Πολλαπλών κατευθύνσεων Δραστηριότητα Του Bakuchiol Κατά Κυτταρικός Μηχανισμοί Του Προσώπου Γήρανση - Πειραματικό Αποδεικτικά στοιχεία Για Α Ολιστική Θεραπεία Προσέγγιση Μέρος 1

Αφηρημένη

Σκοπός: Η γήρανση του δέρματος είναι μια πολυπαραγοντική διαδικασία που περιλαμβάνει το σχηματισμό ενεργών ειδών οξυγόνου, διαδοχική φλεγμονή με μειωμένη βιωσιμότητα των επιδερμικών και δερματικών κυττάρων και ως αποτέλεσμα βλάβης στην εξωκυτταρική μήτρα. Οι αποτελεσματικές μέθοδοι δερμο-καλλυντικής θεραπείας θα πρέπει ιδανικά να αντιμετωπίζουν αυτά τα χαρακτηριστικά σε μια ολιστική προσέγγιση. Εδώ, προσδιορίσαμε το αντίστοιχο προφίλ δραστηριότητας της bakuchiol, ενός μεροτερπενίου που προέρχεται από φυτά, σε μια σειρά από μελέτες in vitro, ex vivo και in vivo και το συγκρίνουμε με τη ρετινόλη, που επί του παρόντος θεωρείται το χρυσό πρότυπο στα τοπικά αντιγηραντικά καλλυντικά.

Το γλυκοσίδιο του cistanche μπορεί επίσης να αυξήσει τη δραστηριότητα του SOD στους ιστούς της καρδιάς και του ήπατος και να μειώσει σημαντικά την περιεκτικότητα σε λιποφουσκίνη και MDA σε κάθε ιστό, καθαρίζοντας αποτελεσματικά διάφορες δραστικές ρίζες οξυγόνου (OH-, H2O2, κ.λπ.) και προστατεύοντας από βλάβη του DNA που προκαλείται από ρίζες ΟΗ. Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες του Cistanche έχουν ισχυρή ικανότητα δέσμευσης ελεύθερων ριζών, υψηλότερη αναγωγική ικανότητα από τη βιταμίνη C, βελτιώνουν τη δραστηριότητα του SOD στο εναιώρημα σπέρματος, μειώνουν την περιεκτικότητα σε MDA και έχουν μια ορισμένη προστατευτική δράση στη λειτουργία της σπερματικής μεμβράνης. Οι πολυσακχαρίτες Cistanche μπορούν να ενισχύσουν τη δραστηριότητα των SOD και GSH-Px σε ερυθροκύτταρα και ιστούς πνευμόνων πειραματικά γηρασμένων ποντικών που προκαλούνται από D-γαλακτόζη, καθώς και να μειώσουν την περιεκτικότητα σε MDA και κολλαγόνο στους πνεύμονες και στο πλάσμα και να αυξήσουν την περιεκτικότητα σε ελαστίνη. ένα καλό αποτέλεσμα σάρωσης στο DPPH, παρατείνει το χρόνο της υποξίας σε γηρασμένα ποντίκια, βελτιώνει τη δραστηριότητα του SOD στον ορό και καθυστερεί τον φυσιολογικό εκφυλισμό του πνεύμονα σε πειραματικά γηρασμένα ποντίκια Με τον κυτταρικό μορφολογικό εκφυλισμό, τα πειράματα έχουν δείξει ότι το Cistanche έχει την καλή αντιοξειδωτική ικανότητα και έχει τη δυνατότητα να είναι φάρμακο για την πρόληψη και τη θεραπεία ασθενειών της γήρανσης του δέρματος. Ταυτόχρονα, η εχινακοσίδη στο Cistanche έχει σημαντική ικανότητα να καθαρίζει τις ελεύθερες ρίζες DPPH και μπορεί να καθαρίζει δραστικά είδη οξυγόνου, να αποτρέπει την αποικοδόμηση του κολλαγόνου που προκαλείται από ελεύθερες ρίζες και επίσης έχει μια καλή επίδραση επιδιόρθωσης στη βλάβη των ανιόντων από τις ελεύθερες ρίζες θυμίνης.

Κάντε κλικ στο Antioxidant Cistanche Tubulosa

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Μέθοδοι: Η αντιοξειδωτική ικανότητα και η ισχύς της βακουχιόλης και της ρετινόλης αναλύθηκαν με μέτρηση της μείωσης του 2,2'-διφαινυλ-1-πικρυυλυδραζυλίου (DPPH) μέσω της διάσπασης απορρόφησης και της φασματοσκοπίας συντονισμού σπιν ηλεκτρονίων, αντίστοιχα. Επιδράσεις στα επίπεδα προσταγλανδίνης Ε2 (PGE2), ανασταλτικού παράγοντα μετανάστευσης μακροφάγων (MIF), αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών 7 (FGF7), κολλαγόνου τύπου Ι και VII (COL1A1, COL7A1), ινονεκτίνης (FN) καθώς και στον μεταβολισμό του υδατοδιαλυτού τετραζολίου 1 (WST-1) προσδιορίστηκαν σε ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες. Η επιδερμική αναγέννηση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα in vitro μοντέλο επούλωσης πληγών. Τα επίπεδα πρωτεΐνης FN αναλύθηκαν ex vivo μετά από επεξεργασία με ένα σκεύασμα που περιείχε βακουχιόλη, ρετινόλη ή όχημα χρησιμοποιώντας υγρό κυψέλης αναρρόφησης. Η βελτίωση της κατάστασης του δέρματος προσδιορίστηκε in vivo σε μια μελέτη σύγκρισης διαχωρισμένων προσώπων μετά την εφαρμογή bakuchiol ή φορέα.

Αποτελέσματα: Σε αντίθεση με τη ρετινόλη, η bakuchiol επέδειξε υψηλή αντιοξειδωτική αποτελεσματικότητα. Τα επίπεδα των PGE2 και MIF μειώθηκαν σημαντικά τόσο από την βακουχιόλη όσο και από τη ρετινόλη. Η βακουχιόλη αλλά όχι η ρετινόλη αύξησαν σημαντικά τα επίπεδα πρωτεΐνης FGF7. Τα επίπεδα μεταβολισμού WST-1 αυξήθηκαν σημαντικά από την βακουχιόλη και τη ρετινόλη. Η εφαρμογή Bakuchiol και ρετινόλης οδήγησε σε σημαντική αύξηση των επιπέδων πρωτεΐνης COL1A1, COL7A1 και FN. Οι πληγές που συμπληρώθηκαν με bakuchiol αλλά όχι ρετινόλη εμφάνισαν σημαντική αύξηση στην αναγέννηση της επιδερμίδας. Κλινικά, οι περιοχές που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σκεύασμα που περιέχει βακουχιόλη έδειξαν στατιστικά σημαντική αύξηση στις τιμές πρωτεΐνης FN μετά από εφαρμογή 4- εβδομάδας σε σύγκριση με περιοχές που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία και περιοχές που έλαβαν θεραπεία με όχημα.

συμπέρασμα: Αυτά τα δεδομένα παρέχουν στοιχεία για την πολυκατευθυντική αποτελεσματικότητα της bakuchiol έναντι των κυτταρικών χαρακτηριστικών της γήρανσης του δέρματος. Το προφίλ δραστηριότητάς του μοιράζεται ορισμένα κοινά χαρακτηριστικά με τη ρετινόλη, αλλά δείχνει αρκετά άγνωστα μέχρι τώρα θετικά αποτελέσματα στις μελέτες μας, συγκεκριμένα διέγερση του κρίσιμου συστατικού εξωκυτταρικής μήτρας FN και επιταχυνόμενη επιδερμική αναγέννηση και επούλωση τραυμάτων.

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ

αντιγήρανση, bakuchiol, ισχυρισμός τεκμηρίωσης in vivo/ex vivo/in vitro, ρετινόλη, φυσιολογία δέρματος/δομές

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Το γερασμένο δέρμα χαρακτηρίζεται από ρυτίδες, ανομοιόμορφη μελάγχρωση, τραχύτητα δέρματος και χαλαρότητα. Αυτά τα κλινικά σημεία είναι το αποτέλεσμα δομικών και μεταβολικών αλλοιώσεων που προκαλούνται από διαδικασίες ενδογενούς και εξωτερικής γήρανσης. Η εγγενής γήρανση έχει αποδοθεί σε παράγοντες όπως η βράχυνση των τελομερών, η χρόνια φλεγμονή, οι μεμονωμένες μεταλλάξεις του μιτοχονδριακού DNA και οι ελεύθερες ρίζες [1]. Το γερασμένο δέρμα περιλαμβάνει περαιτέρω μείωση των αντιοξειδωτικών του συστημάτων[2]. Επίσης, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων μειώνεται λόγω της βιολογικής διαδικασίας γήρανσης που οδηγεί σε απώλεια της δομής και της λειτουργίας του δέρματος. Η εξωτερική γήρανση πυροδοτείται κυρίως από την υπεριώδη ακτινοβολία και τις περιβαλλοντικές επιδράσεις. Αυτές οι προσβολές οδηγούν σε βλάβες του δέρματος που ενισχύουν τη χρονολογική πτώση και επιταχύνουν τη γήρανση του δέρματος. Το ανθρώπινο δέρμα χάνει περαιτέρω την ικανότητα να αντιμετωπίζει φλεγμονώδεις καταστάσεις κατά τη διάρκεια της γήρανσης, με αποτέλεσμα μια χρόνια προφλεγμονώδη κατάσταση.

Η τοπική εφαρμογή ρετινοειδών όπως το ρετινοϊκό οξύ, η ρετινάλη ή η ρετινόλη θεωρείται ως το κλινικό χρυσό πρότυπο για αποτελεσματική θεραπεία αντιγήρανσης [3, 4]. Οι μοριακοί μηχανισμοί των ρετινοειδών έχουν περιγραφεί εκτενώς [5-10]. Τα τοπικά ρετινοειδή μειώνουν αποτελεσματικά τα ορατά σημάδια γήρανσης όπως οι ρυτίδες, η χαλαρότητα ή η τραχύτητα [4, 11] και μειώνουν την αποχρωματισμό του δέρματος που έχει υποστεί φωτοφθορές, συμπεριλαμβανομένου του livedo reticularis και των ακτινικών φακοειδών [12]. Ωστόσο, η τοπική θεραπεία με ρετινοειδή μπορεί να οδηγήσει σε ξηρότητα και ερεθισμό του δέρματος που εξαρτάται από τη συγκέντρωση [13]. Καθώς η εφαρμογή ρετινόλης προκαλεί μικρές ανεπιθύμητες αντιδράσεις σε σύγκριση με άλλα ρετινοειδή όπως το ρετινοϊκό οξύ [6, 14], είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο δραστικό στην καλλυντική θεραπεία της γήρανσης του προσώπου.

Σε αντίθεση με τη ρετινόλη που εφαρμόζεται σε προϊόντα περιποίησης δέρματος από το 1984 [15], η bakuchiol μόλις πρόσφατα κέρδισε την προσοχή ως τοπική αντιγηραντική ένωση. Το Bakuchiol είναι ένα μεροτερπένιο (Εικόνα 1) που προέρχεται από σπόρους Psoralea corylifolia. Έχει χρησιμοποιηθεί στην παραδοσιακή ινδική και κινεζική ιατρική εδώ και αιώνες [16, 17] και είναι καλά ανεκτή [18]. Η Bakuchiol προτάθηκε να παρουσιάζει λειτουργίες παρόμοιες με τη ρετινόλη, καθώς σε ένα μοντέλο υποκατάστατου δέρματος, και οι δύο ουσίες εμφανίζουν παρόμοια πρότυπα γονιδιακής έκφρασης in vitro [19] και μια βελτίωση της δερματικής φωτοφθοράς in vivo [20]. Ως εκ τούτου, έχει επίσης αναφερθεί ως λειτουργικό ανάλογο ρετινοειδών φυτικής προέλευσης [21]. Περαιτέρω μελέτες κατέδειξαν αντιοξειδωτικές [19, 22-24], αντιφλεγμονώδεις [19, 25-27], αντιβακτηριακές [28] καθώς και αντιπολλαπλασιαστικές και αντικαρκινικές επιδράσεις [29, 30] της βακουχιόλης.

Για να βελτιωθούν αποτελεσματικά και να καθυστερήσουν οι πολυπαραγοντικές διαδικασίες γήρανσης του δέρματος, διαφορετικοί κυτταρικοί μηχανισμοί πρέπει να αντιμετωπιστούν σε μια ολοκληρωμένη προσέγγιση. Το Bakuchiol διαμορφώνει ταυτόχρονα διάφορους στόχους καθιστώντας το μια πολλά υποσχόμενη ένωση από αυτή την άποψη. Καθώς το οξειδωτικό και το φλεγμονώδες στρες σχετίζονται στενά με τη γήρανση του δέρματος, η πρόληψή τους από το bakuchiol μπορεί να προάγει τη συνολική κατάσταση του δέρματος. Ωστόσο, η ποιότητα των τρεχόντων επιστημονικών στοιχείων έχει πρόσφατα αξιολογηθεί κριτικά [31]. Σε αυτό το πλαίσιο, προσδιορίσαμε τις (i) αντιοξειδωτικές και (ii) αντιφλεγμονώδεις ικανότητες της βακουχιόλης και της ρετινόλης και εξετάσαμε την ικανότητά τους να βελτιώνουν τον κυτταρικό μεταβολισμό και τη σύνθεση του αυξητικού παράγοντα 7 που συνοψίζεται ως (iii) κυτταρική δραστηριότητα. Αναλύσαμε περαιτέρω εάν η bakuchiol και η ρετινόλη επηρεάζουν την έκφραση ορισμένων (iv) συστατικών ECM και βελτιώνουν (v) την επιδερμική αναγέννηση και επαναεπιθηλιοποίηση. Τέλος, διεξήχθη in vivo μελέτη για την επαλήθευση της κλινικής αντιγηραντικής ικανότητας της bakuchiol στο ανθρώπινο δέρμα.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Υλικά δοκιμής

Το Bakuchiol ελήφθη από την Sytheon Ltd (Boonton, New Jersey, Ηνωμένες Πολιτείες). Η ρετινόλη αγοράστηκε από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, Ηνωμένες Πολιτείες). Για πειράματα κυτταροκαλλιέργειας, και οι δύο υπό δοκιμή ουσίες αραιώθηκαν πρόσφατα σε DMSO (Merck, Darmstadt, Γερμανία). Για τα μητρικά διαλύματα DMSO, η εφαρμοζόμενη συγκέντρωση των ελεγχόμενων ουσιών ήταν 1000- φορές μεγαλύτερη από την υψηλότερη συγκέντρωση που εφαρμόστηκε σε κυτταρική καλλιέργεια αποδίδοντας 0.1 τοις εκατό DMSO σε μέσα ή ρυθμιστικό διάλυμα. Πραγματοποιήθηκαν περαιτέρω αραιώσεις χρησιμοποιώντας μέσα ή ρυθμιστικό διάλυμα με 0.1 τοις εκατό DMSO. Ως εκ τούτου, όλα τα πειράματα κυτταροκαλλιέργειας πραγματοποιήθηκαν παρουσία 0,1 τοις εκατό DMSO. Για τις in vivo μελέτες, η τοπική ρετινόλη διαμορφώθηκε στον ίδιο φορέα με την bakuchiol.

Μελέτες in vitro

Προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής ικανότητας

Η Bakuchiol, η ρετινόλη (και οι δύο εφαρμόστηκαν σε τελική συγκέντρωση 100μM) ή το υψηλών προδιαγραφών trolox (Merck, τελική συγκέντρωση 25μM) αραιώθηκαν σε DMSO. Εν συντομία, 30 μL από αυτές τις ενώσεις (10-πλάσια μεγαλύτερη συγκέντρωση από την τελική συγκέντρωση ανάλυσης) προστέθηκαν σε μια 96-πλάκα με επίπεδο πυθμένα καλά. Στη συνέχεια, 270 μL 39 ug/mL DPPH (Merck, αραιωμένο σε μείγμα νερού/αιθανόλης 1:1) προστέθηκαν γρήγορα σε κάθε φρεάτιο δίνοντας τελική συγκέντρωση 10 τοις εκατό DMSO. Ως έλεγχος, το διάλυμα DPPH επωάστηκε με DMSO που στερούνταν ελεγχόμενες ουσίες. Περαιτέρω, διεξήχθησαν τυφλά μάρτυρες με επώαση βακουχιόλης ή ρετινόλης με νερό/αιθανόλη (1:1) ή μόνο το μίγμα νερού/αιθανόλης (1:1) που περιείχε 10 τοις εκατό DMSO απουσία DPPH. Μετά από 10, 30 και 60 λεπτά, η απορρόφηση στα 524 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πολλαπλών λειτουργιών Spark (Tecan, Männedorf, Ελβετία). Τα σήματα των κενών μαρτύρων αφαιρέθηκαν.

Προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής ισχύος

Τα HDF σπάρθηκαν σε {{0}}πλάκες φρεατίου με 150 000 κύτταρα/φρεάτιο σε μέσο 2 mL που περιείχε 10 τοις εκατό ορό μόσχου και επωάστηκαν για 24 ώρες. Στη συνέχεια, το παλιό μέσο απορρίφθηκε και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα μέσο που περιείχε 2 τοις εκατό ορό μόσχου και μπακουχιόλη ή ρετινόλη σε τελική συγκέντρωση 10 μΜ. Τα HDF ελέγχου συμπληρώθηκαν με 0,1 τοις εκατό DMSO χωρίς βακουχιόλη ή ρετινόλη. Τα τυφλά μάρτυρες πραγματοποιήθηκαν με επώαση ενός μέσου χωρίς κύτταρα. Μετά από 24 ώρες, το ρυθμισμένο μέσο μεταφέρθηκε σε στήλες περιδίνησης του συμπυκνωτή πρωτεΐνης Vivaspin (5000 MWCO· Sartorius, Göttingen, Γερμανία) και συμπυκνώθηκε περίπου 10- φορές. Οι όγκοι όλων των υπερκειμένων του μέσου εξισώθηκαν με την εκ νέου προσθήκη της ροής. Τα επίπεδα πρωτεΐνης FGF7 του συμπυκνωμένου ρυθμισμένου μέσου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ ELISA ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (Bio-Techne GmbH). Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πολλαπλών λειτουργιών Spark (Tecan). Τα σήματα που ελήφθησαν από τυφλά μάρτυρες αφαιρέθηκαν και τα επίπεδα πρωτεΐνης FGF7 κανονικοποιήθηκαν στον συνολικό αριθμό κυττάρων που προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν μετρητή κυττάρων (Scepter, Merck).

Προσδιορισμός μεταβολισμού WST-1

Τα HDF σπάρθηκαν σε τρυβλία {{0}}πηγαδιών με 3000 κύτταρα/φρεάτιο σε μέσο 100 μL που περιείχε 10 τοις εκατό ορό μόσχου και επωάστηκαν για 24 ώρες. Το εξαντλημένο μέσο απορρίφθηκε και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μέσο 100 μL που περιείχε ρετινόλη ή μπακουχιόλη σε τελική συγκέντρωση 1 μΜ ή 10 μΜ, αντίστοιχα. Τα HDF ελέγχου συμπληρώθηκαν με 0,1 τοις εκατό DMSO χωρίς βακουχιόλη ή ρετινόλη. Ως περαιτέρω έλεγχος, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 τοις εκατό triton-X (Merck). Τα τυφλά μάρτυρες πραγματοποιήθηκαν με επώαση ενός μέσου χωρίς κύτταρα. Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το εμπορικά διαθέσιμο αντιδραστήριο πολλαπλασιασμού κυττάρων WST-1 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Merck). Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 και 620 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας Tecan infinity M200 (Tecan). Η διαφορά σε αυτές τις μετρήσεις χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση. Τα σήματα των κενών μαρτύρων αφαιρέθηκαν.

Προσδιορισμός των επιπέδων πρωτεΐνης COL1A1 και COL7A1

Τα HDF σπάρθηκαν σε {{{0}}πλάκες φρεατίου με 10  000 κύτταρα/φρεάτιο σε μέσο 100 μL που περιείχε 10 τοις εκατό ορό μόσχου και επωάστηκαν για 24 ώρες. Η βακουχιόλη ή η ρετινόλη αραιώθηκαν σε μέσο 100 μL χωρίς ορό μόσχου και συμπληρώθηκαν με το παρόν μέσο σε τελική συγκέντρωση 1 μΜ ή 10 μΜ, αντίστοιχα. Ο έλεγχος συμπληρώθηκε με 100μL μέσο χωρίς ορό που απέδωσε συγκέντρωση 0,1 τοις εκατό DMSO που αντιστοιχεί στη θεραπεία με ρετινόλη και βακουχιόλη. Ως υψηλό πρότυπο, εφαρμόστηκαν 10 ng/mL αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού (TGF-) και 11 μg/mL ασκορβικού νατρίου (και τα δύο Merck). Τα τυφλά μάρτυρες πραγματοποιήθηκαν με επώαση ενός μέσου χωρίς κύτταρα. Μετά από 4 ώρες, τα επίπεδα πρωτεΐνης COL1A1 και COL7A1 του ρυθμισμένου μέσου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα κιτ ELISA ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (Novus Biologicals, Littleton, Κολοράντο, Ηνωμένες Πολιτείες). Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πολλαπλών λειτουργιών Spark (Tecan). Τα σήματα των κενών μαρτύρων αφαιρέθηκαν. Τα επίπεδα πρωτεϊνών COL1A1 και COL7A1 κανονικοποιήθηκαν στη συνολική ποσότητα πρωτεΐνης κυτταρολύματος που προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ ανάλυσης δικινχονικού οξέος (Thermo Fisher Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Προϋπόθεση για τη χρήση των αποτελεσμάτων ήταν η θετική αντίδραση των κυττάρων στον υψηλού επιπέδου TGF- και ασκορβικό νάτριο.

Για ανάλυση των επιπέδων πρωτεΐνης COL7A1 μετά από παρατεταμένο χρόνο επώασης, τα HDF σπάρθηκαν σε 96-πλάκες με 3000 κύτταρα/φρεάτιο σε μέσο 100 μL που περιείχε 10 τοις εκατό ορό μόσχου. Όλες οι επεξεργασίες, οι έλεγχοι και η ανάλυση πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω με την εξαίρεση ότι η βακουχιόλη και η ρετινόλη χρησιμοποιήθηκαν μόνο σε τελική συγκέντρωση 10 μΜ. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν όταν επιτεύχθηκε υποσυρροή, ιδιαίτερα μετά από 72 ή 96 ώρες.

Προσδιορισμός των επιπέδων πρωτεΐνης FN

Τα HDF σπάρθηκαν σε τρυβλία {{0}}πηγαδιών με 10 000 κύτταρα/φρεάτιο σε μέσο 100 μL που περιείχε 10 τοις εκατό ορό μόσχου και επωάστηκαν για 24 ώρες. Το παλιό μέσο αντικαταστάθηκε από ένα μέσο που περιείχε 2 τοις εκατό ορό μόσχου και βακουχιόλη ή ρετινόλη σε τελική συγκέντρωση 10 μΜ. Ο έλεγχος συμπληρώθηκε με 0,1 τοις εκατό DMSO χωρίς βακουχιόλη ή ρετινόλη. Τα τυφλά μάρτυρες πραγματοποιήθηκαν με επώαση ενός μέσου χωρίς κύτταρα. Μετά από 24 ώρες, τα επίπεδα πρωτεΐνης FN του ρυθμισμένου μέσου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ ELISA ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, Ηνωμένες Πολιτείες). Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πολλαπλών λειτουργιών Spark (Tecan). Τα σήματα των κενών μαρτύρων αφαιρέθηκαν. Τα επίπεδα πρωτεΐνης FN κανονικοποιήθηκαν στη συνολική ποσότητα πρωτεΐνης κυτταρολύματος που προσδιορίστηκε όπως προαναφέρθηκε.

Προσδιορισμός της επιδερμικής αναγέννησης σε ένα in vitro μοντέλο επούλωσης πληγών

Τα πειράματα διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Για τη θεραπεία μοντέλων επούλωσης τραυμάτων, η βακουχιόλη ή η ρετινόλη αραιώθηκαν σε DPBS και προστέθηκαν σε τελική συγκέντρωση 100μM στην περιοχή του τραύματος (5 μL ανά πληγή). Τα τραύματα αναφοράς συμπληρώθηκαν με την ίδια ποσότητα DPBS που περιέχει 0,1 τοις εκατό DMSO χωρίς βακουχιόλη ή ρετινόλη. Επιπλέον τραύματα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ως περαιτέρω έλεγχος. Τα μοντέλα επούλωσης πληγών επωάστηκαν για 43 ώρες σε 95 τοις εκατό υγρασία, 5 τοις εκατό CO2 και 37 βαθμούς. Στη συνέχεια, τα δείγματα καταψύχθηκαν γρήγορα σε ισοπεντάνιο προψυγμένο με υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 βαθμούς. Η επαναεπιθηλιοποίηση αξιολογήθηκε σε τομές κρυοστάτη βαμμένες με αιματοξυλίνη και ηωσίνη μετρώντας το μήκος της αναγεννημένης επιδερμίδας χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Leica DMLS (10×), κάμερα Leica MC 170 HD CCD και το λογισμικό Leica LAS V4.9 (Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία). Η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε με τυφλό τρόπο.

In vivo μελέτες I και II

Και για τις δύο in vivo μελέτες, οι συστάσεις της τρέχουσας έκδοσης της Διακήρυξης του Ελσίνκι και οι κατευθυντήριες γραμμές της Διεθνούς Διάσκεψης για την Εναρμόνιση της Ορθής Κλινικής Πρακτικής τηρήθηκαν ως ισχύουσες για μια κοσμητική μελέτη. Το πρωτόκολλο σπουδών Ι εγκρίθηκε από την Ανεξάρτητη Επιτροπή Δεοντολογίας Φράιμπουργκ (κωδικός φέκι 08/2610). Και στις δύο μελέτες, όλοι οι εθελοντές παρείχαν γραπτή, ενημερωμένη συγκατάθεση. Τα άτομα είχαν υγιές δέρμα, ανήκαν στον τύπο δέρματος Fitzpatrick I έως III και η έναρξη ή η αλλαγή της ορμονικής φαρμακευτικής αγωγής ήταν ένα κριτήριο αποκλεισμού.

Κατά τη διάρκεια μιας περιόδου προετοιμασίας 10-ημέρας και καθ' όλη τη διάρκεια της περιόδου μελέτης, τα υποκείμενα έπρεπε να απέχουν από την έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία στις περιοχές δοκιμής. Οι δραστηριότητες που προωθούν τον ιδρώτα απαγορεύτηκαν 24 ώρες πριν από τις προγραμματισμένες αξιολογήσεις.

Ένας ερευνητής έδειξε τη σωστή εφαρμογή των σκευασμάτων χρησιμοποιώντας μια ποσότητα, η οποία αντιστοιχούσε στο συνηθισμένο σχήμα φροντίδας του δέρματος των ατόμων.

Μελέτη Ι: Ex vivo προσδιορισμός των επιπέδων πρωτεΐνης FN

Από τις 52 γυναίκες που εντάχθηκαν σε αυτή τη μελέτη ελεγχόμενη από όχημα, 33 άτομα ολοκλήρωσαν τη μελέτη και τα δεδομένα 31 ατόμων (30–64 ετών, μέση ηλικία: 50,9 έτη) συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση δεδομένων. Οι εγκαταλείψεις συνέβησαν λόγω πανδημίας SARS-CoV-2 και προσωπικών λόγων (13 άτομα) καθώς και λόγω αντιδράσεων ασυμβατότητας (πέντε άτομα, που προκλήθηκαν από θεραπεία με ρετινόλη). Οι αντιδράσεις ασυμβατότητας που προκαλούνται από τη ρετινόλη καθώς και τα προβλήματα δειγματοληψίας προκάλεσαν διαφορετικούς αριθμούς ατόμων που εξετάστηκαν για κάθε πάθηση (βλ. αποτελέσματα για λεπτομέρειες).

Επτά ημέρες πριν από τις προγραμματισμένες αξιολογήσεις, απαγορεύτηκε η χρήση προϊόντων περιποίησης δέρματος, καθαριστικών και σαπουνιών στους πήχεις. Την πρώτη ημέρα της μελέτης, καθορίστηκαν τέσσερις περιοχές δοκιμής στους εσωτερικούς πήχεις. Σε δύο περιοχές δοκιμής, εφαρμόστηκαν δύο σκευάσματα verum που περιέχουν {{0}},5 τοις εκατό βακουχιόλη ή 0,15 τοις εκατό ρετινόλη, αντίστοιχα. Σε μια γνώμη που δημοσιεύθηκε από την Επιστημονική Επιτροπή για την Ασφάλεια των Καταναλωτών το 2016, η εφαρμοζόμενη συγκέντρωση ρετινόλης θεωρήθηκε ως καλλυντική θεραπεία [35]. Στις άλλες δύο περιοχές δοκιμής χρησιμοποιήθηκε το αντίστοιχο όχημα ή η περιοχή αφέθηκε χωρίς επεξεργασία. Η τοποθέτηση των θέσεων θεραπείας μετατράπηκε. Μετά από 4 εβδομάδες εφαρμογής δύο φορές την ημέρα των σκευασμάτων δοκιμής, οι εθελοντές επέστρεψαν στο ινστιτούτο δοκιμών. Σε κάθε περιοχή δοκιμής, δημιουργήθηκαν τρεις κυψέλες αναρρόφησης (διαμέτρου 7 mm) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36, 37]. Εν συντομία, τοποθετήθηκαν ειδικά κατασκευασμένες βεντούζες βεντούζες στις περιοχές δοκιμής και εφαρμόστηκε κενό 550–850 mbar. Μετά από περίπου 90–150 λεπτά, όταν είχαν σχηματιστεί φουσκάλες αναρρόφησης, απελευθερώθηκε το κενό και το υγρό αναρροφήθηκε από την κυψέλη χρησιμοποιώντας μια 24-βελόνα μετρητή. Τα υγρά καταψύχθηκαν αμέσως στους -80 βαθμούς σε ξηρό πάγο μέχρι την ανάλυση. Τα επίπεδα πρωτεΐνης FN ποσοτικοποιήθηκαν σε δείγματα υγρού κυψέλης αναρρόφησης χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ ELISA (R&D Systems). Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πολλαπλών λειτουργιών Spark (Tecan). Τα επίπεδα FN κανονικοποιήθηκαν στα ολικά επίπεδα πρωτεΐνης των δειγμάτων υγρού κυψέλης αναρρόφησης που προσδιορίστηκαν όπως προαναφέρθηκε.

Μελέτη II: In vivo προσδιορισμός της βελτίωσης της κατάστασης του δέρματος

Συνολικά, 43 γυναίκες εθελόντριες εγγράφηκαν σε αυτή τη μελέτη σύγκρισης σπασμένων προσώπων ελεγχόμενη από όχημα. Σύμφωνα με ιατρικές εκτιμήσεις, τα άτομα εμφάνισαν μεικτούς τύπους δέρματος (ξηρό, κανονικό, λιπαρό και μεικτό δέρμα). 34 άτομα (39–66 ετών, μέση ηλικία: 56,2 έτη) ολοκλήρωσαν τη μελέτη και συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση. Οι εγκαταλείψεις προκλήθηκαν από τεχνικά προβλήματα και μη συμμόρφωση (οκτώ άτομα), καθώς και από αντιδράσεις ασυμβατότητας (ένα άτομο, που προκλήθηκε από τη θεραπεία με όχημα και bakuchiol).

Δύο εβδομάδες πριν από την έναρξη της μελέτης και κατά τη διάρκεια ολόκληρης της περιόδου μελέτης, οι εθελοντές έπρεπε να απέχουν από τη χρήση προϊόντων αυτομαυρίσματος ή εντατικών καλλυντικών θεραπειών προσώπου (π.χ. αφαίρεση επιφανειακών στρωμάτων δέρματος). Κατά τη διάρκεια της περιόδου προετοιμασίας της ημέρας 10-και καθ' όλη τη διάρκεια της μελέτης, ζητήθηκε από τα υποκείμενα να απέχουν από την εκτέλεση μόνιμου μακιγιάζ, θεραπείες βλεφαρίδων και φρυδιών, μάσκες ματιών και επιθέματα. Τρεις ημέρες πριν από την πρώτη αξιολόγηση, ζητήθηκε από τα υποκείμενα να απέχουν από τη χρήση προϊόντων περιποίησης προσώπου. Το βράδυ πριν από την προγραμματισμένη βαθμολόγηση, οι συμμετέχοντες έπρεπε να σταματήσουν την εφαρμογή διακοσμητικών καλλυντικών.

Τις πρώτες 7 ημέρες της φάσης προετοιμασίας 10-ημέρας, τα άτομα έλαβαν ένα βάζο κρέμας που περιείχε την κρέμα οχήματος της μελέτης (χωρίς πληροφορίες σχετικά με το περιεχόμενο) και το εφάρμοζαν δύο φορές την ημέρα σε ολόκληρο το πρόσωπό τους. Στην αρχή, οι εθελοντές πραγματοποίησαν αυτο-βαθμολόγηση. Συγκεκριμένα, αξιολόγησαν οπτικά τη συνολική εμφάνιση του δέρματος του προσώπου τους παρατηρώντας τη φρεσκάδα και τη λάμψη του καθώς και τυχόν σημάδια γήρανσης του δέρματος. Ως εκ τούτου, εφαρμόστηκε μια οπτική αναλογική κλίμακα που κυμαίνεται από 1 (πολύ κουρασμένος, γερασμένος) έως 10 (πολύ φρέσκο, χωρίς σημάδια γήρανσης του δέρματος). Στη συνέχεια, τα άτομα έλαβαν δύο τυφλά βάζα κρέμας που περιείχαν το verum (όχημα που περιείχε 0,5 τοις εκατό bakuchiol) ή το όχημα, αντίστοιχα, χωρίς καμία προδιαγραφή για το περιεχόμενο. Κατά τη διάρκεια της περιόδου της μελέτης των 12 εβδομάδων, η μία πλευρά του προσώπου υποβλήθηκε σε θεραπεία δύο φορές την ημέρα με verum ενώ η άλλη πλευρά του προσώπου θεραπεύτηκε δύο φορές την ημέρα με το όχημα. Η κατανομή των θεραπειών στις τοποθεσίες δοκιμής μετατράπηκε. Μετά από 12 εβδομάδες τακτικής χρήσης, οι εθελοντές έκαναν ξανά την αυτο-βαθμολόγηση όπως προαναφέρθηκε.

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Microsoft Excel για Office 365 (Microsoft Corporation, Redmond, Ουάσιγκτον, Ηνωμένες Πολιτείες), πακέτο λογισμικού SAS για Windows V9.4 (SAS Institute GmbH, Heidelberg, Γερμανία) και GraphPad Prism V8 (GraphPad Software, San Diego , Καλιφόρνια, Ηνωμένες Πολιτείες).

Η κανονική κατανομή των δεδομένων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το τεστ Shapiro-Wilk. Εάν επιβεβαιώθηκε η κανονική κατανομή, πραγματοποιήθηκε ανάλυση διακύμανσης επαναλαμβανόμενων μετρήσεων (RM-ANOVA) με post hoc σύγκριση ανά ζεύγη. Εάν η υπόθεση της κανονικότητας απορρίφθηκε, οι μετασχηματισμένες με Blom βαθμίδες των αρχικών δεδομένων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μια RM-ANOVA με μετα-hoc σύγκριση ανά ζεύγη ή τα αρχικά δεδομένα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μια δοκιμή κατάταξης πρόσημου Wilcoxon. Όλες οι στατιστικές δοκιμές ήταν διπλής όψης σε επίπεδο σημαντικότητας άλφα=0.05.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Μελέτες in vitro

Προσδιορισμός αντιοξειδωτικών επιδράσεων

Για να αναλύσουμε τα (i) αντιοξειδωτικά αποτελέσματα της βακουχιόλης και της ρετινόλης, πραγματοποιήσαμε δύο διαφορετικές αναλύσεις χρησιμοποιώντας το DPPH ως ανιχνευτή.

Αντιοξειδωτική ικανότητα

Η αντιοξειδωτική ικανότητα προσδιορίστηκε μετρώντας τη μείωση της DPPH μέσω της απορρόφησής της. Το υψηλών προδιαγραφών Trolox έδειξε μια σημαντικά αυξημένη αντιοξειδωτική ικανότητα σε σχέση με τον έλεγχο (p{1}}.0000 για όλα τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία) επαληθεύοντας τη σωστή μέτρηση (Εικόνα 2α). Σχετικά με τον έλεγχο, η απορρόφηση σε δείγματα που έχουν υποστεί επεξεργασία με bakuchiol μειώθηκε επίσης σημαντικά σε όλα τα χρονικά σημεία που ερευνήθηκαν (10 λεπτά: p=0.0003, 30 και 60 λεπτά: p=0.0000 ) επιδεικνύοντας αυξημένη αντιοξειδωτική ικανότητα. Αντίθετα, η ρετινόλη δεν έδειξε σημαντική αντιοξειδωτική ικανότητα σε σύγκριση με τον έλεγχο.

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】