεδο MDA (\\(Ρ<0.001\)). The results illustrated that extracts alleviated LPS‑triggered lipid‑peroxidation injury and inflammatory‑mediator over‑production.

3.6 Επιπτώσεις σε βιοχημικούς δείκτες που σχετίζονται με αντιοξειδωτικά SOD, CAT, LDH, GSH

Μετά την πρόκληση LPS, η ενδοκυτταρική ενζυματική δραστηριότητα SOD, CAT, LDH καθώς και η περιεκτικότητα σε GSH μειώθηκαν απότομα σε σχέση με την ομάδα ελέγχου διαλύτη (\\(P<0.001\)). Low‑dose (12.5 μg/mL) extract treatment could significantly raise SOD activity, but failed to generate prominent changes for CAT and LDH activity. Medium‑and‑high concentration groups (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) concentration‑dependently enhanced SOD, CAT, LDH enzyme activities and intracellular GSH content (\(P<0.001\)). It indicated that optimally‑processed Cistanche tubulosaΤα εκχυλίσματα από αφέψημα θα μπορούσαν να αποκαταστήσουν την κυτταρική ενδογενή αντιοξειδωτική αμυντική ικανότητα έναντι οξειδωτικών προσβολών που προκαλούνται από το LPS.

3.7 Ανασταλτική επίδραση στην προφλεγμονώδη απελευθέρωση κυτοκίνης TNF-, IL-1, IL-6

Τα αποτελέσματα ανίχνευσης ELISA έδειξαν ότι η διέγερση LPS προήγαγε έντονα την έκκριση TNF-, IL-1, IL-6 από μακροφάγους RAW264.7 (\\(P<0.001\)). With the increase of Cistanche tubulosaσυγκέντρωσης θεραπείας εκχυλίσματος, η ποσότητα απελευθέρωσης αυτών των τριών βασικών προφλεγμονωδών κυτοκινών καταστέλλεται προοδευτικά, παρουσιάζοντας σαφή συσχέτιση δόσης-απόκρισης. Επιβεβαίωσε ότι το εκχύλισμα βοτάνων άσκησε ισχυρή αντιφλεγμονώδη λειτουργία περιορίζοντας την έκκριση προφλεγμονώδους κυτοκίνης από ενεργοποιημένα μακροφάγα.

3.8 Κανονισμός για τη φωσφορυλίωση σηματοδότησης-διαδρομής p38/AKT/JNK/NF‑κB

Πειραματικά δεδομένα Western-blot έδειξαν ότι οι αναλογίες p‑p38/p38, p‑AKT/AKT, p‑JNK/JNK και p‑NF‑κB/NF‑κB ήταν σημαντικά αυξημένες στην ομάδα μοντέλου LPS έναντι της ομάδας ελέγχου με διαλύτη (\\(P<0.001\)). Medium‑and‑high‑dosage Cistanche tubulosaΗ παρέμβαση με εκχύλισμα μείωσε σημαντικά την αναλογία p‑p38/p38 και p‑JNK/JNK (\\(P<0.001\)). All concentration‑treatment groups obviously down‑regulated p‑AKT/AKT and p‑NF‑κB/NF‑κB phosphorylation level (\(P<0.05\) or \(P<0.001\)). These observations proved that Cistanche tubulosaΤο εκχύλισμα από αφέψημα ανακούφισε από οξειδωτικούς-φλεγμονώδεις τραυματισμούς μέσω της καταστολής της ενεργοποίησης υπερφωσφορυλίωσης του δικτύου σηματοδότησης p38/AKT/JNK/NF-κB.

