Οι ολιγοσακχαρίτες Βελτιώνουν την οξεία νεφρική βλάβη ανακουφίζοντας το σύμπλεγμα διαφοροποίησης 44-Διαμεσολαβούμενες ανοσοαποκρίσεις στα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα

Περίληψη:Οξεία νεφρική βλάβη (ΑΚΙ)είναι ένα ξαφνικό επεισόδιο τουνεφρική βλάβηπου εμφανίζεται συνήθως σε ασθενείς που εισάγονται σε νοσοκομεία. Μέχρι σήμερα, δεν έχει αναπτυχθεί ιδανική θεραπεία για τη μείωσηΣοβαρότητα ΑΚΙ. Oligo-fucoidanΤο (FC) παρεμβαίνει στο σύμπλεγμα πρωτεϊνών της επιφάνειας των νεφρικών σωληναριακών κυττάρων διαφοροποίησης 44 (CD44) για την πρόληψη της νεφρικής διάμεσης ίνωσης. Ωστόσο, η επίδραση των ολιγοσακχαριτών στην ΑΚΙ παραμένει άγνωστη. Σε αυτή τη μελέτη, το FC, ο γαλακτο-ολιγοσακχαρίτης (GOS) και ο φρουκτο-ολιγοσακχαρίτης (FOS) επιλέχθηκαν για τη διερεύνηση της επίδρασης των ολιγοσακχαριτών στο AKI. Και οι τρεις ολιγοσακχαρίτες έχουν αποδειχθεί ότι απορροφώνται μερικώς από το έντερο. Βρήκαμε ότι οι ολιγοσακχαρίτες μείωσαν δοσοεξαρτώμενα την αντιγονικότητα του CD44 και κατέστειλαν την επαγόμενη από υποξία έκφραση των CD44, φωσφο-JNK, MCP-1, IL-1 και TNF- σε NRK-52E νεφρικά σωληναριακά κύτταρα. Εν τω μεταξύ, η επιμόλυνση CD44 siRNA και ο αναστολέας JNK SP600125 μείωσαν την επαγόμενη από υποξία έκφραση του φωσφο-JNK και των κυτοκινών. Ο συνδέτης του CD44, η υαλουρονάνη, εξουδετέρωσε την επίδραση των ολιγοσακχαριτών στο CD44 και στο φωσφο-JNK. Στις 2 ημέρες μετά το χειρουργείο για τραυματισμό ισχαιμίας-επαναιμάτωσης, οι ολιγοσακχαρίτες μείωσαν τη φλεγμονή των νεφρών, την κρεατίνη ορού, το MCP-1, την IL-1 και τον TNF- σε ποντικούς AKI. Στις 7 ημέρες μετά την επέμβαση, προωθήθηκε η ανάρρωση των νεφρών. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα FC, GOS και FOS αναστέλλουν τον επαγόμενο από υποξία καταρράκτη CD44/JNK και τις κυτοκίνες σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα, βελτιώνοντας έτσι την AKI και τη φλεγμονή των νεφρών σε ποντικούς AKI. Επομένως,συμπλήρωμα ολιγοσακχαρίτηείναι μια πιθανή στρατηγική υγειονομικής περίθαλψης για ασθενείς με ΑΚΙ.

ΕΝΑ ΝΕΟ ΒΟΤΑΝΟ ΓΙΑ ΝΕΦΡΕΣ ΠΑΘΗΣΕΙΣ

Λέξεις-κλειδιά: οξεία νεφρική βλάβη; συστάδα διαφοροποίησης 44; φρουκτο-ολιγοσακχαρίτης; γαλακτοολιγοσακχαρίτης; oligo-fucoidan; φλεγμονή

