Το γλουταμινικό μονονάτριο προκαλεί αλλαγές στα ηπατικά και νεφρικά μεταβολικά προφίλ και στο μικροβίωμα του εντέρου των αρουραίων Wistar

edmund.chen@wecistanche.com

Αφηρημένη:Η βραχυπρόθεσμη και μακροπρόθεσμη κατανάλωση γλουταμινικού μονονάτριου (MSG) αυξάνει το pH των ούρων αλλά τις επιδράσεις στις μεταβολικές οδούς στο ήπαρ, νεφρό και η μικροχλωρίδα του εντέρου παραμένει άγνωστη. Για να αντιμετωπίσουμε αυτό το ζήτημα, διερευνήσαμε ενήλικους αρσενικούς αρουραίους Wistar στους οποίους χορηγήθηκε πόσιμο νερό με ή χωρίς 1 g τοις εκατό MSG για 2 εβδομάδες (n=10, η καθεμία). Πραγματοποιήσαμε μια μεταβολομική μελέτη της νήστιδας βασισμένη σε φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR),συκώτι, καινεφρά, ενώ συλλέχθηκαν δείγματα κοπράνων για εξαγωγή βακτηριακού DNA για τη διερεύνηση της μικροχλωρίδας του εντέρου χρησιμοποιώντας αλληλουχία γονιδίου 16S rRNA. Παρατηρήσαμε σημαντικές αλλαγές στοσυκώτιαρουραίων που έλαβαν MSG σε σύγκριση με μάρτυρες στα επίπεδα γλυκόζης, πυριδοξίνης, λευκίνης, ισολευκίνης, βαλίνης, αλανίνης, κυνουρενικού και νικοτιναμιδίου. Αναμεταξύνεφρόμεταβολιτών, το επίπεδο της τριμεθυλαμίνης (TMA) αυξήθηκε και η πυριδοξίνη μειώθηκε μετά τη θεραπεία με MSG. Η αλληλούχιση του γονιδίου 16S rRNA αποκάλυψε ότι οι αρουραίοι που έλαβαν MSG είχαν αυξημένα τα Firmicutes, τα βακτήρια του εντέρου που σχετίζονται με το μεταβολισμό του TMA, μαζί με μειωμένα είδη Bififidobacterium. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν τον αντίκτυπο της κατανάλωσης MSGσυκώτικαινεφρόμεταβολισμός. Με βάση τις αλλαγές στο μικροβίωμα του εντέρου, υποθέτουμε ότι το TMA και οι μεταβολίτες του όπως το τριμεθυλαμινο-Ν-οξείδιο (TMAO) μπορεί να είναι μεσολαβητές των επιδράσεων του MSG στουγεία των νεφρών.

Λέξεις-κλειδιά:το όξινο γλουταμινικό νάτριο; μικροχλωρίδα του εντέρου? μεταβολική οδός? μεταβολομική; μικροβίωμα; τριμεθυλαμίνη; Νεφρό; Συκώτι

ΕισαγωγήΤο γλουταμινικό μονονάτριο (MSG) προστίθεται συνήθως στα τρόφιμα για να αυξηθεί η γευστικότητα, ειδικά στην ασιατική κουζίνα και στα βιομηχανικά επεξεργασμένα τρόφιμα [1]. Το MSG θεωρείται ασφαλές συστατικό για ανθρώπινη κατανάλωση ανεξάρτητα από την ποσότητα από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) [2] παρά τα πρόσφατα δεδομένα που δείχνουν ότι η μέση ημερήσια πρόσληψη MSG είναι 3–4 g και ότι κάθε επιπλέον γραμμάριο MSG αυξάνει τον κίνδυνο εμφάνισης μεταβολικού συνδρόμου [3]. Αυξημένες ποσότητες διατροφικού MSG σχετίζονται με το υπερβολικό βάρος [4,5] και την υπέρταση [6], αλλά τα αποτελέσματα είναι ασυνεπή [7,8].

Έχουν γίνει προσπάθειες να αποκαλυφθούν οι επιδράσεις του MSG στα μεταβολικά όργανα των ζώων είτε με παρεντερική [9,10] είτε από του στόματος λήψη [11,12]. Σε μια από αυτές τις προσπάθειες για τη διερεύνηση των επιδράσεων του MSG σε αρουραίουςνεφρά, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τόσο η βραχυπρόθεσμη [13] όσο και η μακροπρόθεσμη [11] κατανάλωση MSG προκάλεσε αλκαλικά ούρα σε αρουραίους, αν και ο μηχανισμός της αλκαλοποίησης των ούρων δεν έχει τεκμηριωθεί. Η μεταβολομική είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη προσέγγιση για τον καθορισμό των αλλαγών στους μεταβολίτες από διάφορες καταστάσεις [14,15]. Η βραχυπρόθεσμη κατανάλωση MSG προκάλεσε συγκεκριμένες αλλαγές στους μεταβολίτες των ούρων συμπεριλαμβανομένης της διμεθυλαμίνης (DMA) και της μεθυλαμίνης (MA), οι οποίοι είναι μεταβολίτες που προέρχονται από το έντερο από την τριμεθυλαμίνη (TMA). Το TMA είναι μια πτητική αλειφατική αμίνη μικρής αλυσίδας που παρέχει τη χαρακτηριστική μυρωδιά ψαριού. Στην πραγματικότητα, τα βακτήρια του εντέρου παράγουν TMA από διαιτητικά ψάρια ή μπορεί να δημιουργηθούν από άλλα θρεπτικά συστατικά όπως η χολίνη και η καρνιτίνη, τα οποία είναι άφθονα στα αυγά και το κόκκινο κρέας [16]. Το μεγαλύτερο μέρος του TMA μετατρέπεται ενζυματικά στο άοσμο τριμεθυλαμινο-Ν-οξείδιο (TMAO) και τα υψηλά επίπεδα TMAO στο πλάσμα σχετίζονται με καρδιαγγειακή νόσο (CVD) [17], χρόνιαΝεφρική Νόσος(ΧΝΝ) [18] και διαβήτη [19].