4. Συζήτηση

Παραδοσιακές απαιτήσεις επεξεργασίας που καταγράφονται στην Κινεζική Φαρμακοποιία γιαCistanche tubulosaπεριλαμβάνουν κυρίως την αφαίρεση ακαθαρσιών, το πλύσιμο, την υγρασία, τον τεμαχισμό και το στέγνωμα, χωρίς να καθορίζονται ακριβείς αριθμητικές παράμετροι για το πάχος της φέτας, τη διάρκεια ατμού και τη θερμοκρασία στεγνώματος. Η μη τυποποιημένη χειρωνακτική επεξεργασία επιφέρει μεγάλες διακυμάνσεις ποιότητας των εμπορικών προϊόντων από αφέψημα. Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (εχινακοσίδη και ακτεοσίδη) είναι θερμικά ασταθείς βιοδραστικές ενώσεις. Ο ακατάλληλος χρόνος θέρμανσης ή θερμοκρασία θα προκαλέσει χημική αποσύνθεση και θα μειώσει τη φαρμακευτική αξία. Τα πειράματά μας σε έναν παράγοντα αποκάλυψαν ότι τόσο η ανεπαρκής και υπερβολική άτμισμα όσο και η υπερβολικά υψηλή θερμοκρασία στεγνώματος θα προκαλούσαν απώλεια των στοχευόμενων γλυκοσιδικών συστατικών. Περαιτέρω βελτιστοποίηση πολλαπλών παραγόντων Box‑Behnken έλαβε πρακτικές παραμέτρους κατασκευής: πάχος φέτας 0,6 cm, βρασμός στον ατμό 6 λεπτά, στέγνωμα 57 μοίρες. Υπό αυτές τις συνθήκες, η περιεκτικότητα σε ακτεοσίδη και εχινακοσίδη έφτασε το 7,25 % και το 31,62 %, υπερβαίνοντας κατά πολύ το ελάχιστο όριο ποιότητας της φαρμακοποιίας. Αυτό το βελτιστοποιημένο πρωτόκολλο παρέχει εφικτές ποσοτικές τεχνικές αναφορές για τυποποιημένη βιομηχανική επεξεργασία προέλευσης XinjiangCistanche tubulosa.

Το οξειδωτικό στρες και η φλεγμονή είναι στενά αλληλένδετες παθολογικές διεργασίες. Η περίσσεια ROS προκαλεί υπεροξείδωση των λιπιδίων και δημιουργεί MDA, η οποία ενεργοποιεί περαιτέρω τα έμφυτα ανοσοποιητικά μακροφάγα. Τα ενεργοποιημένα μακροφάγα εκκρίνουν άφθονο ΝΟ και πολλαπλές προφλεγμονώδεις κυτοκίνες, οι οποίες αντίστροφα ενισχύουν την ενδοκυτταρική παραγωγή ROS, σχηματίζοντας αυτοενισχυόμενο οξειδωτικό-φλεγμονώδες φαύλο κύκλο. Οι φυσικές αντιοξειδωτικές ουσίες φυτικής προέλευσης μπορούν να σπάσουν αυτόν τον παθολογικό βρόχο αυξάνοντας το ενδογενές σύστημα αντιοξειδωτικών ενζύμων και περιορίζοντας τη μεταγωγή φλεγμονωδών σημάτων. Σε αυτή τη μελέτη in vitro, η βέλτιστη επεξεργασίαCistanche tubulosaΤα εκχυλίσματα από αφέψημα μείωσαν τα επίπεδα ROS, NO και MDA, ενώ ενίσχυσαν τις δραστηριότητες SOD, CAT, LDH και την περιεκτικότητα σε GSH σε μακροφάγους RAW264.7 που διεγείρονται από LPS. Ταυτόχρονα, ανέστειλε την έκκριση προφλεγμονώδους κυτοκίνης TNF-, IL-1, IL-6, επιδεικνύοντας ολοκληρωμένη αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη ικανότητα.

Τα μόρια της οικογένειας πρωτεΐνης-κινάσης ενεργοποιημένης από μιτογόνο p38, JNK μαζί με AKT και NF-κB συνθέτουν κεντρικό κόμβο μεταγωγής σήματος που μεσολαβεί στις φλεγμονώδεις-οξειδωτικές αποκρίσεις των μακροφάγων. Κατά τη διέγερση του LPS, το ανάντη σήμα πυροδοτεί την ενεργοποίηση φωσφορυλίωσης των p38, JNK και AKT, η οποία προάγει διαδοχικά τη φωσφορυλίωση της υπομονάδας P65 NF-κB και την πυρηνική μετατόπιση. Το ενεργοποιημένο NF-κB δρα ως μεταγραφικός παράγοντας και ξεκινά τη μεταγραφή μεγάλων παρτίδων γονιδίων που σχετίζονται με προφλεγμονώδη-κυτοκίνη και οξειδωτικό στρες. Τα αποτελέσματά μας στο Western-blot το έδειξαν αυτόCistanche tubulosaτο εκχύλισμα θα μπορούσε να καταστείλει τη φωσφορυλίωση των p38, JNK, AKT και NF-κB p65. Επομένως, συμπεραίνουμε ότι η αντιοξειδωτική του στρες και η αντιφλεγμονώδης βιοδραστηριότητά του επιτυγχάνεται, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω του αποκλεισμού της υπερενεργοποίησης του άξονα σηματοδότησης p38/AKT/JNK/NF-κB.

