Βελτιστοποίηση της διαδικασίας αποχρωματισμού και της αντιοξειδωτικής δραστικότητας του εκχυλίσματος πολυσακχαρίτη Cistanche Deserticola με μεθοδολογία επιφάνειας απόκρισης

ΠΕΡΙΛΗΨΗ:

 

Σκοπός:Για να βελτιστοποιηθεί η διαδικασία αποχρωματισμού των πολυσακχαρίτη Cistanche Deserticola και να διερευνήσει την αντιοξειδωτική τους δραστικότητα.

Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούν ενεργοποιημένο άνθρακα ως παράγοντα αποχρωματισμού, διερευνήθηκαν οι επιδράσεις 4 παραγόντων που περιλαμβάνουν τη δοσολογία ενεργού άνθρακα, τη θερμοκρασία αποχρωματισμού, τον χρόνο αποχρωματισμού και το ρΗ επί του ρυθμού αποχρωματισμού και του ρυθμού ανάκτησης πολυσακχαρίτη. Με βάση τα πειράματα ενός παράγοντα, η διαδικασία αποχρωματισμού του εκχυλίσματος πολυσακχαρίτη Cistanche Deserticola βελτιστοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μεθοδολογία επιφάνειας απόκρισης. Χρησιμοποιώντας μια in vitro μέθοδο αξιολόγησης αντιοξειδωτικής δραστηριότητας, η ικανότητα ελεύθερης ριζικής καθαρισμού 1, 1- διφαινυλ -2- picrylhydrazine (DPPH), ολική ικανότητα αναγωγής, ικανότητα καθαρισμού ριζών υδροξυλίου, και 2,2'-azino BIS ({7}} αιθυλβενζοθιαζόλη - 6- σουλφονικό οξύ) αλάτι διαμμονίου (ABTS) Η ικανότητα καθαρισμού ελευθέρων ριζών των πολυσακχαριτών από την Cistanche deserticola προσδιορίστηκε. Αποτελέσματα Οι βέλτιστες συνθήκες διαδικασίας αποχρωματισμού για το εκχύλισμα πολυσακχαριτών από το Cistanche deserticola ήταν οι εξής: ενεργός δοσολογία άνθρακα 20%, θερμοκρασία αποχρωματισμού 37 βαθμοί, Χρόνος αποχρωματισμού 49 λεπτά, ρΗ 5.03. Υπό αυτές τις βέλτιστες συνθήκες, ο ρυθμός αποχρωματισμού και ο ρυθμός ανάκτησης πολυσακχαρίτη ήταν 62,66% και 96,16% αντίστοιχα. Μετά την αποχρωματισμό, οι δυνατότητες της απομάκρυνσης ριζών DPPH και της ελευθέρων ριζών υδροξυλίου αυξήθηκαν σημαντικά, ενώ οι δυνατότητες της καθαρισμού ριζών ανιόντων ABTS μειώθηκαν σημαντικά. Συμπέρασμα Η διαδικασία αποχρωματισμού είναι εύκολη στη λειτουργία, με καλές επιδράσεις αποχρωματισμού και ρυθμό ανάκτησης πολυσακχαρίτη. Έχει σημαντική αξία εφαρμογής και παρέχει βάση για την μεταγενέστερη έρευνα και ανάπτυξη του πολυσακχαρίτη Cistanche Deserticola.

Λέξεις -κλειδιά: cistanche deserticolaπολυσακχαρίτης; αποχρωματισμό. μεθοδολογία επιφάνειας απόκρισης. αντιοξειδωτική δραστηριότητα

Καπετάνιοςεφέ deserticola

 