Εκμεταλλευτήκαμε εδώ τα εργαλεία μεταβολομικής για να διερευνήσουμε τις επιπτώσεις της βραχυπρόθεσμης κατανάλωσης MSG στο μεταβολισμό του πλάσματος,συκώτι,νεφρόκαι του εντέρου, και ανέλυσε τη συσχέτιση μεταξύ των μεταβολικών αποτελεσμάτων και των αλλαγών της μικροχλωρίδας του εντέρου. Τα δεδομένα μας ενδέχεται να παρέχουν νέες μηχανιστικές γνώσεις σχετικά με τις επιδράσεις του διατροφικού MSG, ενώ παράλληλα επιδεικνύουν βιοδείκτες της βλάβης οργάνων που προκαλείται από το MSG.

Υλικά και μέθοδοι

Των ζώωνΕίκοσι 6-αρσενικοί αρουραίοι Wistar εβδομάδων (βάρος περίπου 200 g) ελήφθησαν από το Εθνικό Εργαστηριακό Κέντρο Ζώων (Πανεπιστήμιο Mahidol, Salaya, Μπανγκόκ, Ταϊλάνδη), εγκλιματίστηκαν σε μεμονωμένα μεταβολικά κλουβιά από ανοξείδωτο χάλυβα για 2 εβδομάδες και στη συνέχεια διατηρείται υπό τυπικές συνθήκες θερμοκρασίας (23 ± 2 ◦C), υγρασίας (30–60 τοις εκατό ) και φωτεινότητας (350–400 Lux) 12 ωρών κύκλου σκότους/12 ωρών φωτός. Οι αρουραίοι έλαβαν εμπορική δίαιτα σφαιριδίων Νο. CP 082 (Perfect Companion Group, Μπανγκόκ, Ταϊλάνδη) κατά τη διάρκεια της μελέτης. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του Northeast Laboratory Animal Center (NELAC), Πανεπιστήμιο Khon Kaen, Ταϊλάνδη. Επιπλέον, η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Πανεπιστημίου Khon Kaen της Ταϊλάνδης (AEKKU-NELAC5/2558).

ΑντιδραστήριαΓια τη διατροφή των ζώων χρησιμοποιήθηκε καθαρό MSG ποιότητας τροφίμων (99 τοις εκατό) (Ajinomoto, Τόκιο, Ιαπωνία). Μεθανόλη και χλωροφόρμιο εμπορικής ποιότητας αγοράστηκαν από την RCI LABSCAN LIMITED (Μπανγκόκ, Ταϊλάνδη) για εκχύλιση ιστού, νερό ποιότητας LC-MS αγοράστηκε από τη Merck (Darmstadt, Γερμανία), όξινο φωσφορικό κάλιο (KH2PO4) και οξείδιο δευτερίου (D2) από τη Merck (Darmstadt, Ελβετία), το αζίδιο του νατρίου (NaN3) παρήχθη από τον Ευρωπαϊκό Οργανισμό Χημικών Προϊόντων (ECHA, Ελσίνκι, Φινλανδία), τριμεθυλοσιλυλο-[2,2,3,3-2H4]-προπιονικό νάτριο (TSP) , ένα εσωτερικό πρότυπο για ανάλυση NMR, ελήφθη από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz CA, USA). Για φασματομετρία μάζας, ισοπροπανόλη εμπορικής ποιότητας (C3H8O) και μυρμηκικό οξύ (CH2O2) αγοράστηκαν από την RCI LABSCAN LIMITED (Μπανγκόκ, Ταϊλάνδη).

Πειραματικό σχέδιοΟι αρουραίοι ανατέθηκαν τυχαία για να λάβουν πόσιμο νερό είτε με (n=10) είτε χωρίς (n=10) 1 g τοις εκατό MSG για 2 εβδομάδες. Χρησιμοποιήθηκε νερό αντίστροφης όσμωσης (RO) (συγκέντρωση χλωρίου 3-4 ppm) για τη μελέτη σε ζώα όταν όλοι οι αρουραίοι είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή. Καταγράφηκε η ημερήσια πρόσληψη νερού (ml) και τροφής (g), καθώς και το εβδομαδιαίο σωματικό βάρος (g). Η 24 απέκκριση στα ούρα (ml/αρουραίος/ημέρα) καταγράφηκε σε όλη την περίοδο της μελέτης. Δείγματα αίματος κοπράνων και ουράς (100 μL πλάσματος) συλλέχθηκαν 2 εβδομάδες πριν από τη θυσία των ζώων χρησιμοποιώντας διοξείδιο του άνθρακα (CO2) μετά από 12-ωρη νηστεία. Δείγματα ιστών, π.χ. νήστιδα,συκώτικαινεφρό,συλλέχθηκαν και καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο προτού αποθηκευτούν στους t80 ◦C μέχρι να χρησιμοποιηθούν για ανάλυση.