1. Εισαγωγή

Οξεία νεφρική βλάβη(ΑΚΙ) χαρακτηρίζεται από ξαφνική μείωση του ρυθμού σπειραματικής διήθησης και επακόλουθη αύξηση της κρεατινίνης ορού. Αυτή η βλάβη είναι συχνή σε ασθενείς που εισάγονται σε νοσοκομεία και μονάδες εντατικής θεραπείας, ιδιαίτερα στους ηλικιωμένους. Η ισχαιμία, η σηψαιμία και η νεφροτοξικότητα είναι οι κύριες αιτίες της ΑΚΙ που συχνά συνυπάρχουν και, ως εκ τούτου, περιπλέκουν τη διάγνωση και τη θεραπεία [1]. Η σοβαρή AKI θέτει τους ασθενείς που έχουν εξέλθει σε κίνδυνο ανεπιθύμητων ενεργειών, όπως χρόνια νεφρική νόσο, καρδιαγγειακά συμβάματα, καρκίνος και λοιμώξεις [2]. Το AKI έχει μια ταχεία ανάπτυξη και δεν υπάρχει διαθέσιμη αποτελεσματική θεραπεία για την αποφυγή ή τη μείωση της σοβαρότητάς του. Η πρόσληψη συγκεκριμένων θρεπτικών συστατικών μπορεί να μειώσει τη βλάβη των νεφρικών σωληναριών σε AKI [3]. Ως εκ τούτου, η μελέτη της επίδρασης της ειδικής διατροφής στο AKI θα βοηθήσει στη βελτίωση του AKI και των συνοδών κινδύνων που αντιμετωπίζουν οι ασθενείς που έχουν πάρει εξιτήριο.

Φλεγμονή και στρατολόγηση λευκοκυττάρωνείναι βασικοί διαμεσολαβητές του ΑΚΙ. Τα νεφρά, ειδικά τα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα, δημιουργούνφλεγμονώδεις κυτοκίνεςκατά τη διάρκεια AKI, όπως IL-1, IL-6, μονοκυτταρική χημειοελκτική πρωτεΐνη-1 (MCP-1) και παράγοντας νέκρωσης όγκου- (TNF- ) [4,5] . Αυτές οι κυτοκίνες επάγουν περαιτέρω συστηματική φλεγμονή και στρατολόγηση λευκοκυττάρων. Αν και πολλά υποσύνολα λευκοκυττάρων ασκούν προστατευτικές επιδράσεις στο AKI (όπως τα ρυθμιστικά κύτταρα Τ), τα περισσότερα ουδετερόφιλα, μονοκύτταρα και δενδριτικά κύτταρα είναι επιβλαβή για την ανάκτηση του AKI [6]. Η συστηματική φλεγμονή είναι επίσης επιζήμια για την ανάρρωση από ΑΚΙ λόγω των υψηλών επιπέδων κυτοκίνης [7]. Μεταξύ των κυτοκινών που εκκρίνονται από το νεφρό, η MCP-1 είναι κυρίως υπεύθυνη για τη στρατολόγηση λευκοκυττάρων, ανταποκρίνεται σε διάφορες κυτοκίνες, συμπεριλαμβανομένων των IL-1 και TNF- [8,9], και παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση διαφορετικών νεφρικών βλαβών [10]. Στα ανθρώπινα εγγύς σωληναριακά κύτταρα HK-2, η επαγόμενη από υποξία έκφραση MCP-1 διαμεσολαβείται από την οδό C-Jun NH2- τερματικής κινάσης (JNK) [11]. Η οδός p38 εμπλέκεται επίσης στην επαγόμενη από λευκωματίνη έκφραση MCP-1 σε επιθηλιακά κύτταρα νεφρικών σωληναριακών [12]. Ως εκ τούτου, η ρύθμιση των οδών JNK και p38 μπορεί να επηρεάσει τη φλεγμονή και τη στρατολόγηση λευκοκυττάρων στο AKI.