1.2.3 Μέτρηση του ρυθμού ανάκτησης πολυσακχαριτών

Προετοιμασία της τυπικής καμπύλης:
Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος φαινόλης-σουλφουρικού οξέος. Περίπου 0. Στη συνέχεια, 1,0 ml του διαλύματος αποθέματος μετρήθηκε με ακρίβεια και αραιώθηκε στα 10 ml σε μια ογκομετρική φιάλη για να ληφθεί ένα πρότυπο διάλυμα 0,1 mg/ml. Τα τυποποιημένα διαλύματα 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 και 100 μΐ γλυκόζης μετρήθηκαν με ακρίβεια σε σωλήνες φυγοκεντρότητας 1,5 mL. Προστέθηκε απεσταγμένο νερό σε κάθε σωλήνα για να σχηματίσει συνολικό όγκο 100 μΐ. Ένας άλλος σωλήνας φυγοκέντρησης 1,5 mL που περιείχε 100 μΐ απεσταλμένου νερού χρησιμοποιήθηκε ως διάλυμα κενού ελέγχου. Σε κάθε σωλήνα προστέθηκαν 100 μΐ διαλύματος φαινόλης 5%, αναμίχθηκαν καλά και στη συνέχεια προστέθηκαν γρήγορα 500 μΐ συμπυκνωμένου θειικού οξέος. Οι σωλήνες στροβιλίστηκαν για 3 λεπτά και άφησαν να σταθούν για 35 λεπτά. Στη συνέχεια, 200 μΐ του διαλύματος αντίδρασης μεταφέρθηκαν σε πλάκα 96- και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας έναν αυτόματο αναγνώστη μικροπλακών. Μια τυποποιημένη καμπύλη απεικονίστηκε γραφικά με απορρόφηση (y) ως κάθετο άξονα και συγκέντρωση γλυκόζης (x, UG/ml) ως οριζόντιος άξονας. Η τυπική εξίσωση καμπύλης που ελήφθη ήταν:

Y = 5.507X – 0.01,
r² = 0.992.

Μέτρηση περιεχομένου πολυσακχαριτών:
Ένα δείγμα 100 μΐ αραιωμένωνΚιστάνχες η ερημικήΤο εκχύλισμα πολυσακχαρίτη μετρήθηκε με ακρίβεια σε σωλήνα φυγοκέντρησης 1,5 mL. Η τιμή απορρόφησης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφηκε παραπάνω και η συγκέντρωση πολυσακχαρίτη υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την τυπική καμπύλη.

Μέτρηση του ρυθμού ανάκτησης πολυσακχαρίτη:
Η μάζα των πολυσακχαριτών στοΚιστάνχη της ερημίαςΤο εκχύλισμα πριν και μετά την αποχρωματισμό μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την παραπάνω μέθοδο. Ο ρυθμός ανάκτησης πολυσακχαρίτη υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση (2):

Ποσοστό ανάκτησης πολυσακχαρίτη (%)
= (maftermbefore) × 100%\ left (\ frac {m _ \ text {μετά}} {m _ \ text {πριν}} \ δεξιά) \ times 100 \%(mbefore mafter) × 100%
Οπου:

mbeforem _ \ text {πριν από} mbefore και mafterm _ \ text {after} mafter είναι οι μάζες τουΚιστάνχη της ερημίαςΠολυσακχαρίτες πριν και μετά την αποχρωματισμό, αντίστοιχα (ζ).

 

 

1.2.4 Πειραματικός σχεδιασμός ενός παράγοντα

Οι επιδράσεις των τεσσάρων παραγόντων που ενεργοποιούνται από τον άνθρακα, της θερμοκρασίας αποχρωματισμού, του χρόνου αποχρωματισμού και του ρυθμού αποχρωματισμού και του ρυθμού ανάκτησης πολυσακχαρίτη τουΚιστάνχη της ερημίαςΤο εκχύλισμα πολυσακχαρίτη διερευνήθηκε.

Επίδραση της δοσολογίας ενεργού άνθρακα:
Σταθερός χρόνος αποχρωματισμού σε 30 λεπτά, θερμοκρασία αποχρωματισμού σε 50 μοίρες και ρΗ σε 5.03 (μετρούμενη τιμή δείγματος). Μελετήθηκε η επίδραση της δοσολογίας ενεργού άνθρακα στον ρυθμό αποχρωματισμού και του ρυθμού ανάκτησης πολυσακχαρίτη.