Υπάρχουν αρκετοί περιορισμοί στην τρέχουσα έρευνα. Όλες οι λειτουργικές επαληθεύσεις περιορίζονται σε επίπεδο in-vitro κυτταροκαλλιέργειας. Απαιτούνται περαιτέρω πειράματα in vivo με μοντέλα ζώων για την επαλήθευση της in vivo φαρμακοδυναμικής απόδοσης βελτιστοποιημένων τεμαχίων αφεψήματος. Επιπλέον, αυτή η μελέτη υιοθέτησε συνολικό μικτό εκχύλισμα από κομμάτια αφεψήματος, επομένως δεν μπορούμε να διακρίνουμε μεμονωμένη συμβολή εχινακοσίδης, ακτεοσίδης και άλλων δευτερευόντων μεταβολιτών. Η έρευνα παρακολούθησης μπορεί να απομονώσει μονομερείς ενώσεις για να συγκρίνει την αντίστοιχη ισχύ του αντιοξειδωτικού στρες και να διεξαγάγει έρευνα για το αποτέλεσμα συμβατότητας. Παρόλα αυτά, η παρούσα εργασία μας εξακολουθεί να παρέχει πρακτικές παραμέτρους τεχνολογίας επεξεργασίας και προκαταρκτικά μηχανιστικά στοιχεία για την ανάπτυξηCistanche tubulosaπροϊόντα που σχετίζονται με την υγειονομική περίθαλψη.

5. Συμπέρασμα

Συμπερασματικά, η εκσυγχρονισμένη ροή εργασιών επεξεργασίας που βελτιστοποιήθηκε με τη μεθοδολογία επιφάνειας απόκρισης Box‑Behnken (πάχος φέτας 0,6 cm, ατμός 6 λεπτά, θερμοκρασία στεγνώματος 57 βαθμοί) μπορεί να αυξήσει σημαντικά την περιεκτικότητα σε ακτεοσίδη και εχινακοσίδηCistanche tubulosaκομμάτια αφέψημα. Τα εκχυλίσματα που παρασκευάζονται από αυτές τις βέλτιστα επεξεργασμένες φέτες βοτάνων ασκούν εμφανή αντιοξειδωτική πίεση και αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα έναντι της βλάβης των μακροφάγων RAW264.7 που προκαλείται από το LPS. Ο υποκείμενος μηχανισμός συσχετίζεται με την αποκατάσταση του ενδοκυτταρικού συστήματος αντιοξειδωτικής άμυνας και την αναστολή της υπερβολικής ενεργοποίησης της φλεγμονώδους οδού σηματοδότησης p38/AKT/JNK/NF‑κB. Αυτή η μελέτη παρέχει σταθερή πειραματική βάση για την τυποποιημένη βιομηχανική παραγωγή και τη λειτουργική εκμετάλλευση τροφίμωνCistanche tubulosaπόροι.

Αναφορές

Lin J, Yu Η, Zhao Y, et αϊ. Εκχύλιση εχινακοσίδης απόCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight και διερεύνηση της προστατευτικής του επίδρασης στην ηπατική βλάβη σε αρουραίους με σήψη. Food Sci Technol, 2023, 43:e010523.

Guo J, Tang S, Miao Υ, et αϊ. Οι αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις των γλυκοζιτών λιγνάνης απόCistanche tubulosaστελέχη σε κύτταρα μακροφάγων RAW264.7 που προκαλούνται από LPS/IFN μέσω της οδού PI3K/AKT. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2021, 22(10):1380-1391.

Rani V, Deep G, Singh RK, et αϊ. Οξειδωτικό στρες και μεταβολικές διαταραχές: Παθογένεση και θεραπευτικές στρατηγικές. Life Sciences, 2016,148:183-193.

Park JH, Kim JH, Jang S I. Αντιφλεγμονώδης της dise-necionyl cis-khellactone σε κύτταρα RAW264.7 που διεγείρονται από LPS και η ανασταλτική δράση της σε διαλυτή εποξειδική υδρολάση. Heliyon, 2023,9(10):e21032.

Το Chung YC, Song S J. Isobavachin ανακουφίζει τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις που προκαλούνται από λιποπολυσακχαρίτες σε μακροφάγα καταστέλλοντας τις οδούς σηματοδότησης MAPK και NF-κB. Journal of Ethnopharmacology, 2024,321:117501.

He X, Li Y, Deng B. Η οδός σηματοδότησης PI3K/AKT στη φλεγμονή, τον κυτταρικό θάνατο και τον σχηματισμό γλοιακής ουλής μετά από τραυματική κάκωση νωτιαίου μυελού. Cell Proliferation, 2022,55(9):e13275.