Οι ολιγοσακχαρίτες είναι πολυμερή σακχαριτών που περιέχουν 3-10 μονοσακχαρίτες που είναι δύσπεπτοι και αποτελούν κύριο συστατικό των συνολικών διαθέσιμων πρεβιοτικών ως πρόσθετα διατροφής [13]. Οι περισσότεροι φρουκτο-ολιγοσακχαρίτες (FOS) που καταπίνονται στο ανθρώπινο σώμα ζυμώνονται πλήρως από τη χλωρίδα του παχέος εντέρου και ένα μικρό κλάσμα ανακτάται στα ούρα [14]. Οι γαλακτο-ολιγοσακχαρίτες (GOSs) μπορούν να απορροφηθούν στο αίμα και στη συνέχεια να απεκκριθούν στα ούρα [15]. Η ίδια κατάσταση ισχύει για το fucoidan στα καφέ θαλάσσια φύκια [16]. Οι απορροφημένοι ολιγοσακχαρίτες μπορούν να επηρεάσουν τις βιοχημικές αντιδράσεις και την κυτταρική αναγνώριση [17]. Η προηγούμενη μελέτη μας αποκαλύπτει ότι το ολιγο-φουκοϊδάνη (FC) παρεμβαίνει στην αλληλεπίδραση μεταξύ της πρωτεΐνης CD44 της νεφρικής σωληναριακής κυτταρικής επιφάνειας και των εξωκυτταρικών προσδεμάτων της, αποτρέποντας έτσι τη νεφρική διάμεση ίνωση [18]. Η αλληλεπίδραση μεταξύ του CD44 και των εξωκυτταρικών προσδεμάτων του προάγει το μονοπάτι σηματοδότησης JNK [19]. Επομένως, η καθημερινή κατάποση ολιγοσακχαριτών μπορεί να μειώσει τη φλεγμονή των νεφρών σε ασθενείς με AKI. Ωστόσο, η επίδραση αυτών των πολυμερών στο AKI παραμένει άγνωστη. Αυτή η μελέτη διερεύνησε την επίδραση των FC, FOS και GOS σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με υποξία και σε ποντικούς AKI με τραυματισμό ισχαιμίας-επαναιμάτωσης (IRI). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι τρεις ολιγοσακχαρίτες κατέστειλαν το CD44-που μεσολαβούσαν στις νεφρικές ανοσολογικές αποκρίσεις και μείωσαν τη βαρύτητα μετά την ΑΚΙ. Ως εκ τούτου, η χρήση αυτών των πολυμερών ως συμπλήρωμα διατροφής παρουσιάζει μια νέα στρατηγική θεραπείας AKI

2. Υλικά και Μέθοδοι

2.1. Υλικά

FOS (μέσος βαθμός πολυμερισμού < 10), GOS (μέσος βαθμός πολυμερισμού < 8) και FC (μέσος βαθμός πολυμερισμού < 5) ελήφθησαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ΗΠΑ, Cat No. F8052), Carbosynth (Berkshire, UK, Cat. No. OG32134) και Hi-Q Marine Biotech International (Taipei, Taiwan), αντίστοιχα. Οι ολιγοσακχαρίτες διαλύθηκαν σε διπλά αποσταγμένο Η2Ο και διηθήθηκαν χρησιμοποιώντας στείρα φίλτρα 0,22 μm (Merck Millipore, Darmstadt, Γερμανία). Η υαλουρονάνη (ΗΑ) και όλες οι άλλες χημικές ουσίες βαθμού αντιδραστηρίου ελήφθησαν από τη Sigma. Αντισώματα κατά JNK (sc-7345), phospho-JNK (sc-6254), MCP-1 (sc-52701), IL-1 (sc{{17 }}), και TNF- (sc-52746) αγοράστηκαν από τη Santa Cruz Biotechnology (Ντάλας, Τέξας, ΗΠΑ). Αντισώματα έναντι ρ38 (9212) και φωσφο-ρ38 (9211) ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, ΗΠΑ). Αντισώματα έναντι Ly6G (ab25377) και F4/80 (ab100790) αγοράστηκαν από την Abcam (Cambridge, UK). Αντισώματα κατά του HIF-1 (NB100-105) αγοράστηκαν από τη Novus Biologicals (Centennial, CO, ΗΠΑ).

2.2. Κυτταρική καλλιέργεια

Τα εγγύς νεφρικά σωληναριακά κύτταρα αρουραίου (NRK-52E) και η σειρά μακροφάγων ποντικού RAW264.7 αγοράστηκαν από το Food Industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taiwan). καλλιέργεια σε DMEM συμπληρωμένο με αντιβιοτικό/αντιμυκητιακό διάλυμα και 10% ορό εμβρύου μόσχου. και διατηρείται στους 37 ◦C και 95% υγρασία σε επωαστήρα CO2. Αφού έφθασαν στο 70% συρροή, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό και επωάστηκαν όλη τη νύχτα πριν από το πείραμα. Για το πείραμα υποξίας, τα κύτταρα NRK-52Ε και το πακέτο Anaero (Mitsubishi Gas Chemical America, Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) εναποτέθηκαν σε ορθογώνια βάζα (Mitsubishi Gas Chemical America) και ολόκληρη η διάταξη τοποθετήθηκε σε ένα 37 ◦C θερμοκοιτίδα για 4 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν όλη τη νύχτα υπό κανονικές συνθήκες.