Επίδραση της θερμοκρασίας αποχρωματισμού:
Σταθερή δοσολογία ενεργού άνθρακα στο 20% (Μ: Μ), χρόνος αποχρωματισμού στα 30 λεπτά και ρΗ στα 5,03. Μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας αποχρωματισμού στον ρυθμό αποχρωματισμού και ο ρυθμός ανάκτησης πολυσακχαρίτη.

Επίδραση του χρόνου αποχρωματισμού:
Σταθερή δοσολογία άνθρακα σε 20%, θερμοκρασία αποχρωματισμού σε 50 μοίρες και ρΗ σε 5.03. Μελετήθηκε η επίδραση του χρόνου αποχρωματισμού στον ρυθμό αποχρωματισμού και του ρυθμού ανάκτησης πολυσακχαρίτη.

Επίδραση του pH:
Σταθερή δοσολογία ενεργού άνθρακα στο 20% (Μ: Μ), θερμοκρασία αποχρωματισμού σε 50 μοίρες και χρόνος αποχρωματισμού σε 30 λεπτά. Μελετήθηκε η επίδραση του ρΗ στον ρυθμό αποχρωματισμού και του ρυθμού ανάκτησης πολυσακχαρίτη.

 

1.2.5 Βελτιστοποίηση επιφάνειας απόκρισης Πειραματικός σχεδιασμός

Με βάση τις βέλτιστες περιοχές κατάστασης που προσδιορίστηκαν στα πειράματα ενός παράγοντα, η μέθοδος πειραματικού σχεδιασμού Box-Behnken χρησιμοποιήθηκε για τη διεξαγωγή σχεδιασμού τεσσάρων παραγόντων, τριών επιπέδων για τις συνθήκες αποχρωματισμού τουΚιστάνχη της ερημίαςεκχύλισμα πολυσακχαρίτη. Ο ρυθμός αποχρωματισμού και ο ρυθμός ανάκτησης πολυσακχαρίτη χρησιμοποιήθηκαν ως δείκτες αξιολόγησης. Οι παράμετροι σχεδιασμού εμφανίζονται στον Πίνακα 1.

1.2.6 Προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής δραστικότητας τουΚιστάνχη της ερημίαςΠολυσακχαρίτες

(1) Προσδιορισμός τουΚιστάνχες η ερημικήΔυνατότητα ριζικής καθαρισμού ριζών DPPH πολυσακχαρίτες

Με βάση τη μέθοδο των Kan Jintao et al. [21] με ελαφρές τροποποιήσεις, 0. (1, {{1 0}} διφαινύλιο -2- picrylhydrazine) και 1,1 ml απεσταγμένου νερού. Το μείγμα αφέθηκε να αντιδράσει στο σκοτάδι σε 37 βαθμούς για 30 λεπτά. Η απορρόφηση του διαλύματος αντίδρασης μετρήθηκε στα 517 nm και ο ρυθμός καθαρισμού ριζών DPPH 1,0 mg/ml πολυσακχαρίτες πριν και μετά την αποχρωματισμό υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση (3):

Ρυθμός σάρωσης ριζών DPPH (%)

{0}} [1- (a1 -a2) a 0] × 100%=}}}}}}}} {a {}}} 100 \%= [1 -A0 (A1 -A2)] × 100%

Οπου:

A1a _1 a1 είναι η απορρόφηση του δοκιμαστικού σωλήνα δείγματος,

A2a _2 a2 είναι η απορρόφηση όταν η άνυδρη αιθανόλη αντικαθιστά το διάλυμα DPPH,

A {{0}} a _0 a0 είναι η απορρόφηση όταν το αποσταγμένο νερό αντικαθιστά το δείγμα.