Προετοιμασία και Ανάλυση ΔείγματοςΚάθε ιστός (100 mg υγρής μάζας) χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση μεταβολίτη σύμφωνα με τα προηγούμενα δημοσιευμένα πρωτόκολλα [20]. Πριν από την απόκτηση NMR, η πολική φάση των εκχυλισμάτων ιστών επαναιωρήθηκε σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα NMR 580 μL (ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου 100 mM, pH 7,4, σε D2O, που περιέχει 0,1 mM TSP και 0,2 τοις εκατό NaN3), στροβιλίστηκε σύντομα σε 12,000× g για 5 λεπτά στους 4 ◦C. Στη συνέχεια, 550 μL του μίγματος μεταφέρθηκαν σε γυάλινο σωλήνα NMR (Duran Group, Mainz, Γερμανία) με εξωτερική διάμετρο 5 mm πριν από την ανάλυση NMR. Περίπου 250 mg κοπράνων αναμίχθηκαν με 500 μL νερού ποιότητας HPLC (Merck, Darmstadt, Γερμανία) και ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αναμικτήρα vortex με ταχύτητα 2500 rpm για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το εναιώρημα κοπράνων στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στους 12,000× g για 15 λεπτά στους 4 ◦C και 540 μL υπερκειμένου μεταφέρθηκαν σε καθαρούς μικροσωλήνες 1,5 mL και 60 μL ρυθμιστικού διαλύματος NMR (ρυθμιστικό διάλυμα KH2PO4 1,5 Μ, ρΗ 7). , σε D2O, που περιέχει 2 mM TSP και 1 τοις εκατό NaN3) προστέθηκε. Στη συνέχεια, οι σωλήνες στροβιλίστηκαν για λίγο, φυγοκεντρήθηκαν στους 12,000× g για 10 λεπτά, και τελικά, 580 μL του μίγματος μεταφέρθηκαν σε γυάλινο σωλήνα NMR εξωτερικής διαμέτρου 5 mm για ανάλυση.

Τα εκχυλίσματα ιστών και τα δείγματα κοπράνων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας φασματοσκοπικό εστέρα 4{4}}0 MHz NMR (Bruker Biospin, Rheinstetten, USA) σε θερμοκρασία 298,15 K. Τα φάσματα αναφέρθηκαν στην κορυφή TSP (δ1Η { {14}}.00), σταδιακά και βασική διόρθωση με χρήση MATLAB (Mathworks, Natrick, MA ΗΠΑ). Το σήμα της κορυφής TSP (δ1Η Η1.000–0,005) από όλους τους ιστούς και της κορυφής TSP (δ1Η Η1,20–0,157) από τα κόπρανα αφαιρέθηκαν. Επιπλέον, η κορυφή του νερού αφαιρέθηκε από τη νήστιδα (δ1Η 4,50 και 5,20),συκώτι(δ1Η 4,68 και 5.00),νεφρό(δ1Η 4,31 και 5,74) και κόπρανα (δ1Η 4,18 και 5,23). Επιπλέον, τα ακατέργαστα φάσματα υποβλήθηκαν σε ευθυγράμμιση και κανονικοποίηση κορυφής [21]. Τα φασματικά δεδομένα όλων των δειγμάτων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μη εποπτευόμενη ανάλυση κύριας συνιστώσας (PCA) και εποπτευόμενη ορθογώνια διόρθωση σήματος-προβολή σε λανθάνουσες δομές-διάκριση ανάλυση (O-PLS-DA). Τα δεδομένα επικεντρώθηκαν στη μέση τιμή και κλιμακώθηκαν με μοναδιαία διακύμανση (UV). Τα μοντέλα O-PLS-DA αξιολογούνται με τις τιμές R2X, R2Y και Q2Y, που αντιπροσωπεύουν την καταλληλότητα, το κλάσμα των διακυμάνσεων του πίνακα Y και την ικανότητα πρόβλεψης του μοντέλου, αντίστοιχα [22]. Για να αποφευχθεί η υπερβολική προσαρμογή, πραγματοποιήθηκε 7-διασταυρούμενη επικύρωση διπλού για 500 επαναλήψεις. Η μετάθεση p-value χρησιμοποιήθηκε για να υποδείξει την εγκυρότητα του μοντέλου. Σημαντικές μεταβλητές κάθε έγκυρου μοντέλου επιλέχθηκαν μέσω των συντελεστών συσχέτισης O-PLS-DA με διόρθωση ποσοστού ψευδούς ανακάλυψης Benjamini-Hochberg (p < 0,05).="" για="" την="" ταυτοποίηση="" μεταβολιτών="" χρησιμοποιήθηκαν="" η="" στατιστική="" φασματοσκοπία="" ολικής="" συσχέτισης="" (stocsy)="" [23],="" οι="" εσωτερικές="" βάσεις="" δεδομένων="" χημικής="" μετατόπισης="" και="" η="" βάση="" δεδομένων="" ανθρώπινου="" μεταβολισμού="" (hmdb="" έκδοση="" 4,="" ηπα)="">

Η ανάλυση εμπλουτισμού διαδρομής διεξήχθη επίσης χρησιμοποιώντας το MetaboAnalyst (http://www. metaboanalyst.ca/ (πρόσβαση στις 14 Ιουλίου 2020)) [25]. Η απεικόνιση της μεταβολικής οδού δημιουργήθηκε από το Cytoscape [26]. Οι αλλαγές στους μεταβολίτες προσδιορίστηκαν με STOCSY και πραγματοποιήθηκε μονοπαραγοντική ανάλυση με διερεύνηση της σχετικής συγκέντρωσης σημαντικά διαφορικών μεταβολιτών, υπολογίζοντας την ενσωμάτωση των κορυφών του φάσματος. Σύμφωνα με την τιμή p που υπολογίστηκε από το Student's t-test χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 7 (Ver. 7, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).

Προετοιμασία δείγματος πλάσματος για ανάλυση UHPLC-ESI-QTOF-MSΤο πλάσμα (50 μL) αναμίχθηκε με 150 μL ισοπροπανόλης (IPA), ακολουθούμενο από 24-h επώαση στους 20 ◦C για να κατακρημνιστεί η πρωτεΐνη. Όλα τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν δύο φορές στους 13,000× gat 4 ◦C για 10 λεπτά. Συνολικά λήφθηκαν 50 μL από κάθε δείγμα και συγκεντρώθηκαν σε σωλήνα μικροφυγόκεντρου 1,5 mL για την κατασκευή ενός δείγματος ποιοτικού ελέγχου (QC) και 120 μL από κάθε μείγμα δείγματος μεταφέρθηκαν σε ένα γυάλινο ένθετο HPLC.

Ανάλυση UHPLC-ESI-QTOF-MSΗ ανάλυση UHPLC-ESI-QTOF-MS χρησιμοποιήθηκε στο Khon Kaen University International Phenome Laboratory (KKUIPL). Τα εκχυλίσματα υδατικής φάσης των δειγμάτων αναλύθηκαν σε πλατφόρμα αντίστροφης φάσης. Το τμήμα διαχωρισμού πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα UHPLC (Bruker, Darmstadt, Γερμανία) όταν η σόλο HPLC έντασης Bruker C18 2.1 × 100 mm, στήλη 2 μm (Bruker, Darmstadt, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε. Η θερμοκρασία της στήλης ορίστηκε στους 55 ◦C και η θερμοκρασία του αυτόματου δειγματολήπτη ορίστηκε στους 4 ◦C. Η κινητή φάση Α ήταν 10{{2{0}} τοις εκατό νερό ποιότητας HPLC με 0.1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ (FA) και η κινητή φάση Β ήταν 10 {{30}} τοις εκατό μεθανόλη με 0,1 τοις εκατό FA. Ο ρυθμός ροής ορίστηκε σε 0,4 mL/min και η βαθμίδα έκλουσης ορίστηκε ως —99,9 τοις εκατό A (0.{{4{44}}}}-2.{{46} }} min, 0.25 mL/min), 99,9–75 τοις εκατό A (2.0–1{0.0 min, 0. 4 mL/min), 2{{6{{{{0}} τοις εκατό A (10.0–12.0 min, 0.4 mL/min), 10% A (12.0–21.0 min, 0.4 mL/ min), 0,1 τοις εκατό Α (21,0-23,0 λεπτά, 0,4 mL/min), 99,9 τοις εκατό Α (24,0-26,0 λεπτά, 0,4 mL/min). Εφαρμόστηκε όγκος έγχυσης δείγματος 4 μL για τρόπους θετικής και αρνητικής πολικότητας ιονισμού.

Πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις φασματομετρίας μάζας χρησιμοποιώντας ένα συμπαγές σύστημα ESI-Q-TOF (Bruker, Darmstadt, Γερμανία). Μυρμηκικό νάτριο (HCOONa) που περιείχε 2 mM υδροξείδιο του νατρίου, 0,1 τοις εκατό FA και 50 τοις εκατό IPA εγχύθηκε απευθείας ως εξωτερικός βαθμονομητής με ταχύτητα ροής 0,5 μL/min. Η κατάσταση σε λειτουργία θετικής πολικότητας ιονισμού — εύρος μάζας 50–1300 m/z, τάση κώνου 31 V, τριχοειδής τάση 4500 V, θερμοκρασία πηγής 220 ◦C, θερμοκρασία αποδιάλυσης 220 ◦C, ροή αερίου αποδιάλυσης 8 L/min. Οι συνθήκες λειτουργίας αρνητικής πολικότητας ιονισμού—εύρος m/z: 50–900 m/z, τάση κώνου 31 V, τριχοειδούς τάσης 4500 V, θερμοκρασία πηγής 220 ◦C, θερμοκρασία αποδιάλυσης 220 ◦C, ροή αερίου αποδιάλυσης 8 L/min.

Ανάλυση μικροβιώματος εντέρουΤο DNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το κιτ QiAamp® PowerFecal® Pro DNA (Qiagen, Hilden, Γερμανία). Το εκχυλισμένο DNA μετρήθηκε σε OD 260/280 χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο Nanodrop2000c (Thermo scientifific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Όλο το εξαγόμενο DNA διατηρήθηκε στους t20 ◦C μέχρι τις αναλύσεις. Η περιοχή V3-V4 του γονιδίου 16S ριβοσωμικού RNA (rRNA) για κάθε δείγμα ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τον καθολικό εμπρόσθιο εκκινητή V3 (50-CCTACGGGNGG CWGCAG-30) και τον αντίστροφο εκκινητή V4 ({ {11}}GACTACHVGGGTATCTAATCC-30). Η αντίδραση PCR αποτελείτο από 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix, 12,5 ng εκμαγείο DNA και 5 μΜ από κάθε εκκινητή, με αρχική μετουσίωση στους 95 ◦C για 3 λεπτά ακολουθούμενο από 25 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ◦C για 30 δευτερόλεπτα στους 55 ◦ C για 30 δευτερόλεπτα, επέκταση στους 72 ◦C για 30 δευτερόλεπτα και τελική επέκταση στους 72 ◦C για 10 λεπτά. Ένα Agilent DNA 1000 Chip και Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) συνδυάστηκαν για να ποσοτικοποιήσουν το ενισχυμένο προϊόν. Τα αμπλικόνια PCR καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας σφαιρίδια AMPure XP για καθαρισμό. Το μερικό γονίδιο 16S rRNA αλληλουχήθηκε χρησιμοποιώντας πλατφόρμα Illumina MiSeq (Illumina Inc., San Diego, CA, USA).

Η βιβλιοθήκη αλληλουχίας 16S rRNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας γονιδιωματικό DNA (gDNA) και οι αντίστοιχες αλληλουχίες ζευγαριού άκρου συγχωνεύτηκαν χρησιμοποιώντας FLASH (http://ccb.jhu.edu/software/ FLASH/ (πρόσβαση στις 29 Ιουνίου 2020)) [27] . Το φιλτράρισμα ποιότητας αφαίρεσε ακολουθίες που περιείχαν αναγνώσεις χαμηλής ποιότητας και πραγματοποιήθηκε με χρήση CD-HIT-OTU (http://weizhong-lab.ucsd.edu/ cd-hit-otu (πρόσβαση στις 29 Ιουνίου 2020)) [28] και το rDnaTools πακέτο. Τα OTUs (Λειτουργικές ταξινομικές μονάδες) ταξινομήθηκαν με 97 τοις εκατό ταυτότητα κατωφλίου χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο UCLUST με βάση την ομοιότητα 100 τοις εκατό. Οι αλληλουχίες που μοιράζονται μεγαλύτερη ή ίση με 97 τοις εκατό ομοιότητα αντιστοιχίστηκαν στο ίδιο OTU. Οι αντιπροσωπευτικές αλληλουχίες OTU ευθυγραμμίστηκαν και ταξινομήθηκαν ταξινομικά χρησιμοποιώντας το Ribosomal Database Project (RDP) και συγκρίθηκαν με τις βάσεις δεδομένων αναφοράς NCBI. Η ταξινόμηση βασίζεται στη βάση δεδομένων Green genes (http://greegenes.lbl. gov/ (πρόσβαση στις 29 Ιουνίου 2020)). Το αποτέλεσμα μιας ταξινόμησης αναγνώσεων σε διάφορα ταξινομικά επίπεδα—βασίλειο, φυλή, τάξη, τάξη, οικογένεια, γένος και είδος χρησιμοποιώντας ποσοτικές γνώσεις για τη μικροβιακή οικολογία (QIIME) [29].

Στατιστική ανάλυσηΗ στατιστική ανάλυση της πρόσληψης τροφής και νερού, η παραγωγή όγκου ούρων και το σωματικό βάρος αναφέρθηκαν ως μέσος όρος ±SD ανά ομάδα ζώων και οι διαφορές μεταξύ των ομάδων συγκρίθηκαν για στατιστική σημασία με το Student's t-test με τιμή p < {{2} }.05 θεωρείται ως στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

ΕΠΙΠΤΩΣΗ του MSG στην πρόσληψη τροφής και νερού, σωματικό βάρος και όγκο ούρωνΟι αρουραίοι που έλαβαν MSG και οι αρουραίοι ελέγχου είχαν παρόμοια ποσότητα πρόσληψης τροφής (17,44 ± 1,94 και 18,46 ± 1,37 g/αρουραίος/ημέρα, αντίστοιχα) (Εικόνα 1Α) και σωματικό βάρος (333,58 ± 17,23 και 333,80 ± 15, αντίστοιχα). (Εικόνα 1Β). Ωστόσο, η πρόσληψη νερού ήταν σημαντικά υψηλότερη στους επίμυες που έλαβαν MSG (52,38 ± 18,36 mL/ημέρα) σε σύγκριση με τους ελέγχους (38,38 ± 8,39 mL/ημέρα) (Εικόνα 1C). Και στις δύο ομάδες που έλαβαν θεραπεία με MSG και στις ομάδες ελέγχου, η απελευθέρωση ούρων έτεινε να αυξάνεται με το χρόνο, αν και σημαντική αύξηση παρατηρήθηκε μόνο σε αρουραίους που έλαβαν MSG (15,42 ± 3,92 mL/αρουραίο/ημέρα πριν από τη θεραπεία και 29,09 ± 8,78 mL/αρουραίο/ ημέρα μετά τη θεραπεία). Επίσης, αν και στατιστικά δεν ήταν σημαντική, η παραγωγή ούρων αρουραίων που έλαβαν MSG (29,09 ± 8,78 mL/αρουραίο/ημέρα) ήταν προφανώς υψηλότερη από εκείνη των μαρτύρων (23,15 ± 10,55 mL/αρουραίος/ημέρα) (Εικόνα 1D).

Μεταβολικές Αλλαγές σε Μεταβολικά Σημαντικά ΌργαναΤα φάσματα NMR των δειγμάτων ιστού που συλλέχθηκαν αναλύθηκαν μετά από δύο εβδομάδες θεραπείας με MSG. Η PCA των φασματικών δεδομένων NMR διεξήχθη αρχικά για την παρατήρηση τυχόν εμφανών ομαδοποιήσεων και ακραίων τιμών (Εικόνα 2). Η σαφής ομαδοποίηση και ο πλήρης διαχωρισμός παρατηρήθηκαν στα προφίλ ηπατικών μεταβολιτών μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ομάδας που έλαβε αγωγή με MSG με τιμή p μετάθεσης 0.002, R2X 58 τοις εκατό , Q2Y 0,84, και R2Y 0,93 που απεικονίζονται σε γραφήματα βαθμολογίας PCA και O-PLS-DA (Εικόνα 2Α, Β). Μια αντιπροσωπευτική γραφική παράσταση συντελεστή φόρτισης που αντιστοιχεί στο OPLS με αντιστοίχιση μεταβολίτη παρουσιάζεται στο Σχήμα 3 με σημαντικήσυκώτιμοντέλα που φαίνονται στο Σχήμα 3Α. όλες οι σημαντικές αλλαγές στους μεταβολίτες συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Στο ήπαρ, υψηλότερα επίπεδα έξι μεταβολιτών συμπεριλαμβανομένων γλυκόζης, πυριδοξίνης, 2-δεοξυουριδίνης, ινοσίνης, άγνωστα 1 και 2 βρέθηκαν στην ομάδα που έλαβε MSG, ενώ έντεκα μεταβολίτες , συγκεκριμένα λευκίνη, ισολευκίνη, βαλίνη, αλανίνη, Ν-ακετυλογλυκοπρωτεΐνη, ακετόνη, 1,3 διμεθυλουρικό, ισταμίνη, ξανθίνη, κυνουρενικό και νικοτιναμίδιο, ήταν σημαντικά υψηλότερα στην ομάδα ελέγχου. Η γραφική παράσταση βαθμολογίας PCA βασίζεται στονεφρώνμεταβολίτες (Εικόνα 2Γ) δεν έδειξαν σαφή ομαδοποίηση μεταξύ δύο ομάδων και το μοντέλο O-PLS-DA ήταν στατιστικά σημαντικό με τιμή p μετάθεσης 0.018, R2X 56 τοις εκατό , Q2Y. από 0,29 και R2Y 0,74 (Εικόνα 2D). Δύο αλλοιωμένοι μεταβολίτες βρέθηκαν σειστούς των νεφρώνμε σημαντικά υψηλότερο επίπεδο τριμεθυλαμίνης και σημαντικά χαμηλότερη πυριδοξίνη στην ομάδα που έλαβε MSG σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Εικόνα 3Β). Αντίθετα, τα αποτελέσματα της νήστιδας (Εικόνα 2Ε, ΣΤ), των κοπράνων και του πλάσματος (Εικόνα 2 και Σχήμα S1) δεν αποκάλυψαν ομαδοποίηση μεταξύ των ομάδων θεραπείας και ελέγχου που απεικονίζονται στις γραφικές παραστάσεις βαθμολογιών PCA και O-PLS-DA.

Τα μονοπάτια συσχέτισης των σημαντικών μεταβολιτών στοσυκώτικαιιστούς των νεφρώνδιερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας αναγνωριστικά KEGG και δημιουργήθηκαν από το λογισμικό Cytoscape. Οι μεταβολίτες βρέθηκαν να συνδέουν το μεταβολικό δίκτυο. Όταν αυτά τα αποτελέσματα συνδυάστηκαν για να σχεδιάσουν έναν χάρτη μεταβολικής οδού για να απεικονίσουν μια πιο διαισθητική συσχέτιση, οι μεταβολίτες αποκαλύφθηκε ότι σχετίζονται κυρίως με μεταβολικές οδούς, όπως η ηπατική γλυκονεογένεση, τα αμινοξέα διακλαδισμένης αλυσίδας, οι μεταβολισμοί της βιταμίνης Β6 και της τριμεθυλαμίνης. Εικόνα S3).

Η κατανάλωση MSG αλλάζει το μικροβίωμα του εντέρουΤα αποτελέσματα της ανάλυσης της βακτηριακής σύνθεσης των κοπράνων έδειξαν επτά φυλές, 15 κατηγορίες, 19 τάξεις, 46 οικογένειες, 127 γένη και 220 είδη από όλες τις ομάδες ζώων. Επιλέχθηκαν τα κορυφαία 7-10 είδη και δημιουργήθηκε η ποσοστιαία σχετική αφθονία βακτηριακών κοινοτήτων σε επίπεδο φυλής, τάξης, τάξης, οικογένειας, γένους και είδους (Εικόνα 4). Σε επίπεδο φυλής, οι τέσσερις πρώτες σχετικά άφθονες φυλές ήταν με την ακόλουθη σειρά— Firmicutes > Bacteroidetes > Proteobacteria > Actinobacteria σε όλα τα ζώα (Εικόνα 4Α). Η αφθονία των Actinobacteria ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε επίμυες που έλαβαν MSG (0,30 τοις εκατό) από ότι στους αρουραίους ελέγχου (1,32 τοις εκατό) (Εικόνα 5Α).

Σε επίπεδο τάξης, η πιο άφθονη μικροχλωρίδα ήταν Bacilli > Clostridia > Bacteroidia > Erysipelotrichia σε όλα τα ζώα (Εικόνα 4Β). Η ομάδα που έλαβε MSG είχε σημαντικά υψηλότερα Clostridia (31,59 τοις εκατό) από την ομάδα ελέγχου (19,25 τοις εκατό). Ωστόσο, οι αρουραίοι που έλαβαν MSG είχαν σημαντικά χαμηλότερα ακτινοβακτήρια (0,15 τοις εκατό) από τους αρουραίους ελέγχου (1.09 τοις εκατό) (Εικόνα 4Β). Όταν ερμηνεύτηκαν σε επίπεδο τάξης, τα Lactobacillales, Clostridiales, Bacteroidales, Erysipelotrichales ήταν άφθονα σε όλα τα ζώα (Εικόνα 4C). Τα κλωστρίδια ήταν σημαντικά υψηλότερα στους επίμυες που έλαβαν MSG (31,59 τοις εκατό) από τους αρουραίους ελέγχου (19,25 τοις εκατό), ενώ τα Bififidobacteriales ήταν σημαντικά χαμηλότερα στους επίμυες που έλαβαν MSG (0,06 τοις εκατό) σε σύγκριση με τους αρουραίους ελέγχου (1,06 τοις εκατό).

Οι τέσσερις πιο άφθονες οικογένειες που παρατηρήθηκαν συνήθως σε όλα τα πειραματόζωα ήταν με την ακόλουθη σειρά - Lactobacillaceae > Erysipelotrichaceae > Clostridiaceae > Prevotellaceae (Εικόνα 4Δ). Σε επίπεδο οικογένειας, τα Bififidobacteriaceae ήταν σημαντικά χαμηλότερα, αλλά τα μη αναγνωρισμένα Clostridiales ήταν σημαντικά υψηλότερα στους επίμυες που έλαβαν MSG σε σύγκριση με τους αρουραίους ελέγχου. Η σχετική αφθονία των κορυφαίων τεσσάρων γενών που παρατηρήθηκαν σε όλα τα ζώα ήταν με την ακόλουθη σειρά - Lactobacillus > Turicibacter > Prevotella < clostridium="" (εικόνα="" 4ε).="" ένας="" θερμικός="" χάρτης="" των="" σχετικών="" αφθονιών="" σε="" επίπεδο="" γένους="" έδειξε="" χαμηλότερη="" αφθονία="" lactobacillus="" και="" υψηλότερη="" αφθονία="" clostridium="" σε="" αρουραίους="" που="" έλαβαν="" msg="" (εικόνα="" 5β).="" επιπλέον,="" η="" χαμηλότερη="" αφθονία="" του="" bififidobacterium="" παρατηρήθηκε="" επίσης="" σε="" επίμυες="" που="" έλαβαν="" msg="" (0,06="" τοις="" εκατό)="" σε="" σύγκριση="" με="" τους="" αρουραίους="" ελέγχου="" (1,06="" τοις="">

Σε επίπεδο είδους, τα τέσσερα κορυφαία βακτηριακά είδη του εντέρου που ήταν κοινά σε όλους τους αρουραίους ήταν οι Lacto bacillus intestinalis, Turicibacter sanguinis, Clostridium saudiense και Muribaculum intestinale κατά σειρά (Εικόνα 4ΣΤ). Στην ομάδα που έλαβε θεραπεία με MSG, το Flintibacter butyricus ήταν σημαντικά πιο άφθονο από ό,τι στην ομάδα ελέγχου, ενώ το Faecalibaculum rodentium και το Bififidobacterium pseudolongum ήταν σημαντικά λιγότερο άφθονο.

Συζήτηση

Αρκετές σειρές στοιχείων έχουν συσχετίσει σταθερά την κατανάλωση MSG με δυσμενείς επιπτώσεις στην ανθρώπινη υγεία, όπως η υψηλότερη συχνότητα μεταβολικού συνδρόμου [3], το υπερβολικό βάρος [4,5] και η αρτηριακή υπέρταση [6]. Παρόλα αυτά, τα δεδομένα ήταν αντικρουόμενα σε ορισμένες περιπτώσεις και οι υποκείμενοι μηχανισμοί παραμένουν ασαφείς. Για να αντιμετωπίσουμε αυτό το ζήτημα, διερευνήσαμε τις μεταβολικές μεταβολές των ιστών και τις μικροβιακές αλλαγές του εντέρου που προκαλούνται από την κατανάλωση MSG. Όπως φαίνεται στη σχηματική αναπαράσταση στο Σχήμα 6, η κατανάλωση MSG άλλαξε τους μεταβολίτες που σχετίζονται με την ηπατική γλυκονεογένεση, τον μεταβολισμό των αμινοξέων διακλαδισμένης αλυσίδας (BCAA), τη βιταμίνη Β6 και το μεταβολισμό της τριμεθυλαμίνης. Επιπλέον, η βραχυπρόθεσμη κατανάλωση MSG κατέστειλε τη σχετική αφθονία του Bififidobacterium, το οποίο θεωρείται ευεργετικό βακτήριο, και του Clostridium που σχετίζεται με την παραγωγή TMA και TMAO [30].

Στο ήπαρ, μεταβολίτες όπως η γλυκόζη, η πυριδοξίνη (Β6), η 2-δεοξυουριδίνη, η ινοσίνη, άγνωστα 1 και 2 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ζώα που έλαβαν MSG από ό,τι στους μάρτυρες, ενώ έντεκα μεταβολίτες (δηλ. λευκίνη, ισολευκίνη, βαλίνη , αλανίνη, Ν-ακετυλογλυκοπρωτεΐνη, ακετόνη, 1,3-διμεθυλουρικό, ισταμίνη, ξανθίνη, κυνουρενικό και νικοτιναμίδιο) ήταν σημαντικά χαμηλότερα. Πρώτον, υψηλότερα επίπεδα γλυκόζης μπορεί να υποδεικνύουν αύξηση της ηπατικής γλυκονεογένεσης που σχετίζεται με το MSG, κάτι που συμφωνεί με προηγουμένως αναφερθείσα υψηλή γλυκόζη στο πλάσμα σε νεογέννητους χοίρους που λαμβάνουν συμπλήρωμα MSG (1 g/kg σωματικού βάρους) [31]. Δεύτερον, τα μειωμένα επίπεδα αλανίνης και τριών BCAA, συμπεριλαμβανομένης της βαλίνης, της λευκίνης και της ισολευκίνης, μπορεί να συσχετίζονται με τον καταβολισμό αμινοξέων και τον ενεργειακό μεταβολισμό στον οποίο οι σκελετοί άνθρακα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πρόδρομοι για τη γλυκονεογένεση (αλανίνη, βαλίνη και ισολευκίνη ως γλυκογόνα αμινοξέα). και παραγωγή ενέργειας μέσω του κύκλου τρικαρβοξυλικού οξέος (TCA). Σε συμφωνία με την προηγούμενη αναφορά, διαπιστώσαμε ότι τα προϊόντα αποικοδόμησης λευκίνης και λυσίνης, βήτα-υδροξυϊσοβαλερικού και 5-αμινοβαλερικού, αντίστοιχα, ήταν σημαντικά υψηλότερα στα ούρα των αρουραίων που έλαβαν MSG [13]. Τρίτον, αυξημένη πυριδοξίνη στοσυκώτικαι μειωμένη πυριδοξίνη στονεφρότων αρουραίων που έλαβαν MSG πρότειναν μεταβολή του μεταβολισμού της βιταμίνης Β6. Βρήκαμε επίσης μειωμένα επίπεδα ισταμίνης, κυνουρενικού και νικοτιναμίδης στοσυκώτιτων αρουραίων που έλαβαν θεραπεία με MSG, οι οποίοι είναι προϊόντα των Β6-εξαρτώμενων ενζύμων στον μεταβολισμό της ιστιδίνης και της τρυπτοφάνης. Η σύνδεση μεταξύ της πρόσληψης MSG και του μεταβολισμού της βιταμίνης Β6, της ιστιδίνης και της τρυπτοφάνης πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω. Τέταρτον, οι αρουραίοι που έλαβαν MSG είχαν υψηλότερα επίπεδα τριμεθυλαμίνης (TMA) στονεφρό. Το TMA συντίθεται από διατροφικά συστατικά, συμπεριλαμβανομένης της χολίνης, της L-καρνιτίνης και της βεταΐνης με τη δράση μικροβιακών ενζύμων [16]. Το TMA απορροφάται σε μεγάλο βαθμό με παθητικό τρόπο στην πυλαία κυκλοφορία και κυρίως οξειδώνεται σε τριμεθυλαμινο-Ν-οξείδιο (TMAO) από ηπατικές μονοοξυγενάσες που περιέχουν φφλλαβίνη (FMOs). Ένα μικρό κλάσμα του TMA οξειδώνεται σε διμεθυλαμίνη (DMA) και μεθυλαμίνη (MA) και τελικά απεκκρίνεται στα ούρα [32,33]. Έχουν αναφερθεί υψηλότερα επίπεδα DMA και MA στα ούρα αρουραίων που έλαβαν MSG [13]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι οι αυξημένοι πρόδρομοι TMA, η χολίνη, ή οι μεταβολίτες της, TMAO, μπορούν να οδηγήσουν σε προοδευτικήνεφρώνσωληναρισιακή διάμεση ίνωση, καρδιαγγειακά νοσήματα και χρόνιαΝεφρική Νόσος[34-36]. Ως εκ τούτου, το αυξημένο επίπεδο TMA στονεφρόμπορεί να αποτελεί τη σύνδεση μεταξύ της πρόσληψης MSG καινεφρική βλάβη.

Προχωρώντας από τις παρατηρούμενες αλλαγές στα TMAs, διερευνήσαμε τη μικροχλωρίδα του εντέρου των αρουραίων που έλαβαν MSG και δείξαμε την αλλαγή των δύο μεγάλων φυλών, των Firmicutes και των Bacteroidetes. Η υψηλότερη αφθονία των Firmicutes, αλλά η μικρότερη αφθονία των Bacteroidetes, παρατηρήθηκε σε αρουραίους που έλαβαν MSG. Σε επίπεδο γένους, οι αρουραίοι που έλαβαν MSG είχαν υψηλότερη αφθονία Clostridium και χαμηλότερη αφθονία Lactobacillus και Bififidobacterium. Το γένος Clostridium περιλαμβάνει μια ομάδα μικροοργανισμών που ανήκουν στο γένος Firmicutes. Μερικά Clostridium spp. συνδέονται με το μεταβολισμό του TMA παράγοντας ένζυμα για τη μετατροπή της χολίνης ή των διατροφικών συστατικών σε TMA [33,37,38]. Τα αυξημένα βακτήρια του εντέρου που παράγουν TMA, π.χ. Clostridium spp., υποστηρίζουν την αύξηση των μεταβολιτών TMA στονεφρόκαι ούρα αρουραίων που έλαβαν MSG. Επιπλέον, η κατανάλωση MSG μείωσε τον πληθυσμό του Bififidobacterium, ένα προβιοτικό βακτήριο που παίζει σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση και την υγεία του εντέρου [39]. Οι απλοί και εύπεπτοι υδατάνθρακες όπως η λακτόζη και η σακχαρόζη μεταβιβάζονται στην ανώτερη γαστρεντερική οδό από τον ξενιστή και βακτήρια όπως οι γαλακτοβάκιλλοι. Ωστόσο, οι μη εύπεπτοι υδατάνθρακες, δηλαδή οι διαιτητικές ίνες, μεταβολίζονται στην κατώτερη γαστρεντερική οδό από τα μέλη της μικροχλωρίδας του εντέρου, συμπεριλαμβανομένου του Bififidobacterium. Μια δίαιτα με υψηλή περιεκτικότητα σε κορεσμένα λίπη και απλά σάκχαρα, αλλά χωρίς διαιτητικές ίνες, όπως μια δίαιτα δυτικού τύπου μπορεί να συμβάλει σε μικρότερο αριθμό ωφέλιμων βακτηρίων [40]. Η μείωση του Bififidobacterium, ενός καλού βακτηρίου, έχει αναφερθεί σε χρόνιες φλεγμονώδεις ασθένειες όπως η παχυσαρκία [41], η ηπατίτιδα Β [42] και ο διαβήτης [43,44]. Η επίδραση της κατανάλωσης MSG στη μικροχλωρίδα του εντέρου στον άνθρωπο αναφέρθηκε νωρίτερα χωρίς σημαντικές αλλαγές στη μικροβιακή σύνθεση σε σύγκριση με την αρχική τιμή [45]. Η χαμηλή επίδραση του MSG στη μικροχλωρίδα του εντέρου σε αυτή τη μελέτη μπορεί να οφείλεται στη χαμηλή δόση συμπληρωμάτων MSG (2 g/ημέρα), καθώς η μέση ημερήσια πρόσληψη MSG στην παρατήρησή μας είναι 4 g/ημέρα [3]. Βρήκαμε ότι κάθε 1 g ημερήσιας πρόσληψης MSG αύξανε τον κίνδυνο εμφάνισης μεταβολικού συνδρόμου. Αν και ο μηχανισμός της κατανάλωσης MSG που οδηγεί σε μεταβολικές ασθένειες δεν έχει τεκμηριωθεί, η μείωση του Bififidobacterium σε ζώα που έλαβαν MSG μπορεί να αποτελεί ένδειξη. Συμπτωματικά, το μειωμένο Bififidobacterium σε αρουραίους που έλαβαν MSG που βρέθηκε στην παρούσα μελέτη είναι παρόμοιο με αυτό των αρουραίων με ανεπάρκεια βιταμίνης Β6 [46]. Η εντατική μελέτη του τρόπου με τον οποίο το MSG μειώνει τα καλά βακτήρια και μεταβάλλει την κατάσταση της βιταμίνης Β6 χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση.

Δείξαμε ότι η κατανάλωση MSG προκάλεσε ηπατική καινεφρώνμεταβολικές αλλαγές που εμπλέκονται στη γλυκονεογένεση και στον μεταβολισμό των αμινοξέων διακλαδισμένης αλυσίδας, της βιταμίνης Β6 και του TMA, που συνοδεύονται από αλλαγές στη σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι οι αλλοιωμένες μεταβολικές οδοί μπορεί να σχετίζονται με δυσμενείς επιπτώσεις της μακροχρόνιας κατανάλωσης MSG, ειδικά στηνσυκώτικαινεφρό.