2.3. Ανάλυση Western Blot

Εν συντομία, 15 μg προϊόντος λύσης πρωτεΐνης NRK-52Ε εφαρμόστηκαν σε κάθε λωρίδα και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με στύπωμα Western. Τα σχετικά επίπεδα πρωτεϊνικής ζώνης ποσοτικοποιήθηκαν από πέντε ανεξάρτητα πειράματα με λογισμικό Quantiscan από την Biosoft (Cambridge, UK).

2.4. Βραχεία παρεμβολή (si)RNA Μεταμόλυνση CD44

Το siRNA CD44 αρουραίου (4390771) αγοράστηκε από την Thermo Scientific (Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Μετά την ανάπτυξη σε 70% συρροή, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο επιμόλυνσης Lipofectamine 2000 (Thermo Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

2.5. Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού Κυττάρου

Αφού καλλιεργήθηκαν υποξικά κύτταρα NRK-52Ε για 24 ώρες, το ίδιο μέσο χρησιμοποιήθηκε για την καλλιέργεια κυττάρων RAW264.7 σε ένα τρυβλίο 96-πηγαδιού (2000 κύτταρα/φρεάτιο). Μετά από 24 ώρες επώασης, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων RAW264.7 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας SRB (Abcam, Αρ. Κατ. ab235935) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

2.6. Δοκιμές αντιγονικότητας CD44

Το ανασυνδυασμένο CD44 επίμυος ελήφθη από την R&D Systems (Minneapolis, MN, USA, Cat. Αρ. 6577-CD) και χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή μιας αντίδρασης δέσμευσης με ΗΑ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 20 ng/mL ανασυνδυασμένου CD44 αρουραίου αναμίχθηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις FC, FOS ή GOS για 10 λεπτά για να διερευνηθεί η επίδραση των ολιγοσακχαριτών στην αντιγονικότητα του CD44. Τα μίγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ CD44 ELISA (Abcam, Αρ. Κατ. ab213928) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

2.7. Πειραματικά Ζώα και Νεφρική IRI

Αρσενικά ποντίκια 129S1/SvImJ οκτώ εβδομάδων αγοράστηκαν από την Lasco Technology (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Ταϊπέι (αριθμός έγκρισης LAC-2019-0511) και διαμορφώθηκαν από τον NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Για επαγωγή IRI, ποντίκια (βάρους 21-23 g) υποβλήθηκαν σε αμφοτερόπλευρη σύσφιξη του νεφρικού μίσχου για 30 λεπτά με διεξαγωγή πλευρικής τομής [20]. Τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με εισπνευστική αναισθησία με ισοφλουράνιο προεγχειρητικά. Τα ποντίκια που χειρουργήθηκαν ψευδώς υποβλήθηκαν σε παρόμοια επέμβαση, εκτός από τη σύσφιξη των νεφρικών μίσχων. Όλα τα ποντίκια τράφηκαν με ολιγοσακχαρίτες μέσω του στοματικού καθετήρα από 1 ημέρα πριν έως 2 ημέρες μετά την επέμβαση IRI. Τα πειραματικά ποντίκια χωρίστηκαν στις ακόλουθες πέντε ομάδες με n=8 για τα αποτελέσματα την ημέρα 3 και την ημέρα 7: (1) εικονική ομάδα. (2) Ομάδα ΑΚΙ. (3) Ομάδα AKI που τρέφεται με FC (10 mg/kg/ημέρα). (4) Ομάδα AKI που τρέφεται με FOS (10 mg/kg/ημέρα). και (5) Ομάδα ΑΚΙ που τρέφεται με GOS (10 mg/kg/ημέρα). Τα ποντίκια θυσιάστηκαν 3 ή 7 ημέρες μετά το χειρουργείο και το αίμα συλλέχθηκε και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας βιοχημικό αναλυτή και κιτ ELISA. Το επίπεδο κρεατινίνης ορού κάθε ποντικιού αναλύθηκε για να αξιολογηθεί η ανάπτυξη ΑΚΙ. Η μορφολογία των νεφρών εξετάστηκε με χρώση με περιοδικό οξύ-Schiff (PAS) και χρώση ανοσοϊστοχημείας (IHC) σε τομές παραφίνης 2 μm σταθεροποιημένες με φορμαλίνη.

2.8. Ανοσοϊστοχημεία χρώση

Οι ιστοί των νεφρών σταθεροποιήθηκαν με 4% ρυθμισμένη παραφορμαλδεΰδη, ενσωματώθηκαν σε παραφίνη και κόπηκαν σε τομές 2 μm για χρώση με κιτ HRP DAB του συστήματος UltraVision Quanto Detection System (Thermo Scientific, Fremont, CA, USA) και υβριδισμό με το κύριο αντίσωμα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή .

2.9. Χρώση PAS

Οι τομές νεφρών χρωματίστηκαν με κιτ χρώσης PAS (Abcam, Αρ. Κατ. ab150680) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

2.10. Δοκιμασία ELISA

Το καλλιεργημένο μέσο των κυττάρων NRK-52Ε και τα δείγματα ορού των πειραματικών ποντικών συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ MCP{1}} ELISA (Abcam, Αρ. Κατ. ab208979) και IL-1 Κιτ ELISA (Abcam, Αρ. Κατ. ab197742). Τα δείγματα ορού αναλύθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας κιτ TNF- ELISA (R&D Systems, Αρ. Κατ. MTA00B) και κιτ ELISA σχετιζόμενης με ουδετεροφιλική ζελατινάση (NGAL) (R&D Systems, Αρ. Κατ. MLCN20) από οδηγίες του κατασκευαστή.

2.11. Στατιστικές Δοκιμές

Σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το Student's t-test. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές για τις τιμές p<0.05

3. Αποτελέσματα

3.1. Οι ολιγοσακχαρίτες αναστέλλουν την αύξηση του CD44 και των κυτοκινών στα υποξικά κύτταρα NRK-52E

Η έκφραση CD44 σε κύτταρα NRK-52Ε που υποβλήθηκαν σε αγωγή με FC, FOS και GOS παρακολουθήθηκε αρχικά για να αξιολογηθεί η επίδραση των ολιγοσακχαριτών στα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα. Η προκαλούμενη από υποξία έκφραση CD44 αναστέλλεται και από τους τρεις ολιγοσακχαρίτες στην περιοχή 0.05–0,5 mg/mL (Εικόνα 1Α). Ως εκ τούτου, η δόση ολιγοσακχαρίτη των 0,1 mg/mL χρησιμοποιήθηκε στα ακόλουθα πειράματα κυττάρων. Στο παρασκευασμένο σύστημα, η θεραπεία υποξίας προκάλεσε αξιοσημείωτα την έκφραση του δείκτη υποξίας HIF{-1 στα κύτταρα NRK-52Ε, υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα ήταν σε κατάσταση υποξίας (Εικόνα 1Β). Η υποξία ρύθμισε τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης JNK, MCP{-1, IL-1 και TNF- αλλά όχι στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ολιγοσακχαρίτες (Εικόνα 1Β, Γ). Η έκφραση JNK αυξήθηκε σε υποξικά κύτταρα αλλά όχι σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με FC ή σε αγωγή με FOS. Το GOS δεν επηρέασε την έκφραση της JNK σε υποξικά κύτταρα, αλλά κατέστειλε την ανοδική ρύθμιση της φωσφορυλιωμένης JNK. Επομένως, οι ολιγοσακχαρίτες μπορούν να αναστείλουν την επαγόμενη από υποξία μεταγωγή σηματοδότησης JNK και την έκφραση κυτοκίνης σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα. Αν και το FC και το GOS ρύθμισαν προς τα πάνω το φωσφορυλιωμένο p38 σε υποξικά κύτταρα, η έκφραση αυτής της πρωτεΐνης δεν αυξήθηκε στα υποξικά κύτταρα. Αυτό το εύρημα υποδεικνύει ότι η ρ38 δεν παίζει βασικό ρόλο στις αποκρίσεις που προκαλούνται από υποξία στα κύτταρα NRK-52Ε.

3.2. Τα CD44 και JNK παίζουν κρίσιμο ρόλο στην αύξηση της κυτοκίνης στα υποξικά κύτταρα NRK-52E