 

(2) Προσδιορισμός της συνολικής μείωσης της ισχύος τουΚιστάνχη της ερημίαςΠολυσακχαρίτες

Αναφερόμενος στη μέθοδο από τους Lu Xue et al. [22], 1. Ένα διάλυμα εργασίας 5 μΐ και 180 μΐ FRAP (μείωση της αντιοξειδωτικής ισχύος ιόντων σιδήρου) προστέθηκαν σε ένα 96- καλά πλάκα, αναμειγνύεται καλά και αφέθηκε να αντιδράσει σε 37 μοίρες για 5 λεπτά. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 593 nm και η συνολική μειωτική ισχύς των πολυσακχαριτών εκφράστηκε με βάση τη συγκέντρωση του τυπικού διαλύματος FesO4.

(3) Προσδιορισμός της ικανότητας καθαρισμού ριζών υδροξυλίουΚιστάνχες η ερημικήΠολυσακχαρίτες

Ακολουθώντας τη μέθοδο που περιγράφεται στη βιβλιογραφία [23] και οι οδηγίες του κιτ προσδιορισμού υδροξυλικής ρίζας ρίζας, 1. Χρησιμοποιήθηκε αποσταγμένο νερό για να αντικατασταθεί το υπεροξείδιο του υδρογόνου για την απορρόφηση της ομάδας ελέγχου (Acontrola _ \ text {control} acontrol) και το αποσταγμένο νερό χρησιμοποιήθηκε για να αντικαταστήσει το δείγμα για την απορρόφηση ομάδας κενής ομάδας (Ablanka _ \ text {Blank} ablank). Οι τιμές απορρόφησης μετρήθηκαν στα 550 nm και ο ρυθμός καθαρισμού ριζών υδροξυλίου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση (4):

Ποσοστό καθαρισμού ριζών υδροξυλίου (%)

= [(acontrol -asample) (acontrol -ablank)] × 100%= \ left [\ frac {(a _} {control {} - a {}}}}}} { A _ \ text {blank})} \ right] \ times 100 \%= [(acontrol -Ablank) (acontrol -asample)] × 100%

Οπου:

Asamplea _ \ text {δείγμα} asample είναι η απορρόφηση της ομάδας δείγματος,

Acontrola _ \ text {control} acontrol είναι η απορρόφηση της ομάδας ελέγχου,

Ablanka _ \ text {blank} ablank είναι η απορρόφηση της κενής ομάδας.

 

(4) Προσδιορισμός της ικανότητας καθαρισμού ριζών κατιόντων ABTSΚιστάνχη της ερημίαςΠολυσακχαρίτες

Σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφηκε στη βιβλιογραφία [24] και οι οδηγίες του κιτ προσδιορισμού ριζών κατιόντων ABTS, 1. Ένα δείγμα 10 μΐ αναμίχθηκε με 20 μΐ διαλύματος λειτουργίας αντιδραστηρίου τεσσάρων και 170 μΐ διαλύματος εργασίας ABTS, αναμειγνύεται διεξοδικά και αφέθηκε να αντιδράσει στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 6 λεπτά. Το απιονισμένο νερό χρησιμοποιήθηκε ως κενό έλεγχο. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 405 nm και ο ρυθμός καθαρισμού ριζών κατιόντων ABTS υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση (5):

ABTS κατιόντος ριζική καθαρή ποσοστό (%)

= [(bblank -bsample) bblank] × 100%= \ left [\ frac {(b _} {blank} - b { 100 \%= [BBLANK (BBLANK -BESAMPLE)] × 100%

Οπου:

Bblankb _ \ text {blank} bblank είναι η απορρόφηση της αντίδρασης μεταξύ διαλύματος αποσταγμένου νερού και abts,

Bsampleb _ \ text {δείγμα} bsample είναι η απορρόφηση της αντίδρασης μεταξύ του διαλύματος δείγματος και ABTS.

 

1.3 Επεξεργασία δεδομένων

Το λογισμικό SigMaplot 12.5 χρησιμοποιήθηκε για την σχεδίαση και χρησιμοποιήθηκε λογισμικό σχεδιασμού 8. 0.