Η έκφραση του CD44, της φωσφορυλιωμένης JNK και των κυτοκινών στα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα επηρεάστηκαν όλα από ολιγοσακχαρίτες, αλλά η συσχέτισή τους μένει να διευκρινιστεί. Για να διερευνηθεί ο ρόλος του CD44 στη μεταγωγή σηματοδότησης JNK και στην έκφραση κυτοκίνης σε υποξικά κύτταρα, τα κύτταρα NRK-52Ε διαμολύνθηκαν με διαφορετικές δόσεις CD44 siRNA. Το CD44 siRNA στις 50 και 100 μ.μ. εμπόδισε αποτελεσματικά την αυξημένη από την υποξία έκφραση του CD44 και ανέστειλε σημαντικά την επαγόμενη από υποξία αύξηση στα επίπεδα των φωσφορυλιωμένων JNK, MCP{10}}, IL-1 και TNF- (Εικόνα 2Α). Η επίδραση του αποκλεισμού του CD44 στην έκφραση JNK σχετιζόταν με τις δόσεις του siRNA. Η έκφραση JNK σε υποξικά κύτταρα προκλήθηκε από CD44 siRNA στα 50 ρΜ αλλά ανεστάλη στα 100 ρΜ. Και οι δύο δόσεις κατέστειλαν την ανοδική ρύθμιση της φωσφορυλιωμένης JNK. Ο εκλεκτικός αναστολέας για JNK, SP600125, μείωσε σημαντικά την έκφραση των MCP-1, IL-1 και TNF- σε υποξικά NRK-52Ε κύτταρα (Εικόνα 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ανασταλτική επίδραση της επιμόλυνσης CD44 siRNA σε κυτοκίνες που προκαλούνται από υποξία αποδίδεται σε μείωση της φωσφορυλιωμένης JNK.

Σχήμα 1. Ανασταλτική επίδραση ολιγοσακχαριτών στη μεταγωγή σήματος CD44 σε υποξικά κύτταρα NRK-52Ε. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με FC, FOS ή GOS για 30 λεπτά και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε υποξική καλλιέργεια. Η έκφραση πρωτεΐνης αναλύθηκε με στύπωμα Western. (Α) Δοσοεξαρτώμενες επιδράσεις των ολιγοσακχαριτών στην έκφραση του CD44. (Β) Επίδραση ολιγοσακχαριτών σε σήματα που σχετίζονται με CD44-. Η συγκέντρωση ολιγοσακχαρίτη ορίστηκε ως 0,1 mg/mL. Οι σχετικές αυξήσεις στις πρωτεϊνικές ζώνες παρουσιάζονται επίσης σε μορφή ραβδόγραμματος (C). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD (n=4).

Σχήμα 2. Ο ρόλος των CD44 και JNK σε φλεγμονώδεις αποκρίσεις που προκαλούνται από υποξία σε κύτταρα NRK-52Ε. Η έκφραση πρωτεΐνης αναλύθηκε με στύπωμα Western. (Α) Ανασταλτική επίδραση της επιμόλυνσης CD44 siRNA σε φωσφορυλιωμένη JNK και κυτοκίνες. (Β) Ανασταλτική επίδραση του SP600125 στις κυτοκίνες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 20 μΜ SP600125 για 30 λεπτά αγωγή πριν από την υποξία. Οι σχετικές αυξήσεις στις ζώνες πρωτεΐνης παρουσιάζονται επίσης σε μορφή ραβδόγραμμα. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD (n=4).

3.3. Η επαγόμενη από υποξία έκκριση κυτοκίνης σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα προάγει τον πολλαπλασιασμό των μακροφάγων

Η φλεγμονή είναι μεσολαβητής της νεφρικής βλάβης στο ΑΚΙ. Ως εκ τούτου, εξετάστηκε η επίδραση της ολιγοσάκκας στα λευκοκύτταρα. Το Σχήμα 3Α δείχνει ότι τα FC, FOS και GOS δεν επηρέασαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων RAW264.7 μακροφάγων. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων RAW264.7 προωθήθηκε από το 24-μέσο καλλιέργειας ώρας για υποξικά κύτταρα NRK-52Ε (Εικόνα 3Β) αλλά όχι από το μέσο για τα υποξικά κύτταρα NRK-52Ε που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ολιγοσακχαρίτες. Το πρώτο είχε υψηλότερα επίπεδα MCP-1 και IL{-1 από το δεύτερο (Εικόνα 3Γ, Δ). Και οι τρεις ολιγοσακχαρίτες μείωσαν σημαντικά το MCP-1 και το IL{-1 στο μέσο καλλιέργειας των υποξικών NRK-52Ε κυττάρων. Επομένως, τα FC, FOS και GOS μπορούν να μειώσουν την έκφραση και την έκκριση κυτοκινών σε υποξικά νεφρικά σωληναριακά κύτταρα και, κατά συνέπεια, να μειώσουν τη φλεγμονή που προκαλείται από τραυματισμένα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα.